2026届高三生物一轮复习课件：微生物的培养技术及应用

第九章 生物技术与工程 [第二讲：微生物的培养技术及应用] 微生物 考点一：微生物的培养 的统称。 难以用肉眼观察的微小生物 包括细菌、真菌、病毒 及一些原生生物 禽流感病毒 SARS病毒 大型真菌 本章提及的微生物主要指用于发酵的细菌和真菌。 实验室培养微生物条件 1）提供微生物生长繁殖所需营养和环境条件 ——培养基的配制 2）确保其它微生物无法混入 ——无菌技术 高压蒸汽灭菌 固体培养基上的菌落 3）将需要的微生物分离出来 ——微生物的纯培养 考点一：微生物的培养 人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。 用以培养、分离、鉴定、保存微生物或积累其代谢物。 (1)概念： (2)作用： (3)类型： 固体培养基 液体培养基 半固体培养基 考点一：微生物的培养 1. 培养基的配置 培养微生物后 液体培养基： 固体培养基： 不同培养基的比较： 分离、计数、鉴定、 菌种保存等 有无凝固剂 如琼脂 微生物在琼脂固体培养基表面或内部生长形成肉眼可见的菌落 用于扩大微生物种群数量 课本P9 考点一：微生物的培养 1. 培养基的配置 考点一：微生物的培养 1. 培养基的配置 划分标准 培养基种类 特点 用途 物理性质 化学成分 用途 不加凝固剂 加凝固剂，如琼脂 扩大培养 观察微生物的运动 微生物分离、鉴定、活菌计数、保藏菌种 含化学成分不明确的天然物质 工业生产 培养基成分明确 分类、鉴定 允许特定种类的微生物生长,同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基 培养、分离出特定微生物 在培养基中加入某种指示剂或化学药品,用以鉴别不同种类的微生物 鉴别不同种类微生物 天然培养基 合成培养基 固体培养基 液体培养基 半固体培养基 选择培养基 鉴别培养基 2. 选择培养基 实验室筛选微生物原理： 人为提供__________________的条件（包括_____、_____和_____等），同时_____________________________ 有利于目的菌生长 抑制或阻止其他微生物的生长 营养 温度 pH 选择培养基的概念 在微生物学中，将允许 生长，同时 或 其他种类微生物生长的培养基。 特定种类的微生物 抑制 阻止 课P16 大本练习册P309 考点一：微生物的培养 以尿素为唯一氮源的培养基 （1）利用营养条件进行选择培养 分离固氮菌 分离自养型微生物 不加含碳有机物的无碳培养基 不加氮源的无氮培养基 （2）在培养基中加入某种化学物质。 分离得到酵母菌、霉菌等 加入青霉素的培养基 分离得到金黄色葡萄球菌 加入高浓度食盐的培养基 （3）改变微生物的培养条件。 厌氧型微生物，兼性厌氧型 无氧环境下培养 筛选出能分解尿素的细菌 2. 选择培养基 考点一：微生物的培养 培养基中加氨苄青霉素 采用影印法接种 具有抗氨苄青霉素能力的菌落 获得没有氨苄青霉素抗性的细菌 培养基+氨苄青霉素 培养基 没有抗氨苄青霉素能力的菌落被淘汰 2. 选择培养基 考点一：微生物的培养 ①首先把大量对链霉素敏感的大肠杆菌涂布在不含链霉素的平板1的表面，待其长出密集的小菌落后，用影印法接种到不含链霉素的培养基平板 2 和含有链霉素的培养基平板3上。培养后，在平板3上出现了个别抗链霉素的菌落。 ②比较2和3，在2上找到3上那几个抗性菌落的“孪生兄弟”，把其挑至不含链霉素的培养液4 中 ③经培养后，再涂布在平板 5 上。重复以上各步骤，最后在试管 12 中获得了较纯的抗性菌落。 影印法 引起原始菌种出现抗药性的原因是什么？理由是？ 1．(2022·菏泽二模)精氨酸营养缺陷型谷氨酸棒状杆菌缺乏将鸟氨酸转化为精氨酸的酶，不能在缺少精氨酸的培养基上生长，但可作为鸟氨酸发酵的优良菌种。如图为野生型谷氨酸棒状杆菌经诱变获得精氨酸营养缺陷型谷氨酸棒状杆菌并进行筛选的过程示意图，过程②将紫外线照射处理的菌液接种在某培养基上。培养至菌落不再增加时，平板上的菌落如图甲所示。过程③向培养基中添加某种物质继续培养得到如图乙所示平板。下列叙述正确的是 (　 ) B A．紫外线照射可导致谷氨酸棒状杆菌发生基因突变或染色体变异 B．图乙中菌落B为精氨酸营养缺陷型谷氨酸棒状杆菌 C．