专题14 基因工程（4大要点+4大题型）（天津专用）2026年高考生物二轮复习讲练测

专题14 基因工程 目录 第一部分 高考风向解读 洞察考向，感知前沿 第二部分 核心要点提升 要点精析、能力提升 要点01 限制酶的选择原则 要点02基因表达载体的构建 要点03目的基因的检测与鉴定 要点04 蛋白质工程的基本原理 第三部分 题型精准突破 固本培优，精准提分 A组·保分基础练 题型01 基因工程的基本工具 题型02基因工程的基本操作程序 题型03蛋白质工程及其应用 题型04 PCR技术 B组·增分能力练 第四部分 真题演练进阶 对标高考，感悟考法 考情解读 核心要点 高考考情 高考新风向 基因工程的基本工具 （2025天津卷）基因表达载体的构建、转基因的生物安全 （2024天津卷）蛋白质工程及应用 （2023天津卷）PCR技术的原理及应用（引物的选择） 1.夯实基础：熟练掌握工具酶、载体、PCR等核心概念。 2.关注前沿：了解基因编辑、合成生物学等领域的最新进展。 3.提升思维：注重从“技术原理→设计应用→评价反思”的逻辑训练。 4.强化实验：深入理解教材中相关实验的设计思路与分析方法。 · 基因工程的基本操作流程 PCR技术 蛋白质工程及应用 新风向演练 1．【新情境-骨架蛋白】（2025·天津·二模）幽门螺杆菌是一种常见的人类致病菌，其骨架蛋白MreB通过影响脲酶活性参与调控其致病性。为了研究MreB基因对脲酶活性的具体影响，科学家将该基因导入能合成脲酶且无抗生素抗性的另一种细菌中，所用质粒和目的基因如图所示。下列叙述正确的是（    ） A．为了将MreB基因定向插入到质粒中，可选SamⅠ和EcoRⅠ切割质粒 B．从卡那霉素选择培养基上生长的菌落中挑取的菌株即为目的菌株 C．用E.coliDNA连接酶构建重组载体能有效防止目的基因的反向连接 D．将重组质粒导入细菌的过程中，需用处理以增大其对周围DNA的吸收 【答案】D 【详解】A、若用SamⅠ和EcoRⅠ切割质粒，会破使质粒上的启动子被切除，使目的基因无法正常表达，所以不能用SamⅠ和EcoRⅠ切割质粒，A错误； B、从卡那霉素选择培养基上生长的菌落中挑取的菌株，可能是导入了普通质粒（不含目的基因）的菌株，不一定是导入了重组质粒（含有目的基因）的目的菌株，还需要进一步鉴定，B错误； C、E.coliDNA连接酶只能连接黏性末端，不能防止目的基因的反向连接，C错误； D、将重组质粒导入细菌（如大肠杆菌）的过程中，用Ca2+处理细菌，可使其成为感受态细胞，增大其对周围DNA的吸收能力，有利于重组质粒进入细菌细胞，D正确。 故选D。 2．【联系实际-HPV】（2025·天津·一模）宫颈癌主要由人乳头瘤病毒（HPV）感染引起，目前已知HPV具有200多种亚型。研究人员发现在高危类型HPV16、HPV18等诱发的宫颈癌细胞中，HPVE6/E7癌蛋白持续稳定表达，VGX-3100是全球首个针对HPV感染相关宫颈癌前病变的治疗性DNA疫苗，以HPVE6/E7癌蛋白为抗原靶点，能有效激活免疫系统，精准识别并杀伤已经感染HPV的细胞，从而实现对感染细胞的清除。下列有关说法错误的是（　　） A．可利用核酸分子杂交技术检测人体是否感染HPV B．E7癌蛋白是HPV病毒基因组编码的一种蛋白质，使细胞周期调控失常 C．抗原呈递细胞以胞吞的方式摄取VGX-3100并将其呈递给辅助性T细胞 D．VGX-3100进入机体后，体内针对HPV的细胞毒性T细胞数量会增多 【答案】C 【详解】A、HPV是一种DNA病毒，含有特定的核酸序列，所以可利用核酸分子杂交技术，将待测样本的核酸与HPV的特异性核酸探针进行杂交，从而检测人体是否感染HPV，A正确；    B、由题干“在高危类型HPV16、HPV18等诱发的宫颈癌细胞中，HPVE6/E7癌蛋白持续稳定表达”可知，E7癌蛋白是由HPV病毒基因组编码的一种蛋白质，且能使细胞周期调控失常，B正确；    C、VGX - 3100是治疗性DNA疫苗，属于大分子物质，抗原呈递细胞以胞吞的方式摄取VGX - 3100，处理后将其抗原信息呈递给辅助性T细胞，而不是呈递VGX - 3100本身，C错误；    D、VGX - 3100以HPVE6/E7癌蛋白为抗原靶点，能有效激活免疫系统，精准识别并杀伤已感染的HPV细胞，体内针对HPV的细胞毒性T细胞数量会增多，D正确。 故选C。 3．【新热点-AI技术】（2025·天津·一模）“逆折叠AI模型”依据自然界中已知的大量“序列-结构”对应关系，学习到氨基酸序列与最终三维结构之间复杂的对应关系，使该模型能从目标蛋白质的结构出发，快速生成大量可能折叠成该结构的氨基酸序列，实现了蛋白质工程的自动化和标准化。下列说法正确的是（　　） A．生成目标氨基酸序列需要肽键的结构、氨基酸的性质与数目为依据 B．从蛋白质的三维结构到氨基酸序列，AI模型依据的原理是中心法则 C．氨基酸发生替换后，蛋白质的空间结构和功能可能不会因此而发生改变 D．该模型预测蛋白质的结构并直接设计改造蛋白质，而不用改造基因 【答案】C 【详解】A、该模型依据“序列-结构”对应关系生成氨基酸序列，而非肽键结构或氨基酸数目。肽键是氨基酸间的基本连接方式，但模型的核心是学习序列与空间构象的关联，A错误； B、中心法则描述遗传信息从DNA→RNA→蛋白质的单向流动，而“逆折叠”是从蛋白质结构反向推导序列，属于逆向工程，与中心法则方向相反，B错误； C、氨基酸替换可能发生在非关键位点，若替换后氨基酸性质相似，蛋白质的空间构象和功能可保持不变，C正确； D、蛋白质工程需通过改造基因来实现蛋白质设计，该模型仅提供序列预测，最终仍需基因操作（如定点突变）表达目标蛋白，D错误。 故选C。 4．【新科研-基因编辑】（2025·天津·二模）利用转基因技术将绿色荧光蛋白基因(GFP)整合到野生型小鼠Gata3基因一端，如图甲所示。实验得到表达Gata3 - GFP蛋白质的杂合子小鼠，交配获得Gata3 - GFP基因纯合子小鼠。为鉴定交配获得的4只新生小鼠的基因型，设计引物1和引物2用于PCR扩增，PCR产物电泳结果如图乙所示。 下列叙述正确的是（　　） A．Gata3基因的启动子无法控制GFP基因表达 B．翻译时先合成GFP蛋白，再合成Gata3蛋白 C．2号小鼠是Gata3 - GFP基因的纯合子，4号小鼠是野生型 D．用引物1和引物3进行PCR，能更好区分杂合子和纯合子 【答案】C 【详解】A、分析图中可知，启动子在左侧，GFP基因整合于Gata3基因的右侧，启动子启动转录后，可以使GFP基因转录，Gata3基因的启动子能控制GFP基因的表达，A错误； B、因启动子在左侧，转录的方向向右，合成的mRNA从左向右为5'→3'，刚好是翻译的方向，所以翻译时先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白，B错误； C、整合GFP基因后，核酸片段变长，2号个体只有大片段，所以是Gata3-GFP基因纯合子，4号个体只有小片段，是野生型，C正确； D、用引物1和引物3进行PCR扩增，杂合子和Gata3—GFP基因纯合子都能扩增出相应片段，因此无法区分杂合子和纯合子，D错误。 故选C。 知识串联·核心必记 要点01 限制酶的选择原则 1．限制酶的选择 (1) 不破坏目的基因原则:图甲可选择PstⅠ,而不选择SmaⅠ。 (2) 保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则:所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择Sma I。 (3) 确保出现相同黏性末端原则:通常选择与切割目的基因相同的限制酶切割质粒,如图中PstI;为避免目的基因和质粒自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图也可选择PstI和EcoRI两种限制酶。 2. 标记基因的作用 标记基因可用于检测目的基因是否导人受体细胞: 【典例1】研究人员欲将某动物体内基因X导入大肠杆菌的质粒中保存，质粒含有抗性基因与酶切位点，目的基因两端酶切位点如下图所示，下列叙述错误的是（　　）    A．使用HindⅢ和XbaI进行酶切能避免基因X与质粒反向连接 B．目的基因X与质粒连接可使用E.coliDNA连接酶 C．Ca2+处理大肠杆菌能降低细胞膜通透性，有利于重组质粒导入受体细胞 D．含有基因X的大肠杆菌能在氨苄青霉素选择培养基中生长 【答案】C 【详解】A、分析题图可知，使用HindⅢ和XbaI进行酶切会产生不同的粘性末端，故能避免基因X与质粒反向连接，A正确； B、目的基因X与质粒用HindⅢ和XbaI酶切会产生粘性末端，E.coliDNA连接酶可连接粘性末端，故目的基因X与质粒连接可使用E.coliDNA连接酶，B正确； C、用Ca2+处理大肠杆菌，能提高细胞膜的通透性，使细胞处于感受态即能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，有利于重组质粒导入受体细胞，C错误； D、分析题图可知，重组质粒上含有氨苄青霉素抗性基因，故含有基因X的大肠杆菌能在氨苄青霉素选择培养基中生长，D正确。 故选C。 要点02 基因表达载体的构建 (1) 构建基因表达载体的目的:使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，并能够表达和发挥作用。 (2) 基因表达载体的组成 （3） 基因表达载体的构建过程 提醒:若考虑两两相连，则DNA连接酶连接DNA片段会出现三种情况,即目的基因与目的基因的连接、目的基因与质粒的连接、质粒与质粒的连接,需筛选出重组质粒。 【典例2】番茄在较低温度下运输或储存的过程中容易出现冻伤的现象。科学家利用基因工程技术培育出抗冻的转基因番茄。下图为外源DNA和质粒上标出的酶切位点及相关基因，其中AFPs基因为抗冻基因。下列相关叙述不正确的是（    ）      A．基因工程中常用的工具酶有限制酶，DNA连接酶 B．获得的AFPs基因应插入质粒上的启动子与终止子之间 C．应用BamHI和HindⅢ切割目的基因和质粒以避免目的基因反接 D．能在含四环素的培养基上生长的受体细胞中一定都含有AFPs基因 【答案】D 【详解】A、基因工程中常用的工具酶有限制酶，DNA连接酶，质粒属于基因工程中的常见工具，A正确； B、启动子和终止子分别控制基因转录的开始和结束，获得的AFPs基因应插入质粒上的启动子与终止子之间，以保证目的基因能够正确的表达，B正确； C、为了防止目的基因和质粒自连或反接，应该选择两种限制酶进行切割，在目的基因两端、质粒上分别形成两种黏性末端，结合题图可知应用BamHⅠ和HindⅢ，C正确； D、导入了重组DNA的细胞具有四环素抗性，但仅导入了质粒等情况下细胞也具有四环素抗性，故能在含四环素的培养基上生长的受体细胞中不一定含有AFPs基因，D错误。 故选D。 要点03 目的基因的检测与鉴定 【典例3】33．（20-21高二下·山东德州·期末）研究人员将GNA基因和ACA基因连接成融合基因，再与pBI121质粒载体结合，导入玉米细胞，最终获得了抗蚜虫玉米新品种，部分操作如下图，下列相关叙述错误的是（　　） 注：图中 Ⅰ、Ⅰ、Ⅰ为限制酶 A．①②过程均需使用DNA连接酶，②过程是基因工程的核心步骤 B．与只用Ⅰ相比，用Ⅰ和Ⅰ处理融合基因和载体可保证基因转录方向正确 C．只要检测出玉米细胞中含有融合基因，就说明抗蚜虫玉米培育成功 D．在加入卡那霉素的培养基上存活下来的细胞，不一定是成功导入重组载体的细胞 【答案】C 【详解】A、①②过程均是涉及DNA的连接，需使用DNA连接酶，②重组载体是基因工程的核心步骤，A正确； B、 K pn Ⅰ和 Xho Ⅰ作用位点不同，用 K pn Ⅰ和 Xho Ⅰ处理融合基因和载体，只有基因方向正确才能形成重组载体，从而保证基因转录方向正确，B正确； C、检测出玉米细胞中含有融合基因，不一定能说明抗蚜虫玉米培育成功，因为融合基因可能不能正常表达，还需作修饰处理，C错误； D、在加入卡那霉素的培养基上存活下来的细胞，不一定是成功导入重组载体的细胞，因为导入含有卡那霉素抗性基因的非重组载体也能在加入卡那霉素的培养基上存活下来，D错误。 故选C。 要点04 蛋白质工程的基本原理 （1） 蛋白质工程的概念 （2） 基本思路 从预期蛋白质功能出发→设计预期蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到并改变相应的脱氧核苷酸序列或合成新基因→获取所需的蛋白质 【典例4】31．（23-24高二下·吉林白山·期末）将人胰岛素A链上1个天冬氨酸替换为甘氨酸。B链末端增加2个精氨酸，可制备出一种人工长效胰岛素。下列关于该胰岛素的叙述，错误的是（    ） A．可通过蛋白质工程方法生产 B．比人胰岛素多了2个肽键 C．甘氨酸与精氨酸的R基不同 D．