3.2 第1课时 目的基因的筛选与获取和基因表达载体的构建-【优学精讲】2024-2025学年高中生物选择性必修第三册教用Word(人教版)

该教案聚焦基因工程核心内容，涵盖目的基因的筛选与获取（含PCR技术）及基因表达载体构建。通过导学聚焦生产生活需求，结合基因工程操作程序，以判断正误、对比表格等学习支架梳理知识脉络。 资料特色在于融合科学思维与探究实践，如通过PCR与体内DNA复制对比、引物设计分析培养科学思维，结合限制酶选择实例提升探究能力。助力学生理解技术原理，为教师提供结构化教学资源，提升课堂效率。

第1课时　目的基因的筛选与获取和基因表达载体的构建 导学 聚焦 1.运用结构与功能和技术思维理解PCR技术的过程、原理、条件等内容。 2.结合基因工程的基本操作程序，针对人类生产和生活的某一需求，尝试提出初步的基因工程构想，完成初步设计 知识点（一）　目的基因的筛选与获取 1.筛选合适的目的基因 2.获取目的基因的方法 3.利用PCR获取和扩增目的基因 （1）原理：　DNA半保留复制　。 （2）PCR反应的条件 参与的组分 在DNA复制中的作用 DNA母链 提供DNA复制的　模板　 4种脱氧核苷酸 合成DNA子链的原料 （耐高温的）DNA聚合酶 催化合成DNA子链 引物（长度通常为20～30个核苷酸） 使DNA聚合酶能够从　引物的3'端　开始连接脱氧核苷酸 缓冲液（含Mg2＋） 真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要　Mg2＋　激活 （3）PCR扩增的过程 过程Ⅰ为　变性　，该阶段的温度为　90 ℃　以上，目的是使双链DNA解聚为　单链　。 过程Ⅱ为　复性　，该阶段的温度为　50 ℃　左右，两种引物通过　碱基互补配对　与两条单链DNA结合。 过程Ⅲ为　延伸　，该阶段的温度为　72 ℃　左右，该过程需要在耐高温的　DNA聚合酶　的催化下，利用　4种脱氧核苷酸　为原料，根据碱基互补配对原则从子链的　3'　端延伸合成新的子链DNA。 （4）PCR产物的鉴定：常采用　琼脂糖凝胶电泳　来鉴定。 4.判断下列有关表述的正误 （1）目的基因一定是编码蛋白质的基因。（　×　） 提示：目的基因包括编码蛋白质的基因和调控基因。 （2）DNA聚合酶能够从引物的5'端开始连接脱氧核苷酸。（　×　） 提示：DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸。 （3）PCR过程不需要解旋酶。（　√　） （4）PCR技术中，DNA模板链上碱基G和C的比例越高，DNA变性解链的温度就越高。（　√　） 探讨　分析PCR扩增技术的原理和过程 聚合酶链式反应是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，下图为PCR扩增中第一轮的变化，结合所学知识回答下列问题： （1）结合下图分析PCR过程中为什么需要引物？DNA链复制的方向是怎样的？ 提示：DNA聚合酶不能从头合成子链，只能把游离的脱氧核苷酸连接到已经存在的片段上。加入引物，能够使DNA聚合酶从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸。DNA链复制的方向总是从子链的5'端向3'端延伸。 （2）PCR扩增目的基因时，复性温度的设定是成败的关键。复性温度过高会破坏引物与模板的碱基配对，复性温度过低又会造成引物不能与DNA模板链的特定部位结合。复性温度的设定与引物长度、碱基组成有关，假设引物的长度相同，在G—C含量高时，对复性温度的设定有什么要求？说明理由。 提示：在引物的G—C含量高时，设定的复性温度要高一些。因为DNA分子中G—C之间有三个氢键，A—T之间有两个氢键。 （3）在利用PCR获取和扩增目的基因时，从第几轮循环才会产生完整的目的基因（可用相关图解解释）？ 