第一部分 专题六 考向十二 基因工程与细胞工程-【金版教程】2026年高考生物大二轮专题复习冲刺方案全书word（单选版）

大二轮专题复习冲刺方案　生物学(经典单选版 考向十二　基因工程与细胞工程 命题点1　基因工程及应用 1．基因工程：是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。又叫作重组DNA技术。 2．蛋白质工程：是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过改造或合成基因，来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需求。(实质：通过改造基因来改造蛋白质) 3．质粒：是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。 4．PCR：是聚合酶链式反应的缩写。它是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。 5．限制酶：能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开的酶。 6．DNA连接酶：能将两个DNA片段连接起来的酶，能恢复被限制酶切开的磷酸二酯键。 7．标记基因：如四环素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因等，便于重组DNA分子的筛选。 8．启动子：是一段有特殊序列结构的DNA片段，位于基因的上游，紧挨转录的起始位点，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱使基因转录出mRNA，最终表达出人类所需要的蛋白质。 9．终止子：使转录在所需要的地方停下来，它位于基因的下游，是一段有特殊序列的DNA片段。 10．目的基因：用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因就是目的基因，主要是指编码蛋白质的基因。 11．T－DNA：农杆菌Ti质粒上的一段DNA片段，可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA上。 12．转化：指目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。 13．乳腺生物反应器：科学家将药用蛋白基因与乳腺中特异表达的基因的启动子等调控元件重组在一起，通过显微注射的方法导入哺乳动物的受精卵中，由这个受精卵发育成的转基因动物在进入泌乳期后，可以通过分泌乳汁来生产所需要的药物，这称为乳腺生物反应器或乳房生物反应器。 写出基因工程的基本操作步骤。 答案：基因工程的基本操作步骤包括：①目的基因的筛选与获取；②基因表达载体的构建；③将目的基因导入受体细胞；④目的基因的检测和鉴定。 获取目的基因的方法。 答案：(1)基因文库中获取目的基因；(2)PCR扩增目的基因；(3)人工合成目的基因。 PCR定义及利用PCR技术获取目的基因的条件和过程。 答案：(1)PCR定义：是利用DNA半保留复制的生物学原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因进行大量复制的技术。 (2)条件 模板 目的基因的两条链 原料 4种脱氧核苷酸 酶 耐高温的DNA聚合酶 引物 一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。2种 在一定的缓冲溶液中进行；需要控制温度的变化 (3)过程 变性 当温度超过90 ℃时，双链DNA解聚为单链 复性 温度下降到50 ℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合 延伸 72 ℃左右时，在耐高温的DNA聚合酶作用下，从引物3′端开始进行互补链的合成 写出基因表达载体的组成元件及其功能，以及构建基因表达载体的一般步骤。 答案：(1)基因表达载体组成元件及功能 启动子 位于目的基因上游，是RNA聚合酶识别结合的位点，驱动基因的转录 终止子 位于目的基因下游，是RNA聚合酶脱离的位点，终止基因的转录 标记基因 用于鉴定受体细胞中是否含有目的基因 复制原点 用于启动DNA复制 (2)过程 构建基因表达载体的一般步骤：①用一定的限制酶切割载体，使它出现一个切口；②用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段；③利用DNA连接酶对目的基因和载体进行拼接，形成重组DNA分子。 根据图示说明构建基因表达载体的过程中如何选择限制酶。 (1)根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类。 (2)根据质粒的特点确定限制酶的种类。 答案：(1)①应选择切点位于目的基因两端的限制酶，如图中可选择PstⅠ。 ②不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，如图中不能选择SmaⅠ。 ③为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图中也可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切点)。 (2) 写出将目的基因导入植物、动物、微生物的哪种细胞及方法。写出农杆菌转化法的过程及Ca2＋处理法。 答案：(1) 细胞类型 方法 植物细胞 花粉管通道法 农杆菌转化法 动物细胞(受精卵) 显微注射技术 微生物细胞(原核细胞) Ca2＋处理法 (2)①农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T－DNA(可转移的DNA)转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。如果将目的基因插入Ti质粒的T－DNA中，通过农杆菌的转化作用，就可以使目的基因进入植物细胞。②用Ca2＋处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，然后再将重组的基因表达载体导入其中。 简述在基因、RNA、蛋白质、个体水平上对目的基因进行检测和鉴定的方法。 答案： DNA粗提取原理及鉴定原理。 答案：提取原理：DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面存在差异，可以利用这些差异，选用适当的物理或化学方法对它们进行提取。DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精；DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，它于2 mol·L－1的NaCl溶液中溶解度最大。 鉴定原理：在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色。 1．限制酶、DNA连接酶、DNA聚合酶、RNA聚合酶、解旋酶、DNA酶 答案： 2．Ti质粒、T－DNA 答案：Ti质粒是农杆菌内携带的大型环状双链DNA分子，其上有一段特殊片段为T－DNA，两端由25 bp的左右边界序列界定。农杆菌侵染植物细胞后，可以将T－DNA片段整合入植物基因组里。 1．化疗会造成癌症病人血小板减少。血小板生成素(TPO)可促进血小板产生。研究人员将含人TPO基因的表达载体导入中国仓鼠卵巢细胞中，获得有生物活性的TPO并应用于临床。下列叙述错误的是(　　) A．用PCR技术可获取和扩增人TPO基因 B．构建表达载体需要解旋酶和DNA聚合酶 C．表达载体包括TPO基因、标记基因、启动子和终止子等 D．用抗原—抗体杂交技术可检测TPO基因的表达情况 [关键能力]　PCR技术是获取目的基因的常规手段，可根据TPO基因的特异性序列设计引物，通过变性—复性—延伸的循环特异性扩增TPO基因，A正确；构建表达载体只需限制酶和DNA连接酶，解旋酶和DNA聚合酶参与DNA复制，不参与载体构建，B错误；由教材“基因表达载体是载体的一种，除目的基因、标记基因外，它还必须有启动子、终止子等”，C正确；表达成功的标志是翻译出TPO蛋白，通过抗原—抗体杂交可检测TPO基因是否成功表达，D正确。 [答案]　B 2．(2025·江苏卷，19，改编)图示人体正常基因A突变为致病基因a及HindⅢ切割位点。AluⅠ限制酶识别序列及切割位点为，下列相关叙述不正确的有(　　) A．基因A突变为a是一种碱基增添的突变 B．用两种限制酶分别酶切A基因后，形成的末端类型不同 C．用两种限制酶分别酶切a基因后，产生的片段大小不同 D．产前诊断时，该致病基因可选用HindⅢ限制酶开展酶切鉴定 [解析]　由图可知，基因A突变为基因a，是由于T—A替换成了G—C，属于碱基对的替换，A错误；HindⅢ切割后形成的是黏性末端，AluⅠ切割后形成的是平末端，B正确；突变后的基因a中间片段不存在HindⅢ的切割位点，存在AluⅠ的切割位点，基因a分别用HindⅢ和AluⅠ酶切后产生的片段大小不一致，C正确；正常的基因A用HindⅢ酶切后产生4个片段，突变后的基因a用HindⅢ酶切后产生3个片段，D正确。 [答案]　A 3．