过程③向培养基中添加的某种物质是谷氨酸 D．过程②所用培养基是一种鉴别培养基 原核生物。无染色体 A菌落为野生型 添加物质后出现新的微生物：精氨酸 缺乏精氨酸，促进野生型，抑制突变型，选择培养基 鉴别培养基：在培养基中加入某种指示剂或化学药品(不影响微生物正常生长)，使微生物的某种代谢产物与培养基中的特定指示剂或化学药品发生反应。从而达到鉴定的作用。 伊红-亚甲蓝培养基鉴别大肠杆菌 课本P30 深紫色，金属光泽的菌落 刚果红培养基鉴别纤维素分解菌 课本P30 透明圈 3. 鉴别培养基 考点一：微生物的培养 考点一：微生物的培养 1. 培养基的配置 (4)营养成分: 微生物提供C、N等元素的营养物质。 ①基本成分： 水、碳源、氮源、无机盐。 碳源 无机碳源： 有机碳源： 氮源 NH4＋、NO3-、NH3、氮气（固氮菌）等。 牛肉膏、蛋白胨、尿素、氨基酸等。 CO2、CO32-、HCO3-。 葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨等。 无机氮源： 有机氮源： 无机盐 Zn、Cu、Mn、Co、Mo等 大量元素： 微量元素： Ca、K 、Mg等 自养微生物 异养微生物 为什么培养基需要氮源？ N是微生物合成蛋白质、核酸等物质所必需的。 课P10 大本练习册P306 ②特殊需求： 满足微生物对 的需求。 pH、特殊营养物质、O2 维生素、氨基酸、嘌呤、嘧啶等 表1-1 1000ml牛肉膏蛋白胨培养基的营养组成 组分 含量 提供的主要营养 牛肉膏 5g 碳源、氮源、磷酸盐和维生素等 蛋白胨 10g 碳源、氮源和维生素等 NaCl 5g 无机盐 H2O 定容至1000ml 水 培养乳酸菌需要添加维生素 培养霉菌时需将PH调至酸性，培养细菌时将PH调至中性或微碱性 培养厌氧微生物时需要提供无氧条件 考点一：微生物的培养 1. 培养基的配置 牛肉膏、蛋白胨：均可提供碳元素、氮元素。 考点一：微生物的培养 2. 无菌技术 (1)目的：获得　　　　　　。 (2)关键：　　　　　　。 纯净的培养物 防止杂菌污染 芽孢 某些细菌（如芽孢杆菌属）在营养条件缺乏时，在菌体内形成的一个圆形或椭圆形、含水量低、抗逆性强的休眠体。 芽孢壁很厚，对干旱、低温、高温等恶劣的环境有很强的抵抗力。例如，有的细菌的芽孢，煮沸3小时以后才死亡。 孢子是脱离亲本后能直接或间接发育成新个体的生殖细胞，它是有丝分裂或减数分裂的产物。 孢子 考点一：微生物的培养 条件 结果 常用方法 应用范围 消毒 灭菌 　 (3)常用的灭菌、消毒方法比较 较为温和的物理或化学方法 强烈的理化因素 仅杀死物体表面或内部的部分微生物，不能消灭芽孢和孢子 杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子 灼烧灭菌法 干热灭菌法 湿热灭菌法 日常用品 不耐高温的液体（牛奶、饮料） 用酒精擦拭双手，用氯气消毒水源 用紫外灯照射接种室、接种箱、超净工作台。 接种工具(涂布器、接种环)、试管口或瓶口 玻璃器皿、金属用具 培养基及容器 煮沸消毒法 巴氏消毒法 化学药剂消毒法 紫外线消毒法 考点一：微生物的培养 2. 无菌技术 考点二：微生物的分离 1. 纯培养 (1)概念：由 繁殖所获得的微生物群体是纯培养物，获得 的过程就是纯培养。 微生物群 分散 单个细胞 单个菌落 繁殖 不同菌落的形状、大小、光泽度、颜色、透明度等不同。菌落是鉴定菌种的重要依据。 单一个体 纯培养物 菌落：分散的微生物(单一个体)在适宜的 表面或内部可以繁殖形成肉眼可见的、有一定形态结构的 。 固体培养基 子细胞群体 稀释 平板划线 稀释涂布平板 实例——酵母菌的纯培养 配制培养基 灭菌 倒平板 配制培养基 灭菌 a、配制培养基 马铃薯200g 切成小块 加水1000ml，煮沸至马铃薯软烂 过滤，加入20g葡萄糖、15-20g琼脂，用蒸馏水定容至1000ml。 考点二：微生物的分离 1. 纯培养 b、灭菌 锥形瓶 包器材 培养基 高压蒸汽灭菌 包上牛皮纸 转移 加棉塞 用皮筋勒紧 高压蒸汽灭菌锅中，在压力为100kPa、温度为121℃的条件下 培养皿 干热灭菌（通常） 灭菌15-30min 考点二：微生物的分离 1. 