2025年高中生物竞赛辅导课件：植物细胞的脱分化脱分化

第11章 植物组织培养 1 提纲 植物组培的研究进展 1.植物组织培养的理论基础 1.1植物的无性繁殖 1.2植物细胞全能性理论 1.3植物细胞的脱分化与再分化 2.植物组织培养 2.1实验材料的清洗和消毒 2.2培养基 2.3接种 2.4种质保存 2.5植物细胞的大规模培养技术 思考题 组培问题 植物组织培养发展简史 1、萌芽阶段：(从20世纪初到30年代中） 1838-1839年，德国科学家Schleide 和Schwann发表了细胞学说，奠定了组织培养的理论基础。 1902年，德国植物学家Haberlandt 根据细胞学说，提出植物细胞全能性（totipotency）理论。 1904年，Hanning 最先成功地培养了萝卜和辣根菜的胚。 1922年，Knudson 采用胚培养法获得大量兰花幼苗。克服其种子发芽困难的问题。 玉米成熟胚的培养 3 Haberlandt： 观点： 贡献： 提出细胞全能性 首次进行离体细胞培养 高等植物的组织和器官可以分割成单个细胞 4 1934年，美国植物生理学家White 用番茄根尖建立起第一个活跃生长的无性繁殖系，从而使非胚器官的培养首先获得成功。 2、奠基阶段（从20世纪30年代末到50年代中） 1934年：Gautherete培养山毛杨、黑杨形成层组织产生了Callus 1937年：White发现3种B族维生素和IAA对植物生长有用 1939年：Gautherete培养胡萝卜根小外植体成功 1939年：White培养烟草种间杂种幼茎切段原形成层成功 5 组织培养的奠基人--- White 6 3、快速发展和应用阶段（从20世纪50年代末至今） 1958年，英国科学家Steward 等用胡萝卜根的愈伤组织细胞进行悬浮培养，成功诱导出胚状体并分化为完整的小植株。这是第一次实现人工体细胞胚培养，是植物组织培养的第一个突破。 1960年英国学者Cocking用酶法分离原生质体成功。这是植物组织培养的第二个突破。 1962年，Murashinge 和Skoog 在烟草培养中筛选出至今仍被广泛使用的MS培养基。 1964-1966年，印度科学家Guha 和Maheswari 在曼陀罗花药培养中首次由花粉诱导得到了单倍体植株。 1972年，Carlson 通过两个种的烟草原生质体融合培养，获得了第一个体细胞杂交的杂种植株。…… 7 野胡萝卜的胚状体 原生质体 8 单倍体育种 9 原生质体融合 10 第11章 植物组织培养 11.1 植物组织培养的理论基础 11.1.1 植物的无性繁殖 11.1.2 植物细胞全能性理论 11.1.3 植物细胞的脱分化与再分化 11.2 植物组织培养的过程 11.2.1 植物材料的清洗与消毒 11.2.2 培养基 11.2.3 接种 11.2.4 种质保存 11.2.5 植物组织和细胞的大规模培养 11 11.1植物组织培养的理论基础 植物组织培养（Tissue culture） 是指用无菌方法使植物体的离体（in vitro)器官、组织和细胞在人为提供的条件下生长和发育的所有培养技术的总称，也称之为离体培养（In vitro culture）或试管培养。 器官（organ)：根、茎、叶、花、果实、种子 组织（tissue)：花药、胚珠、胚、胚乳、形成层等 12 11.1.1植物的无性繁殖 一、有性生殖 1、有性生殖是生物界中最普遍的一种生殖方式。它是指两个性细胞两两结合形成合子，进而形成新的个体。性细胞是通过减数分裂产生的。 2、优点：其后代具有了两个亲本的遗传物质，具有更大的生活力和变异性。 13 二、无性生殖 无性生殖是不经生殖细胞的两两结合，由母体直接产生新个体的方式。从本质上讲，是由体细胞进行的繁殖就是无性生殖。 植物无性生殖的方式主要是营养生殖------ 由植物营养器官（根、茎、叶）的一部分，在与母体脱落后，发育成一个新的个体。 如马铃薯的块茎、蓟的根、秋海棠的叶 14 营养生殖 甘薯 马铃薯 15 营养生殖 用腋芽來繁殖的甘蔗 16 营养生殖 落地生根 吊 兰 大蒜 17 summary 植物中常常有性繁殖和无性繁殖共存,在有性繁殖受到破坏的时候(花被破坏)通常会选择无性繁殖. 有性繁殖使个体的基因发生变异,能更好的适应环境, 无性繁殖往往花费较少的能量,且成功机会高。 