(2025·黑吉辽蒙卷，25)香树脂醇具有抗炎等功效，从植物中提取难度大、产率低。通过在酵母菌中表达外源香树脂醇合酶基因N，可高效生产香树脂醇。回答下列问题。 (1)可从______________中查询基因N的编码序列，设计特定引物。如图1所示，a链为转录模板链，为保证基因N与质粒pYL正确连接，需在引物1和引物2的5′端分别引入________和________限制酶识别序列。PCR扩增基因N，特异性酶切后，利用________连接DNA片段，构建重组质粒，大小约9.5 kb(kb为千碱基对)，假设构建重组质粒前后，质粒pYL对应部分大小基本不变。 (2)进一步筛选构建的质粒，以1～4号菌株中提取的质粒为模板，使用引物1和引物2进行PCR扩增，电泳PCR产物，结果如图2。在第5组的PCR反应中，使用无菌水代替实验组的模板DNA，目的是检验PCR反应中是否有________的污染。初步判断实验组________(从“1～4”中选填)的质粒中成功插入了基因N，理由是__________________________________ __________________________________________________________。 (3)为提高香树脂醇合酶催化效率，将编码第240位脯氨酸或第243位苯丙氨酸的碱基序列替换为编码丙氨酸的碱基序列，丙氨酸的密码子有GCA等。a是诱变第240位脯氨酸编码序列的引物(GCA为诱变序列)，b、c、d其中一条是诱变第243位苯丙氨酸的引物，其配对模板与a的配对模板相同。据此分析，丙氨酸的密码子除GCA外，还有________。 a：5′－…GCA/CCC/GAG/TTC/TGG/CTG/TTT/CCC/TCT/TTC/TTC…－3′ b：5′－…GAA/CTG/TGG/GAC/ACC/CTG/AAC/TAC/TTC/TCT/GAG…－3′ c：5′－…GCC/TGG/CTG/TTT/CCC/TCT/TTC/TTC/CCC/TAC/CAC…－3′ d：5′－…GAT/AAT/AAG/ATC/CGA/GAG/AAG/GCC/ATG/CGA/AAG…－3′ (4)进一步检测转基因酵母菌发酵得到的________含量并进行比较，可以选出最优的香树脂醇合酶基因的改造方案。 [解析]　(1)可以从序列数据库中查询某基因的编码序列。为保证目的基因插入质粒的启动子与终止子之间，应用SpeⅠ和XhoⅠ对质粒进行切割，但由于基因N中存在SpeⅠ的切割位点，故在设计引物时不能引入SpeⅠ的识别序列，由图1可知，XbaⅠ、SpeⅠ切割产生的黏性末端相同，故可在引物中引入XbaⅠ的识别序列来替代。已知a链为转录模板链，引物与DNA链的3′端结合，故a链的转录方向为从右向左，因此，引物2的5′端应引入XbaⅠ的识别序列，引物1的5′端应引入XhoⅠ的识别序列。连接DNA片段需要DNA连接酶。 (2)使用无菌水代替实验组的模板DNA，目的是检验PCR反应中是否有外源DNA的污染。因为实验中的重组质粒大小约为9.5 kb，而质粒pYL大小为7.2 kb，因此目的基因的大小约为2.3 kb，图2中实验组1的电泳条带数据符合目的基因的大小。 (3)结合题中信息，仔细比较b、c、d与a序列，只有c配对的模板与a相同，其中a中的GCA是诱变序列，c中的GCC是诱变序列，即GCC也是丙氨酸的密码子。 (4)转基因成功的酵母菌能表达外源香树脂醇合酶基因N，可高效生产香树脂醇，因此进一步检测转基因酵母菌发酵得到的香树脂醇含量并进行比较，可以选出最优的香树脂醇合酶基因的改造方案。 [答案]　(1)序列数据库　XhoⅠ　XbaⅠ　DNA连接酶 (2)外源DNA　1　实验中的重组质粒大小约为9.5 kb，而质粒pYL的大小为7.2 kb，因此目的基因的大小为2.3 kb左右 (3)GCC　(4)香树脂醇 4．(2024·新课标卷，35)某研究小组将纤维素酶基因(N)插入某种细菌(B1)的基因组中，构建高效降解纤维素的菌株(B2)。该小组在含有N基因的质粒中插入B1基因组的M1与M2片段；再经限制酶切割获得含N基因的片段甲，片段甲两端分别为M1与M2；利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术将片段甲插入B1的基因组，得到菌株B2。酶切位点(Ⅰ～Ⅳ)、引物(P1～P4)的结合位置、片段甲替换区如图所示，→表示引物5′→3′方向。回答下列问题。 (1)限制酶切割的化学键是____________。为保证N基因能在菌株B2中表达，在构建片段甲时，应将M1与M2片段分别插入质粒的Ⅰ和Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ酶切位点之间，原因是________________________________________________________________________________________。 (2)CRISPR/Cas9技术可以切割细菌B1基因组中与向导RNA结合的DNA。向导RNA与B1基因组DNA互补配对可以形成的碱基对有G－C和____________________。 (3)用引物P1和P2进行PCR可验证片段甲插入了细菌B1基因组，所用的模板是________________；若用该模板与引物P3和P4进行PCR，实验结果是______________。 (4)与秸秆焚烧相比，利用高效降解纤维素的细菌处理秸秆的优点是____________________ __________________________(答出2点即可)。 [解析]　由题干可得出下图 (2)RNA的碱基组成有A、U、G、C，DNA的碱基组成为A、T、G、C，向导RNA与B1基因组DNA互补配对可以形成的碱基对有G－C和C－G、A－T、U－A。 (3)用引物P1和P2进行PCR可扩增N基因，验证片段甲插入了细菌B1基因组，所用的模板是菌株B2的基因组DNA中N基因的两条链；因为P4是以细菌B1基因组DNA为模板设计的引物，故以菌株B2的基因组DNA为模板，以P3、P4为引物进行PCR，实验结果是不能扩增出DNA片段。 [答案]　(1)磷酸二酯键　片段甲含有启动子和终止子、N基因，可以确保N基因能够表达 (2)U－A、A－T (3)菌株B2的基因组DNA　无扩增产物 (4)实现废物利用，减少环境污染 命题点2　细胞工程与胚胎工程 1．植物组织培养：是指将离体的植物器官、组织或细胞等，培养在人工配制的培养基上，给予适宜的培养条件，诱导其形成完整植株的技术。 2．脱分化：在一定的激素和营养等条件的诱导下，已经分化的植物器官、组织或细胞产生愈伤组织的过程。 3．再分化：脱分化产生的愈伤组织在培养过程中重新分化成根、芽等器官的过程。 4．全能性：细胞经分裂和分化后，仍然具有产生完整生物体或分化成其他各种细胞的潜能。 5．愈伤组织：已经分化的细胞经过脱分化，失去其特有的结构和功能，转变成未分化的细胞，进而形成不定形的薄壁组织团块，称为愈伤组织。 6．植物细胞培养：在离体条件下对单个植物细胞或细胞团进行培养使其增殖的技术。 7．细胞工厂化生产：利用植物细胞培养来获得目标产物，这个过程就是细胞产物的工厂化生产。 8．植物体细胞杂交：是指将不同来源的植物体细胞，在一定条件下融合成杂种细胞，并把杂种细胞培养成新植物体的技术。 9．动物细胞培养：是指从动物体中取出相关组织，将它分散成单个细胞，然后在适宜的培养条件下，让这些细胞生长和增殖的技术。 10．原代培养：人们通常将分瓶之前的细胞培养，即动物组织经处理后的初次培养称为原代培养。 11．传代培养：将分瓶后的细胞培养称为传代培养。 12．接触抑制：当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞通常会停止分裂增殖。 13．动物细胞融合技术：就是使两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的技术。 14．动物细胞核移植技术：是将动物一个细胞的细胞核移入去核的卵母细胞中，使这个重新组合的细胞发育成新胚胎，继而发育成动物个体的技术。这种动物叫克隆动物。 15．iPS细胞：通过体外诱导(插入特定基因、特定蛋白、小分子化合物)获得的一种类似于胚胎干细胞的一类细胞。 16．胚胎工程：是指对生殖细胞、受精卵或早期胚胎细胞进行多种显微操作和处理，然后将获得的胚胎移植到雌性动物体内生产后代，以满足人类的各种需求。胚胎工程技术包括体外受精、胚胎移植和胚胎分割等。 17．卵裂：受精卵形成后即在输卵管内进行有丝分裂，开始发育。胚胎发育早期，有一段时间是在透明带内进行分裂，细胞的数量不断增加，但胚胎的总体积并不增加，这种受精卵的早期分裂称为卵裂。 18．胚胎移植：是指将通过体外受精及其他方式得到的胚胎，移植到同种的、生理状态相同的雌性动物体内，使之继续发育为新个体的技术。实质是：早期胚胎在相同生理环境条件下，空间位置的转移。 19．胚胎分割：是指采用机械方法将早期胚胎切割成2等份、4等份或8等份等，经移植获得同卵双胎或多胎的技术。 写出植物组织培养的生物学原理、一般操作流程以及注意事项。 答案：(1)原理：植物细胞的全能性。 (2)流程： → (3)注意事项：①实验中使用的培养基和所有的器械都要灭菌。接种操作必须在酒精灯火焰旁进行，并且每次使用后的器械都要灭菌。②接种时注意外植体的方向，不要倒插。③诱导愈伤组织期间一般不需要光照，在后续的培养过程中，每日需要给予适当时间和强度的光照。