提示：第3轮，如图所示： （4）如果循环n次，则共消耗多少对引物？ 提示：共消耗2n－1对引物。 （5）下图是某同学设计的两组引物（只标注了部分碱基序列），都不合理，请分别说明理由。 提示：第1组：引物 Ⅰ 和引物 Ⅱ 会因局部发生碱基互补配对而失效。第2组：引物 Ⅰ'自身折叠后会因出现局部碱基互补配对而失效。 1.生物体内DNA复制与PCR反应的比较 2.PCR中的数量关系 复制次数 1 2 3 n DNA分子数 2 4 8 2n 含引物的DNA分子数 2 4 8 2n 含其中一种引物的DNA分子数 1＝ 21－1 3＝ 22－1 7＝ 23－1 2n－1 同时含两种引物的DNA分子数 0＝ 21－2 2＝ 22－2 6＝ 23－2 2n－2 共消耗引物的对数 1＝ 21－1 3＝ 22－1 7＝ 23－1 2n－1 含脱氧核苷酸链等长的DNA分子数 0＝ 21－2 0＝ 22－4 2＝ 23－6 2n－2n 1.下列有关体内DNA复制与PCR技术比较的叙述，错误的是（　　） A.二者子链的延伸方向相同，均为5'端→3'端 B.二者均需要解旋酶破坏氢键来实现解旋 C.体内DNA复制需要能量，PCR反应也需要能量 D.二者遵循的碱基互补配对原则相同 解析：B　DNA体内复制与利用PCR技术扩增DNA时，子链的延伸方向相同，均为5'端→3'端，A正确；PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，在高温条件下氢键断裂，B错误；体内DNA复制与利用PCR扩增DNA时都需要能量，但两者所需能量来源不同，C正确；体内DNA复制与利用PCR扩增DNA时，遵循的碱基互补配对原则相同，D正确。 2.下图a、b、c均为PCR扩增的DNA片段，下列有关说法正确的是（　　） A.片段a、b、c的长度均相同 B.片段a、b只是第一次循环的产物 C.片段c最早出现在第二次循环的产物中 D.经过30次循环后，片段c的数量为230 解析：C　图中片段a、b只有一种引物，是由原始DNA链为模板复制而来，其长度比片段c长，A错误；由于原始模板在每次循环中均可作为模板，则每次循环都能产生图中片段a、b，B错误；由于第一次循环的产物只有一种引物，而图中片段c有两种引物，则最早出现在第二次循环的产物中，C正确；经过30次循环后，得到的DNA片段总数为230，这包括图中的片段a、b，D错误。 3.利用PCR将某小段含目的基因的DNA分子扩增循环n次，则（　　） A.需要已知目的基因的全部序列以便设计引物 B.共需2n－2个引物参与子代DNA分子的合成 C.应向反应体系中加入解旋酶、DNA聚合酶、缓冲液等 D.理论上第4轮循环产物中含两种引物的DNA片段占7/8 解析：D　只需要已知目的基因两端的序列便可设计引物，A错误；扩增循环n次，需一种引物的数量为2n－1，常规PCR共需两种引物的数量为2×（2n－1）＝2n＋1－2，B错误；不需向PCR的反应体系中加入解旋酶，C错误；理论上第4轮循环产物中含两种引物的DNA片段占（24－2）/16＝7/8，D正确。 知识点（二）　基因表达载体的构建 1.构建基因表达载体的目的 （1）使目的基因在受体细胞中　稳定存在　，并且可以　遗传　给下一代。 （2）使目的基因能够　表达　和发挥作用。 2.基因表达载体的组成 小提醒：目的基因插入位点不是随意的。基因表达载体需要启动子与终止子的调控，所以目的基因应插入启动子和终止子之间的部位，若目的基因插入启动子部位，启动子将失去原功能。 3.基因表达载体的构建过程 （1）先用一定的　限制酶　切割载体，使它出现一个切口； （2）然后用　同种限制酶　或　能产生相同末端　的限制酶切割含有目的基因的DNA片段； （3）再利用　DNA连接酶　将目的基因片段拼接到载体的切口处，形成重组DNA分子。 4.判断下列有关表述的正误 （1）基因工程操作程序的核心步骤是目的基因的获取。（　×　） 提示：基因工程操作程序的核心步骤是基因表达载体的构建。 （2）基因表达载体中有的含有启动子和终止密码子。（　×　） 提示：基因表达载体中有的含有启动子和终止子。 （3）标记基因不一定是抗生素抗性基因。（　√　） （4）基因表达载体中启动子是DNA聚合酶识别和结合的部位。（　×　） 提示：启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位。 探讨　分析基因表达载体构建的目的和方法 目的基因导入受体细胞之前，需构建基因表达载体，图甲、乙分别表示质粒及目的基因所在DNA片段，图中箭头表示相关限制酶的切割位点。 （1）构建基因表达载体时目的基因插入的位置应该在哪里？为什么？ 提示：启动子下游和终止子上游；因为只有插入在启动子和终止子之间，目的基因才可以正常表达。 （2）构建基因表达载体时，能否用SmaⅠ酶切割质粒？为什么？ 提示：不能；因为SmaⅠ会破坏质粒的抗生素抗性基因。该基因是标记基因，便于重组DNA分子的筛选，若被破坏，无法进一步筛选。 （3）与只使用EcoRⅠ相比较，使用BamHⅠ和Hind Ⅲ 两种限制酶同时处理质粒、外源DNA的优点是什么？ 提示：可以防止质粒和目的基因的自身环化以及目的基因与载体的反向连接。 1.启动子、终止子与起始密码子、终止密码子的区别 位置 作用 启动子 位于DNA分子上 RNA聚合酶识别结合位点，启动转录过程 终止子 位于DNA分子上 决定转录的结束 起始密码子 位于mRNA分子上 决定翻译的开始 终止密码子 位于mRNA分子上 决定翻译的结束 2.构建基因表达载体中限制酶的选择技巧 （1）根据目的基因两端的限制酶切割位点确定限制酶的种类 ①应选择切割位点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择PstⅠ。 ②不能选择切割位点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择SmaⅠ。 ③为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择PstⅠ和EcoR Ⅰ两种限制酶（但要确保质粒上也有这两种酶的切点，如图乙）。 （2）根据质粒的特点确定限制酶的种类 1.下列关于基因表达载体构建的叙述，错误的是（　　） A.启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，组成它的基本单位是脱氧核苷酸 B.基因表达载体的组成包括目的基因、启动子、终止密码子、标记基因等组件 C.人工构建的诱导型启动子，当诱导物存在时，可激活或抑制目的基因的表达 D.由于受体细胞不同，基因表达载体的构建也有所差别 解析：B　启动子在基因的上游，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，组成它的基本单位是脱氧核苷酸，A正确；基因表达载体的组成包括目的基因、启动子、终止子、标记基因等组件，B错误；由于受体细胞有植物、动物和微生物之分，以及目的基因导入受体细胞的方法不同，因此基因表达载体的构建是不完全相同的，D正确。 2.某实验小组利用如图所示的质粒和目的基因来构建基因表达载体，将目的基因导入大肠杆菌细胞并表达。下列叙述错误的是（　　） A.图中的质粒用酶A切割后，会产生4个游离的磷酸基团 B.在构建重组质粒时，可用酶A和酶C切割质粒和目的基因 C.成功导入目的基因的大肠杆菌可在含氨苄青霉素的培养基中生长 D.若用酶B和酶C切割，则可以避免质粒的自身环化 解析：B　限制酶每一次切割后会得到两个末端，会有2个游离的磷酸基团，而图中的质粒含有2个酶A的切割位点，则会产生4个游离的磷酸基团，A正确；在构建重组质粒时，可用酶B和酶C切割质粒和目的基因，假如用酶A切割质粒会破坏两个标记基因，B错误；用酶B和酶C切割质粒时四环素抗性基因被破坏，成功导入目的基因的大肠杆菌可在含氨苄青霉素的培养基中生长，C正确；用酶B和酶C两种限制酶切割可以避免目的基因和质粒自身环化以及两者之间的反向连接等问题，D正确。 　　 　