18 11.1.2 植物细胞全能性理论 定义：1902年由Haberlandt提出，即植物体细胞在适当的条件下，具有不断分裂和繁殖、发育成完整植株的能力。 20世纪80年代：每一个植物细胞具有该植物的全部遗传信息，在适当条件下可表达出该细胞的所有遗传信息，分化出植物有机体所有不同类型细胞，形成不同类型的器官甚至胚状体，直至形成完整再生植株。 19 从一个细胞发育成一个植株 20 离体细胞具有生命的特征属性，在全能性的基础上，提供合适的营养和环境条件，离体细胞经历脱分化（dedifferentiation）和再分化（redifferentiation）过程，可形成再生植物。 植物细胞全能性理论是植物组织培养的核心理论 21 11.1.3 植物细胞的脱分化与再分化 1、细胞分化（cellular differentiation）。 含义：由一个或一种细胞增殖产生的后代，在形态结构和生理功能上发生稳定性的差异的过程。 随着分化发育的进程，细胞逐渐丧失其分化潜能。从全能性到多能性，再到单能性，最后失去分化潜能成为成熟定型的细胞。 22 植物细胞的分化 23 细胞分化是组织分化和器官分化的基础，是离体培养再分化和植株再生得以实现的基础。 24 2、植物细胞的脱分化 脱分化：由高度分化的植物器官、组织或细胞在一定条件下，重新获得分裂能力，产生愈伤组织的过程，又称去分化。 或者说，离体培养条件下，一个已分化的细胞回复到原始无分化状态或分生组织细胞状态或胚性细胞的状态的过程。 25 细胞全能性 脱分化 个体再生 再分化 细胞分裂 细胞全能性的表达是通过细胞脱分化和再分化实现的，在大多数情况下，脱分化是细胞全能性表达的前提，再分化是细胞全能性表达的最终体现。 26 愈伤组织的诱导 愈伤组织：脱分化后的细胞，经过细胞分裂，产生无组织结构、无明显极性的、松散的细胞团。 愈伤组织的诱导是组培的第一步和关键步骤。 外植体 （静止细胞） 培养基 诱导 愈伤组织 (分裂细胞) 活化 细胞 27 愈伤组织的种类: 分为：胚性愈伤组织 （Embryonenic callus）和非胚性愈伤组织。 胚性愈伤组织：能形成体细胞胚的愈伤组织 。 质地较坚实，颜色有乳白色或黄色，表面具球形颗粒，其生长缓慢；从细胞学来看，胚性愈伤组织由等直径细胞组成，细胞较小，原生质浓厚，无液泡，常富含淀粉粒，核大，分裂活性强。 非胚性愈伤组织：不能分化形成体细胞胚。 资料 28 黄瓜子房组织经脱分化形成胚性愈伤组织 29 愈伤组织（callus）培养 （１）、愈伤组织的形成 在细胞脱分化过程中，大多数情况下形成愈伤组织。愈伤组织的细胞往往是异质性的，无明显极性，其形成过程可分为诱导期、分裂期和分化期。 30 形成过程（三个时期） 诱导期（起动期）：是细胞准备分裂的时期。细胞大小几乎不变，内部发生生理生化变化，迅速合成蛋白质和核酸。 分裂期：外层细胞分裂，中间细胞常不分裂，形成小芯。细胞分裂快，结构疏松，缺少结构，浅而透明。在原培养基上，细胞必分化，及时转移，其可无限制地进行细胞分裂，维持不分化状态。 分化期：细胞在形态和生理功能上的分化，出现形态和功能各异的细胞。 31 愈伤组织形态发生 （1）过程：外层细胞分裂，逐渐减慢并停止；内部较深处的细胞开始分裂，而且分裂方向也发生改变，形成微管化组织和瘤状结构。 （2）形态发生方式：器官发生和体细胞胚胎发生。 32 3、细胞的再分化与器官发生 细胞的再分化（redifferentiation) 是脱分化后的分生细胞（愈伤组织）在一定条件下，重新分化为各种类型的细胞，并进一步发育成完整植株。 33 高等植物细胞脱分化和再分化示意图 由愈伤组织再分化形成再生植株，可经过 器官发生和胚状体发生两条途径。 成熟细胞 分生细胞 愈伤组织 器官发生 胚状体发生 成熟细胞 脱分化 分裂 再分化 34 35 器官发生 植物的器官发生是指培养条件下的愈伤组织（组织或细胞团）分化形成不定根（adventitious roots）或不定芽（adventitious shoots）等器官，再进一步发育成完整植株的过程。 36 通过器官发生形成再生植株 有三种方式： 第一种方式是先芽后根(芽根在不同培养基上诱导)； 第二种方式为先根后芽(芽根在不同培养基上诱导) ； 第三种方式是在愈伤组织的不同部位形成芽和根，再通过维管组织的联系形成完整植株。 37 胚状体发生 胚状体：在植物细胞、组织或器官体外培养过程中，由一个或一些体细胞经过胚胎发生和发育过程，形成的与合子胚相类似的结构。