④植物激素中生长素/细胞分裂素比值高，利于根的分化，植物激素中生长素/细胞分裂素比值低，利于芽的分化。 写出植物体细胞杂交技术的生物学原理、一般操作流程及注意事项。 答案：(1)原理：细胞膜的流动性和细胞的全能性。 (2)操作流程： (3)注意事项：①去壁用酶：纤维素酶和果胶酶。②诱导原生质体融合方法：物理法，包括电融合法、离心法等；化学法，包括聚乙二醇(PEG)融合法、高Ca2＋—高pH融合法等。③杂种细胞需要经过植物组织培养获得杂种后代。 写出动物细胞培养原理、条件及过程。 答案：(1)原理：细胞增殖。 (2)培养条件： (3)过程： 写出单克隆抗体制备技术的生物学原理、一般操作流程和两次筛选的方法和目的。 答案：(1)原理：细胞膜流动性、免疫学原理。 (2)一般流程： (3)两次筛选：①第一次筛选通过用特定的选择培养基筛选：未融合的细胞和同种细胞融合后形成的细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能生长，从而得到杂交瘤细胞；②第二次筛选通过用96孔板进行克隆化培养和抗体检测，经多次筛选得到能产生特异性抗体的细胞群，从而得到既能分泌所需抗体又能大量增殖的杂交瘤细胞。 杂交瘤细胞的特点？单克隆抗体的特点？生物导弹的特点？ 答案：(1)杂交瘤细胞既能大量增殖，又能产生足够数量的特定抗体。 (2)单克隆抗体能准确地识别抗原的细微差异，与特定抗原发生特异性结合，并且可以大量制备。 (3)生物导弹(以抗体—药物偶联物/ADC为例)：抗体—药物偶联物(ADC)通过将细胞毒素与能特异性识别肿瘤抗原的单克隆抗体结合，实现了对肿瘤细胞的选择性杀伤，在临床上具有靶点清楚、毒副作用小等优点。 写出动物体细胞核移植技术的过程(以高产奶牛为例)。 答案： 写出什么是受精以及受精的场所，受精前精子和卵子的准备及受精过程。 答案：(1)受精：精子与卵子结合形成合子(即受精卵)的过程。 (2)场所：哺乳动物的受精在输卵管内完成。 (3)受精前准备及过程： 写出胚胎早期发育的几个阶段。 答案： 以牛为例写出胚胎移植的操作过程及意义。 答案：(1)操作过程： (2)意义：胚胎移植是早期胚胎在相同生理环境条件下空间位置的转移，能充分发挥雌性优良个体的繁殖潜力。 写出胚胎分割的意义。 答案：胚胎分割实质是动物的无性繁殖(或克隆)，可增加动物后代的数量。可用于促进优良动物品种的繁殖；为遗传学研究提供遗传性状相同的个体。胚胎移植前进行性别鉴定、遗传病筛查等，对于人工控制动物性别、动物繁育健康后代具有重要意义。 1．植物组织培养、花药离体培养 答案：植物组织培养：是利用植物细胞的全能性的原理，将离体的植物器官、组织或细胞等，经脱分化和再分化培养诱导其形成完整植株的技术。 花药离体培养：是利用植物花药(花粉)作为外植体进行植物组织培养，生成单倍体的过程。单倍体在单倍体育种工程中有重要价值。 2．植物组织培养、植物体细胞杂交 答案：植物组织培养是植物体细胞杂交中的一个环节，两种原生质体经过融合产生杂种细胞后需要经过植物组织培养诱导生成杂种植株。 3．植物组织培养、动物细胞培养 答案：植物组织培养：是利用植物细胞的全能性的原理将植物细胞培育成完整植株的技术。 动物细胞培养：是利用细胞增殖的原理进行动物细胞的扩大化培养技术。 最终产物不同，植物组织培养最终获得个体，动物细胞培养最终获得细胞。 4．植物体细胞杂交、动物细胞融合技术(在原理、酶、诱导方法、结果及应用方面比较) 答案：植物体细胞杂交技术：利用植物细胞的全能性的原理，最终获得的是杂种植株。 动物细胞融合技术：利用细胞膜流动性原理获得的是融合细胞，而非动物个体。 5．动物体细胞核移植技术、克隆 答案：动物体细胞核移植技术：是利用动物体细胞核具有全能性原理，将动物一个细胞的细胞核移入去核的卵母细胞中，使这个重组细胞发育成新胚胎，继而发育成动物个体的技术，这些个体因为遗传物质几乎相同而性状相同，被称为克隆动物，因此动物体细胞核移植技术也被称为克隆。 6．桑葚胚、囊胚、原肠胚 答案：桑葚胚：当受精卵卵裂产生的子细胞逐渐形成致密的细胞团，形似桑葚时，这时的胚胎称为桑葚胚。 囊胚：胚胎进一步发育，细胞继续分化。聚集在胚胎一端的细胞形成内细胞团，将来发育成胎儿的各种组织，而沿透明带内壁扩展和排列的细胞，称为滋养层细胞，它们将来发育成胎膜和胎盘的一部分。随着胚胎的进一步发育，胚胎的内部出现了含有液体的腔——囊胚腔，这个时期的胚胎叫作囊胚。 原肠胚：囊胚孵化后，就发育形成原肠胚。原肠胚表面的细胞层为外胚层，向内迁移的细胞形成内胚层。随着发育的进行，一部分细胞还会在内、外两个胚层之间形成中胚层。这三个胚层将逐渐分化形成各种组织、器官等。 7．试管羊、克隆羊 答案：试管羊：通过人工操作使羊的卵子在体外受精，经培养发育为早期胚胎后，再进行移植产生个体的过程。属于有性生殖。 克隆羊：是利用动物细胞核的全能性原理，通过人工操作利用动物体细胞核移植技术使重组细胞形成重构胚，经激活后通过胚胎移植使其在受体母羊体内发育为个体的过程。属于无性生殖。 1．(2025·四川卷，6)研究人员用花椰菜(BB，2n＝18)根与黑芥(CC，2n＝16)叶片分别制备原生质体，经PEG诱导融合形成杂种细胞，进一步培养获得再生植株，其中的植株N经鉴定有33条染色体。下列叙述正确的是(　　) A．两个原生质体融合形成的细胞即为杂种细胞 B．再生植株N的形成证明杂种细胞仍具有全能性 C．花椰菜和黑芥的原生质体能融合，证明两种植物间不存在生殖隔离 D．植株N的B组和C组染色体不能正常联会配对，无法产生可育配子 [解析]　两个原生质体融合形成的细胞不一定是杂种细胞，有可能是两个花椰菜原生质体融合或两个黑芥原生质体融合等，A错误；全能性是指已经分化的细胞仍然具有发育成完整个体或分化成其他各种细胞的潜能，杂种细胞经过培养形成再生植株N，这证明了杂种细胞仍具有全能性，B正确；花椰菜和黑芥是不同物种，它们之间存在生殖隔离，原生质体能融合并不能证明不存在生殖隔离，因为生殖隔离是指不同物种之间一般是不能相互交配的，即使交配成功，也不能产生可育的后代，C错误；植株N是花椰菜(BB，2n＝18)和黑芥(CC，2n＝16)二者原生质体经PEG诱导融合形成的杂种细胞培育而成(缺少一条染色体)，染色体组成是BBCC，存在同源染色体，在减数分裂时能正常联会配对，能产生可育配子，D错误。 [答案]　B 2．(2025·安徽卷，14)细胞工程技术已在生物制药和物种繁育等领域得到了广泛应用。下列关于动物细胞工程的叙述，正确的是(　　) A．从动物体内取出组织，用胰蛋白酶处理后直接培养的细胞称为传代细胞 B．将特定基因或特定蛋白导入已分化的T细胞，可将其诱导形成iPS细胞 C．将B淋巴细胞与骨髓瘤细胞混合，经诱导融合的细胞即为能分泌所需抗体的细胞 D．采用胚胎分割技术克隆动物常选用桑葚胚或囊胚，因这两个时期的细胞未发生分化 [答案]　B 3．(2025·湖北卷，6)利用犬肾细胞MDCK扩增流感病毒，生产流感疫苗，具有标准化、产量高等优点。但MDCK细胞贴壁生长的特性不利于生产规模的扩大，严重制约疫苗的生产效率。研究人员通过筛选，成功获得一种无成瘤性的(多代培养不会癌变)、可悬浮培养的MDCK细胞——XF06。下列叙述错误的是(　　) A．XF06悬浮培养可提高细胞密度，进而提升生产效率 B．细胞贴壁生长特性的改变是由于流感病毒感染 C．可采用离心技术从感染病毒的细胞裂解液中分离出流感病毒 D．采用无成瘤性细胞生产疫苗，是为了避免疫苗中有致瘤DNA的污染 [解析]　根据题意，与贴壁生长的细胞培养相比，XF06悬浮培养能更充分利用空间，提高细胞密度，从而提升生产流感疫苗的效率，A正确；根据题意不能判断出细胞贴壁特性的改变是流感病毒感染导致的，B错误；细胞裂解液中，流感病毒和其他细胞裂解物的密度、质量等性质不同，可采用离心技术从感染病毒的细胞裂解液中分离出流感病毒，C正确；根据题意可知，无成瘤性MDCK细胞经多代培养不会发生癌变，采用无成瘤性细胞生产疫苗，能避免疫苗中有致瘤DNA的污染，D正确。 [答案]　B 4．(2025·北京海淀高三一模)对人类胚胎从2细胞阶段到囊胚阶段进行细胞发育追踪，发现大多数内细胞团细胞主要来源于2细胞阶段其中一个分裂较早的细胞——细胞M。下列叙述错误的是(　　) A．2细胞阶段细胞间差异可能与基因选择性表达有关 B．胚胎发育的后期，大部分体细胞来源于细胞M C．内细胞团将来会发育成胎儿的胎盘、胎膜等结构 D．相比小鼠模型，该实验要遵循更严格的伦理要求 [答案]　C (三十九)多倍体与异源多倍体 1．由受精卵发育而来、体细胞中含有三个或三个以上染色体组的个体称为多倍体。 2．异源多倍体是指不同物种杂交产生的杂种后代经过染色体加倍形成的多倍体。常见的多倍体植物大多数属于异源多倍体，如小麦、萝卜、甘蓝等。由于异源多倍体有稀缺性、多物种特点集结性等特点，在育种方面有很高的科研和实用价值。 1.(2024·海南卷，10)多花报春(AA)和轮花报春(BB)均是二倍体植物，其中A、B分别代表两个远缘物种的1个染色体组，每个染色体组均含9条染色体。异源四倍体植物丘园报春(AABB)形成途径如图。下列有关叙述错误的是(　　) A．多花报春芽尖细胞有丝分裂后期染色体数目为36条 B．F1植株通过减数分裂可产生A、B两种配子 C．利用秋水仙素或低温处理F1幼苗，均可获得丘园报春 D．