（1）PCR每一次循环一般可以分为　变性、复性和延伸　三步。 （2）PCR技术中引物的作用是　使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸　。 （3）一个基因表达载体的组成中除　目的基因、标记基因　外还必须有　启动子、终止子　等。 （4）在构建基因表达载体时，一般用同种限制酶切割目的基因和载体的目的是　产生相同的黏性末端，便于DNA连接酶连接成重组DNA　。 1.在核酸分子杂交技术中，常常使用已知序列的单链核酸片段作为探针（探针是指以放射性同位素、生物素或荧光染料等进行标记的已知核苷酸序列的核酸片段）。为了获得B链作探针，可应用PCR技术进行扩增，应选择的引物种类是（　　） A.引物1与引物2 B.引物3与引物4 C.引物2与引物3 D.引物1与引物4 解析：C　要获得B链，根据PCR中子链延伸方向为5'端到3'端，则需选择引物2与引物3进行扩增，故选C。 2.（2024·海南中学模拟）PCR是聚合酶链式反应的缩写，下图表示PCR的过程，下列叙述错误的是（　　） A.反应体系中需加入耐高温的DNA聚合酶，该酶在B过程起作用 B.引物a和引物b的长度应适宜，且相互之间不能发生碱基互补配对 C.PCR是体外进行的DNA扩增，PCR扩增遵循DNA半保留复制原则 D.A过程通过高温破坏DNA分子中的氢键，使双链DNA解聚为单链 解析：A　反应体系中需加入耐高温的DNA聚合酶，该酶的作用是催化合成DNA子链，在C过程中起作用，A错误；引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，用于PCR的引物长度通常为20～30个核苷酸，且引物之间不能发生碱基互补配对，否则引物之间会配对形成双链核酸，从而失去作用，B正确；PCR是体外进行DNA扩增的技术，根据题图可知，PCR扩增遵循DNA半保留复制原则，C正确；A过程为DNA变性过程，该过程通过高温破坏DNA分子中的氢键，当温度上升到90 ℃以上时，双链DNA解聚为单链，D正确。 3.限制酶的发现为DNA的切割和功能基因的获得创造了条件。限制酶Sau3AⅠ、EcoRⅠ、BamHⅠ的识别序列及切割位点分别为、。含某目的基因的DNA片段如图所示，若利用质粒A（含限制酶Sau3AⅠ、EcoRⅠ、BamHⅠ的酶切割位点各1个）构建基因表达载体，为克服目的基因和质粒A的自身环化以及目的基因与质粒的任意连接等，应该如何选择限制酶（　　） A.用限制酶EcoRⅠ或BamHⅠ处理含某目的基因的DNA和质粒A B.用限制酶Sau3AⅠ和BamHⅠ处理含某目的基因的DNA和质粒A C.用限制酶Sau3AⅠ和EcoRⅠ处理含某目的基因的DNA和质粒A D.用限制酶EcoRⅠ和BamHⅠ处理含某目的基因的DNA和质粒A 解析：D　用限制酶Sau3AⅠ切割目的基因会破坏目的基因，质粒含有限制酶EcoRⅠ、BamHⅠ的酶切割位点，获取目的基因也可以用限制酶EcoRⅠ、BamHⅠ进行切割，但为了防止目的基因或质粒自身环化，需要使用不同种限制酶进行切割，则可以使用限制酶EcoRⅠ和BamHⅠ去切割质粒和目的基因，则获得的重组质粒会进行正常连接。 4.（2024·天津滨海新区高二期末）基因工程中，需使用特定的限制性内切核酸酶切割目的基因和质粒，便于重组和筛选。已知限制性内切核酸酶Ⅰ的识别序列和切割位点是—G↓GATCC—，限制性内切核酸酶Ⅱ的识别序列和切割位点是—↓GATC—，根据图示分析下列叙述正确的是（　　） A.质粒用限制性内切核酸酶Ⅱ切割，目的基因用限制性内切核酸酶Ⅰ切割 B.用限制性内切核酸酶切割获得目的基因时，有四个磷酸二酯键被水解 C.限制性内切核酸酶Ⅰ和限制性内切核酸酶Ⅱ切割后获得的黏性末端不同 D.