可进一步发育成植株。也叫体细胞胚。 区别于自然发生的珠心胚及其他通过无融合生殖和由合子胚分裂产生的胚 。 合子胚：由植物的雌雄配子融合 形成的合子继而发育形成的胚 38 合子心型胚 正在萌发的体胚 合子胚与体胚比较 39 胚状体发生 胚状体发生初期的细胞分裂与合子胚的不同，但分化后的发育过程与合子胚的类似。 双子叶植物胚胎发生： 合子－原胚－球形胚－心型胚－鱼雷胚－子叶胚 单子叶植物胚胎发生： 合子－原胚－球形胚－盾型胚－子叶胚 胚状体产生的方式有： ①直接由器官上发生。 ②培养物先形成愈伤组织，由愈伤组织再分化形成胚状体。 ③在花药培养中，可由小孢子发育成胚状体。 40 胚状体发生（续） 经过愈伤组织的胚胎发生需要三个培养阶段： 第一阶段是诱导外植体形成愈伤组织； 第二阶段是诱导愈伤组织胚性化； 第三阶段是体细胞胚形成。 41 花椰菜体细胞胚发育的不同阶段 42 影响脱分化与再分化的因素 内因：外植体遗传性状；外植体生理状况 不同生理年龄和不同季节都会有不同的培养反应。 外因： （1）营养条件（无机物，有机物，激素等） （2）环境条件 (光照，温度，湿度，培养基酸 碱度，培养基渗透压等) 43 4.植物激素在植物细胞分化中的作用 生长素影响细胞壁的强度 ，促进细胞伸长和分化 ，细胞分裂素则促进细胞分裂并影响分化方向，二者的配比是影响脱分化和再分化的关键。 44 激动素和生长素的比例 决定根芽分化的理论 当培养基中细胞分裂素／生长素比值 (1)比值高时促进芽的分化； (2)比值低时促进的根分化； (3) 两种激素浓度相当时， 诱导愈伤组织占优势或不分化。 45 激素调控细胞分化的机理 实验 已初步证明生长素处理植物细胞主要是作用于转录系统； 一般认为细胞分裂素主要是作用于翻译系统。 46 5、影响细胞分化的其他因素 切割等的机械伤害；切割损伤的刺激，促使细胞增殖。 化学试剂；(三氯乙醛使分化细胞重新回到愈伤状态) 电离辐射 弱光或黑暗条件有利于脱分化中的细胞分裂。 47 11.2 植物组织培养的过程 48 获取 外植体 无菌接种 诱导愈伤组织 的形成 试管苗的形成 扩大培养 移栽 脱分化 再分化 49 11.2.1 植物材料的清洗与消毒 1、材料的选取与清洗 –流程 自来水冲洗5min 中性洗涤剂（洗洁精）水溶液清洗材料， 并用自来水冲洗干净， 分装如干净的三角烧瓶中，备用。 50 2、外植体消毒 灭菌时，既要将材料上附着的微生物杀死，同时又不能伤及材料。 因此，灭菌采用何种药剂，什么浓度，处理多长时间，均应根据材料对药剂的敏感情况仔细敲定。 51 常用表面灭菌剂使用浓度及效果比较 灭菌剂 使用浓度(%) 去除的难易 灭菌时间(min) 升汞 0.1～1 最难 5～15 次氯酸钠 2 易 5～30 次氯酸钙 9～10 易 5～30 漂白粉饱和溶液 易 5～30 （双氧水） 10～12 最易 5～15 溴水 1～2 易 2～10 酒精 70～75 易 0.2～2 硝酸银 1 较难 5～30 抗生素 4～50（mg/l） 中 30～50 52 通常需要注意以下三个方面：    （1）选择合适的灭菌种类  要考虑灭菌效果，也要摸索灭菌时间，最好选择灭菌效果好，又容易被去除的灭菌剂。使用灭菌剂后，一定要用无菌水多次漂洗，否则留在组织上的灭菌剂会影响外植体的生长。    （2）考虑不同材料对灭菌剂的耐力  不同种类的外植体，或处于不同生理状态的同一种的外植体，对灭菌剂产生的反应不同。    （3）任何一种灭菌剂对不同材料如叶片、茎段和根部，浸泡时间和浓度是不同的，对任何一种外植体使用灭菌剂灭菌时，需要做筛选试验，以确定合适的灭菌剂和使用浓度及时间，才能达到灭菌的效果。 53 不同培养器官的灭菌顺序 器官 顺序 灭菌前 灭菌中 灭菌后 茎尖 清洗 75%酒精3-5秒，转入0.1%升汞加吐温8-10min 转入无菌水洗4次，接种培养基。 腋芽 清洗 75%酒精3-5秒，转入0.1%升汞加吐温20-30min， 转入无菌水洗4次，接种培养基。 花蕾 75%酒精6-7秒，转入0.1%升汞加吐温8-10min， 转入无菌水洗4次，接种培养基。 种子 浸种、催芽 75%酒精3-5秒，转入0.1%升汞加吐温20-30min， 转入无菌水洗4次，接种培养基。 54 11.2.2 培养基 培养基 (culture medium) 是植物组织培养的重要营养条件。 