丘园报春减数分裂过程中能形成18个四分体 答案：B 解析：多花报春AA体细胞含有2×9＝18条染色体，其芽尖细胞有丝分裂后期染色体数目为18×2＝36条，A正确；A、B分别代表两个远缘物种的1个染色体组，F1植株中不含同源染色体，不能正常联会产生配子，B错误；利用秋水仙素或低温处理F1幼苗，均可使其染色体加倍，获得丘园报春，C正确；丘园报春为异源四倍体，含有36条染色体，减数分裂过程中能形成18个四分体，D正确。 2．(2024·黑吉辽卷，15)栽培马铃薯为同源四倍体，育性偏低。GBSS基因(显隐性基因分别表示为G和g)在直链淀粉合成中起重要作用，只有存在G基因才能产生直链淀粉。不考虑突变和染色体互换，下列叙述错误的是(　　) A．相比二倍体马铃薯，四倍体马铃薯的茎秆粗壮，块茎更大 B．选用块茎繁殖可解决马铃薯同源四倍体育性偏低问题，并保持优良性状 C．Gggg个体产生的次级精母细胞中均含有1个或2个G基因 D．若同源染色体两两联会，GGgg个体自交，子代中产直链淀粉的个体占35/36 答案：C 解析：相比二倍体马铃薯，四倍体马铃薯的茎秆粗壮，块茎更大，所含的营养物质也更多，A正确；植物可进行无性繁殖，可保持母本的优良性状，选用块茎繁殖可解决马铃薯同源四倍体育性偏低问题，并保持优良性状，B正确；Gggg细胞复制之后为GGgggggg，减数分裂Ⅰ后期同源染色体分离，非同源染色体自由组合，故Gggg个体产生的次级精母细胞含有2个或0个G基因，C错误；若同源染色体两两联会，GGgg个体自交，GGgg产生的配子为1/6GG、4/6Gg、1/6gg，只有存在G基因才能产生直链淀粉，故子代中产直链淀粉的个体占1－1/6×1/6＝35/36，D正确。 3．(2024·福建卷，7)中国水仙是一种三倍体观赏花卉。传统生产采用分球茎繁殖方式，不仅周期长、产率低、花色单调，还易积累病毒。下列措施无法达到改良目的的是(　　) A．用水仙鳞片进行植物组织培养以提高产率 B．利用单倍体育种对中国水仙进行品种选育 C．选用水仙幼嫩组织作为外植体获得脱毒苗 D．通过基因工程技术引入外源基因改变花色 答案：B 解析：用水仙鳞片进行植物组织培养可以在短期内得到大量植株，可以提高产率，A正确；中国水仙是一种三倍体观赏花卉，其在形成配子时联会紊乱，不能形成正常的配子，不能进行单倍体育种，B错误；幼嫩组织几乎不含病毒，可选用水仙幼嫩组织作为外植体获得脱毒苗，C正确；生物的性状受基因的控制，可通过基因工程技术引入外源基因改变花色，D正确。 4．(2025·北京朝阳二模)育种工作者将异源多倍体小麦的抗叶锈病基因转移到普通小麦，流程如图。图中A、B、C、D表示4个不同的染色体组，每组有7条染色体，C染色体组中含携带抗病基因的染色体。 下列分析不正确的是(　　) A．异源多倍体AABBCC的培育一定要用秋水仙素加倍处理 B．杂交后代①的染色体组成为AABBCD，含有42条染色体 C．通过病菌接种实验处理杂交后代②可以筛选出杂交后代③ D．射线照射利于含抗病基因的染色体片段转接到小麦染色体上 答案：A 解析：异源多倍体AABBCC的培育也可以采用两种植物AABB与CC通过植物体细胞杂交的方法获得，A错误；杂交后代①由异源多倍体AABBCC与普通小麦AABBDD杂交获得，染色体组成为AABBCD，含有6个染色体组，每组有7条染色体，含有42条染色体，B正确；杂交后代③含有带抗病基因的染色体，有抗病性状，因此通过病菌接种实验处理杂交后代②可以筛选出杂交后代③，C正确；射线照射可以提高突变率，有利于染色体发生结构变异，含抗病基因的染色体片段转接到小麦染色体上，D正确。 (四十)单克隆抗体、酶标抗体 1．单克隆抗体：是由单一B细胞(杂交瘤细胞)克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体。由于其独有的特征广泛应用于医学检测、治疗、科研等很多领域。 2．酶标抗体：是利用酶标抗体以检测相应抗原的一种免疫学标记技术。其基本原理是使抗原结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性，而相对应的抗体与某种酶连接成酶标抗体，既可以与固相载体表面的抗原结合，又保留了酶活性，测量时加入酶反应的底物后，底物被酶催化为有色产物，产物的量与受检抗原的量成比例，故可根据颜色深浅来定性或定量分析。酶标抗体法具有灵敏性强，特异性高，重复性好，检测速度快的特点。 1．(2024·福建卷，1)我国科研团队研制出全球首个以尿液中的抗原为靶标的戊肝诊断试剂盒，该成果属于单克隆抗体在临床上的应用。下列叙述错误的是(　　) A．该试剂盒的研制过程应用了动物细胞融合技术 B．该试剂盒的检测原理为抗原抗体的特异性结合 C．该试剂盒检测前的采样不会对受检者造成创伤 D．该试剂盒还可用于其他类型病毒性肝炎的检测 答案：D 解析：依据题干信息，戊肝诊断试剂盒属于单克隆抗体的研究成果，单克隆抗体制备过程需要已免疫的B淋巴细胞与骨髓瘤细胞的融合，所以应用了动物细胞融合技术，A正确；该试剂盒的检测原理为抗原抗体的特异性结合，B正确；依据题干信息，该试剂盒以尿液中的抗原为靶标，所以该试剂盒检测前的采样不会对受检者造成创伤，C正确；抗体具有特异性，所以戊肝诊断试剂盒只能用于戊肝的检测，不能用于其他类型病毒性肝炎的检测，D错误。 2．(2025·广东汕头二模)某酶联免疫法试剂盒可用于单纯疱疹病毒的IgG抗体检测，如图是其说明书中检测原理的描述。下列叙述错误的是(　　) 酶联免疫检测原理：将已知抗原固定在试剂盒中的载体上，IgG抗体与该抗原结合后，再与酶标记抗体结合，酶标抗体中的酶催化某种显色物质发生显色(阳性)反应 A．酶标记抗体中的酶所催化底物不一定是蛋白质 B．血浆中待测抗体的含量对显色的深浅产生影响 C．若血清检测为阳性提示曾感染过单纯疱疹病毒 D．阴性结果时发生固定抗原与酶标抗体特异结合 答案：D 解析：酶具有专一性，酶标记抗体中的酶所催化的底物由该酶的性质决定，不一定是蛋白质，A正确；血浆中待测抗体(IgG抗体)含量越多，与固定抗原结合的量越多，进而结合的酶标记抗体也越多，酶催化显色物质显色就越深，所以血浆中待测抗体的含量对显色的深浅产生影响，B正确；若血清检测为阳性，说明血清中有与单纯疱疹病毒抗原结合的IgG抗体，IgG抗体的产生是机体曾感染过单纯疱疹病毒引发免疫反应的结果，提示曾感染过单纯疱疹病毒，C正确；根据检测原理，阴性结果时说明血清中没有与固定抗原结合的IgG抗体，也就不会发生酶标抗体与固定抗原通过IgG抗体的间接结合，即不会发生固定抗原与酶标抗体特异结合，D错误。 3．(2025·广东一模)噬菌体展示技术是将外源蛋白或多肽的DNA序列插入噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，使外源基因随噬菌体外壳蛋白的表达而表达，同时，外源蛋白或多肽随噬菌体的重新组装而展示到噬菌体表面的生物技术。利用该技术可以获得单克隆抗体(最新技术)。请回答下列问题： (1)传统单克隆抗体的获得需先对小鼠进行____________________________处理，整个过程中涉及的现代科学技术有____________________________________。 (2)外源DNA片段含________个游离的磷酸。为了得到大量的外源DNA，可使用PCR技术进行体外扩增，合成引物________(填“需要”或“不需要”)知道整个外源DNA序列。 (3)噬菌体展示技术获得的抗体还可用于定量检测抗原，如双抗体夹心法，具体原理如下图所示： 分析上图可知，固相抗体和酶标抗体均能与抗原结合，这是由于不同抗体可与同一抗原表面的____________结合。该检测方法中，酶标抗体的作用是_____________________________ _________，可通过测定产物量来推测抗原量。 (4)试说说噬菌体展示技术可能的局限性：__________________________________________ ________________________________________。 答案：(1)注射特定的抗原蛋白(免疫)　动物细胞培养、动物细胞融合 (2)2　不需要 (3)不同部位　与待测抗原结合，催化特定底物生成相应产物 (4)不能展示对噬菌体或宿主细胞有毒的蛋白质，噬菌体的蛋白质无法被内质网和高尔基体等加工 解析：(1)传统单克隆抗体的获得需先对小鼠进行注射特定的抗原蛋白(免疫)处理，使其产生已免疫的B淋巴细胞，整个过程中涉及的现代科学技术有动物细胞融合(已免疫的B细胞和骨髓瘤细胞融合)、动物细胞培养(体内培养和体外培养)。 (2)每个DNA分子的每条单链上各有一个游离的磷酸基团，因此外源DNA片段含2个游离的磷酸。 (3)抗体与抗原的结合具有特异性，因此不同抗体可与同一抗原表面的不同部位结合。由于抗体具有特异性，因此该检测方法中，酶标抗体的作用是与待测抗原结合，酶催化特定底物生成相应产物，可通过测定产物量来推测抗原量。 (四十一)启动子和报告基因 1．启动子是一段有特殊序列结构的DNA片段，位于基因的上游，紧挨转录的起始位点，是RNA聚合酶识别和结合的部位。 (1)组成型启动子：驱动基因在所有细胞、组织和器官中持续表达，活性不受时空限制。调控基因表达，一般来自管家基因。 (2)组织特异型启动子：调控基因仅在特定组织或发育阶段表达，如乳腺生物反应器需使用乳腺组织特异性启动子(如乳清蛋白基因启动子)。 (3)诱导型启动子：受外界信号(如光、盐、激素)调控启动转录，例如盐诱导型启动子可增强作物抗逆性。即有诱导物存在时，可以激活或抑制目的基因的表达。 2．