最初在粗面内质网中合成 【答案】D 【详解】A、人工长效胰岛素是对天然蛋白质的改造，需要通过蛋白质工程改造相应基因，并通过基因工程生产相应蛋白质，因此人工长效胰岛素可通过蛋白质工程方法生产，A正确； B、将人胰岛素A链上1个天冬氨酸替换为甘氨酸，B链末端增加2个精氨酸，可制备出一种人工长效胰岛素，因此该长效胰岛素比人胰岛素多了2个精氨酸，以及A链上存在一个氨基酸的差异，即人工长效胰岛素比人胰岛素多了2个肽键，B正确； C、组成蛋白质的氨基酸的不同在于R基的不同，故甘氨酸与精氨酸的R基不同，C正确； D、蛋白质的合成场所为核糖体，故最初在核糖体上合成，D错误。 故选D。 01 基因工程的基本工具 1．（2025·天津·二模）用氨苄青霉素抗性基因（AmpR）、四环素抗性基因（TetR）作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体（重组质粒），并转化到受体菌中。下列叙述错误的是（　　）    A．若用HindⅢ酶切，目的基因转录的产物可能不同 B．若用PvuⅠ酶切，在含Tet（四环素）培养基中的菌落，不一定含有目的基因 C．若用SphⅠ酶切，可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否 D．若用SphⅠ酶切，携带目的基因的受体菌在含Amp（氨苄青霉素）和Tet的培养基中能形成菌落 【答案】D 【详解】A、若用HindⅢ酶切，目的基因可能正向插入，也可能反向插入，转录的产物可能不同，A正确。 B、若用PvuⅠ酶切，重组质粒和质粒中都有四环素抗性基因（TetR），因此在含Tet（四环素）培养基中的菌落，不一定含有目的基因，B正确； C、DNA凝胶电泳技术可以分离不同大小的DNA片段，重组质粒的大小与质粒不同，能够鉴定重组质粒构建成功与否，C正确； D、SphⅠ的酶切位点位于四环素抗性基因中，若用SphⅠ酶切，重组质粒中含氨苄青霉素抗性基因（AmpR），因此携带目的基因的受体菌在含Amp（氨苄青霉素）的培养基中能形成菌落，在含Tet的培养基中不能形成菌落，D错误。 故选D。 2．（2025·天津·一模）科学家利用转基因生菜作为生物反应器生产人胰岛素时，依据植物偏好密码子（编码同种氨基酸的多个密码子中，生物优先高频使用的特定密码子）的原理对人胰岛素基因进行改造，提高胰岛素基因在植物细胞中的表达效率。对改造后的胰岛素基因进行一系列操作以构建基因表达载体（部分过程如图所示），再通过农杆菌转化法转入生菜细胞中表达人胰岛素。 下列说法正确的是（    ） A．改造后的人胰岛素基因表达产物与天然胰岛素的氨基酸序列不完全相同 B．构建质粒3的过程中可使用HindⅢ和XbaⅠ两种酶切割质粒1和质粒2 C．使用含有卡那霉素或潮霉素的培养基筛选导入目的基因的生菜细胞 D．农杆菌T-DNA上添加复制原点才能使目的基因在生菜细胞中复制 【答案】B 【详解】A、改造人胰岛素基因是依据 “植物偏好密码子”，密码子改变但编码的氨基酸不变（密码子的简并性），因此表达产物的氨基酸序列与天然胰岛素完全相同，A 错误； B、质粒1含Hind Ⅲ、Xba Ⅰ 酶切位点，质粒2含Hind Ⅲ、Xba Ⅰ 酶切位点，用这两种酶切割质粒1和质粒2，可将 “启动子 + 胰岛素基因” 连接到质粒2上构建质粒3（保证黏性末端匹配），B 正确； C、基因表达载体含 “潮霉素抗性基因”（筛选标记），因此应使用含潮霉素的培养基筛选；卡那霉素抗性基因不在T-DNA区域，未整合到最终载体中，C错误； D、农杆菌Ti质粒的T-DNA可整合到植物细胞的染色体DNA上，借助植物细胞的复制系统完成复制，无需额外添加复制原点，D错误。 故选B。 3．（2025·天津河西·二模）双向启动子可同时结合两个RNA聚合酶来驱动下游基因的表达，研究人员构建了如图所示的表达载体，以检测双向启动子作用效果。下列分析正确的是（　　）    A．表达载体中GUS基因和LUC基因转录时使用同一条DNA单链为模板 B．为连入GUS基因，需用SalⅠ和SphⅠ酶切已整合了双向启动子及LUC基因的质粒 C．在培养基中添加壮观霉素可筛选出成功导入表达载体的受体细胞 D．通过观察是否出现荧光和蓝色物质可检测双向启动子的作用效果 【答案】D 【详解】A、转录是从子链（mRNA）5'→3'方向进行的，由图可知，双向启动子位于GUS基因和LUC基因之间，所以GUS基因和LUC基因转录时的模板链不是DNA分子的同一条链，A错误； B、如果用SphI 酶切已整合了双向启动子及LUC基因的质粒时就会破坏LUC基因，B错误； C、T-DNA中含有潮霉素抗性基因，而不包含壮观霉素抗性基因，因此可以通过在培养基中添加潮霉素来筛选成功导入表达载体的受体细胞，C错误； D、双向启动子如果正常表达，就会合成荧光素酶和β-葡萄糖苷酶，催化底物分别产生荧光或生成蓝色物质，从而确定双向启动子的作用，D正确。 故选D。 02 基因工程的基本操作程序 4．（2024·天津·三模）为了对重金属污染的土壤进行生物修复，研究者将从杨树中克隆的重金属转运蛋白（HMA3）基因与外源高效启动子连接，导入杨树基因组中（如图）。 为检测获得的转基因杨树苗中是否含有导入的HMA3基因，同时避免内源HMA3基因的干扰，在进行PCR扩增时，应选择的引物组合是（    ） A．①+③ B．①+② C．③+② D．③+④ 【答案】B 【详解】图示中克隆的重金属转运蛋白（HMA3）基因与外源高效启动子连接，导入杨树基因组中，若要检测获得的转基因杨树苗中是否含有导入的HMA3基因和高效启动子，需要检测是否含有高效启动子序列和HMA3基因序列，应选择的引物组合是①+②，即B正确，ACD错误。 故选B。 5．（2025·天津·二模）双向启动子可同时结合两个RNA聚合酶来驱动下游基因的表达，研究人员构建了下图所示的表达载体，以检测双向启动子作用效果。下列分析正确的是（    ） A．可用农杆菌转化法将构建好的表达载体导入动物细胞 B．可通过观察是否出现荧光确认双向启动子的作用 C．在培养基中添加壮观霉素可筛选出成功导入表达载体的植物受体细胞 D．为连入GUS基因，需用SalI和AgeI酶切已整合了双向启动子及LUC基因的质粒 【答案】D 【详解】A、将基因表达载体导入植物细胞常用的方法是农杆菌转化法，而非导入动物细胞的方法，A错误； B、双向启动子如果正常表达，就会合成荧光素酶和β-葡萄糖苷酶，催化底物分别产生荧光或生成蓝色物质，从而确定双向启动子的作用，B错误； C、如果成功导入含有壮观霉素抗性基因的基因表达载体，受体细胞就具有抗壮观霉素的能力，在含有壮观霉素的培养基上能生存，因此可以筛选出成功导入表达载体的微生物受体细胞，C错误； D、根据题图分析可知，在不破坏破坏LUC基因前提下，为连入GUS基因，需用SalI和AgeI酶切已整合了双向启动子及LUC基因的质粒，D正确。 故选D。 6．（2025·天津南开·一模）研究表明，COX-2基因与肿瘤细胞的迁移有关，科研人员通过构建COX-2基因表达载体（如图），用于进一步研究COX-2基因表达产物对肿瘤细胞迁移的作用机制。图中1链为转录的模板链，BamHⅠ、SacⅠ为限制酶识别序列，LacZ基因表达产物可使显色剂X-gal变蓝。下列说法正确的是（    ） A．通过PCR扩增COX-2基因片段，需要加入引物A和引物D B．为构建COX-2表达载体，需在与1链结合的引物的5'端添加BamHⅠ识别序列 C．在含氨苄青霉素的培养基中能生长的是含重组质粒的菌落 D．在含X-gal培养基中长出的蓝色菌落含重组质粒 【答案】B 【详解】A、已知COX-2基因的1链为转录的模板链，根据PCR扩增引物的设计原则，引物需要与模板链的两端互补。由图可以看出，引物C与1链的3'端互补，引物B与2链的3'端互补，DNA聚合酶是从引物的3''端进行延伸的，所以应该选择引物B和C扩增COX-2基因，A错误； B、使基因准确插入质粒，需要在引物的5'端添加限制酶的识别序列。DNA聚合酶是从引物的3'端开始延伸DNA链的，在5'端添加序列不影响DNA链的延伸，同时可以利用限制酶对引物和质粒进行切割，以便后续连接。从质粒的结构（有BamHⅠ和SacⅠ的酶切位点）以及实验目的来看，与1链结合的引物的5'端需添加限制酶BamHⅠ，与2链结合的引物的5'端需添加限制酶SacⅠ的识别序列，B正确； C、在含氨苄青霉素的培养基中能生长的是含重组质粒的菌落，也可能是空载质粒，C错误； D、根据题意，在含X-gal培养基中长出的白色菌落含重组质粒，D错误。 故选B。 7．（2025·天津·二模）癌症是人类健康的重大威胁之一，传统治疗手段难以实现精准治疗。超声波具有非侵入、组织穿透性强、时空特异性等特点，科研人员拟开发“响应超声波的药物递送系统”细菌以实现癌症的精准治疗。 (1)用于培养药物递送细菌的液体培养基中包含水、酵母提取物、蛋白胨等成分，其中蛋白胨主要为细菌提供____和维生素。可利用____的方法快速直观地测定细菌数量，以便即时使用适量的细菌进行治疗。 (2)C蛋白有抗肿瘤作用，超声波可导致局部温度升高到42℃。科研人员制备了工程菌1，其中含有图1所示的基因表达载体。37℃培养的工程菌1接受超声波刺激后，可升温至42℃，____，从而发挥抗肿瘤作用。    (3)T蛋白有T1、T2和T3三种亚型，具有相似的功能，制备分别含有这三种基因的工程菌1，并检测C蛋白表达量，结果如图2所示。科研人员最终选择____（填T1、T2或T3）基因进行后续研究，判断的依据是_____。 (4)工程菌1只能在超声波刺激期间发挥作用，科研人员设计了含图3所示的基因表达载体的工程菌2，可以实现在短时间的超声波刺激后维持长时间的治疗。已知B基因编码的B酶可以作用于识别位点a和b，使a、b处的DNA发生断裂，最终导致a、b之间的DNA片段发生倒转。请根据以上信息，使用下列选项将表达载体补充完整。____；____；____；____；____。    ①P1启动子②P3启动子（持续表达型启动子）③T基因④C基因⑤B基因 【答案】(1) 碳源、氮源 显微镜直接计数 (2)解除T蛋白二聚体对P1启动子的抑制，启动C基因的表达 (3) T3 温度由37℃到42℃时，含有T3亚型的C蛋白表达量变化最大 (4) P3启动子 C基因 P1启动子 B基因 T基因 【详解】（1）蛋白胨的作用：蛋白胨是由蛋白质水解得到的产物，含有多种氨基酸、多肽等，可为细菌生长提供碳源、氮源（合成蛋白质、核酸等的原料），同时也可提供部分碳源和维生素。 细菌计数方法：题目要求 “快速直观” 测定细菌数量，常用方法为显微镜直接计数法（如血球计数板法），通过显微镜直接观察并计数菌体，无需培养，适合即时检测。 （2）根据图 1，工程菌 1 的基因表达载体中，C 基因由 P1 启动子驱动，且 T 基因（编码 T 蛋白）由持续表达型启动子 P2 驱动。 37℃时，T 蛋白可能抑制 P1 启动子活性，导致 C 基因不表达；当超声波刺激升温至 42℃，温度变化可能使 T 蛋白的抑制作用解除（或 P1 启动子在高温下激活），从而启动 C 基因转录，产生具有抗肿瘤作用的 C 蛋白。 （3）图 2 纵坐标为 C 蛋白表达量，横坐标为温度。观察不同 T 蛋白亚型（T1、T2、T3）对应的曲线，T3 亚型在 37℃时表达量最低，42℃时表达量最高，即温度响应最显著（表达量变化幅度最大）。 选择 T3 基因的原因是：在超声波升温（37℃→42℃）后，其驱动的 C 基因表达量激增最明显，能更高效地发挥抗肿瘤作用。 （4）目标：工程菌 2 需在短时间超声波刺激后维持长时间治疗，即通过一次刺激启动持续表达。 B 酶的作用：B 酶可识别位点 a 和 b，使中间 DNA 片段倒转。倒转后，启动子方向需与转录方向一致。 载体设计逻辑：P2启动子之后应连接T3基因；a、b之间应为持续表达型启动子，即P3启动子，其后应连接的是④C 基因；中间应为P1 启动子和B 基因，超声刺激升温后，P1启动子的抑制解除，启动B基因转录，表达的B酶使a、b之间DNA片段逆转，进而启动C基因的持续表达。 03 蛋白质工程及其应用 8．（2024·天津·一模）下列对发酵工程应用的描述错误的是（　　） A．微生物肥料是利用微生物代谢产生的有机酸、生物活性物质等来增进土壤肥力 B．利用发酵工程从微生物细胞中提取单细胞蛋白，生产微生物饲料 C．微生物农药是利用微生物或其代谢物来防治病虫害的 D．发酵工程和蛋白质工程结合能生产自然界不存在的蛋白质 【答案】B 【详解】A、微生物肥料是利用微生物代谢产生的有机酸、生物活性物质等来增进土壤肥力的，常见的有根瘤菌肥、固氮菌肥，A正确； B、微生物饲料主要是利用微生物大量繁殖产生的高蛋白菌体来生产饲料的，而并非是从菌体提取单细胞蛋白，B错误； C、微生物农药是利用微生物或其代谢产物来防治农林害虫的，作为生物防治的重要手段，将在农业的可持续发展方面发挥越来越重要的作用，C正确； D、由蛋白质工程概念可推知发酵工程和蛋白质工程结合能生产自然界不存在的蛋白质，D正确。 