在离体培养条件下，不同种植物组织对营 养有不同要求; 同种植物不同部位的组织对营养的要求也不相同 ； 55 1、培养基的成分及作用 大多数培养基的成分是由无机营养物、碳源、维生素、生长调节物质和有机附加物等五类物质组成的。 56 无机营养物 无机营养物主要由大量元素和微量元素两部分组成。 大量元素中，氮源通常有硝态氮或铵态氮，但在培养基中用硝态氮的较多，也有将硝态氮和铵态氮混合使用的。 磷和硫则常用磷酸盐和硫酸盐来提供。 钾是培养基中主要的阳离子，在近代的培养基中，其数量有逐渐提高的趋势。 而钙、钠、镁的需要则较少。 培养基所需的钠和氯化物，由钙盐、磷酸盐或微量营养物提供。 微量元素包括碘、锰、锌、钼、铜、钴和铁。培养基中的铁离子，大多以螯合铁的形式存在，即FeSO4与Na2—EDTA（螯合剂）的混合。 57 碳源 　　培养的植物组织或细胞，它们的光合作用较弱。因此，需要在培养基中附加一些碳水化合物以供需要。培养基中的碳水化合物通常是蔗糖。蔗糖除作为培养基内的碳源和能源外，对维持培养基的渗透压也起重要作用。 58 维生素 　　在培养基中加入维生素，常有利于外植体的发育。培养基中的维生素属于B族维生素，其中效果最佳的有维生素B1、维生素B6、生物素、泛酸钙和肌醇等。 59 有机附加物 　　包括人工合成或天然的有机附加物。最常用的有酪朊水解物、酵母提取物、椰子汁及各种氨基酸等。另外，琼脂也是最常用的有机附加物，它主要是作为培养基的支持物，使培养基呈固体状态，以利于各种外植体的培养。 60 生长调节物质 常用的生长调节物质大致包括以下三类： (1)植物生长素类。如吲哚乙酸（IAA）、萘乙酸（NAA）、2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）。 (2)细胞分裂素。如玉米素（Zt）、6-苄基嘌呤（6-BA或BAP）和激动素（Kt）。 (3)赤霉素。组织培养中使用的赤霉素只有一种，即赤霉酸（GA3）。 61 2、几种常用培养基的特点 (1) MS培养基。 MS固体培养基可用来诱导愈伤组织，或用于胚、茎段、茎尖及花药培养， 与其它培养基的基本成分相比，MS培养基中的硝酸盐、钾和铵的含量高，这是它的明显特点。 62 B5培养基 (2) B5培养基的主要特点是含有较低的铵，这是因为铵可能对不少培养物的生长有抑制作用 。 63 N6培养基。 N6培养基特别适合于禾谷类植物的花药和花粉培养，在国内外得到广泛应用。 64 回顾内容 1.高等植物细胞脱分化和再分化的过程图 成熟细胞 分生细胞 愈伤组织 器官发生 胚状体发生 成熟细胞 脱分化 分裂 再分化 65 续回顾内容 2、材料的选取与清洗 –流程 自来水冲洗5min 中性洗涤剂（洗洁精）水溶液清洗材料， 并用自来水冲洗干净， 分装如干净的三角烧瓶中，备用。 66 新内容：3、培养液的配制 【1】制备母液 　　母液：将培养基中的各种成分，按原量10倍、100倍或1000倍称量，配成浓缩液。每次配制培养基时，取其总量的1/10、1/100、1/1000，加以稀释，即成培养液。 67 例，MS培养基母液配制 (1)大量元素 MS基本培养基大量元素母液配制（10倍） MS培养基 母液配制 母液代号 试剂 培养基含量 （毫克/升） 母液含量（克） 蒸馏水定容 （毫升） 每升培养基用 母液量(毫升) K KNO3 1900 19 1000 100 NH4 NH4NO3 1650 16.5 Mg MgSO4 370 3.7 P KH2PO4 170 1.7 Ca CaCl2·2H20 440 4.4 (2) MS微量元素母液（100X） 称10升量溶解在100ml蒸馏水中。 配1升养基取母液10ml。   化学药品 1升量 10升量 ① MnSO4·4H2O （ MnSO4·H2O） 22．3 mg/L （21．4 mg/L） 223mg ② ZnSO4·7H2O 8．6 mg/L 86mg ③ CoCl2·6H2O 0．025mg/L 0．25mg ④ CuSO4·5H2O 0．025 mg/L 0．25mg ⑤ Na2MoO4·2H2O 0．25 mg/L 2．5mg ⑥ KI 0．83 mg/L 8．3 mg ⑦ H3BO3 6．2 mg/L 62 mg (3)铁盐 铁盐要单独配制。由硫酸亚铁(FeSO4·7H2O) 5.57克和乙二胺四乙酸二钠(Na—EDTA)7.45克溶于1升水中配成。