纯培养 c、倒平板 待培养基冷却至50 ℃左右时，在酒精灯火焰附近倒平板。 ①拔出锥形瓶的棉塞 ②将瓶口迅速通过火焰 ③用拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，将培养基（10～20mL）倒入培养皿，立即盖上皿盖 ④等待培养基冷却凝固后，将培养皿倒转过来放置 课P12 考点二：微生物的分离 2. 倒平板 2.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？ 最好不要用这个平板培养微生物。 防止空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生。 将所倒平板放入37℃的恒温箱中培养12h～24h，观察是否有菌落存在以确定是否被污染或灭菌是否彻底。 3.怎么确定所倒平板未被杂菌污染？ 1.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？ 平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，将平板倒置可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染，防止培养基表面的水分过快蒸发。 考点二：微生物的分离 2. 倒平板 平板划线法是通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。在数次划线后培养，可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体。 d. 接种和分离酵母菌 平板划线法 ①灼烧接种环，直至接种环金属丝烧红。 ②在火焰旁冷却接种环，拔出酵母菌培养液试管的棉塞 ③试管口通过火焰。 ④在火焰附近用接种环蘸取一环菌液 ⑤试管口通过火焰，并塞上棉塞 ⑥将皿盖打开一条缝隙，用接种环在培养基表面迅速划三至五条平行线，盖上皿盖 ⑦灼烧接种环，待其冷却后，从第一次划线的末端开始作第二次划线。重复以上操作，作第三、四、五次划线。 考点二：微生物的分离 3. 平板划线法 第1区划线 接种环灭菌 第2区划线 接种环灭菌 第3区划线 接种环灭菌 接种环灭菌 1 2 3 4 5 ①接种环只蘸一次菌液,但要在培养基不同位置连续划线多次. ②划线首尾不能相接 ③每次划线前接种环进行灭菌 ④划线后,培养皿倒置培养 平板划线法 蘸取菌液 考点二：微生物的分离 3. 平板划线法 3. 微生物纯培养 1.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？ 以免接种环温度太高，杀死菌种。 2.在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？ 划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。 3.为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时,仍然需要灼烧接种环吗？为什么？ 接种结束后：杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者 每次划线前：杀死上次划线时残留菌种，使下一次划线的菌种直接来源上次划线的末端，从而使每次划线时菌种数目逐渐减少，直至得到单个细胞 取菌种前：杀死接种环上原有微生物 考点二：微生物的分离 完成平板划线后，待菌液被培养基吸收，将接种后的平板和一个未接种的平板倒置，放入28℃左右的恒温培养箱中培养24-28h。 作对照，该培 养皿无菌落说 明培养基没有 污染 e. 培养 考点二：微生物的分离 3. 平板划线法 4．在分离、纯化大肠杆菌实验中，划线接种(甲)、培养结果(乙)如图。下列有关叙述错误的是(　 ) A．甲中a区域为划线的起始位置 B．接种前应对培养基进行高压蒸汽灭菌 C．连续划线的目的是获得单个细菌形成的菌落 D．接种过程中至少需要对接种环灼烧5次 【大本P308 T3 】 A 考点三：微生物的计数 1. 稀释涂布平板法 将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。