故选B。                           9．（2025·天津河西·一模）在蛋白质特定位置的氨基酸侧链基团上安装一个分子接头，诱导蛋白质主链发生局部环化的技术，可改变蛋白质局部的折叠方式从而调控其功能。下列有关此技术的叙述正确的是（    ） A．改造蛋白质需要通过基因工程来实现 B．适用于改造任意氨基酸序列的蛋白质 C．可能导致蛋白质分子内氢键数量发生变化 D．改变了氨基酸的种类和数量从而改变蛋白质的功能 【答案】C 【详解】A．该技术是对蛋白质直接进行化学修饰（在侧链基团安装分子接头），并不同于蛋白质工程中通过改造基因来改造蛋白质，无需通过基因工程改变DNA序列来合成新蛋白质，A错误； B．该技术要求在“特定位置”的氨基酸侧链进行操作，说明对氨基酸类型（如需特定反应基团）和位置有选择性，并非适用于任意序列的蛋白质，B错误； C．局部环化会改变蛋白质主链构象，而氢键是维持二级结构（如α螺旋、β折叠）和三级结构的关键作用力，构象变化可能导致分子内氢键数量或分布改变，C正确； D．该技术是通过修饰侧链基团（如巯基、氨基等）而改变蛋白质的空间结构，未替换或增减氨基酸，故氨基酸种类和数量不变，D错误； 故选C。 10．（2025·天津河西·一模）科学家通过对相关基因进行改造，使T4溶菌酶的第3位异亮氨酸变成了半胱氨酸，于是在该半胱氨酸与第97位的半胱氨酸之间形成了一个二硫键，T4溶菌酶的耐热性得到了提高。下列说法错误的是（　　） A．若利用微生物生产T4溶菌酶，可采用显微注射技术将重组质粒导入受体细胞 B．该技术需要从预期的蛋白质功能出发，推测应有的氨基酸序列 C．该技术属于蛋白质工程，合成的蛋白质不是自然界中已存在的 D．改造后T4溶菌酶的氨基酸序列和空间结构都不同于天然溶菌酶 【答案】A 【详解】A、利用微生物生产T4溶菌酶，可以使用处理的方法将目的基因导入受体细胞，A错误； B、该技术需要从预期的蛋白质功能出发，推测应有的氨基酸序列，属于蛋白质工程，B正确； C、该技术属于蛋白质工程，合成的蛋白质不是自然界中已存在的，C正确； D、改造后T4溶菌酶的氨基酸序列与天然溶菌酶不同，由于新形成了二硫键，其空间结构也不同于天然蛋白质，D正确。 故选A。 11．（2024·天津·一模）α-环糊精是食品、医药等常用原料。α-环糊精葡萄糖糖基转移酶（cgt）生产α、β和γ环糊精的混合物，分离纯化十分不便。cgt在芽孢杆菌中的产量较低，诱变效果不佳。cgt的372位天冬氨酸和 89 位酪氨酸是酶与底物作用的关键位点，江南大学一实验室将它们分别替换为赖氨酸和精氨酸后，形成的重组cgt催化特异性提高了27倍。 (1)重叠PCR是常用的 DNA定点突变技术，其原理如图所示。与细胞内的DNA 复制相比，PCR不需要用到_______酶。要完成两处位点的突变，至少要设计________种引物。图中第1对和第2对引物的PCR产物混合、变性、退火后可形成①②两种产物，其中产物①_________（能/不能）延伸，原因是_____________________________________________。 (2)如图是该酶编码（非模板）链的部分序列，请你设计替换372位天冬氨酸到赖氨酸（仅以密码子是AAG为例）的引物 FP2和RP1________________和_________________（只写371位到373位对应的9个碱基序列，并标出5'端和3'端）。 (3)上述过程需要用到____________工程。用大肠杆菌大量生产重组cgt需要解决酶的分泌问题，主要是因为大肠杆菌缺少________________（填细胞器）。成功获得工程菌后，还须对获得的α-环糊精葡萄糖糖基转移酶（cgt） 进行活性检测，这是属于____________水平的检测与鉴定。 【答案】(1) 解旋 6 不能 DNA 聚合酶只能将脱氧核苷酸添加到引物的 3'端 (2) 5'-GGCAAGCCC -3' 5'-GGGCTTGCC-3' (3) 蛋白质（或蛋白质和发酵） 内质网、高尔基体 个体 【详解】（1）与细胞内的DNA复制相比，PCR利用DNA热变性原理，90℃左右的温度下，氢键断裂，双链打开，不需要用到解旋酶；要完成两处位点的突变，由图可知，完成一处突变需要两种通用引物，和两种突变引物，如果要完成两种突变，则需要两种通用引物，和四种突变引物，至少要设计6种引物；PCR扩增过程中，耐高温的DNA聚合酶只能将4种脱氧核苷酸加到引物的3'端，图中产物①两条链的3'端无延伸的模板。 （2）372位天冬氨酸（GAC）替换为赖氨酸AAG，则从结果看，需要将题（2）图中展示序列第372为氨基酸对应三个碱基序列变为AAG，即371位到373位对应的9个碱基序列变为5'-GGCAAGCCC-3',再根据碱基互补配对原则，结合图中显示序列的突变引物RP1应为5'-GGGCTTGCC-3'，与图中显示序列互补的模板链结合的突变引物FP2应与突变引物RP1碱基互补，应为5'-GGCAAGCCC-3'。 （3）通过对自然界存在的指导合成cgt基因进行改造，来改造现有蛋白质cgt，最终得到重组cgt，这属于蛋白质工程；大肠杆菌是原核细胞，没有内质网、高尔基体等复杂的细胞器，不能将细胞内合成的重组cgt进行加工与分泌；成功获得工程菌后，目的基因已在细胞中成功表达为cgt，最后对cgt活性进行检测属于个体水平的检测与鉴定。 04 PCR技术 12．（2025·天津河西·三模）根据某基因上游和下游的碱基序列，设计合成了用于该基因PCR的两段引物（单链DNA）。引物与该基因变性DNA（单链DNA）结合为双链DNA的过程称为复性。下图是两引物的Tm（引物熔解温度，即50%的引物与其互补序列形成双链DNA分子时的温度）测定结果，以下分析错误的是（　　） A．PCR过程中，复性温度应高于引物的Tm值以提高PCR效率 B．两引物分别与DNA的两条互补单链结合，是子链延伸的起点 C．若两引物的脱氧核苷酸数相同，推测引物2的（G+C）含量较高 D．适当减少引物2的脱氧核苷酸数，可使其Tm值接近引物1 【答案】A 【详解】A、PCR过程中，复性温度应低于引物的Tm值以提高PCR效率，A错误； B、PCR过程是：目的基因DNA受热变性后解链为单链，引物与单链互补结合，合成的子链在DNA聚合酶的作用下进行延伸，所以两引物分别与DNA的两条互补单链结合，是子链延伸的起点，B正确； C、DNA含有的氢键数越多，其热稳定性越高，而A和T碱基对间有两个氢键，C和G碱基对间有三个氢键，曲线图显示：引物2的Tm高于引物1，说明引物2的热稳定性较高，因此若两引物的脱氧核苷酸数相同，推测引物2的（G+C）含量较高，C正确； D、适当减少引物2的脱氧核苷酸数，会降低引物2的热稳定性，可使其Tm值接近引物1，D正确。 故选A。 13．（2025·天津河西·一模）干扰素是一种具有干扰病毒复制作用的糖蛋白，在临床上被广泛用于治疗病毒感染性疾病。利用PCR技术扩增干扰素基因，可用于干扰素的规模化生产。下列有关叙述正确的是（　　） A．为使PCR产物能被限制酶切割，可在引物的5'端添加识别序列 B．在设计两种引物时，需要让引物和引物之间的碱基序列互补 C．PCR体系中需要添加耐高温的解旋酶和DNA聚合酶 D．PCR扩增干扰素基因时，子链的延伸方向是3'→5' 【答案】A 【详解】A、在引物的5'端添加限制酶识别序列，可使PCR产物两端带有特定酶切位点，便于后续与载体连接，A正确； B、两种引物应分别与模板DNA两条链的3'端互补配对，引物之间无需碱基序列互补，否则会导致非特异性结合，B错误； C、PCR通过高温（90-95℃）使DNA变性解链，无需解旋酶；催化子链合成的是耐高温的DNA聚合酶（如Taq酶），C错误； D、DNA聚合酶催化子链合成时，只能沿5'→3'方向延伸，D错误。 故选A。 14．（2025·天津河北·一模）在基因工程的PCR扩增及产物鉴定实验中，科学家需通过优化实验条件获得高特异性产物，并通过琼脂糖凝胶电泳验证结果（如图所示）。已知实验以质粒DNA为模板，目标产物为含EcoRⅠ酶切位点的500bp基因片段，下列叙述正确的是（    ） A．引物设计时5′端可添加EcoRⅠ识别序列，且使3′端与模板完全互补 B．当模板DNA和脱氧核苷酸存在时，TaqDNA聚合酶即可催化反应 C．电泳时设置合适的电压和时间主要是防止大分子DNA片段跑出凝胶 D．若标准样中c为750bp，则500bp目标产物应出现在b处 【答案】A 【详解】A、引物在5′端添加EcoRⅠ识别序列（GAATTC）以便构建表达载体，3′端需与模板完全互补以确保延伸特异性，A正确； B、Taq DNA聚合酶的催化需要适宜条件，还需Mg2+激活，B错误； C、电泳时需设置合适的电压和电泳时间，主要目的是控制DNA片段的迁移距离，使目标产物位于凝胶可视范围内，防止小分子跑出而非大分子DNA片段跑出，C错误； D、在琼脂糖凝胶电泳中，DNA片段迁移速率与分子大小呈负相关，500bp产物应位于750bp条带下方，所以若c为750bp，则产物500bp应出现在d处，D错误。 故选A。 15．（2025·天津蓟州·一模）为了将某纳米抗体和绿色荧光蛋白基因融合表达，运用重组酶技术构建质粒，如图1所示。请回答下列问题： (1)进行PCR扩增时需要耐高温的DNA聚合酶，为使其活化应在PCR反应缓冲液中加入________（填“Ca2+”或“Mg2+”）。 (2)有关基因序列如图2，引物F2-F、F1-R应在下列选项中分别选用_______。 A．5'-ATGGTG……CAACCA-3' B．5'-TGGTTG……CACCAT-3' C．5'-GACGAG……CTGCAG-3' D．5'-CTGCAG……CTCGTC-3' (3)将PCR产物片段与线性质粒载体混合后，在酶的作用下可形成环形质粒，直接用于转化细菌。这一过程与传统重组质粒构建过程相比，无需使用的酶主要是________。 (4)构建好的重组质粒除了含有目的基因、标记基因，还要有_______，用以控制目的基因的表达。 (5)如何将重组质粒导入大肠杆菌？_______。 (6)为了验证平板上菌落中的质粒是否符合设计，用不同菌落的质粒为模板，用引物F1-F和F2-R进行了PCR扩增，质粒P1~P4的扩增产物电泳结果如图3.根据图中结果判断，符合要求的质粒为______。 【答案】(1)Mg2+ (2)CD (3)限制酶 (4)启动子和终止子 (5)用Ca2+处理大肠杆菌，使细胞处于能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，可将重组质粒导入细胞 (6)P1和P2 【详解】（1）进行 PCR扩增时需要耐高温的DNA聚合酶，为使其活化应在PCR反应缓冲液中加入Mg2+。 （2）由图1可知，引物F2−F用于扩增F2片段，引物F1−R用于扩增F1片段，C选项中5′−GACGAG−3′ 能与EGFP基因右端和AnBI 中左侧部分碱基进行碱基互补配对，因此引物 F2−F 选用C；D选项中 5′−CTGCAG−3′ 能与AnBI 中左侧部分碱基和GFP基因右端右侧部分序列进行碱基互补配对，因此引物F1−R选用D。 故选CD。 （3）传统重组质粒构建需要使用限制性内切核酸酶(限制酶)切割质粒使其具有与目的基因相同的黏性末端，之后再用 DNA 连接酶将目的基因和质粒连接成重组质粒。将 PCR 产物片段与线性质粒载体混合后，在 DNA 连接酶的作用下可形成环化质粒，不需要使用限制酶。 （4）启动子好和终止子分别控制转录的开始和结束，故构建好的重组质粒除了含有目的基因、标记基因，还要有启动子和终止子，用以控制目的基因的表达。 （5）大肠杆菌属于原核生物，将重组质粒导入大肠杆菌一般是用Ca2+处理大肠杆菌，使细胞处于能吸收周围环境中 DNA 分子的生理状态。 （6）EGFP为720bp，AnBI 为390bp，二者的总大小为720bp+390bp=1100bp，用引物F1−F和F2−R进行了PCR扩增，其大小接近于P1、P2，根据图中结果判断，符合要求的质粒有P1、P2。 1．（2025·天津·一模）马铃薯作为重要农作物，提高其冷耐受性可拓展栽培马铃薯的种植区域。我国科研人员发现，野生马铃薯中S基因表达与其冷耐受性调控有关，将该基因导入栽培马铃薯中可显著增强其抗寒能力。结合下图分析，下列叙述错误的是（    ） 限制酶 识别序列及切割位点 BglⅡ EcoRⅠ XbaⅠ A．PCR扩增S基因时，需要模板、引物、4种脱氧核苷酸和耐高温的DNA聚合酶等 B．为保证S基因正确插入载体中，需对其上游引物的5′端添加碱基序列5′-GAATTC-3′ C．用含重组Ti质粒的农杆菌侵染栽培马铃薯后，利用抗性基因2筛选成功转化的细胞 D．将已转化的马铃薯与普通栽培马铃薯种植在寒冷条件下可检验S基因是否发挥作用 【答案】B 【详解】A、PCR扩增基因的必备条件是：模板（S 基因的 DNA）、引物、4 种脱氧核苷酸（dNTP）、耐高温的 DNA 聚合酶（Taq 酶），A正确； B、为保证S基因正确插入载体中，扩增目的基因时，需要在引物的5“端添加限制酶的识别序列。