每配1升培养基，加铁盐5毫升。 70 MS基本培养基铁盐母液配制 （200倍） MS培养基 母液配制 母液 代号 试剂 培养基含量 （毫克/升） 母液称量 （克） 蒸馏水定容 （毫升） 每升培养基 用母液量（毫升） Fe Na2-EDTA  37.3 3.730 500 5   FeSO4·7H20  27.8 2.780 (4) 有机物质 主要指氨基酸和维生素类物质。它们都是分别称量，分别配成所需的浓度(0.1～1.0毫克/毫升)，用时按培养基配方中要求的量分别加入。 72 MS培养基有机物母液配制 (100倍） MS培养基 母液配制 母液 代号 试剂 培养基含量 （毫克/升） 母液称量（毫克） 蒸馏水定容（毫升） 每升培养基 用母液量（毫升） C 甘氨酸 2．0 200 1000 10 盐酸噻胺 0．4 40 盐酸比哆素 0．5 50 烟酸 0．5 50 肌醇 100 10000 　 (5)植物激素 最常用的有生长素和细胞分裂素。这类物质使用浓度很低，一般为0.01～10毫克/升。 配制植物生长素：用1～2毫升0.1mol·L-1 氢氧化钠溶解，再加蒸馏水稀释至所需浓度。 配制细胞分裂素：应先用少量0.5或1mol·L-1的盐酸溶解，然后加蒸馏水至所需量。 74 【2】配制培养基的具体操作 ①按照用量量取每种母液； ②用粗天平称取蔗糖、琼脂放在一边备用； 75 ③将②中称好的琼脂加蒸馏水300～400毫升，加热并不断搅拌，直至煮沸溶解呈透明状，再停止加热。 76 ④将①中所取的各种物质(包括蔗糖)，加入煮好的琼脂中，再加水至1000毫升，搅拌均匀，配成培养基。 77 ⑤用1N的氢氧化钠或盐酸，滴入④中的培养基里，每次只滴几滴，滴后搅拌均匀，并用pH试纸测其pH值，直到将培养基的pH值调到5.8。 　 78 　⑥将配好的培养基，用漏斗分装到三角瓶(或试管)中，并用棉塞塞紧瓶口，瓶壁写上号码。瓶中培养基的量约为容量的1/4或1/5。 79 4、培养基的灭菌与保存（略） 　高压蒸汽灭菌锅内，在汽相120℃条件下，灭菌20分钟。 间歇灭菌法进行灭菌，即将培养基煮沸10分钟，24小时后再煮沸20分钟，如此连续灭菌三次，即可达到完全灭菌的目的。 　　 80 高压蒸汽灭菌注意事项： ①高压蒸汽灭菌锅装锅不可过满，便于热蒸汽的上下回流，收到良好灭菌效果。 因灭菌作用取决于温度，而不是取决于压力。 ②保持压力过程中严格遵守时间：时间过长破坏化学物质；时间不足则达不到灭菌效果。 101.3kPa(121.3℃)消毒15～40min。 所需时间随要进行消毒的液体容积而变化(表11.5)。 ③冷却被消毒溶液时，防止压力急速下降。 如果压力下降速度，超过了温度下降速率，会使液体滚沸，从培养容器中溢出。 ④仅当高压灭菌锅压力表指针回到零(温度不高于50℃)时，才能打开灭菌锅。 ⑤某些生长调节物质(如GA3、玉米素、IAA、ABA)、尿素及某些维生素等，遇热易分解，则通过滤膜过滤除菌。 ⑥滤膜用前须安装于支座，或铝箔包裹，进行高压灭菌。 ⑦过滤器的灭菌温度不应超过121℃。 ⑧经灭菌的培养基，应置于4～5℃低温下保存。含IAA或GA3培养基，要在配制后1周内使用完；其它培养基最多应不超过1月。 11.2.3 接种 83 1、无菌接种步骤 （1）将初步洗涤及切割的材料放入烧杯，入超净台上 用消毒剂灭菌 再用无菌水冲洗 取出放置在灭过菌的纱布上或滤纸上。 84 （2）材料吸干后，一手拿镊子、一手拿剪刀或解剖刀，对材料进行适当的切割。 如叶片切成0.5cm平方的小块； 茎切成含有一个节的小段。 微茎尖要剥成只含1-2片幼叶的茎尖大小等。 85 86 （3）用灼烧消毒过的器械将切割好的外植体插植或放置到培养基上。 接种完后，将管口在火焰上再灼烧数秒种。并用棉塞，塞好后，包上包口纸，包口纸里面也要过火。 87 88 11.2.4 种质保存 种质:指亲代通过生殖细胞或体细胞传递给子代的遗传物质 种质保存:利用天然或人工创造的适宜环境，使个体中所含有的遗传物质保持其遗传完整性，高活力，能通过繁殖将遗传物质传递下去。 