报告基因是分子生物学研究中用于追踪基因表达活动的工具性基因，报告基因编码可被快速识别的蛋白质或酶(如荧光素酶、绿色荧光蛋白等)，其产物具备低成本、高灵敏度的检测特性，通常将其编码序列与目的基因或调控序列(如启动子、增强子)融合，在宿主细胞内共表达，通过检测报告产物间接反映目标基因的时空表达特征。 1．SplitFAST报告基因系统是将FAST蛋白拆分为两个独立原件：FAST蛋白N端(N－FAST)和FAST蛋白C端(C－FAST)，将可能有相互作用的目的蛋白(X或Y)分别与两个独立原件融合，如图所示。下列分析正确的是(　　) A．N－FAST和C－FAST一定是对FAST蛋白直接进行拆分获得 B．N－FAST和C－FAST结合导致蛋白X和Y的结合 C．荧光剂与蛋白X和Y结合后会显示荧光 D．该系统可以筛选能够阻断两种蛋白之间相互作用的因子 答案：D 解析：虽然系统是将FAST蛋白拆分为N－FAST和C－FAST，但不一定是直接对FAST蛋白进行拆分获得的，有可能是通过基因工程等手段，先获取相关基因片段，再表达得到对应的蛋白片段，A错误；从原理上来说，是蛋白X和Y结合后，使得与之融合的N－FAST和C－FAST靠近结合，而不是N－FAST和C－FAST结合导致蛋白X和Y的结合，B错误；由图可知，是当X和Y结合后，N－FAST和C－FAST靠近结合，荧光剂才会显示荧光，而不是荧光剂与蛋白X和Y结合后显示荧光，C错误；如果加入某些因子后，原本能相互作用的蛋白X和Y不再相互作用，那么与之融合的N－FAST和C－FAST也不会靠近结合，荧光剂就不会显示荧光，所以可以通过荧光是否显示来筛选能够阻断两种蛋白之间相互作用的因子，D正确。 2．(2025·广东卷，21)大肠杆菌是重要工业菌株之一，其培养过程可分为快速生长期和生长稳定期两个阶段。为了通过调节蛋白质合成与降解速率来动态调控代谢途径关键酶的蛋白量，使细胞适配不同阶段的生产需求，研究者设计了两种质粒，并以稳定性好的红色荧光蛋白mKate2为模式蛋白，测试质粒功能。回答下列问题： (1)研究者首先构建质粒①(图a)用于在细胞内表达C­末端带SsrA短肽的mKate2，将质粒导入感受态细胞后，在添加抗生素的选择培养基上培养。根据培养基上菌落的生长状况，结合PCR及________检测，筛选获得重组菌株W1。 (2)将W1在适宜条件下进行摇瓶培养，定时取样检测培养液中细胞密度，方法有________________(答一种)。接种前需检测液体培养基的荧光强度，其作用是___________ _______________________________。培养结果(图b)表明，进入生长稳定期后荧光强度快速下降，原因是________________________________________________________。 (3)研究者选用启动子PX、X基因(编码阻遏蛋白X，阻遏PX开启转录)，重新构建质粒②(图a)，导入野生型大肠杆菌中获得重组菌株W2。在适宜条件下摇瓶培养，W2的生长趋势不变，培养期间荧光强度的变化趋势为__________________________________________________。 (4)莽草酸是一种重要工业化学品，其胞内合成代谢途径见图c。由于野生型大肠杆菌胞内酶A活性弱，且莽草酸会被快速转化为细胞生长必需物，因此细胞中无法大量积累莽草酸。为了保证细胞正常生长，并在生长稳定期实现莽草酸的大量积累，利用上述两种质粒的调控功能，结合野生型菌株遗传物质的改造，提出重组生产菌株构建思路：___________________ _______________________________________________________________________。 答案：(1)荧光　(2)稀释涂布平板法、显微镜直接计数法　排除培养基本身荧光对实验结果的干扰　PGeo在生长稳定期停止基因转录，且带有SsrA短肽的mKate2被降解 (3)快速生长期无荧光，生长稳定期荧光强度逐渐增强 (4)先敲除野生菌株中的酶B基因，再将质粒①中的mKate2基因替换为酶B基因，将质粒②中的mKate2基因替换为酶A基因，并将两种质粒导入野生菌株中 解析：(3)在重组菌株W2中，启动子PX被阻遏蛋白X阻遏转录。在细胞快速生长阶段，阻遏蛋白X阻遏mKate2基因的表达；随着细胞进入生长稳定期，阻遏蛋白X停止表达并被降解，对PX启动子的阻遏作用降低，mKate2基因开始表达，荧光强度开始上升，所以培养期间荧光强度的变化趋势为快速生长期无荧光，生长稳定期荧光强度逐渐增强。 (4)为了保证细胞正常生长，并在生长稳定期实现莽草酸的大量积累，利用上述两种质粒的调控功能，结合野生型菌株遗传物质的改造，提出重组生产菌株构建思路是：首先对野生型大肠杆菌进行改造，敲除酶B基因；然后将质粒①中的mKate2基因替换为酶B基因，使相关代谢途径关键酶在快速生长期正常表达以保证细胞正常生长，进入生长稳定期后该酶降解，减少对莽草酸的转化；同时将质粒②中的mKate2基因替换为酶A基因，利用其调控机制在生长稳定期实现莽草酸合成相关基因的稳定表达，从而大量积累莽草酸，最后将两种质粒导入野生菌株。 3．(2025·广东广州高三上阶段练习)近年来，光作为一种基因表达诱导物，可以精准调控基因表达，在基因编辑领域和糖尿病精准治疗领域有重大突破。其中科学家开发出一种光诱导基因表达的模式，如图所示。 利用该模式科学家研究精准治疗糖尿病模型小鼠。 (1)首先利用PCR技术扩增胰岛素基因，已知该基因编码区其中一条链的序列为 5′－AGCCCTCC……GAACCAGC－3′，下列可选用的一对引物是________。 A．5′－CCTCCCCA－3′ B．5′－AGCCCTCC－3′ C．5′－GCTGGTTC－3′ D．5′－GABCCAGC－3′ (2)然后将目的基因与蓝光诱导型启动子结合，构建光诱导基因表达元件。若将该元件与质粒结合构建基因表达载体，需进一步PCR扩增该元件，此时需在引物的________端(填“3′”或“5′”)添加限制酶识别位点。 (3)将上述(2)中基因表达载体导入模型小鼠后，若要降低该小鼠血糖，需给予的外部条件是________。实验结果表明由于蓝光穿透性不好，所以血糖下降不明显。科学家发现某发光底物F(无毒性，可被小鼠直接吸收)可在荧光素酶(小鼠体内无此酶)的作用下发出蓝光，请写出继续利用转基因技术帮助模型小鼠更好的降低血糖的措施___________________________ ___________________________。 (4)为更好的解决蓝光穿透性差的问题，科学家发现远红光穿透性强，且在红假单胞菌中找到可感应远红光的蛋白R和蛋白S，在远红光下两者结合。利用此原理，科学家构建了3种新的表达载体，如下图所示。已知3种表达载体利用了3种启动子，分别是：远红光诱导型启动子1、持续表达型启动子2、RNA聚合酶T特异性诱导型启动子3。 资料1：表达载体1中基因A、基因R表达可形成完整肽段；表达载体2中基因S、基因A′表达可形成完整肽段。 资料2：某些蛋白质相互作用机制如下图所示。 资料3：蛋白A和蛋白A′结合时可形成RNA聚合酶T。利用此方法降低血糖的机理是__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。 答案：(1)BC　(2)5′ (3)蓝光照射　将荧光素酶基因导入小鼠染色体上，然后口服发光底物F (4)持续表达型启动子2驱动下S基因和A′基因表达形成S－A′完整肽段，只有在远红光的照射下，远红光诱导型启动子1驱动A基因和R基因表达产生A－R完整肽段，在R蛋白和S蛋白作用下，使A、A′结合形成RNA聚合酶T，使特异性诱导型启动子3驱动胰岛素基因表达，合成胰岛素，使血糖降低，从而达到治疗效果 解析：(1)基因编码区其中一条链的序列为5′－AGCCCTCC……GAACCAGC－3′，另一条链的序列为3′－TCGGGAGG……CTTGGTCG－5′；引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸，与基因的3′端碱基互补配对，从基因的两端向中间扩增，可知选用的一对引物是5′－AGCCCTCC－3′，5′－GCTGGTTC－3′，故选B、C。 (2)引物引导子链从5′端向3′端延伸，需在引物的5′端添加限制酶识别位点。 (3)题干信息：光作为一种基因表达诱导物，可以精准调控基因表达；将上述(2)中基因表达载体导入模型小鼠后，若要降低该小鼠血糖，需给予的外部条件是蓝光照射。由于发光底物F(无毒性，可被小鼠直接吸收)可在荧光素酶(小鼠体内无此酶)的作用下发出蓝光，可以将荧光素酶基因导入小鼠染色体上，然后口服发光底物F，从而帮助模型小鼠更好的降低血糖。 (4)分析题图及资料信息可知，降低血糖的机理是持续表达型启动子2驱动下S基因和A′基因持续表达形成S－A′完整肽段。而只有在远红光的照射下，远红光诱导型启动子1驱动A基因和R基因表达产生A－R完整肽段，所以在远红照射时，体内存在R蛋白和S蛋白，在R蛋白和S蛋白作用下，使A、A′结合形成RNA聚合酶T，使特异性诱导型启动子3驱动胰岛素基因表达，合成胰岛素，使血糖降低，从而达到治疗效果。使胰岛素的合成受远红光照射的调节。 (四十二)PCR扩增和扩增产物凝胶电泳 1．PCR(聚合酶链式反应)：是一种用于在实验室中扩增DNA片段的技术。 (1)PCR引物的定义和作用 定义：一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。 作用：引物使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸(DNA聚合酶不具有从头合成子链的功能)。 (2)PCR引物的选择和设计 ①引物需位于目的基因两侧，且能顺利扩增出目的基因。 ②引物只能与母链的3′端结合，引导子链从5′端向3′端延伸。 ③引物长度通常为20～30个核苷酸，自身不能碱基互补配对。 ④构建基因表达载体时，载体上目的基因插入位点的限制酶识别序列不能出现在目的基因内部。 ⑤如果目的基因两侧没有与载体相同的酶切位点，可通过PCR技术在两个引物的5′端添加对应的酶切位点。构建重组DNA分子通常采用双酶切法，因此两个引物5′端分别添加不同的酶切位点。 (3)PCR种类及原理 ①普通PCR(聚合酶链式反应)：通过高温变性(90 ℃以上)、低温复性(50 ℃左右)和适温延伸(72 ℃)的循环，扩增特定DNA片段。依赖Taq DNA聚合酶，每轮循环使目标DNA数量倍增。广泛用于DNA克隆、法医鉴定和古生物分析等，需通过凝胶电泳对产物定性检测。 ②实时荧光定量PCR(qPCR/Real－Time PCR)：实时荧光定量PCR的原理是在PCR反应体系中加入引物的同时，加入与某条模板链互补的荧光探针，其两端有荧光分子和淬灭剂(R为荧光分子，Q为淬灭剂)，当探针完整时，由于R和Q距离近，R不发出荧光。 在PCR中，当Taq酶催化子链延伸至探针处，与目的基因结合的探针被Taq酶(Taq酶具有外切酶活性，延伸时可水解模板上的阻断物)水解，R与Q分离，R即可发出荧光(如图1)。每扩增一次，就有一个荧光分子生成。将荧光检测系统接收到荧光信号的强度绘制成一条曲线，即扩增曲线(如图2)。 ③逆转录PCR(RT－PCR)：RT－PCR是将RNA的反转录(RT)和cDNA的聚合酶链式扩增(PCR)相结合的技术。首先经反转录酶的作用，从RNA合成cDNA，再以cDNA为模板，在DNA聚合酶作用下扩增合成目的片段。RT－PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平、细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。 ④巢式PCR：巢式PCR是一种变异的聚合酶链反应(PCR)，使用两对(而非一对)PCR引物扩增完整的片段。第一对PCR引物扩增片段和普通PCR相似。第二对引物称为巢式引物(因为他们在第一次PCR扩增片段的内部)结合在第一次PCR产物内部，使得第二次PCR扩增片段短于第一次扩增(如图)。 如果第一对引物(外引物)由于引物错配扩增出了非特异性产物，第二次能在错误片段上进行引物配对并扩增的概率极低，所以通过第二对引物的扩增，PCR的特异性得到了提升。进行两轮PCR的另一个好处是这种方法有助于从有限的起始DNA中扩增得到足量的产物。 ⑤反向PCR：可扩增一段已知序列的两端未知序列(PCR只能扩增两端序列已知的基因片段)。扩增前先用限制性内切酶酶切样品DNA，然后用DNA连接酶连接成一个环状DNA分子，通过反向PCR扩增引物的上游片段和下游片段(如图)。 2．琼脂糖凝胶电泳：PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷，在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。 1．(2025·江苏一模)下列关于PCR的叙述错误的是(　　) A．用PCR方法扩增目的基因时需要知道基因的部分序列 B．设计的引物序列必须全部能够和模板DNA碱基互补 C．复性温度过高可能导致PCR反应得不到任何扩增产物 D．第四轮循环产物中含有两种引物的DNA片段所占比例为7/8 答案：B 解析：用PCR方法扩增目的基因时不必知道基因的全部序列，只需要知道一段已知目的基因的核苷酸序列，从而根据这段序列合成引物，A正确；设计引物时需要避免引物之间形成碱基互补配对而造成引物自连，不需全部能够和模板DNA碱基互补，B错误；复性的目的是引物与模板DNA结合，故复性温度过高可能导致引物与模板DNA不能结合，因而使得PCR反应得不到任何扩增产物，C正确；DNA复制为半保留复制，DNA复制n次，共形成2n个DNA，其中两个DNA含有母链和子链(含引物A或引物B)，(2n－2)个DNA都含有子链(含有引物A和引物B)，第四轮循环即DNA复制4次，共形成16个DNA，产物中同时含有引物A和引物B的DNA片段所占的比例为14/16＝7/8，D正确。 2．科研人员在常规PCR基础上发展出同时检测多种病原体的多重PCR技术，检测原理(a、b)及结果(c)如下图。下列叙述错误的是(　　) A．需要针对不同病原体设计特异性引物和荧光探针 B．图b是PCR反应的复性过程 C．多重PCR同时完成对4种病原体的检测 D．由结果推测该检测样品中有A病原体的核酸 答案：B 解析：不同的病原体的碱基序列是不同的，因此需要根据病原体的碱基序列设计不同的特异性引物和荧光探针，A正确；图b是PCR反应的延伸过程，该过程中发生合成子链的过程，B错误；科研人员在常规PCR基础上发展出同时检测多种病原体的多重PCR技术，由图c可知，多重PCR同时完成对(A、B、C、D)4种病原体的检测，实验组中B、C、D的剩余探针荧光强度与阴性对照组相似，说明该检测样品中没有B、C、D病原体的核酸，实验组中A的剩余探针荧光强度与阴性对照组不同，说明该检测样品中有A病原体的核酸，C、D正确。 3．(2025·辽宁本溪高三开学考)如图所示，在一段未知序列的突变体DNA片段中，插入了已知序列的T－DNA，要想对T－DNA两侧的未知序列进行测序，下列做法正确的是(　　) A．用引物①和引物④直接进行PCR扩增之后再测序 B．用引物②和引物③直接进行PCR扩增之后再测序 C．用DNA连接酶连接成环状后，再用引物①④PCR扩增后测序 D．用DNA连接酶连接成环状后，再用引物②③PCR扩增后测序 答案：C 解析：直接选用引物①④组合进行PCR扩增，引物选择方向相反，无法完成扩增，A错误；用引物②和引物③可实现对已知的T－DNA序列进行扩增，达不到预期目的，B、D错误；用DNA连接酶连接成环状后，由于DNA两条链反向平行，且子链从引物的3′开始延伸，故用引物①④PCR扩增后测序，恰好可扩增出T－DNA两侧的未知序列，C正确。 4．某种二倍体植物的P1和P2植株杂交得F1，F1自交得F2。对个体的DNA进行PCR检测，产物的电泳结果如图所示，其中①～⑧为部分F2个体，框中上边2个条带是一对等位基因的扩增产物，下边2个条带是另一对等位基因的扩增产物，这2对等位基因位于非同源染色体上。下列叙述正确的是(　　) A．①②个体均为杂合体，F2中③所占的比例小于⑤ B．还有一种F2个体的PCR产物电泳结果有3条带 C．③和⑦杂交子代的PCR产物电泳结果与②⑧电泳结果不同 D．①自交子代的PCR产物电泳结果与④电泳结果相同的占1/2 答案：B 解析：由题可知，这2对等位基因位于非同源染色体上，隐含条件是这2对等位基因独立遗传。假设A、a分别为上部两条带的等位基因，B、b分别为下部两条带的等位基因，由电泳图可知P1基因型为AAbb，P2基因型为aaBB，F1基因型为AaBb，F2中①(AaBB)、②(Aabb)都为杂合子，③(AABb)占F2的比例为1/8，⑤(AABB)占F2的比例为1/16，A错误；电泳图中的F1的基因型由①到⑧依次为：AaBB、Aabb、AABb、aaBB、AABB、AAbb、aabb、AaBb，未出现的基因型为aaBb，其个体PCR产物电泳结果有3条带，B正确；③(AABb)和⑦(aabb)杂交子代基因型为Aabb、AaBb，其PCR产物电泳结果与②⑧电泳结果相同，C错误；①(AaBB)自交子代基因型及所占比例为1/4AABB、1/2AaBB、1/4aaBB，其PCR产物电泳结果与④(aaBB)电泳结果相同的占1/4，D错误。 5．重叠延伸PCR技术是采用具有互补末端的引物，使PCR产物形成重叠链，从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸，获得想要的目的基因。某科研团队运用重叠延伸PCR技术在水蛭素基因的特定位点引入特定突变，以实现基因的定点突变，原理如图。下列说法错误的是(　　) A．过程②需要含Mg2＋的缓冲液、DNA模板、引物、四种脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶等 B．若引物2的突变位点设计为A，则引物3的突变位点应设计为G C．经过过程④获得的杂交DNA有2种，其中只有一种可以经过过程⑤获得目的基因 D．以过程⑤获得的目的基因为模板，可以使用引物1和引物4进行PCR 答案：B 解析：过程①为PCR反应，需要在添加Mg2＋的缓冲液中才能进行，需提供模板DNA、分别与两条模板链结合的引物、4种脱氧核苷酸和耐高温的DNA聚合酶等，A正确；结合题图，若引物2的突变位点设计为A，则目的是让基因中的碱基对A—T突变为T—A，由图可看出，步骤④获得的杂交DNA，一条链与引物2互补，另一条链与引物3互补，所以引物2和引物3的序列互补，引物3的突变位点应设计为T，B错误；过程④获得的杂交DNA有2种，一种3′端为单链，一种5′端为单链，由于DNA复制时以DNA母链为模板，子链延伸方向为5′端→3′端，则5′端为单链的杂交DNA可经过程⑤获得目的基因，C正确；过程⑤获得的目的基因一条链一端能与引物1互补，另一条链一端能与引物4互补，因此可以使用引物1和引物4进行PCR，D正确。 