结合图表分析，在载体的启动子和终止子之间有BglⅡ、EcoRI和XbaⅠ的识别序列，切割载体需从这三种酶里选两种；而S基因内部含有XbaⅠ，这种酶不能用于切割S基因。再根据各种限制酶的识别序列及切割位点，可知，需要用BglⅡ、EcoRI切割载体，同时用BglⅡ和EcoRI切割S基因，才能保证S基因的正向连接(启动子一端)，故PCR扩增S基因时需在上游引物添加的碱基序列是5'-AGATCT-3'，在下游引物添加的碱基序列是5'-GAATTC-3'，B错误； C、Ti 质粒的T-DNA区域包含抗性基因2（图中抗性基因2位于T-DNA范围内），T-DNA 会转移到植物细胞，因此可利用抗性基因2筛选转化细胞，C正确； D、检验S基因是否发挥抗寒作用，可通过表型鉴定：将已转化（含S基因）和普通马铃薯种植在寒冷条件下，对比两者的抗寒能力，即可验证S基因的功能，D正确。 故选B。 2．（2025·天津·二模）生物技术与工程的发展催生了生物医药的生产。下列相关操作的叙述正确的是（    ） A．体外培养杂交瘤细胞制备单克隆抗体时，培养液中加入血浆会影响单克隆抗体的纯度 B．对动物细胞培养时需要无菌无毒的环境，因此需要对培养基进行消毒处理 C．将基因组文库中的胰岛素基因与大肠杆菌的DNA重组后可利用发酵工程生产胰岛素 D．将药用蛋白基因与腺病毒重组，然后侵染奶牛的乳腺细胞可得到乳腺生物反应器 【答案】A 【详解】A、体外培养杂交瘤细胞制备单克隆抗体时培养液中加入血浆会影响单克隆抗体的纯度，因为血浆中可能有其他的抗体，A正确； B、对动物细胞培养时需要无菌无毒的环境，需要对培养基进行湿热灭菌处理，B错误； C、从基因组文库中获得的胰岛素基因有内含子，在大肠杆菌中，其初始转录产物中与内含子对应的RNA序列不能被切除，无法表达出胰岛素，C错误； D、将药用蛋白基因和乳腺蛋白启动子等调控元件一起与腺病毒重组，导入受精卵中可制备乳腺生物反应器，不是导入乳腺细胞中，D错误。 故选A。 3．（2024·天津·一模）免疫PCR是对微量抗原的一种检测方法。下图是利用该技术检测牛乳中微量抗生素的流程图：首先将抗体1固定在微板上，冲洗后加入待检的牛乳，再加入DNA标记的抗体2，进行PCR扩增，最后进行电泳检测。下列相关叙述错误的是（    ） A．PCR扩增获得产物的量越多，电泳后距离点样孔越近 B．图示过程所需抗体无需对高温有较强的耐受性 C．图示过程中三次冲洗的目的均不同 D．图示抗原检测过程发生两次抗原与抗体的结合 【答案】A 【详解】A、PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定，在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。在带电量相同的情况下，相对分子质量比较大的DNA片段迁移速度慢，因而距离加样孔越近，但与产物的量无关，A错误； B、该免疫PCR检测的原理是将一段已知序列的DNA片段标记到抗体2上，通过抗原抗体的特异性识别并结合，抗体2会与固定抗体1、抗生素形成复合物“固定抗体1—抗生素—抗体2”，再用PCR方法将这段DNA进行扩增，通过检测PCR产物的量（DNA片段的量），即可推知固定抗体1上吸附的抗生素的量，与抗体是否耐高温没有多大关系，因此图示过程所需抗体无需对高温有较强的耐受性，B正确； C、图示过程，第一次冲洗是为了去除未结合的抗体1，第二次冲洗是为了去除未结合的抗生素和牛奶成分，第三次冲洗是为了去除未结合的抗体2，三次冲洗的目的均不同，C正确； D、据图可知，图示抗原检测过程分别与抗体1和抗体2结合了一次，共发生两次抗原与抗体的结合，D正确。 故选A。 4．（2024·天津河北·一模）miRNA是一类真核生物中广泛存在的单链非编码RNA分子．成熟的miRNA与AGO家族蛋白结合形成沉默复合体，该复合体可通过识别和结合靶基因转录出的mRNA并对其进行剪切或抑制其翻译过程，从而调控生物性状。下列相关分析正确的是（    ） A．miRNA基因的表达包括转录和翻译两个阶段 B．沉默复合体发挥作用的场所是细胞核 C．利用PCR技术可检测靶基因转录出的mRNA的相对含量 D．沉默复合体通过碱基互补配对的方式识别靶基因并抑制其表达 【答案】C 【详解】A、根据题意，成熟的miRNA与AGO家族蛋白结合形成沉默复合体，该复合体可通过识别和结合靶基因转录出的mRNA并对其进行剪切或抑制其翻译过程，所以miRNA基因的表达过程只有转录阶段，不翻译成蛋白质，A错误； B、有题干可知，沉默复合体可对靶基因转录出的mRNA并对其进行剪切或抑制翻译过程，因此其发挥作用的场所是细胞质，B错误； C、现将靶基因转录出的mRNA进行逆转录得到cDNA，再利用PCR技术可检测靶基因转录出的mRNA的相对含量，C正确； D、沉默复合体通过碱基互补配对的方式识别靶基因转录出的mRNA，不是直接识别靶基因，D错误。 故选C。 5．（2024·天津·一模）研究发现，水稻蜡质基因（Wx）编码直链淀粉合成酶。若Wx基因中第226位碱基是正常的G，该位点所在的内含子能被正常剪接，胚乳中直链淀粉含量最高，基因型记做GG；若该位点突变成T，则不能被正常剪接，胚乳中直链淀粉的合成水平会降低，基因型记做TT。为检测Wx基因该位点碱基是G或T，研究人员以待测水稻叶片总DNA为材料，以Wx基因片段设计引物如图所示，对PCR扩增产物经AccⅠ酶切后电泳。已知引物1为5＇-GCTTCACTTCTCTGCTTGTG-3＇，两引物之间无另外的AccI酶的识别位点。下列叙述正确的是（　　） A．组成上述两种淀粉合成酶的氨基酸的种类不同，数目相同 B．GT杂合型水稻品种酶切电泳结果为2条条带 C．若酶切产物只能观察到大约460bp的DNA条带，则表明该水稻品种为TT型 D．该实验中需设计的引物2为5＇-TTCAACTCTCGTTAAATCAT-3＇ 【答案】C 【详解】A、由题意可知，若Wx基因中第226位碱基是正常的G，该位点所在的内含子能被正常剪接，若该位点突变成T，则不能被正常剪接，由于内含子不能被剪切后会导致用于翻译的mRNA比内含子被正常剪切后的mRNA变长，因此翻译形成的上述两种淀粉合成酶的氨基酸的数目不相同，A错误； B、若Wx基因中第226位碱基是正常的G，该位点所在的内含子能被正常剪接，胚乳中直链淀粉含最高，基因型记做GG；若该位点突变成T，则不能被正常剪接，胚乳中直链淀粉的合成水平会降低，基因型记做TT，故GT杂合型水稻品种的G能被酶切成两段，而T不能被酶切，故酶切电泳结果为3条条带，B错误； C、PCR产物从71bp开始，到530bp为止，共460bp。若PCR产物不被酶切，电泳后只有一条460bp左右的条带，则基因型为TT，C正确； D、分析题图可知，引物的延伸方向为5'→3'，故图示所给引物1设计区碱基序列所在的DNA链为非模板链，故引物1的碱基序列与非模板链的碱基序列相同，而引物2要以引物2设计区碱基序列所在的DNA链为模板，故引物2的碱基序列应与所给序列碱基互补配对，该实验中需设计的引物2为5'－ATGATTTAACGAGAGTTGAA－3'，D错误。 故选C。 6．（2024·天津河北·三模）番茄在低温下运输、储存的过程中，容易出现冻伤，影响番茄的品质。科学家利用基因工程技术将AFPs抗冻基因转入番茄植株，培育抗冻番茄。下列叙述错误的是（    ） A．筛选与获取AFPs抗冻基因是培育抗冻番茄的首要步骤 B．基因表达载体中的启动子是 RNA 聚合酶识别和结合的位点 C．AFPs抗冻基因可通过农杆菌转化法转移至双子叶植物细胞中 D．抗冻番茄培育成功的标志是检测出番茄细胞中含 AFPs基因 【答案】D 【详解】A、基因工程基本操作程序：目的基因的获取、基因表达载体的构建、目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定。故筛选和获取AFPs抗冻基因是培育抗冻番茄的首要步骤，A正确； B、基因表达载体中的启动子是 RNA聚合酶识别和结合的位点，能控制转录的开始，B正确； C、将目的基因导入植物细胞最常用的方法是农杆菌转化法，C正确； D、只有番茄具有抗冻性才能代表抗冻番茄培育成功，含有的 AFPs基因若不表达，也不会形成抗冻番茄，D错误。 故选D。 7．（2025·天津武清·二模）同源重组技术结合tetr-sacB双重选择系统可对基因进行敲除与回补以研究基因的功能：如图1是科研人员利用该方法对大肠杆菌LacZ基因进行敲除与回补的相关过程，tetr是四环素抗性基因。sacB基因（2071bp）是蔗糖致死基因，LacZ基因表达产物能将培养基中的无色化合物X-gal水解成蓝色化合物。请回答下列问题。    (1)据图1分析：过程①中，设计两种引物时需在引物5′端分别添加的限制酶序列是________；过程⑤中，为了精确完成目的基因的敲除，设计引物时需在引物的5′端添加上________序列。 (2)过程③中，将质粒3导入大肠杆菌甲的目的是________。 (3)下图2是对完成过程⑥后的菌落进行鉴定时的PCR产物电泳结果。    其中泳道________（填数字）对应的菌株可能转化成功。过程⑦中，在含有________和X-gal培养基中若出现________色菌落，即为LacZ基因敲除菌株。 (4)过程⑧是通过同源重组技术结合tetr-sacB双重选择系统可对LacZ基因再进行回补，则在筛选LacZ基因回补菌株时应在培养基中添加________和X-gal。推测对已敲除的基因进行回补的主要目的是_______。 【答案】(1) EcoR I、BamH I LacZ基因两端的同源 (2)让质粒3在大肠杆菌中进行扩增（或扩增质粒3或增加质粒3的数量） (3) 4、5、7 四环素 白 (4) 蔗糖 作为对照，进一步证明相应功能（或性状的改变的确是由该基因缺失所引起的） 【详解】（1）观察图1，HindⅢ会破坏tetr基因，XmaⅠ会破坏复制原点，为保证sacB基因和质粒2定向连接，应用限制酶BamHⅠ、EcoRⅠ切割目的基因和质粒，引物是根据目的基因两端的DNA序列设计的，因此设计引物时，需在引物5'端添加限制酶BamHⅠ、EcoRⅠ的识别序列。过程⑤是为了精确完成目的基因（LacZ基因）的敲除，需要利用同源重组，所以设计引物时需在引物的5'端添加上LacZ基因两端的同源序列。 （2）过程③中，将质粒3导入大肠杆菌甲，质粒3中含有tetr-sacB片段等，导入大肠杆菌甲的目的是让质粒3在大肠杆菌中进行扩增（或扩增质粒3或增加质粒3的数量），为后续将其导入大肠杆菌乙进行基因敲除做准备。 （3）sacB基因是目的基因，sacB基因中含有2071bp，4、5、7的电泳结果接近（或大于）2071bp，说明4、5、7对应的菌株中含有目的基因，说明泳道4、5、7对应的菌株可能转化成功。过程⑦中，由于sacB基因是蔗糖致死基因，LacZ基因表达产物能将无色化合物X-gal水解成蓝色化合物，LacZ基因敲除菌株不能将X-gal水解成蓝色化合物，且含有tetr（四环素抗性基因），所以在含有四环素和X-gal培养基中若出现白色菌落，即为LacZ基因敲除菌株。 （4）过程⑧是对LacZ基因进行回补，由于sacB基因是蔗糖致死基因，回补后的菌株含有完整的LacZ基因能将X-gal水解成蓝色化合物，所以在筛选LacZ基因回补菌株时应在培养基中添加蔗糖和X-gal。对已敲除的基因进行回补的主要目的是作为对照，进一步证明相应功能（或性状的改变的确是由该基因缺失所引起的）。 8．（2025·天津南开·二模）白细胞表面抗原2(SLA-2)在抗原呈递、器官移植以及免疫应答方面有着重要作用。为进一步研究SLA-2的结构与功能，科研人员以能稳定传代的猪肾上皮细胞为材料，构建了稳定高表达 SLA-2基因的细胞株，过程如下图。其中AmpR为氨苄青霉素抗性基因，PuroS为嘌呤霉素抗性基因，嘌呤霉素是真核生物和原核生物中蛋白质合成的有效抑制剂。Bcl I、Not I、Xba I、Sau3A I为限制酶，括号内数值表示距复制原点的长度。请回答下列问题： 限制酶 Bcl I Not I Xba I Sau3A I 识别序列和切割位点 (5'-3') 5'-T↓GATCA-3' 5'-GC↓GGCCGC-3' 5^'-T↓CTAGA-3' 5^'-↓GATC-3' (1)已知限制酶X识别的序列有回文对称的特点，即一条链从左往右读和其互补链从右往左读的序列是相同的。SLA-2 基因上的一段核苷酸序列为“-ATCTCGAGCGGG-”，则对该序列进行剪切的限制酶X 识别的核苷酸序列最可能为___________________________(写出6个核苷酸)。 (2)图中SLA-2基因以a链为转录模板链，由此可以推测 SLA-2基因的转录是从其__________________(填“左侧”或“右侧”)开始的；过程④需将 SLA-2基因准确插入到质粒2中，为保证图中SLA-2基因按照正确的方向与质粒2连接，SLA-2基因位点1和2 的识别序列所对应的酶分别是_________________，酶切后加入___________________酶使它们形成重组质粒。 (3)研究人员将过程④提取的重组质粒用Not Ⅰ和 Sau3A Ⅰ完全酶切，可能得到的条带大小为______________ bp。 (4)科研人员为了筛选出抗嘌呤霉素的猪肾上皮细胞，应选择添加___________________的培养基。为确定最小致死浓度 (使某种细胞全部死亡的最小浓度)，所培养的猪肾上皮细胞应为________________(填“转化”或“未转化”)的猪肾上皮细胞。 【答案】(1)-CTCGAG-（或-GAGCTC-） (2) 右侧 XbaⅠ酶和NotⅠ酶 DNA连接 (3)3305、1240、963、177 (4) 嘌呤霉素 未转化 【详解】（1）根据题目信息“已知限制酶X识别的序列有回文对称的特点，即一条链从左往右读和其互补链从右往左读的序列是相同的”可知，结合SLA-2基因上的一段核苷酸序列为“-ATCTCGAGCGGG-”可确定，对该序列进行剪切的限制酶X识别的核苷酸序列最可能为-CTCGAG-（或-GAGCTC-）。 （2）①图中SLA-2基因以a链为转录模板链，由于子链的延伸方向是5’→3’，由此可以推测SLA-2基因的转录是从其“右侧”开始的； ②过程④需将SLA-2基因准确插入到质粒2中，为保证图中SLA-2基因按照正确的方向与质粒2连接，由于BclⅠ中包含Sau3AⅠ的识别序列，因此不能选择Sau3AⅠ对质粒进行切割，又知目的基因的位点2是转录的起始点，因此应该在位点2的一端添加NotⅠ酶的识别序列，在位点1部位添加XbaⅠ酶的识别序列，即SLA-2基因位点1和2的识别序列所对应的酶分别是XbaⅠ酶和NotⅠ酶； ③酶切后加入DNA连接酶使它们形成重组质粒。 （3）研究人员将过程④提取的质粒用NotI和Sau3AI完全酶切，由于BclⅠ中包含Sau3AⅠ的识别序列，根据酶的识别序列可知，Sau3AI也能切割BclⅠ所识别的序列，则重组质粒中有3个酶切位点，即用NotI和Sau3AI完全酶切质粒2后获得的序列为2273-1310=963bp，2450-2273=177bp，2450-2273+1100-（2310-2273）=1240bp，4445-（2450-1310）=3305bp，综上所述，可能得到的条带大小为3305、1240、963、177。 （4）①结合（2）与题目信息分析可得，科研人员为了筛选出抗嘌呤霉素的猪肾上皮细胞，需要在培养基中添加嘌呤霉素； ②为确定最小致死浓度（使某种细胞全部死亡的最小浓度），所培养的猪肾上皮细胞应为“未转化”的猪肾上皮细胞，以此作为对照来检测转化的猪肾上皮细胞的抗性。 9．（2025·天津北辰·三模）科研团队为研究番茄抗虫基因（SIJA2）的功能，进行了相关实验。图1为SIJA2基因过表达番茄（OE）构建的过程，图2为SIJA2基因敲除突变番茄（KO）构建的部分过程。    (1)图1中，①过程需要消耗的原料为________。为保证SIJA2基因能与载体正确连接形成重组质粒且以B链充当转录的模板，在进行引物设计时，应在引物_______和引物_______的5'端，分别添加限制酶_______和_______的识别序列。除了限制酶，过程②还需用到_______酶。为提高SIJA2基因导入受体细胞的几率在过程③可用_______处理受体细胞。愈伤组织通过⑤________过程可获得SIJA2基因过表达番茄（OE）。 (2)CRISPR/Cas9由sgRNA（单链向导RNA）和Cas9蛋白两大部分组成，sgRNA由crRNA和tracrRNA组成，其中crRNA含有与靶基因片段配对的序列，能引导Cas9切开靶基因所在双链DNA，随后细胞将断裂上下游两端的序列连接起来，实现对基因的编辑，如图2所示。要准确敲除SIJA2基因，需设计正确的向导RNA（sgRNA），才能准确引导Cas9蛋白切割SIJA2基因。设计sgRNA需要的信息及运用的原理是________。 (3)科研人员将OE、KO以及未处理（WT）三组番茄进行一系列实验，定期测量相关数据，记录于下表：（注：“+”的数目代表程度或数量变化） 组别 SIJA2基因表达量 抗虫性 生长速率 产量 OE +++ +++ +++ ++++ KO － + + + WT + ++ ++ ++ 进一步研究发现，OE番茄通过SIJA2基因的过表达，使其实现抗虫性强、生长速率快及产量增加的三重效果，由此看出基因和性状之间存在的数量关系是________。 【答案】(1) （四种）脱氧核苷酸 2 3 SmaI BamHI DNA连接酶 Ca2+ 再分化 (2)SIJA2基因的碱基序列及碱基互补配对原则 (3)一个基因（或一对基因）可以控制多个性状 【详解】（1）①过程是逆转录，以RNA为模板合成DNA，以脱氧核苷酸为原料，脱氧核苷酸连接在引物的3'端，所以应选引物2和引物3，同时为保证目的基因和运载体正确连接，避免反向连接，目的基因插入T-DNA中启动子和终止子之间（T-DNA携带目的基因进入受体细胞的DNA中），故不能选择XhoⅠ，因为会破坏潮霉素抗性基因，也不能选择NdoⅠ，NdoⅠ会切掉终止子，所以选择SmaI和BamHI，因此在引物的5'端分别连接SmaI和BamHI的酶切序列，过程②是构建基因表达载体，需要用限制酶和DNA连接酶，将表达载体导入受体细胞（农杆菌）常用Ca2+处理，使其成为感受态细胞，容易吸收外源DNA分子，愈伤组织通过再分化过程可获得SIJA2基因过表达番茄（OE）。 （2）sgRNA与靶基因上的序列配对，引导Cas9蛋白切割SIJA2基因，涉及的原理有SIJA2基因的碱基序列及碱基互补配对原则。 （3）OE番茄通过SIJA2基因的过表达，使其实现抗虫性强、生长速率快及产量增加的三重效果，说明一个基因（或一对基因）可以控制多个性状。 10．（2025·天津·一模）CRISPR/Cas9基因编辑技术可以改变目的基因序列。使用该技术，需要向细胞加入两种组分：向导RNA（用于和目的基因中待编辑的序列相结合）、核酸酶Cas9（用于识别并切割待编辑的序列，造成DNA双链断裂）。断裂后的DNA在细胞中发生修复，很容易造成目的基因序列发生改变，实现基因编辑。大薯D蛋白是大薯体内重要的贮藏蛋白，在人体内表现出抗氧化、抗炎等生物活性。我国科研工作者设计并构建了基因编辑载体（载体关键组分如下图所示），并利用此载体编辑大薯D蛋白基因以开展后续研究。回答下列问题： (1)构建基因编辑载体，需要将U启动子、向导RNA序列、T启动子、Cas9基因分别连接入农杆菌的________，形成重组DNA分子。上述载体的设计，一定需要利用D蛋白基因序列信息的是________。 (2)T启动子选用限制酶BclⅠ切割、载体选用限制酶BglⅡ切割以后，两者能顺利连接，原因最可能是_______。 (3)采用单酶切后进行连接反应，T启动子容易出现正向连接（图中箭头向右，目的基因正常转录）和反向连接（图中箭头向左，目的基因无法转录）两种情况。选用引物________（填序号），进行扩增可以鉴定出正向连接的情况，原因是_______。 (4)基因编辑载体成功构建并导入大薯细胞后，可采用________技术在分子水平检测D蛋白基因的编辑是否发生。 【答案】(1) Ti质粒的T-DNA 向导RNA序列 (2)BclI和BglII切割后产生的黏性末端相同 (3) ①③ 正向连接时，引物①③可正常扩增出目的条带，反向连接时无法扩增出目的条带 (4)DNA分子杂交 【详解】（1）构建基因编辑载体时，需要将U启动子、向导RNA序列、T启动子、Cas9基因分别连接入农杆菌的Ti质粒的T-DNA，形成重组DNA分子，因为农杆菌的Ti质粒的T-DNA可以转移，携带目的基因进入受体细胞并在其中进行表达。向导RNA用于和目的基因（D蛋白基因）中待编辑的序列相结合，所以向导RNA的设计一定需要利用D蛋白基因序列信息。 （2）不同的限制酶可能切割出相同的黏性末端，这样就可以使不同来源的DNA片段进行连接。限制酶Bcl Ⅰ切割T启动子，载体选用限制酶Bgl Ⅱ切割以后，两者能顺利连接，最可能的原因是这两种限制酶切割后产生的黏性末端相同。 （3）由图可知，在T启动子上含有引物②和引物③对应的结合序列，T启动子如果正向连接，目的基因正常转录，如果反向连接，目的基因无法转录，所以选用引物①和引物③（或引物②和引物④）进行扩增可以鉴定出正向连接的情况，原因是正向连接时使用引物①和引物③进行PCR可获得预期产物，反向连接无法获得扩增产物（或正向连接时使用引物②和引物④进行PCR可获得预期产物，反向连接无法获得扩增产物）。 （4）在基因工程中，检测目的基因（这里是编辑后的 D 蛋白基因 ）是否发生编辑（即分子水平的检测 ），常用DNA 分子杂交技术（原理是碱基互补配对，用标记的探针与待测 DNA 杂交，判断是否有目标序列变化 ）。 1．（2025·天津·高考真题）二倍体番茄浆果中的小分子化合物H对食用者有益。H是由前体物甲经酶A催化成乙，乙经酶B催化成丙，丙再经酶C催化而成。浆果积累这些化合物，仅影响自身籽粒数及食用者健康，对应关系如下表： 累积物 甲 乙 丙 H 食用者健康 无影响 有害 有害 有益 浆果籽粒数 多 无 少 多 表达酶A、B和C的基因分别为A、B和C，位于非同源染色体上。为获取浆果含H的纯合番茄植株（不考虑突变与染色体互换），开展以下研究。 (1)浆果含H的纯合番茄植株的基因型为_____。 (2)基因型AaBbCc植株自交，中浆果籽粒数有_____种表型，有籽浆果植株占_____。为获得理想番茄植株，须遴选浆果籽粒数_____的，具有该性状的自交，后代不出现性状分离的基因型有_____种（类群M）。随后，再遴选浆果含H且该性状不分离的植株。 (3)除直接测量浆果H含量外，还可分别提取类群M各自交子代浆果的蛋白质来筛选目标植株，其方法是：用_____抗体对提取的蛋白质进行特异性识别，阳性率为_____%的子代即为目标品系。 【答案】(1)AABBCC (2) 3 13/16（或81.25%） 多 11 (3) 酶A 100 【详解】（1）根据题干信息，H是由前体物甲经酶A催化成乙，乙经酶B催化成丙，丙再经酶C催化而成，而表达酶A、B和C的基因分别为A、B和C，所以浆果含H的纯合番茄植株的基因型为AABBCC。 （2）基因型AaBbCc植株自交，根据基因的自由组合定律，后代基因型有多种组合，浆果籽粒数的表型由基因控制，结合表格信息，多籽浆果的基因型aa----、A-B-C-，无籽浆果的基因型是A-bb--，少籽浆果的基因型是A-B-cc，所以F1中浆果籽粒数有3种表型。无籽浆果植株的基因型为A-bb--，其比例为3/4×1/4×1=3/16，所以有籽浆果植株占1-3/16=13/16。理想番茄植株要求浆果含H且籽粒数多，籽粒数多的表型对应的是有籽情况，所以须遴选浆果籽粒数多的F1，具有该性状（籽粒数多）的F1基因型为A-B-C-，自交后代不出现性状分离的基因型有aa----（1×3×3=9种）、A-BBCC（2种），共11种。 （3）类群M的基因型有2种，分别为aa----、A-BBCC，要筛选含H的植株，其基因型为A-BBCC，与aa----的植株相比，基因型为A-BBCC的植株含有酶A，所以除直接测量浆果H含量外，还可以分别提取类群M各自交子代浆果的蛋白质来筛选目标植株，用酶A抗体对提取的蛋白质进行特异性识别，阳性率为100%的子代即为目标品系（AABBCC）。 2．（2024·天津·高考真题）金黄色葡萄球菌（简称Sa）是人体重要致病细菌、不规范使用抗生素易出现多重抗药性Sa。 (1)Sa产生抗药性可遗传变异的来源有______（至少答出2点）。 (2)推测Sa产生头孢霉素抗性与其R基因有关。为验证该推测，以图1中R基因的上、下游片段和质粒1构建质粒2，然后通过同源重组（质粒2中的上、下游片段分别与Sa基因组中R基因上、下游片段配对，并发生交换）敲除Sa的R基因。    ①根据图1信息，简述质粒2的构建过程（需包含所选引物和限制酶）：______，然后回收上、下游片段，再与SacII酶切质粒1所得大片段连接，获得质粒2。 ②用质粒2转化临床分离的具有头孢霉素抗性、对氯霉素敏感的Sa，然后涂布在含______的平板上，经培养获得含质粒2的Sa单菌落。 ③将②获得的单菌落多次传代以增加同源重组敲除R基因的几率，随后稀释涂布在含______的平板上，筛选并获得不再含有质粒2的菌落。从这些菌落分别挑取少许菌体，依次接种到含____________的平板上，若无法增殖，则对应菌落中细菌的R基因疑似被敲除。 ④以③获得的菌株基因组为模板，采用不同引物组合进行PCR扩增，电泳检测结果如图2，表明R基因已被敲除的是______。    