89 种质保存方法 按照保存时的所设定的温度分为： (1)常温保存 (2)常低温保存 (3)低温保存 (4)超低温保存 90 （1） 常温保存 温度:20~25℃ 改变培养基中营养物质的浓度 改变培养的环境条件：降低氧的含量 降低无机盐浓度 提高渗透压：甘露醇、蔗糖 增加生长调节物质 覆盖矿物油 降低氧压 特点:保存时间短,1年转3～5次 91 (2) 常低温和(3)低温保存 方法: 常低温:0~15℃ 低温:-80~0℃ 特点:简便易行,投资小.1年转1~3次 低温保存 改变培养基成分 改变培养条件 92 (4) 超低温保存 超低温保存：也叫冷冻保存，指在-196℃的液氮超低温下使细胞代谢和生长处于基本停止的状态，在适宜条件下可繁殖，再生出新的植株，并保持原来的遗传特性。 93 保存原理 低温冰冻过程中，如果生物细胞内水分结冰，细胞结构就遭到不可逆的破坏，导致细胞和组织死亡。 植物材料在超低温条件下，冰冻过程中避免了细胞内水分结冰，并且在解冻过程中防止细胞内水分次生结冰而达到植物材料保存目的。 94 冷冻的方法 95 快速冷冻法 将要保存的样品直接置于-196℃液氮中使之迅速冷却 。降温速度为1000 ℃／min。 采用该法要求细胞体积小、 含水量低、液泡化程度低的材料。 96 慢速冷冻法 将处于0℃ 或其他预处理温度的材料，以 0.5～5℃/min的降温速度从起始温度降到液氮的保存方法。 适宜保存的材料有：成熟的、含有大液泡和含水量高的细胞，对于保存在悬浮培养中的细胞特别有效。 97 预冷冻法 预冷冻法指将植物保存材料放入液氮前，需经过短暂 时间的低温锻炼的方法。 可分为两步冷冻法和逐级冷冻法。 两步冷冻法：先慢速降温到预冷温度 (-30 ～ -50 ℃)，停留1～3h后投入液氮。 逐级冷冻法：逐级降温（每级降温后停留5分钟）直到投入到液氮中。 98 干燥冷冻法 将材料置于27～29℃烘箱内降低植物含水量，再投入液氮中保存的方法。 可防止材料因细胞内过度结冰而冻死。 99 解冻 方法有： 快速解冻 和 慢速解冻 快速解冻法 ：是指将液氮中保存的材料直接投入到 37-40℃温水浴中进行解冻。解冻 的升温速度为500- 750℃/min。 对象：大多数植物材料 慢速解冻法 ：将液氮中保存的材料先置于0℃低温下解冻，再逐渐升至室温下进行解冻的方法。 适宜材料：细胞含水量较低的材料 。 100 超低温保存的程序 组织材料 预处理 加冷冻防护剂0℃ 慢冻法-40℃或-100℃ 预冻法-70~-20℃ 快冻法 种质库（-196℃） 迅速解冻（34~40℃） 再培养 细胞生长、植株再生 101 冷冻保存的应用前景（意义） 1、长期保存种质的遗传稳定性。 2、长期保存去病毒的种质。 3、保存稀有珍贵及濒危植物的种质资源。 4、保存不稳定性的培养物，如单倍体。 5、保持培养细胞形态发生的能力。 6、防止种质衰老。 7、延长花粉寿命，解决不同开花期和异地植物 杂交上的困难。 8、冷冻解冻过程可筛选抗逆新品种。 9、便于国际间的种质交换。 102 总结 植物组织培养的过程 一、培养基配制 1、配制几种母液 2、配制培养基 二、培养基灭菌 三、接种 四、培养 103 四、培养 （1）初代培养 初代培养旨在获得无菌材料和无性繁殖系。无性繁殖系包括：茎梢、芽丛、胚状体和原球茎等 。 (2)继代培养 继代培养是继初代培养之后的连续数代的扩繁殖培养过程。 旨在繁殖出相当数量的无根苗，最后能达到边繁殖边生根的目的。 3、生根培养 无根苗生根 五、驯化移栽 104 11.2.5植物组织和细胞的大规模培养 105 1、规模化培养的产业发展 1950年，Bonner用银胶菊培养物生产橡胶； 迄今，400多种植物细胞生产600多种次代物； 发酵罐规模化培养植物细胞，次代物集中于酶类、生物碱、甾体、萜类、色素等，应用于药物、食品、颜料、香精等生产领域。 106 植物细胞大规模培养的技术要求： 从工程的角度讲必须要进一步研究和开发适宜于植物细胞生长和次生代谢产物生产的生物反应器，建立最佳的控制和调节系统。 107 从细胞生长与培养技术方面讲必须满足以下 3 个条件： 1 、培养的细胞在遗传上应是稳定的，以得到产量恒定的产物。 2 、细胞生长及生物合成的速度快，在较短的时间内能得到较高产量的终产物。 3 、代谢产物要在细胞中积累而不被迅速分解，最好能将其释放到培养基中。 108 植物细胞培养的特性 （1）植物细胞较微生物细胞大得多，有纤维素细胞壁．细胞耐拉不耐扭，抵抗剪切力差； （2）培养过程生长速度缓慢，易受微生物污染，需用抗生素； （3）细胞生长的中期及对数期．