稀释度足够高时，能在培养基表面形成单个菌落。 两个基本操作：________和________ 梯度稀释 涂布平板 稀释涂布平板法的过程 6支试管，分别加入9ml无菌水 1ml 102 1ml 103 1ml 104 1ml 105 1ml 106 1ml 107 微量 移液器 稀释10倍菌液 101 土壤10g ②在火焰旁称取土壤10g，加入90ml无菌水中，摇匀，制成稀释10倍的土壤菌液。 分别取1ml上清液，加入盛有9ml无菌水的试管中，制成不同稀释倍数的菌液。 取6支试管，分别加入9ml无菌水。 （1）样品梯度的稀释 考点三：微生物的计数 稀释涂布平板法的过程 灼 ⑤将涂布器在火焰上灼烧，待酒精燃尽后，涂布器冷却后，进行涂布。 涂 ⑥用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀。 滴 ③取0.1ml菌液，滴加到培养基表面 ④将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中 浸 （2）取样涂布平板 各梯度分别涂布3个平板 1个不涂布作空白对照 考点三：微生物的计数 放入37℃恒温箱中培养1～2d 稀释103倍 稀释104倍 稀释105倍 空白对照 （3）培养与观察 为了保证结果准确，一般选择菌落数为_________的平板进行计数 30～300 考点三：微生物的计数 稀释涂布平板计数法计数（活菌计数） 计算公式 每g样品中的菌落数 = ( C ÷ V ) ◊ M 代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数 代表涂布平板时所用的稀释液的体积（mL） 代表稀释倍数 某同学再稀释倍数为106的培养基中测得平板上菌落数的平均数为234，那么每g样品中的菌落数时（涂布平板时所用稀释液的体积为0.1mL）（ ） A. 2.34◊108 B. 2.34◊108 C. 234 D. 23.4 例 考点三：微生物的计数 方法 平板划线法 稀释涂布平板法 纯化原理 接种工具 单菌落的获得 用途 接种效果图 相同点 通过连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散 将菌液进行一系列的等比稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到固体培养基的表面，进行培养，以得到单菌落。 接种环 涂布器 从最后划线区挑取 分离纯化菌种，获得单菌落 ①分离纯化菌种，获得单菌落 ②用于计数 ①都能分离纯化菌种 ②都在固体培养基上进行的 2. 显微镜直接计数法 计数原理 利用特定的细菌计数板或_____________，在显微镜下观察、计数，然后再计算一定体积的样品中微生物的数量 优点 是一种常用的、________的测定微生物数量的方法 缺点 统计的结果一般是死菌数和活菌数的总和 血细胞计数板 快速直观 考点三：微生物的计数 微生物的计数方法比较 内容 直接计数法 间接计数法 主要用具 显微镜、细菌计数板或血细胞计数板 涂布器 计数依据 细菌个数 培养基上菌落数 优点 计数方便、操作简单 计数的是活菌 计算公式 每毫升原液含菌株数＝每小格平均菌株数×400×104×稀释倍数 每克样品中的菌株数:(C÷V)×M 　C:某稀释度下平板上生长的平均菌落数;V:涂布平板时所用的稀释液的体积(mL);M:稀释倍数 缺点 不能区分死菌与活菌 当两个或多个菌体连在一起时,平板上观察到的只是一个菌落 结果 比实际值偏大 比实际值偏小 当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。 考点四：微生物的选择与鉴别 案例 分解尿素细菌鉴定原理： 细菌合成的脲酶将尿素分解为氨，氨会使培养基的碱性增强，pH升高，因此可以通过检测培养基pH的变化来判断是否发生了该化学反应，进而判断该菌是否为尿素分解细菌。 CO(NH2)2 + H2O 2NH3 + CO2 脲酶 呈碱性，遇酚红指示剂呈 色。 红 在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，培养某种细菌后，如果pH升高，指示剂将变红： 既是选择培养基又是鉴别培养基 ①土壤取样 细菌适宜在酸碱度接近中性的潮湿土壤中生长， 绝大多数分布在距地表3~8cm的土壤层。 