【答案】(1)基因突变、基因重组、表观遗传等 (2) 采用引物1和4进行PCR扩增（或采用引物1和3以及引物2和4分别进行PCR扩增），用SacⅡ和EcoRⅠ对PCR产物进行酶切 氯霉素（或氯霉素+头孢霉素） 脱水四环素 头孢霉素 D 【详解】（1）Sa为原核生物产生抗药性可遗传变异的来源有基因突变、基因重组、表观遗传等。 （2）①由图1可知，质粒2上依次接有SacⅡ、EcoRⅠ、SacⅡ三个酶切位点，而质粒1上只有SacⅡ酶切位点，R基因的上下游依次含有SacⅡ、EcoRⅠ、EcoRⅠ、SacⅡ酶切位点，若要构建质粒2，可以采用引物1和4进行PCR扩增可得到整个R基因，以及上下游片段（或采用引物1和3以及引物2和4分别进行PCR扩增），用SacⅡ和EcoRⅠ对PCR产物进行酶切，然后回收上、下游片段，再与SacII酶切质粒1所得大片段连接，获得质粒2。 ②用质粒2转化临床分离的具有头孢霉素抗性、对氯霉素敏感的Sa，因为重组的质粒2上含有氯霉素抗性基因，所以可以将重组后的含质粒2的菌落涂布在含氯霉素（或氯霉素+头孢霉素）的平板上，能生存下来的菌落就是，含质粒2的Sa单菌落。 ③推测Sa产生头孢霉素抗性与其R基因有关。为验证该推测需要敲除R基因，因为质粒2上含有Y可被脱水四环素又到表达的Sa致死基因，所以将②获得的单菌落多次传代以增加同源重组敲除R基因的几率，随后稀释涂布在含脱水四环素的平板上，可诱导R基因死亡，若无法增殖，则对应菌落中细菌的R基因疑似被敲除。 ④以③获得的菌株基因组为模板，采用不同引物组合进行PCR扩增，电泳检测结果如图2，表明R基因已被敲除的是D组，由图1可知，R基因两侧含有的引物为2和3，所以扩增后含有引物2或3，或者2和3的可能含有R基因，所以表明R基因已被敲除的是D组。 3．（2023·天津·高考真题）构建可利用纤维素产乙醇的转基因酿酒酵母菌株是解决能源危机的手段之一，为此设计表达载体，思路如下。 (1)外源基因的选择    纤维素常见生物降解途径如下。 酿酒酵母通常无法吸收纤维素、寡糖和纤维二糖，应向酿酒酵母转入上图中三种酶的基因，并使其表达产物在细胞________(内/外)发挥作用。 (2)外源基因的插入方法 同源重组是碱基序列基本相同的DNA区段通过配对、链断裂和再连接而产生片段交换的过程。通过同源重组将外源基因插入染色体的特定位点可获得遗传稳定的工程菌株，如甲图所示。 酿酒酵母基因组有多个AB短序列。为通过同源重组将外源基因插入AB之间，在设计表达载体时，可采用PCR技术在外源基因两端分别引入A和B,获得乙图所示长片段。PCR时应选用的一对引物为________(从P1~P6中选)。 (3)标记基因的选择  URA3是尿嘧啶合成关键酶基因，常被用作标记基因。另外，URA3编码的蛋白可将外源5-氟乳清酸转化为有毒物质，导致细胞死亡。 ①为得到成功插入酶I基因的菌株1，需将酶I基因同URA3一起插入URA3缺陷型酿酒酵母基因组AB之间，并利用__________的培养基筛选存活菌株。 ②在后续插入酶Ⅱ基因时，为继续利用URA3作为筛选标记，需切除菌株1的URA3。为此设计表达载体时，还应向URA3两端引入酿酒酵母基因组中不存在的同源区段C和C´,并以下图方式______排列才能通过同源重组达到上述目的。 此后，需要将菌株1在_________的培养基上培养，存活菌株即为URA3被成功切除的菌株1´。 (4)表达载体的构建   综上，为将三种酶基因依次插入酿酒酵母基因组中，在构建表达载体时，A、B、C、C´、URA3和酶基因应采用下图______的排布方式。 【答案】(1)外 (2)P1和P6 (3) 不含尿嘧啶 2 含有5-氟乳清酸和尿嘧啶（只答含有5-氟乳清酸得2分） (4)4 【详解】（1）由于酵母菌无法吸收纤维素、寡糖和纤维二糖，所以导入分解纤维素的酶发挥作用的场所在细胞外。 （2）根据题干信息“当目的基因两侧的小段序列与基因表达载体上某序列相同时，就可以发生同源切割，将目的基因直接插入”，要保证目的基因两侧的小段序列与基因表达载体上某序列相同，需要选择P1和P6这对引物进行PCR。 （3）①URA3 作为标记基因，其表达产物可以合成细胞代谢所必需的尿嘧啶，所以在筛选被转化的受体细胞时，需在培养基中去除尿密啶，无URA3(连同目的基因)的酵母细胞将无法存活，因此可筛选出含有目的基因及 URA3 的受体细胞。 ②如题图所示，方式1中URA3 两侧C、C’是反向同源序列，方式2中URA3 两侧C、C’是同向同源序列。在发生同源重组时，方式1只是导致URA3序列倒位，但不会切除 URA3；而方式2将导致 URA3 以环状小分子形式被切除，并在细胞分裂过程中因不能复制而丢失。故选方式 2。由于尿嘧啶可以使5-氟乳清酸转化为对酵母菌有毒物质，所以应该在含有5-氟乳清酸的培养基上，如果切割成功，则不含尿嘧啶，形成菌落，如果切割不成功，则会产生有毒物质，不能形成菌落。 （4）在明确了表达载体整体构建思路后，最终的表达载体需要同 时满足两个条件：一是需要将UR43标记基因与目的基因（酶基因）一起 插入酿酒酵母基因组AB之间，所以A、B应置于标记基因与目的基因最 外侧；二是需要利用C、C片段切除URA3 标记基因，同时不能影响酶基因，所以C、 C应紧邻URA3两侧。同时满足上述条件 的只有图4。 / 学科网（北京）股份有限公司 $ 专题14 基因工程 目录 第一部分 高考风向解读 洞察考向，感知前沿 第二部分 核心要点提升 要点精析、能力提升 要点01 限制酶的选择原则 要点02基因表达载体的构建 要点03目的基因的检测与鉴定 要点04 蛋白质工程的基本原理 第三部分 题型精准突破 固本培优，精准提分 A组·保分基础练 题型01 基因工程的基本工具 题型02基因工程的基本操作程序 题型03蛋白质工程及其应用 题型04 PCR技术 B组·增分能力练 第四部分 真题演练进阶 对标高考，感悟考法 考情解读 核心要点 高考考情 高考新风向 基因工程的基本工具 （2025天津卷）基因表达载体的构建、转基因的生物安全 （2024天津卷）蛋白质工程及应用 （2023天津卷）PCR技术的原理及应用（引物的选择） 1.夯实基础：熟练掌握工具酶、载体、PCR等核心概念。 2.关注前沿：了解基因编辑、合成生物学等领域的最新进展。 3.提升思维：注重从“技术原理→设计应用→评价反思”的逻辑训练。 4.强化实验：深入理解教材中相关实验的设计思路与分析方法。 · 基因工程的基本操作流程 PCR技术 蛋白质工程及应用 新风向演练 1．【新情境-骨架蛋白】（2025·天津·二模）幽门螺杆菌是一种常见的人类致病菌，其骨架蛋白MreB通过影响脲酶活性参与调控其致病性。为了研究MreB基因对脲酶活性的具体影响，科学家将该基因导入能合成脲酶且无抗生素抗性的另一种细菌中，所用质粒和目的基因如图所示。下列叙述正确的是（    ） A．为了将MreB基因定向插入到质粒中，可选SamⅠ和EcoRⅠ切割质粒 B．从卡那霉素选择培养基上生长的菌落中挑取的菌株即为目的菌株 C．用E.coliDNA连接酶构建重组载体能有效防止目的基因的反向连接 D．将重组质粒导入细菌的过程中，需用处理以增大其对周围DNA的吸收 2．【联系实际-HPV】（2025·天津·一模）宫颈癌主要由人乳头瘤病毒（HPV）感染引起，目前已知HPV具有200多种亚型。研究人员发现在高危类型HPV16、HPV18等诱发的宫颈癌细胞中，HPVE6/E7癌蛋白持续稳定表达，VGX-3100是全球首个针对HPV感染相关宫颈癌前病变的治疗性DNA疫苗，以HPVE6/E7癌蛋白为抗原靶点，能有效激活免疫系统，精准识别并杀伤已经感染HPV的细胞，从而实现对感染细胞的清除。下列有关说法错误的是（　　） A．可利用核酸分子杂交技术检测人体是否感染HPV B．E7癌蛋白是HPV病毒基因组编码的一种蛋白质，使细胞周期调控失常 C．抗原呈递细胞以胞吞的方式摄取VGX-3100并将其呈递给辅助性T细胞 D．VGX-3100进入机体后，体内针对HPV的细胞毒性T细胞数量会增多 3．【新热点-AI技术】（2025·天津·一模）“逆折叠AI模型”依据自然界中已知的大量“序列-结构”对应关系，学习到氨基酸序列与最终三维结构之间复杂的对应关系，使该模型能从目标蛋白质的结构出发，快速生成大量可能折叠成该结构的氨基酸序列，实现了蛋白质工程的自动化和标准化。下列说法正确的是（　　） A．生成目标氨基酸序列需要肽键的结构、氨基酸的性质与数目为依据 B．从蛋白质的三维结构到氨基酸序列，AI模型依据的原理是中心法则 C．氨基酸发生替换后，蛋白质的空间结构和功能可能不会因此而发生改变 D．该模型预测蛋白质的结构并直接设计改造蛋白质，而不用改造基因 4．【新科研-基因编辑】（2025·天津·二模）利用转基因技术将绿色荧光蛋白基因(GFP)整合到野生型小鼠Gata3基因一端，如图甲所示。实验得到表达Gata3 - GFP蛋白质的杂合子小鼠，交配获得Gata3 - GFP基因纯合子小鼠。为鉴定交配获得的4只新生小鼠的基因型，设计引物1和引物2用于PCR扩增，PCR产物电泳结果如图乙所示。 下列叙述正确的是（　　） A．Gata3基因的启动子无法控制GFP基因表达 B．翻译时先合成GFP蛋白，再合成Gata3蛋白 C．2号小鼠是Gata3 - GFP基因的纯合子，4号小鼠是野生型 D．用引物1和引物3进行PCR，能更好区分杂合子和纯合子 知识串联·核心必记 要点01 限制酶的选择原则 1．限制酶的选择 (1) 不破坏目的基因原则:图甲可选择PstⅠ,而不选择SmaⅠ。 (2) 保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则:所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择Sma I。 (3) 确保出现相同黏性末端原则:通常选择与切割目的基因相同的限制酶切割质粒,如图中PstI;为避免目的基因和质粒自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图也可选择PstI和EcoRI两种限制酶。 2. 标记基因的作用 标记基因可用于检测目的基因是否导人受体细胞: 【典例1】研究人员欲将某动物体内基因X导入大肠杆菌的质粒中保存，质粒含有抗性基因与酶切位点，目的基因两端酶切位点如下图所示，下列叙述错误的是（　　）    A．使用HindⅢ和XbaI进行酶切能避免基因X与质粒反向连接 B．目的基因X与质粒连接可使用E.coliDNA连接酶 C．Ca2+处理大肠杆菌能降低细胞膜通透性，有利于重组质粒导入受体细胞 D．含有基因X的大肠杆菌能在氨苄青霉素选择培养基中生长 要点02 基因表达载体的构建 (1) 构建基因表达载体的目的:使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，并能够表达和发挥作用。 (2) 基因表达载体的组成 （3） 基因表达载体的构建过程 提醒:若考虑两两相连，则DNA连接酶连接DNA片段会出现三种情况,即目的基因与目的基因的连接、目的基因与质粒的连接、质粒与质粒的连接,需筛选出重组质粒。 【典例2】番茄在较低温度下运输或储存的过程中容易出现冻伤的现象。科学家利用基因工程技术培育出抗冻的转基因番茄。下图为外源DNA和质粒上标出的酶切位点及相关基因，其中AFPs基因为抗冻基因。下列相关叙述不正确的是（    ）      A．基因工程中常用的工具酶有限制酶，DNA连接酶 B．获得的AFPs基因应插入质粒上的启动子与终止子之间 C．应用BamHI和HindⅢ切割目的基因和质粒以避免目的基因反接 D．能在含四环素的培养基上生长的受体细胞中一定都含有AFPs基因 要点03 目的基因的检测与鉴定 【典例3】33．（20-21高二下·山东德州·期末）研究人员将GNA基因和ACA基因连接成融合基因，再与pBI121质粒载体结合，导入玉米细胞，最终获得了抗蚜虫玉米新品种，部分操作如下图，下列相关叙述错误的是（　　） 注：图中 Ⅰ、Ⅰ、Ⅰ为限制酶 A．①②过程均需使用DNA连接酶，②过程是基因工程的核心步骤 B．与只用Ⅰ相比，用Ⅰ和Ⅰ处理融合基因和载体可保证基因转录方向正确 C．只要检测出玉米细胞中含有融合基因，就说明抗蚜虫玉米培育成功 D．在加入卡那霉素的培养基上存活下来的细胞，不一定是成功导入重组载体的细胞 要点04 蛋白质工程的基本原理 （1） 蛋白质工程的概念 （2） 基本思路 从预期蛋白质功能出发→设计预期蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到并改变相应的脱氧核苷酸序列或合成新基因→获取所需的蛋白质 【典例4】31．（23-24高二下·吉林白山·期末）将人胰岛素A链上1个天冬氨酸替换为甘氨酸。B链末端增加2个精氨酸，可制备出一种人工长效胰岛素。下列关于该胰岛素的叙述，错误的是（    ） A．可通过蛋白质工程方法生产 B．