易凝聚为直径较大的团块，悬浮培养较难； （4）培养时需供氧，培养液粘度大： 109 （5）因为有细胞壁, 培养细胞产物滞留于细胞内，产量较低； （6）细胞培养过程有结构与功能全能性,因而易分化,从而导致目的产物低于原植物体内浓度； （7）悬浮培养中要求有一定的细胞浓度，否则不生长 。 植物细胞培养需要解决的问题 （1）氧和二氧化碳的控制，过多氧过少氧均不利于生长； （2）营养物的供应； （3）细胞密度过高引起细胞团聚甚至分化 （4）培养过程中细胞的分化的防止， （5）细胞取得中微生物的去除； （6）细胞壁脆性的存在要求培养体系剪切力要小 111 2、植物细胞规模化培养系统 按照培养方式分为： 悬浮培养 固定化培养 器官培养 112 （1）悬浮培养 所需的生物反应器主要有 ： 机械搅拌式； 气压搅拌式 旋转式 113 悬浮培养的特点 增加培养细胞与培养液的接触面，改善营养供应； 可带走培养物产生的有害代谢产物，避免有害代谢产物局部浓度过高等问题； 保证氧的充分供给等三个基本优点，使悬浮培养细胞的生长条件比固体培养有很大的改善。 机械搅拌式反应器 在微生物发酵罐的基础上改进设计，根据植物细胞的特性，其搅拌装置要减少剪切，一般改叶轮式为螺旋式； 因为植物细胞生长周期长，需要随时补充水分和营养，因此必须设计加液装置； 由于植物细胞的生理活动需要新鲜空气，且细胞代谢也可能产生有害气体，所以必须设计通气装置； 为便于取样观察，一般还设计有取样口。 115 图示：机械搅拌式反应器 116 气压搅拌式培养系统 消除机械搅拌式反应器的剪切作用，同时避免搅拌器转动的中轴所带来的污染。 但其缺点是搅拌不均匀，不彻底。 117 图示：气压搅拌式反应器 118 图示：气压搅拌式反应器 119 　旋转式培养系统 一般用于产品中试或某些必需裂解细胞才能获得目的产物的培养，其优点是控制精确，处理灵活，缺点是培养体积较小。 120 成功的悬浮细胞培养体系 必须满足： 悬浮培养物分散性良好，细胞团较小， 均一性好，细胞形状和细胞团大小大致相同，外观为大小均一的小颗粒。 细胞生长迅速，悬浮细胞的生长量一般2～ 3 天甚至更短时间便可增加 1 倍。 121 悬浮培养体系基本是处于封闭状态时，细胞扩增生长成 S 形曲线。 122 （2）固定化培养 小规模固定化小规模的植物细胞固定化可用无菌的塑料注射器进行。 配制一定浓度的海藻酸钠溶液，高温、高压灭菌。通过离心或过滤收集植物细胞，将细胞悬浮于海藻酸钠溶液混合，倒入塑料注射器中，慢慢滴入到含有CaCl2的培养基中，不断搅拌，使之形成球形颗粒，然后通过过滤收集颗粒，用含有CaCl2的培养基清洗后，转入装有培养基的摇瓶中进行培养。 以下简要介绍褐藻钙固定植物细胞的技术路线： 大量培养植物细胞 混合 倒入塑料注射器 慢慢滴入含氯化钙的培养基 一定浓度的海藻酸钠溶液 海藻酸钙固定的细胞团 图：大规模植物细胞固定化装置 含CaCl2的培养基 盖子 空气出口 海藻酸钠+细胞悬浮液 喷嘴 无菌空气入口 大规模固定化植物细胞的大规模固定化原则上可根据上述方法进行，但是不能再用塑料注射器，而需要采用如图所示的大规模细胞固定化装置进行细胞的固定化。 （2）固定化培养 固定化培养系统的优点： 1）易控制培养系统的理化环境，从而可以研究特定的代谢途径，并便于调节； 2）细胞固定在一定的介质中，并可以从培养基中不断提取产物，因此它可以进行连续生产，有利于次生产物的合成。 126 细胞固定化培养技术按照其支持物不同可以分为两大类： 包埋式固定化培养系统：支持物多采用琼脂、琼脂糖、藻酸盐、聚丙烯酰胺等； 附着式固定化培养系统：支持物采用尼龙网、聚氨酯泡沫、中空纤维等材料。 127 （3）器官培养 利用生物反应器对植物的根、芽和胚状体等器官进行培养。 优点：产量高、遗传稳定 128 3、植物细胞规模化培养的影响因素 内因：外植体（种类、年龄、部位等） 外因：培养环境（温度、光照）； 培养系统类型；振荡频率 培养基（营养成分、酸碱度，含氧量，激素类型与比例）； 129 毛地黄 补充内容：植物组培专题 一、褐化问题 1、褐化现象是指组织培养诱导脱分化或再分化的过程中，外植体组织从表面向培养基释放褐色物质而使得培养基逐渐变成褐色，外植体随之褐变死亡的现象 ，又称酚污染 。 2、褐化现象在植物组织培养过程中广泛存在，已经成为植物组织培养成功的主要影响因素之一。 3、一般认为，褐化是由于酚类物质被多酚氧化酶（PPO）氧化成醌类物质，抑制了相关酶的活性，从而阻碍培养材料的正常生长，甚至导致培养物死亡。 