6．(2024·黑吉辽卷，7)关于采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物的实验，下列叙述正确的是(　　) A．琼脂糖凝胶浓度的选择需考虑待分离DNA片段的大小 B．凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示DNA分子的具体位置 C．在同一电场作用下，DNA片段越长，向负极迁移速率越快 D．琼脂糖凝胶中的DNA分子可在紫光灯下被检测出来 答案：A 解析：凝胶载样缓冲液中指示剂只是指示电泳进度，当指示剂前沿接近凝胶边缘时，则停止电泳，它不能指示DNA分子的具体位置，B错误；在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关，在同一电场作用下，DNA片段越长，DNA向其所带电荷相反的电极迁移的速率越慢，C错误；琼脂糖凝胶中的DNA分子与其中的核酸染料结合后，可在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来，D错误。 (四十三)同源切割、CRISPR/Cas9(基因编辑)、基因沉默、基因敲除 1．同源切割：是一种基因操作技术，通过利用DNA序列间的同源性，在无需传统限制性内切酶和DNA连接酶的条件下，实现目的基因与载体的定向整合或替换。当目的基因两侧的小段序列与基因表达载体上某序列相同时，就可以发生同源切割，将目的基因直接插入。 2．CRISPR/Cas9：是一种源自细菌天然免疫系统的基因编辑工具，通过靶向切割DNA双链实现基因组的精确修饰。CRISPR－Cas9通过诱导DNA双链断裂触发细胞修复机制，而同源切割利用同源模板实现精准基因编辑，两者的结合实现了“靶向切割＋定向修复”的闭环基因操作。 3．基因沉默：是指通过特定的分子机制抑制基因的表达，使其无法正常转录成mRNA或翻译成蛋白质，但不改变DNA序列本身。基因沉默可以通过多种方式实现，包括DNA甲基化、组蛋白修饰(如H3K9甲基化)、RNA干扰(如miRNA介导的沉默)等。这些机制通常会导致染色质结构的变化，阻碍转录因子接近DNA模板，或者导致mRNA被降解，从而阻止蛋白质的合成。 4．基因敲除：是指利用基因编辑技术(如CRISPR/Cas9系统、TALENs、ZFNs等)直接删除或破坏目标基因的一部分或全部DNA序列，从而永久性地消除该基因的功能。基因敲除技术依赖于精确的DNA切割能力和细胞自身的修复机制。当目标基因被切割后，细胞会尝试修复这一损伤，可能导致基因片段的缺失、插入或替换，进而使基因失活。 1．(2025·山东德州模拟)CRISPR/Cas9基因编辑技术能对基因进行定点编辑，其原理如图1所示。科研人员根据猪的细胞表面抗原基因RAG1的启动子设计了sgRNA1和sgRNA2，并利用CRISPR/Cas9基因编辑技术获得了两种基因敲除猪，检测基因敲除猪体内的RAG1基因表达情况如图2所示。下列说法错误的是(　　) A．CRISPR/Cas9识别目标DNA序列主要与sgRNA序列的特异性相关 B．基因敲除猪的细胞表面抗原减少，器官移植过程中免疫排斥作用减弱 C．两种sgRNA都可引导Cas9在转录水平上减弱RAG1基因的表达 D．据图2可知，用sgRNA2制备的基因敲除猪用于器官移植效果更好 答案：D 解析：CRISPR/Cas9识别目标DNA序列主要与sgRNA编码序列有关，即主要与sgRNA序列的特异性相关，A正确；猪的细胞表面抗原会导致器官移植时发生免疫排斥，基因敲除猪的细胞表面抗原减少，器官移植过程中免疫排斥作用减弱，提高器官移植的成功率，B正确；转录是以DNA的一条链为模板合成RNA的过程，启动子是RNA聚合酶识别与结合的位点，用于驱动基因的转录，科研人员根据猪的细胞表面抗原基因RAG1的启动子设计了sgRNA1和sgRNA2，故两种sgRNA都可引导Cas9在转录水平上减弱RAG1基因的表达，C正确；据图2可知，与对照组相比，用sgRNA1制备的基因敲除猪RAG1基因表达更低，说明用sgRNA1制备的基因敲除猪用于器官移植效果更好，D错误。 2．(2025·安徽卷，20)稻瘟病是一种真菌病害，水稻叶片某些内生放线菌对该致病菌有抑制作用。科研小组分离筛选出内生放线菌，并开展了相关研究。回答下列问题。 (1)采集有病斑的水稻叶片，经表面消毒、研磨处理，制备研磨液。此后，采用______________(填方法)将研磨液接种于不同的选择培养基，分别置于不同温度下培养，目的是____________________________________。 (2)经筛选获得一株内生放线菌，该菌株高效合成铁载体小分子，能辅助内生放线菌吸收铁离子。R基因是合成铁载体的关键基因之一。科研小组构建R基因敲除株，探究铁载体的功能。主要步骤如下：首先克隆R基因的上游片段R－U和下游片段R－D；然后构建重组质粒；最后利用重组质粒和内生放线菌DNA片段中同源区段可发生交换的原理，对目标基因进行敲除。如图1所示。 说明：用图1中的引物1和2进行PCR扩增。 采用PCR技术鉴定R基因的敲除结果。PCR通过变性、复性和延伸三步，反复循环，可实现基因片段的________。R基因敲除过程中，可发生多种形式的同源区段交换，PCR检测结果如图2所示，其中R基因敲除株为菌落______(填序号)，出现菌落④的可能原因是________________________________________________________________。 (3)内生放线菌和稻瘟病致病菌的生长均需要铁元素。科研小组推测该内生放线菌通过对铁离子的竞争性利用，从而抑制稻瘟病致病菌生长。设计实验验证该推测，简要写出实验思路。 答案：(1)稀释涂布平板法　筛选出不同条件下的内生放线菌 (2)扩增　②　重组质粒和内生放线菌R基因组合在一起，形成了7000 bp的DNA片段 (3)实验分2组进行，甲组是内生放线菌＋稻瘟病致病菌＋含Fe培养基；乙组是R基因敲除放线菌＋稻瘟病致病菌＋含Fe培养基，在相同且适宜条件下培养一段时间，观察致病菌的生长情况。(其他答案合理即可) 解析：(1)研磨液里含有内生放线菌，可用稀释涂布平板法将研磨液接种于不同的选择培养基上进行筛选。经过一段时间培养后，在适宜的温度下，可以形成内生放线菌的菌落，从而分离纯化出内生放线菌。 (2)PCR的原理是体外DNA半保留复制，可实现基因片段的大量扩增。由图1可知，未发生同源重组前，在引物1、2的作用下可扩增出的片段为3000 bp，故菌落①③未发生同源重组。若R－U和R－D都发生同源重组，则会减少R基因中间的2000 bp的序列，从而使扩增的片段减小到1000 bp，故菌落②为发生同源重组后的R基因敲除株。根据题干信息，R基因敲除过程中可发生多种形式的同源区段交换，菌落④的大小约为7000 bp，正好是重组质粒(4000 bp)和R基因(3000 bp)的总和，则可以推测在同源重组过程中，只发生了R－U或R－D一处同源重组，导致整个质粒片段接入。 (3)若要验证内生放线菌通过与稻瘟病致病菌竞争性利用铁离子抑制稻瘟病致病菌的生长，则实验的自变量应为内生放线菌是否能利用培养液中的铁离子，即R基因的有无，因变量应该为稻瘟病致病菌的生长情况，据此写出实验思路。 3．(2025·福建漳州高三上模拟)贝氏不动杆菌(A菌)是一种非致病性细菌，可从环境中吸收DNA并整合到自身基因组中，此过程被称为基因水平转移(HGT)。结肠癌常由KRAS基因中G12位点突变导致，可作为结肠癌检测点。科学家利用A菌的HGT能力进行结肠癌检测实验。 (1)获取转基因结肠癌细胞。 当目的基因两侧的小段序列与表达载体上某序列相同时，可通过同源切割后进行片段互换实现同源重组。将针对KRAS基因设计的表达载体导入结肠癌细胞，经同源重组，获得转基因结肠癌细胞，如图1所示。 为鉴定结肠癌细胞是否被成功转化，以________________为模板，用图1中的引物________进行PCR扩增检测，在图2中绘制成功转化的PCR产物的电泳条带。 (2)构建细菌传感器A，验证其特异性的HGT能力。 ①依据(1)中的原理，构建图3所示的表达载体，其中Ⅰ、Ⅱ分别对应的序列为________、________(填“同源区1”或“同源区2”)。将该表达载体导入A菌(不含同源区1和同源区2)中，以获得细菌传感器A。 ②将细菌传感器A与(1)中转基因结肠癌细胞裂解液混合，一段时间后，观察细菌传感器A在不同培养基中的生长情况。若实验结果为__________________________________ ____________________________________________，则证明细菌传感器A发生HGT。 (3)改造细菌传感器A，以期用于临床检测结肠癌细胞。 肿瘤细胞可将DNA释放到肠腔中，临床检测时需将细菌传感器A置于结肠处，一段时间后，通过培养、观察粪便中细菌的生长情况，以诊断待测者是否患结肠癌。为达到以上检测目的，需改造细菌传感器A，使其仅能降解正常的KRAS序列，且含图4所示的表达载体。若患有结肠癌，则细菌传感器A能在含有诱导物与卡那霉素的培养基中形成菌落，原因是________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。 