取样时一般要铲去表层土。 城市：公园里、街道旁、花盆中 农村：农田里、菜园里 取样时用的铁铲和取样纸袋在使用前都需要灭菌，操作完成后，一定要洗手。 考点四：微生物的选择与鉴别 3. 案例 ②样品系列稀释与涂布 测定土壤中细菌的数量，一般选用1×104、 1×105、 1×106倍稀释倍数进行平板培养。 0.1mL 0.1mL 0.1mL 课P18 大本练习册P310 如果1个平板的计数结果与另 2个相差太远(不在30~300范围内)，说明在操作过程中可能出现了错误，因此，不能简单地将3个平板的计数值用来求平均值。 空白对照设置：将未接种的培养基同时进行培养，以判断培养基是否有杂菌污染。 完全培养基对照设置：接种在完全培养基上同时进行培养，以判断选择培养基是否具有筛选作用。 ③平板设置 未接种 实验组： 对照组： 选择培养基组： 完全培养基组： 滤膜法 测定水样是否符合饮用水的卫生标准，常用滤膜法测定大肠杆菌的总数。大肠杆菌在含有伊红美蓝的固体培养基(EMB培养基)上长出的菌落呈黑色。滤膜法的大致流程：用滤膜过滤待测水样→水样中的细菌留在滤膜上→将滤膜转移到EMB培养基止培养→统計菌落数目。据图回答问题。 (1)待测水样过滤完之后，还有部分细菌吸附在滤杯杯壁上，将这部分细菌也尽可能集中到滤膜上的操作为_________________________________。 (2)将完成过滤之后的滤膜紧贴在EMB培养基上，这属于微生物培养中的___________操作。从功能上看，EMB培养基属于___________培养基。 (3)若要测定待测水样中酵母菌的数目，应更换上述过滤装置中的滤膜，选择孔径___________(填“更大”或“更小”)的滤膜。 无菌条件下用无菌水冲洗滤杯，再次过滤 接种 鉴别 更大 (2021·广东高考真题)中国科学家运用合成生物学方法构建了一株嗜盐单胞菌H，以糖蜜（甘蔗榨糖后的废弃液，含较多蔗糖）为原料，在实验室发酵生产PHA等新型高附加值可降解材料，期望提高甘蔗的整体利用价值。工艺流程如图。 回答下列问题： ①为提高菌株H对蔗糖的耐受能力和利用效率，可在液体培养基中将蔗糖作为___________，并不断提高其浓度，经多次传代培养（指培养一段时间后，将部分培养物转入新配的培养基中继续培养）以获得目标菌株。 唯一碳源 (2021·湖南高考真题)大熊猫是我国特有的珍稀野生动物，每只成年大熊猫每日进食竹子量可达12~38kg。大熊猫可利用竹子中8%的纤维素和27%的半纤维素。研究人员从大熊猫粪便和土壤中筛选纤维素分解菌。 回答下列问题： ①为筛选纤维素分解菌，将大熊猫新鲜粪便样品稀释液接种至以_______为唯一碳源的固体培养基上进行培养，该培养基从功能上分类属于______培养基。 选择 纤维素 ②配制的培养基必须进行灭菌处理，目的是_____________________。检测固体培养基灭菌效果的常用方法是_________。 为了杀死培养基中的所有微生物(微生物和芽孢、孢子) 不接种培养(或空白培养) ④为高效降解农业秸秆废弃物，研究人员利用从土壤中筛选获得的3株纤维素分解菌，在37℃条件下进行玉米秸秆降解实验，结果如表所示。在该条件下纤维素酶活力最高的是菌株____，理由是_________。 C 菌株 秸秆总重(g) 秸秆残重(g) 秸秆失重（%） 纤维素降解率（%） A 2.00 1.51 24.50 16.14 B 2.00 1.53 23.50 14.92 C 2.00 1.42 29.00 23.32 接种C菌株后秸秆失重最多，纤维素降解率最大 例5.(2021·山东，20)含硫蛋白质在某些微生物的作用下产生硫化氢导致生活污水发臭。硫化氢可以与硫酸亚铁铵结合形成黑色沉淀。为探究发臭水体中甲、乙菌是否产生硫化氢及两种菌的运动能力，用穿刺接种的方法，分别将两种菌接种在含有硫酸亚铁铵的培养基上进行培养，如图所示。若两种菌繁殖速度相等，下列说法错误的是（ ） A.乙菌的运动能力比甲菌强 B.为不影响菌的运动需选用液体培养基 C.该实验不能比较出两种菌产生硫化氢的量 D.穿刺接种等接种技术的核心是防止杂菌的污染 穿刺接种法 $