4、影响外植体褐化的因素 4.1 外植体本身对褐化的影响 组织培养过程中，木本植物一般比草本植物易发生褐变。 在木本植物中，核桃、板栗由于单宁含量很高，进行组织培养难度很大，不仅在接种后的初代培养期容易发生褐变，而且在形成愈伤组织以后也会因为褐变而引起死亡。 褐化程度也因为外植体材料的生理状态不同存在差异。分生组织细胞分裂频率高、生长速度快，所以分生部位外植体比分化部位外植体褐化程度轻。 荔枝无菌苗不同组织的诱导实验中发现，根部极大部分基本不能诱导愈伤组织，即使诱导出愈伤组织也全部褐变；多数叶片较难诱导愈伤组织，诱导出的愈伤组织多出现中度褐变；茎部最容易诱导愈伤组织，且组织生长良好。 4.2 培养基成分对褐化的影响 初代培养时，培养基中无机盐浓度影响酚类分泌物的产生。 细胞分裂素BA或KT不仅能促进酚类物质的合成，且能激活PPO的活性，增强酚类物质的氧化能力，从而加剧褐化的发生。 4.3 培养条件对褐化的影响 温度对褐化的影响。一定程度的高温能激活PPO活性，促进酚类物质的氧化，加速组织培养的褐化。 光照能够促进多种植物组织培养中酚类物质的氧化，加速组织的褐变。 克服外植体褐化的措施 选择适宜的培养基可以保证外植体的正常代谢和分化，抑制组织培养的褐变。 培养基的状态也是影响植物组织培养褐变的因素之一。在几种不同的培养方式中，褐变程度顺序是：固体培养基>半固体培养基>液体培养基>纸桥培养基 。 较强的光照会使酶活性加强，褐变程度加强。所以可以进行初期的暗培养或者漫射光培养，同时注意降低培养室内的温度。 选择合适的外植体并创造最佳的培养条件是克服组织培养褐变的主要途径。处于生长旺盛期的外植体如芽、茎尖、幼嫩的茎段等，具有较强的分生能力，褐变程度低，是植物组织培养外植体的首选 。 培养基中加入抗褐化剂、吸附剂 抗氧化剂(如Vc)和其他抑制剂可有效抑制酶促的外植体褐变。活性炭是一种可以吸附培养物分泌的酚、醌等有害物质的吸附剂，能有效地降低褐变。研究表明PVP在离体培养中起到良好的抑制组织褐变作用 。 二、玻璃化问题 玻璃化的表现 培养材料的玻璃化是植物组织培养过程中经常遇到和较难克服的障碍。玻璃化的愈伤组织，难以继代培养，分化能力降低；玻璃化的试管苗呈半透明玻璃状，叶片失绿、增厚且硬脆，叶表面缺少角质层或蜡质发育不全，呼吸与光合作用功能不全，植株矮小肿胀、组织畸形，很难再恢复形成正常的试管苗，更难诱导生根和移栽成活。 玻璃化的原因 由于导致玻璃化苗发生的因素很多，不同植物的主导影响因素也可能各不相同 培养基中的水分状态和相对湿度。 愈伤组织、胚状体和试管苗内部生理失调。 细胞分裂素的激素浓度 培养温度  导致组培苗玻璃化的因素 光照时间长短对玻璃化的影响可能因植物种类而异 ；有些材料光照时间太长会导致玻璃化的百分率明显上升。  培养温度过高，会导致玻璃化的百分率明显上升。 激素浓度对玻璃化的影响可能因植物种类而异 ； 有人认为激动素浓度越高，玻璃化现象越严重。 铵盐离子浓度水平过高，会导致玻璃化 增加琼脂糖浓度能降低玻璃化。 在一定浓度范围内，玻璃苗数随蔗糖浓度增加而减少，蔗糖浓度与玻璃苗数呈负相关。 培养器材内空气不流通，氧气不足时，也会导致玻璃化百分率的上升。 控制玻璃化的措施 ①增加或减少光照强度或时间。 ②增加昼夜温差  会使玻璃化现象消失。昼夜温差以9-11℃为最佳。 ③热激处理  40℃热激处理瑞香愈伤组织培养物，可以完全消除再生苗的玻璃化，且能够提高愈伤组织的芽分化频率。  ④降低或消除铵盐离子浓度减少玻璃苗的发生，完全除去NH4NO3，则玻璃苗的发生比对照降低了35.9%。 ⑤增加通气度  使用透气性较好的棉塞、牛皮纸代替透气性较差的塑料薄膜或铝箔封口 控制玻璃化的措施  ⑥增加琼脂糖或蔗糖浓度能降低生菜玻璃化率。  ⑦降低激素浓度可改善继代培养代数较多时产生的玻璃化现象。 ⑧尽可能采用容积较大的容器。  ⑨添加硝酸银2.0mg/L可有效防止生菜玻璃苗产生。在培养基中加入0.3%的活性炭降低油菜茎尖培养过程玻璃芽的产生。 组织培养的前景 花芽分化和开花的成因， 试管内人工受精，获得杂种或自交种； 通过分离单倍体细胞，培育纯合的二倍体优良品系，缩短育种时间； 通过选择突变体，提高植物的品质，增强抗盐、抗旱、抗寒等方面的能力，扩大植物的生长范围； 将体细胞冷藏在低温下，建立基因库，达到保存物种的目的； 获得药用价值高和工业生产所需的次生产品 思考题 教材：3, 4, 6 , 7, 11 147 $