比人胰岛素多了2个肽键 C．甘氨酸与精氨酸的R基不同 D．最初在粗面内质网中合成 01 基因工程的基本工具 1．（2025·天津·二模）用氨苄青霉素抗性基因（AmpR）、四环素抗性基因（TetR）作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体（重组质粒），并转化到受体菌中。下列叙述错误的是（　　）    A．若用HindⅢ酶切，目的基因转录的产物可能不同 B．若用PvuⅠ酶切，在含Tet（四环素）培养基中的菌落，不一定含有目的基因 C．若用SphⅠ酶切，可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否 D．若用SphⅠ酶切，携带目的基因的受体菌在含Amp（氨苄青霉素）和Tet的培养基中能形成菌落 2．（2025·天津·一模）科学家利用转基因生菜作为生物反应器生产人胰岛素时，依据植物偏好密码子（编码同种氨基酸的多个密码子中，生物优先高频使用的特定密码子）的原理对人胰岛素基因进行改造，提高胰岛素基因在植物细胞中的表达效率。对改造后的胰岛素基因进行一系列操作以构建基因表达载体（部分过程如图所示），再通过农杆菌转化法转入生菜细胞中表达人胰岛素。 下列说法正确的是（    ） A．改造后的人胰岛素基因表达产物与天然胰岛素的氨基酸序列不完全相同 B．构建质粒3的过程中可使用HindⅢ和XbaⅠ两种酶切割质粒1和质粒2 C．使用含有卡那霉素或潮霉素的培养基筛选导入目的基因的生菜细胞 D．农杆菌T-DNA上添加复制原点才能使目的基因在生菜细胞中复制 3．（2025·天津河西·二模）双向启动子可同时结合两个RNA聚合酶来驱动下游基因的表达，研究人员构建了如图所示的表达载体，以检测双向启动子作用效果。下列分析正确的是（　　）    A．表达载体中GUS基因和LUC基因转录时使用同一条DNA单链为模板 B．为连入GUS基因，需用SalⅠ和SphⅠ酶切已整合了双向启动子及LUC基因的质粒 C．在培养基中添加壮观霉素可筛选出成功导入表达载体的受体细胞 D．通过观察是否出现荧光和蓝色物质可检测双向启动子的作用效果 02 基因工程的基本操作程序 4．（2024·天津·三模）为了对重金属污染的土壤进行生物修复，研究者将从杨树中克隆的重金属转运蛋白（HMA3）基因与外源高效启动子连接，导入杨树基因组中（如图）。 为检测获得的转基因杨树苗中是否含有导入的HMA3基因，同时避免内源HMA3基因的干扰，在进行PCR扩增时，应选择的引物组合是（    ） A．①+③ B．①+② C．③+② D．③+④ 5．（2025·天津·二模）双向启动子可同时结合两个RNA聚合酶来驱动下游基因的表达，研究人员构建了下图所示的表达载体，以检测双向启动子作用效果。下列分析正确的是（    ） A．可用农杆菌转化法将构建好的表达载体导入动物细胞 B．可通过观察是否出现荧光确认双向启动子的作用 C．在培养基中添加壮观霉素可筛选出成功导入表达载体的植物受体细胞 D．为连入GUS基因，需用SalI和AgeI酶切已整合了双向启动子及LUC基因的质粒 6．（2025·天津南开·一模）研究表明，COX-2基因与肿瘤细胞的迁移有关，科研人员通过构建COX-2基因表达载体（如图），用于进一步研究COX-2基因表达产物对肿瘤细胞迁移的作用机制。图中1链为转录的模板链，BamHⅠ、SacⅠ为限制酶识别序列，LacZ基因表达产物可使显色剂X-gal变蓝。下列说法正确的是（    ） A．通过PCR扩增COX-2基因片段，需要加入引物A和引物D B．为构建COX-2表达载体，需在与1链结合的引物的5'端添加BamHⅠ识别序列 C．在含氨苄青霉素的培养基中能生长的是含重组质粒的菌落 D．在含X-gal培养基中长出的蓝色菌落含重组质粒 7．（2025·天津·二模）癌症是人类健康的重大威胁之一，传统治疗手段难以实现精准治疗。超声波具有非侵入、组织穿透性强、时空特异性等特点，科研人员拟开发“响应超声波的药物递送系统”细菌以实现癌症的精准治疗。 (1)用于培养药物递送细菌的液体培养基中包含水、酵母提取物、蛋白胨等成分，其中蛋白胨主要为细菌提供____和维生素。可利用____的方法快速直观地测定细菌数量，以便即时使用适量的细菌进行治疗。 (2)C蛋白有抗肿瘤作用，超声波可导致局部温度升高到42℃。科研人员制备了工程菌1，其中含有图1所示的基因表达载体。37℃培养的工程菌1接受超声波刺激后，可升温至42℃，____，从而发挥抗肿瘤作用。    (3)T蛋白有T1、T2和T3三种亚型，具有相似的功能，制备分别含有这三种基因的工程菌1，并检测C蛋白表达量，结果如图2所示。科研人员最终选择____（填T1、T2或T3）基因进行后续研究，判断的依据是_____。 (4)工程菌1只能在超声波刺激期间发挥作用，科研人员设计了含图3所示的基因表达载体的工程菌2，可以实现在短时间的超声波刺激后维持长时间的治疗。已知B基因编码的B酶可以作用于识别位点a和b，使a、b处的DNA发生断裂，最终导致a、b之间的DNA片段发生倒转。请根据以上信息，使用下列选项将表达载体补充完整。____；____；____；____；____。    ①P1启动子②P3启动子（持续表达型启动子）③T基因④C基因⑤B基因 03 蛋白质工程及其应用 8．（2024·天津·一模）下列对发酵工程应用的描述错误的是（　　） A．微生物肥料是利用微生物代谢产生的有机酸、生物活性物质等来增进土壤肥力 B．利用发酵工程从微生物细胞中提取单细胞蛋白，生产微生物饲料 C．微生物农药是利用微生物或其代谢物来防治病虫害的 D．发酵工程和蛋白质工程结合能生产自然界不存在的蛋白质              9．（2025·天津河西·一模）在蛋白质特定位置的氨基酸侧链基团上安装一个分子接头，诱导蛋白质主链发生局部环化的技术，可改变蛋白质局部的折叠方式从而调控其功能。下列有关此技术的叙述正确的是（    ） A．改造蛋白质需要通过基因工程来实现 B．适用于改造任意氨基酸序列的蛋白质 C．可能导致蛋白质分子内氢键数量发生变化 D．改变了氨基酸的种类和数量从而改变蛋白质的功能 10．（2025·天津河西·一模）科学家通过对相关基因进行改造，使T4溶菌酶的第3位异亮氨酸变成了半胱氨酸，于是在该半胱氨酸与第97位的半胱氨酸之间形成了一个二硫键，T4溶菌酶的耐热性得到了提高。下列说法错误的是（　　） A．若利用微生物生产T4溶菌酶，可采用显微注射技术将重组质粒导入受体细胞 B．该技术需要从预期的蛋白质功能出发，推测应有的氨基酸序列 C．该技术属于蛋白质工程，合成的蛋白质不是自然界中已存在的 D．改造后T4溶菌酶的氨基酸序列和空间结构都不同于天然溶菌酶 11．（2024·天津·一模）α-环糊精是食品、医药等常用原料。α-环糊精葡萄糖糖基转移酶（cgt）生产α、β和γ环糊精的混合物，分离纯化十分不便。cgt在芽孢杆菌中的产量较低，诱变效果不佳。cgt的372位天冬氨酸和 89 位酪氨酸是酶与底物作用的关键位点，江南大学一实验室将它们分别替换为赖氨酸和精氨酸后，形成的重组cgt催化特异性提高了27倍。 (1)重叠PCR是常用的 DNA定点突变技术，其原理如图所示。与细胞内的DNA 复制相比，PCR不需要用到_______酶。要完成两处位点的突变，至少要设计________种引物。图中第1对和第2对引物的PCR产物混合、变性、退火后可形成①②两种产物，其中产物①_________（能/不能）延伸，原因是_____________________________________________。 (2)如图是该酶编码（非模板）链的部分序列，请你设计替换372位天冬氨酸到赖氨酸（仅以密码子是AAG为例）的引物 FP2和RP1________________和_________________（只写371位到373位对应的9个碱基序列，并标出5'端和3'端）。 (3)上述过程需要用到____________工程。用大肠杆菌大量生产重组cgt需要解决酶的分泌问题，主要是因为大肠杆菌缺少________________（填细胞器）。成功获得工程菌后，还须对获得的α-环糊精葡萄糖糖基转移酶（cgt） 进行活性检测，这是属于____________水平的检测与鉴定。 04 PCR技术 12．（2025·天津河西·三模）根据某基因上游和下游的碱基序列，设计合成了用于该基因PCR的两段引物（单链DNA）。引物与该基因变性DNA（单链DNA）结合为双链DNA的过程称为复性。下图是两引物的Tm（引物熔解温度，即50%的引物与其互补序列形成双链DNA分子时的温度）测定结果，以下分析错误的是（　　） A．PCR过程中，复性温度应高于引物的Tm值以提高PCR效率 B．两引物分别与DNA的两条互补单链结合，是子链延伸的起点 C．若两引物的脱氧核苷酸数相同，推测引物2的（G+C）含量较高 D．适当减少引物2的脱氧核苷酸数，可使其Tm值接近引物1 13．（2025·天津河西·一模）干扰素是一种具有干扰病毒复制作用的糖蛋白，在临床上被广泛用于治疗病毒感染性疾病。利用PCR技术扩增干扰素基因，可用于干扰素的规模化生产。下列有关叙述正确的是（　　） A．为使PCR产物能被限制酶切割，可在引物的5'端添加识别序列 B．在设计两种引物时，需要让引物和引物之间的碱基序列互补 C．PCR体系中需要添加耐高温的解旋酶和DNA聚合酶 D．PCR扩增干扰素基因时，子链的延伸方向是3'→5' 14．（2025·天津河北·一模）在基因工程的PCR扩增及产物鉴定实验中，科学家需通过优化实验条件获得高特异性产物，并通过琼脂糖凝胶电泳验证结果（如图所示）。已知实验以质粒DNA为模板，目标产物为含EcoRⅠ酶切位点的500bp基因片段，下列叙述正确的是（    ） A．引物设计时5′端可添加EcoRⅠ识别序列，且使3′端与模板完全互补 B．当模板DNA和脱氧核苷酸存在时，TaqDNA聚合酶即可催化反应 C．电泳时设置合适的电压和时间主要是防止大分子DNA片段跑出凝胶 D．若标准样中c为750bp，则500bp目标产物应出现在b处 15．（2025·天津蓟州·一模）为了将某纳米抗体和绿色荧光蛋白基因融合表达，运用重组酶技术构建质粒，如图1所示。请回答下列问题： (1)进行PCR扩增时需要耐高温的DNA聚合酶，为使其活化应在PCR反应缓冲液中加入________（填“Ca2+”或“Mg2+”）。 (2)有关基因序列如图2，引物F2-F、F1-R应在下列选项中分别选用_______。 A．5'-ATGGTG……CAACCA-3' B．5'-TGGTTG……CACCAT-3' C．5'-GACGAG……CTGCAG-3' D．5'-CTGCAG……CTCGTC-3' (3)将PCR产物片段与线性质粒载体混合后，在酶的作用下可形成环形质粒，直接用于转化细菌。这一过程与传统重组质粒构建过程相比，无需使用的酶主要是________。 (4)构建好的重组质粒除了含有目的基因、标记基因，还要有_______，用以控制目的基因的表达。 (5)如何将重组质粒导入大肠杆菌？_______。 (6)为了验证平板上菌落中的质粒是否符合设计，用不同菌落的质粒为模板，用引物F1-F和F2-R进行了PCR扩增，质粒P1~P4的扩增产物电泳结果如图3.根据图中结果判断，符合要求的质粒为______。 1．（2025·天津·一模）马铃薯作为重要农作物，提高其冷耐受性可拓展栽培马铃薯的种植区域。我国科研人员发现，野生马铃薯中S基因表达与其冷耐受性调控有关，将该基因导入栽培马铃薯中可显著增强其抗寒能力。结合下图分析，下列叙述错误的是（    ） 限制酶 识别序列及切割位点 BglⅡ EcoRⅠ XbaⅠ A．PCR扩增S基因时，需要模板、引物、4种脱氧核苷酸和耐高温的DNA聚合酶等 B．为保证S基因正确插入载体中，需对其上游引物的5′端添加碱基序列5′-GAATTC-3′ C．用含重组Ti质粒的农杆菌侵染栽培马铃薯后，利用抗性基因2筛选成功转化的细胞 D．将已转化的马铃薯与普通栽培马铃薯种植在寒冷条件下可检验S基因是否发挥作用 2．（2025·天津·二模）生物技术与工程的发展催生了生物医药的生产。下列相关操作的叙述正确的是（    ） A．体外培养杂交瘤细胞制备单克隆抗体时，培养液中加入血浆会影响单克隆抗体的纯度 B．对动物细胞培养时需要无菌无毒的环境，因此需要对培养基进行消毒处理 C．将基因组文库中的胰岛素基因与大肠杆菌的DNA重组后可利用发酵工程生产胰岛素 D．将药用蛋白基因与腺病毒重组，然后侵染奶牛的乳腺细胞可得到乳腺生物反应器 3．（2024·天津·一模）免疫PCR是对微量抗原的一种检测方法。下图是利用该技术检测牛乳中微量抗生素的流程图：首先将抗体1固定在微板上，冲洗后加入待检的牛乳，再加入DNA标记的抗体2，进行PCR扩增，最后进行电泳检测。下列相关叙述错误的是（    ） A．PCR扩增获得产物的量越多，电泳后距离点样孔越近 B．