答案：(1)结肠癌细胞染色体DNA　1、4　 (2)①同源区2　同源区1　②细菌传感器A能在含卡那霉素的培养基中形成菌落，不能在含壮观霉素的培养基中形成菌落 (3)肠腔中若存在含突变基因的DNA片段，不会被细菌传感器A降解，会将细菌传感器A中的KanR抑制基因替换，从而解除对卡那霉素抗性基因表达的抑制，使细菌传感器A可在同时添加诱导物与卡那霉素培养基中形成菌落 解析：(1)据图1可知，成功转化的转基因结肠癌细胞的DNA中含有KanR基因、同源区1和同源区2，为鉴定结肠癌细胞是否被成功转化，可采用PCR技术，在PCR反应过程中，每条引物结合一条模板DNA链(目的DNA)，从5′—3′方向开始扩增，所以最后扩增得到的序列就只能是在两条引物之间的序列，因此为鉴定结肠癌细胞是否被成功转化，以结肠癌细胞染色体DNA为模板，用图1中的引物1、4进行PCR扩增检测。若成功转化，由图1(表达载体)可知，同源区1和同源区2之间有2400 bp，即转化成功的PCR产物的电泳条带在标准条带2400 bp位置附近，见答案图。 (2)①图3所示表达载体应包含与目标整合位点同源区，结合图3启动子方向与图1的箭头方向可知，该过程中Ⅱ对应的应是同源区1，Ⅰ是同源区2，两者之间需要插入标记基因，图中选择了specR(壮观霉素抗性基因)。②A菌具有吸收特定DNA片段的能力，由于specR被替换，而卡那霉素抗性基因导入，故能证明细菌传感器A发生HGT的实验结果是：细菌传感器A能在含卡那霉素的培养基中形成菌落，不能在含壮观霉素的培养基中形成菌落。 (3)肿瘤细胞可将DNA释放到肠腔中，临床检测时需将细菌传感器定植于待测者结肠处，一段时间后对粪便中的细菌进行培养，由于改造后的细菌传感器A能降解正常的KRAS序列，结合图示可知，若患有结肠癌，肠腔中存在含突变基因的DNA片段，会将细菌传感器中的KanR抑制基因替换，从而解除对卡那霉素抗性基因表达的抑制，同时诱导物激活诱导型启动子，启动卡那霉素抗性基因的表达，在该培养基上细菌可以生长繁殖，使细菌传感器A可在同时添加诱导物与卡那霉素培养基中形成菌落。 (四十四)双标记与蓝白斑筛选 1．双标记 双标记基因筛选技术广泛应用于基因工程领域，核心原理在于利用两种不同筛选标记区分重组DNA与非重组DNA。比如常利用载体携带的两个不同抗生素抗性基因(如氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因)，通过插入失活和两次抗生素筛选获得转基因成功的目标细胞。 2．蓝白斑筛选 β－半乳糖苷酶显色反应选择法，即我们常说的蓝白斑筛选法，也是一种常用的检测目的基因是否导入受体细胞的方法。这种检测方法用到的载体上含有LacZ基因，其表达产物可以产生有活性的β－半乳糖苷酶，将无色的5­溴­4­氯­3­吲哚­β­D­半乳糖苷(X－gal)水解成蓝色产物。如果目的基因插入LacZ基因，重组载体转入受体细胞后就不能产生β－半乳糖苷酶，无法将X－gal水解成蓝色产物，因此在筛选平板上含有重组载体的菌落呈白色。 1．(2025·安徽卷，15)质粒K中含有β－半乳糖苷酶基因，将该质粒导入大肠杆菌细胞后，其编码的酶可分解X－gal，产生蓝色物质，进而形成蓝色菌落，如图所示。科研小组以该质粒作为载体，采用基因工程技术实现人源干扰素基因在大肠杆菌中的高效表达。下列叙述错误的是(　　) A．使用氯化钙处理大肠杆菌以提高转化效率，可增加筛选平板上白色和蓝色菌落数 B．如果筛选平板中仅含卡那霉素，生长出的白色菌落不可判定为含目的基因的菌株 C．因质粒K中含两个标记基因，筛选平板中长出的白色菌落即为表达目标蛋白的菌株 D．若筛选平板中蓝色菌落偏多，原因可能是质粒K经酶切后自身环化并导入了大肠杆菌 答案：C 解析：氯化钙处理大肠杆菌能增强其对质粒的摄取能力，使更多大肠杆菌获得质粒，提高其转化效率，若获得空载质粒(β－半乳糖苷酶基因未被破坏)，则会在筛选平板上形成蓝色菌落，若获得重组质粒(人源干扰素基因的插入会破坏β－半乳糖苷酶基因)，则会在筛选平板上形成白色菌落，因此，使用氯化钙处理可增加筛选平板上白色和蓝色菌落数，A正确；若筛选平板中仅含卡那霉素，能在上面形成白色菌落的菌可能是导入目的基因的大肠杆菌，也可能是导入空白质粒的大肠杆菌，B正确；筛选平板中长出白色菌落，只能说明菌株中导入了β－半乳糖苷酶基因被破坏的质粒，但该质粒中是否正确连接目的基因，且目的基因是否转录、翻译，是否表达出目标蛋白未知，还需要进一步鉴定，C错误；如果筛选平板上蓝色菌落明显偏多，说明大量没有插入目的基因的质粒K导入了大肠杆菌，推测原因可能是酶切后的载体发生自身环化并导入了大肠杆菌，D正确。 2．(2025·四川成都二诊)相分离是蛋白质具有的一种物理特性，是驱动细胞内各类无膜凝聚体形成的重要机制。研究人员将未知蛋白与不具有相分离特性的Cry2蛋白相连，如果未知蛋白具有相分离特性，则在蓝光照射下会发生凝聚，从而开发出检测蛋白是否有相分离特性的工具。FUS蛋白作为经典的相分离蛋白，经常用作实验对照。为了探究X蛋白是否具备相分离特性，科学家需要构建能同时表达Cry2蛋白和X蛋白的重组质粒，质粒中LacZ基因编码产生的β－半乳糖苷酶可以分解X－gal产生蓝色物质，使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色。图1表示质粒的结构，图2表示含有目的基因的DNA片段，其中P1、P2、P3表示引物，其余箭头处表示相关限制酶的识别位点。回答下列问题： (1)据图1分析，应选用四种限制酶中的__________和________切割质粒，以保证目的基因插入后能够正常表达出Cry2蛋白和X蛋白。 (2)已知X蛋白基因转录得到的mRNA前三个碱基为起始密码子AUG。研究发现在紧邻起始密码子AUG之前加入5′－GCCACC－3′序列，会显著提高基因的表达效率。利用PCR技术获取X蛋白基因时，为保证X蛋白基因能正确插入载体并高效表达，除选择引物P1外，还需要选择引物________(填“P2”或“P3”)，并在该引物5′端增加碱基序列5′－__________________－3′。 (3)通过琼脂糖凝胶电泳可将不同的DNA片段区分开来，该技术所依据的原理是__________________________________________________。对PCR产物进行电泳检测，结果显示除X蛋白基因条带外，还有多条非特异性条带(引物和模板不完全配对导致)。为减少非特异性条带的产生，可适当________(填“提高”或“降低”)PCR中复性过程的温度。 (4)为筛选出成功导入重组质粒的目标菌，需要将重组质粒与经Ca2＋处理的大肠杆菌混匀，再将大肠杆菌接种到含有四环素和X－gal的培养基上。培养一段时间后，培养基中颜色为________的菌落为目标菌落，原因是__________________________________________ __________________________________________________________。 (5)为了确认X蛋白的相分离特性，还可以构建两种重组质粒作为对照，对照组质粒与实验组质粒相比，所含基因的差异分别是______________________、____________________ ________________________。 答案：(1)MunⅠ　XhoⅠ (2)P2　GAATTCGCCACC (3)不同DNA分子的大小和构象不同，在凝胶中的迁移速率不同　提高 (4)白色　重组质粒中不含LacZ基因，不能编码产生β－半乳糖苷酶，不能分解X－gal产生蓝色物质 (5)不含X蛋白基因　用FUS蛋白基因替换X蛋白基因 解析：(1)据图可知，EcoRⅠ能将Cry2切掉，不能选用，SalⅠ位于终止子外，也不能选用，故只能选用MunⅠ和XhoⅠ切割质粒，产生不同的黏性末端，以保证目的基因插入后能够正常表达出Cry2蛋白和X蛋白。 (2)根据图中X蛋白基因的编码链的方向及质粒中启动子方向可知，需要将编码链的5′端靠近启动子，由于X蛋白基因中含有MunⅠ的酶切位点，所以不能用MunⅠ进行切割，但是EcoRⅠ与MunⅠ切割产生的黏性末端相同，所以可以在设计引物的时候添加EcoRⅠ的识别序列(5′－GAATTC－3′)，同时在紧邻起始密码子AUG之前加入5′－GCCACC－3′序列，会显著提高基因的表达效率，所以还需要选择引物P2，并在其5′端增加碱基序列5′－GAATTCGCCACC－3′。 (3)不同DNA分子的大小和构象不同，在凝胶中的迁移速率不同，所以可以通过琼脂糖凝胶电泳将不同的DNA片段区分开来；可适当提高PCR中复性过程的温度，来减少引物和模板不完全配对现象，从而减少非特异性条带的产生。 (4)分析题意可知，LacZ基因编码产生的β－半乳糖苷酶可以分解X－gal产生蓝色物质，使菌落呈现蓝色，重组质粒中导入了目的基因，切除了LacZ基因，则重组质粒中不含LacZ基因，不能编码产生β－半乳糖苷酶，不能分解X－gal产生蓝色物质，培养一段时间后，培养基中颜色为白色的菌落为目标菌落。 (5)由题意可知，对照组质粒与实验组质粒相比，不含有X蛋白基因，此外FUS蛋白作为经典的相分离蛋白，经常用作实验对照，故为了确认X蛋白的相分离特性，还可以构建两种重组质粒作为对照，对照组质粒与实验组质粒相比，所含基因的差异分别是不含X蛋白基因、用FUS蛋白基因替换X蛋白基因。 39 学科网（北京）股份有限公司 $