图示过程所需抗体无需对高温有较强的耐受性 C．图示过程中三次冲洗的目的均不同 D．图示抗原检测过程发生两次抗原与抗体的结合 4．（2024·天津河北·一模）miRNA是一类真核生物中广泛存在的单链非编码RNA分子．成熟的miRNA与AGO家族蛋白结合形成沉默复合体，该复合体可通过识别和结合靶基因转录出的mRNA并对其进行剪切或抑制其翻译过程，从而调控生物性状。下列相关分析正确的是（    ） A．miRNA基因的表达包括转录和翻译两个阶段 B．沉默复合体发挥作用的场所是细胞核 C．利用PCR技术可检测靶基因转录出的mRNA的相对含量 D．沉默复合体通过碱基互补配对的方式识别靶基因并抑制其表达 5．（2024·天津·一模）研究发现，水稻蜡质基因（Wx）编码直链淀粉合成酶。若Wx基因中第226位碱基是正常的G，该位点所在的内含子能被正常剪接，胚乳中直链淀粉含量最高，基因型记做GG；若该位点突变成T，则不能被正常剪接，胚乳中直链淀粉的合成水平会降低，基因型记做TT。为检测Wx基因该位点碱基是G或T，研究人员以待测水稻叶片总DNA为材料，以Wx基因片段设计引物如图所示，对PCR扩增产物经AccⅠ酶切后电泳。已知引物1为5＇-GCTTCACTTCTCTGCTTGTG-3＇，两引物之间无另外的AccI酶的识别位点。下列叙述正确的是（　　） A．组成上述两种淀粉合成酶的氨基酸的种类不同，数目相同 B．GT杂合型水稻品种酶切电泳结果为2条条带 C．若酶切产物只能观察到大约460bp的DNA条带，则表明该水稻品种为TT型 D．该实验中需设计的引物2为5＇-TTCAACTCTCGTTAAATCAT-3＇ 6．（2024·天津河北·三模）番茄在低温下运输、储存的过程中，容易出现冻伤，影响番茄的品质。科学家利用基因工程技术将AFPs抗冻基因转入番茄植株，培育抗冻番茄。下列叙述错误的是（    ） A．筛选与获取AFPs抗冻基因是培育抗冻番茄的首要步骤 B．基因表达载体中的启动子是 RNA 聚合酶识别和结合的位点 C．AFPs抗冻基因可通过农杆菌转化法转移至双子叶植物细胞中 D．抗冻番茄培育成功的标志是检测出番茄细胞中含 AFPs基因 7．（2025·天津武清·二模）同源重组技术结合tetr-sacB双重选择系统可对基因进行敲除与回补以研究基因的功能：如图1是科研人员利用该方法对大肠杆菌LacZ基因进行敲除与回补的相关过程，tetr是四环素抗性基因。sacB基因（2071bp）是蔗糖致死基因，LacZ基因表达产物能将培养基中的无色化合物X-gal水解成蓝色化合物。请回答下列问题。    (1)据图1分析：过程①中，设计两种引物时需在引物5′端分别添加的限制酶序列是________；过程⑤中，为了精确完成目的基因的敲除，设计引物时需在引物的5′端添加上________序列。 (2)过程③中，将质粒3导入大肠杆菌甲的目的是________。 (3)下图2是对完成过程⑥后的菌落进行鉴定时的PCR产物电泳结果。    其中泳道________（填数字）对应的菌株可能转化成功。过程⑦中，在含有________和X-gal培养基中若出现________色菌落，即为LacZ基因敲除菌株。 (4)过程⑧是通过同源重组技术结合tetr-sacB双重选择系统可对LacZ基因再进行回补，则在筛选LacZ基因回补菌株时应在培养基中添加________和X-gal。推测对已敲除的基因进行回补的主要目的是_______。 8．（2025·天津南开·二模）白细胞表面抗原2(SLA-2)在抗原呈递、器官移植以及免疫应答方面有着重要作用。为进一步研究SLA-2的结构与功能，科研人员以能稳定传代的猪肾上皮细胞为材料，构建了稳定高表达 SLA-2基因的细胞株，过程如下图。其中AmpR为氨苄青霉素抗性基因，PuroS为嘌呤霉素抗性基因，嘌呤霉素是真核生物和原核生物中蛋白质合成的有效抑制剂。Bcl I、Not I、Xba I、Sau3A I为限制酶，括号内数值表示距复制原点的长度。请回答下列问题： 限制酶 Bcl I Not I Xba I Sau3A I 识别序列和切割位点 (5'-3') 5'-T↓GATCA-3' 5'-GC↓GGCCGC-3' 5^'-T↓CTAGA-3' 5^'-↓GATC-3' (1)已知限制酶X识别的序列有回文对称的特点，即一条链从左往右读和其互补链从右往左读的序列是相同的。SLA-2 基因上的一段核苷酸序列为“-ATCTCGAGCGGG-”，则对该序列进行剪切的限制酶X 识别的核苷酸序列最可能为___________________________(写出6个核苷酸)。 (2)图中SLA-2基因以a链为转录模板链，由此可以推测 SLA-2基因的转录是从其__________________(填“左侧”或“右侧”)开始的；过程④需将 SLA-2基因准确插入到质粒2中，为保证图中SLA-2基因按照正确的方向与质粒2连接，SLA-2基因位点1和2 的识别序列所对应的酶分别是_________________，酶切后加入___________________酶使它们形成重组质粒。 (3)研究人员将过程④提取的重组质粒用Not Ⅰ和 Sau3A Ⅰ完全酶切，可能得到的条带大小为______________ bp。 (4)科研人员为了筛选出抗嘌呤霉素的猪肾上皮细胞，应选择添加___________________的培养基。为确定最小致死浓度 (使某种细胞全部死亡的最小浓度)，所培养的猪肾上皮细胞应为________________(填“转化”或“未转化”)的猪肾上皮细胞。 9．（2025·天津北辰·三模）科研团队为研究番茄抗虫基因（SIJA2）的功能，进行了相关实验。图1为SIJA2基因过表达番茄（OE）构建的过程，图2为SIJA2基因敲除突变番茄（KO）构建的部分过程。    (1)图1中，①过程需要消耗的原料为________。为保证SIJA2基因能与载体正确连接形成重组质粒且以B链充当转录的模板，在进行引物设计时，应在引物_______和引物_______的5'端，分别添加限制酶_______和_______的识别序列。除了限制酶，过程②还需用到_______酶。为提高SIJA2基因导入受体细胞的几率在过程③可用_______处理受体细胞。愈伤组织通过⑤________过程可获得SIJA2基因过表达番茄（OE）。 (2)CRISPR/Cas9由sgRNA（单链向导RNA）和Cas9蛋白两大部分组成，sgRNA由crRNA和tracrRNA组成，其中crRNA含有与靶基因片段配对的序列，能引导Cas9切开靶基因所在双链DNA，随后细胞将断裂上下游两端的序列连接起来，实现对基因的编辑，如图2所示。要准确敲除SIJA2基因，需设计正确的向导RNA（sgRNA），才能准确引导Cas9蛋白切割SIJA2基因。设计sgRNA需要的信息及运用的原理是________。 (3)科研人员将OE、KO以及未处理（WT）三组番茄进行一系列实验，定期测量相关数据，记录于下表：（注：“+”的数目代表程度或数量变化） 组别 SIJA2基因表达量 抗虫性 生长速率 产量 OE +++ +++ +++ ++++ KO － + + + WT + ++ ++ ++ 进一步研究发现，OE番茄通过SIJA2基因的过表达，使其实现抗虫性强、生长速率快及产量增加的三重效果，由此看出基因和性状之间存在的数量关系是________。 10．（2025·天津·一模）CRISPR/Cas9基因编辑技术可以改变目的基因序列。使用该技术，需要向细胞加入两种组分：向导RNA（用于和目的基因中待编辑的序列相结合）、核酸酶Cas9（用于识别并切割待编辑的序列，造成DNA双链断裂）。断裂后的DNA在细胞中发生修复，很容易造成目的基因序列发生改变，实现基因编辑。大薯D蛋白是大薯体内重要的贮藏蛋白，在人体内表现出抗氧化、抗炎等生物活性。我国科研工作者设计并构建了基因编辑载体（载体关键组分如下图所示），并利用此载体编辑大薯D蛋白基因以开展后续研究。回答下列问题： (1)构建基因编辑载体，需要将U启动子、向导RNA序列、T启动子、Cas9基因分别连接入农杆菌的________，形成重组DNA分子。上述载体的设计，一定需要利用D蛋白基因序列信息的是________。 (2)T启动子选用限制酶BclⅠ切割、载体选用限制酶BglⅡ切割以后，两者能顺利连接，原因最可能是_______。 (3)采用单酶切后进行连接反应，T启动子容易出现正向连接（图中箭头向右，目的基因正常转录）和反向连接（图中箭头向左，目的基因无法转录）两种情况。选用引物________（填序号），进行扩增可以鉴定出正向连接的情况，原因是_______。 (4)基因编辑载体成功构建并导入大薯细胞后，可采用________技术在分子水平检测D蛋白基因的编辑是否发生。 1．（2025·天津·高考真题）二倍体番茄浆果中的小分子化合物H对食用者有益。H是由前体物甲经酶A催化成乙，乙经酶B催化成丙，丙再经酶C催化而成。浆果积累这些化合物，仅影响自身籽粒数及食用者健康，对应关系如下表： 累积物 甲 乙 丙 H 食用者健康 无影响 有害 有害 有益 浆果籽粒数 多 无 少 多 表达酶A、B和C的基因分别为A、B和C，位于非同源染色体上。为获取浆果含H的纯合番茄植株（不考虑突变与染色体互换），开展以下研究。 (1)浆果含H的纯合番茄植株的基因型为_____。 (2)基因型AaBbCc植株自交，中浆果籽粒数有_____种表型，有籽浆果植株占_____。为获得理想番茄植株，须遴选浆果籽粒数_____的，具有该性状的自交，后代不出现性状分离的基因型有_____种（类群M）。随后，再遴选浆果含H且该性状不分离的植株。 (3)除直接测量浆果H含量外，还可分别提取类群M各自交子代浆果的蛋白质来筛选目标植株，其方法是：用_____抗体对提取的蛋白质进行特异性识别，阳性率为_____%的子代即为目标品系。 2．（2024·天津·高考真题）金黄色葡萄球菌（简称Sa）是人体重要致病细菌、不规范使用抗生素易出现多重抗药性Sa。 (1)Sa产生抗药性可遗传变异的来源有______（至少答出2点）。 (2)推测Sa产生头孢霉素抗性与其R基因有关。为验证该推测，以图1中R基因的上、下游片段和质粒1构建质粒2，然后通过同源重组（质粒2中的上、下游片段分别与Sa基因组中R基因上、下游片段配对，并发生交换）敲除Sa的R基因。    ①根据图1信息，简述质粒2的构建过程（需包含所选引物和限制酶）：______，然后回收上、下游片段，再与SacII酶切质粒1所得大片段连接，获得质粒2。 ②用质粒2转化临床分离的具有头孢霉素抗性、对氯霉素敏感的Sa，然后涂布在含______的平板上，经培养获得含质粒2的Sa单菌落。 ③将②获得的单菌落多次传代以增加同源重组敲除R基因的几率，随后稀释涂布在含______的平板上，筛选并获得不再含有质粒2的菌落。从这些菌落分别挑取少许菌体，依次接种到含____________的平板上，若无法增殖，则对应菌落中细菌的R基因疑似被敲除。 ④以③获得的菌株基因组为模板，采用不同引物组合进行PCR扩增，电泳检测结果如图2，表明R基因已被敲除的是______。    3．（2023·天津·高考真题）构建可利用纤维素产乙醇的转基因酿酒酵母菌株是解决能源危机的手段之一，为此设计表达载体，思路如下。 (1)外源基因的选择    纤维素常见生物降解途径如下。 酿酒酵母通常无法吸收纤维素、寡糖和纤维二糖，应向酿酒酵母转入上图中三种酶的基因，并使其表达产物在细胞________(内/外)发挥作用。 (2)外源基因的插入方法 同源重组是碱基序列基本相同的DNA区段通过配对、链断裂和再连接而产生片段交换的过程。通过同源重组将外源基因插入染色体的特定位点可获得遗传稳定的工程菌株，如甲图所示。 酿酒酵母基因组有多个AB短序列。为通过同源重组将外源基因插入AB之间，在设计表达载体时，可采用PCR技术在外源基因两端分别引入A和B,获得乙图所示长片段。PCR时应选用的一对引物为________(从P1~P6中选)。 (3)标记基因的选择  URA3是尿嘧啶合成关键酶基因，常被用作标记基因。另外，URA3编码的蛋白可将外源5-氟乳清酸转化为有毒物质，导致细胞死亡。 ①为得到成功插入酶I基因的菌株1，需将酶I基因同URA3一起插入URA3缺陷型酿酒酵母基因组AB之间，并利用__________的培养基筛选存活菌株。 ②在后续插入酶Ⅱ基因时，为继续利用URA3作为筛选标记，需切除菌株1的URA3。为此设计表达载体时，还应向URA3两端引入酿酒酵母基因组中不存在的同源区段C和C´,并以下图方式______排列才能通过同源重组达到上述目的。 此后，需要将菌株1在_________的培养基上培养，存活菌株即为URA3被成功切除的菌株1´。 (4)表达载体的构建   综上，为将三种酶基因依次插入酿酒酵母基因组中，在构建表达载体时，A、B、C、C´、URA3和酶基因应采用下图______的排布方式。 / 学科网（北京）股份有限公司 $