质粒中标记基因的作用是便于筛选出目的基因已经表达的细胞 解析：B　限制性内切核酸酶Ⅱ能识别限制性内切核酸酶Ⅰ的识别序列，限制性内切核酸酶Ⅰ不能识别限制性内切核酸酶Ⅱ的识别序列；要将目的基因从该DNA链中提取出来，需要在目的基因左右切开，所以要用限制性内切核酸酶Ⅱ；质粒不能用限制性内切核酸酶Ⅱ，若用该酶切割，质粒的两个标记基因均被破坏，A错误；由于DNA是双链，用限制性内切核酸酶Ⅱ将目的基因左右切开时，有四个磷酸二酯键被水解，B正确；限制性内切核酸酶Ⅰ和限制性内切核酸酶Ⅱ切割后产生的黏性末端相同，C错误；质粒中标记基因的作用是用来筛选含有目的基因的受体细胞，D错误。 知识点一　目的基因的筛选与获取 1.下列有关获取目的基因的叙述错误的是（　　） A.目的基因就是编码蛋白质的基因 B.筛选和获取目的基因是基因工程的第一步 C.来自苏云金杆菌的Bt基因可作为转基因抗虫棉的目的基因 D.序列比对工具的应用为科学家找到合适的目的基因提供了更多的机会 解析：A　目的基因主要是指编码蛋白质的基因，A错误；目的基因的筛选与获取是实施基因工程的第一步，B正确；来自苏云金杆菌的Bt基因可作为培育转基因抗虫棉用到的目的基因，C正确；随着测序技术的发展，以及序列数据库和序列比对工具等的应用，越来越多的基因的结构和功能为人们所知，这为科学家找到合适的目的基因提供了更多的机会和可能，D正确。 2.下列关于PCR技术的叙述，正确的是（　　） A.PCR技术建立在对扩增的目的基因序列完全已知的基础上 B.该技术需要解旋酶和耐高温的DNA聚合酶 C.该技术需要一对特异性的引物，要求一对引物的序列是互补的 D.该技术应用DNA半保留复制原理，也需要模板、原料、能量、酶等条件 解析：D　PCR技术扩增的目的基因序列不一定完全是已知的，A错误；该技术是通过高温来使DNA解旋的，不需要解旋酶，B错误；该技术需要的一对引物，分别能与模板DNA的两条链进行碱基互补配对，其序列不是互补的，C错误。 3.用PCR扩增下面的DNA片段： 5'-GACCTGTGGAAGC……CATACGGGATTG-3' 3'-CTGGACACCTTCG……GTATGCCCTAAC-5' 供选择的引物有： ①5'-GACCTGTGGAAGC-3' ②5'-CATACGGGATTG-3' ③5'-GTATGCCCTAAC-3' ④5'-CAATCCCGTATG-3' 共四种，应选择（　　） A.①② B.②③ C.③④ D.①④ 解析：D　用PCR扩增DNA片段的过程中，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3'端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5'端至3'端延伸的，故引物的碱基序列应与每条模板链5'端的一段核苷酸链的碱基序列相同，即应以模板链5'端的一段脱氧核苷酸单链片段作为引物；由题干信息分析可知，5'端的碱基序列是5'-GACCTGTGGAAGC-3'和5'-CAATCCCGTATG-3'，故对应的引物为①④，D正确。 4.下图表示形成cDNA并进行PCR扩增的过程。据图分析，下列叙述正确的是（　　） A.过程①所需的原料是核糖核苷酸 B.过程②所需的酶必须耐高温 C.过程③需要解旋酶破坏氢键 D.过程④的引物对之间不能互补配对 解析：D　过程①为逆转录，所需的原料是脱氧核苷酸，A错误；由DNA单链合成DNA双链的过程中所需要的DNA聚合酶不需要耐高温，B错误；过程③为变性，温度上升到超过90 ℃时，双链DNA解聚为单链，不需要解旋酶破坏氢键，C错误；过程④为复性，温度降到50 ℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合，但引物对之间不能互补配对，D正确。 5.下图表示利用PCR技术扩增目的基因的部分过程，其原理与细胞内DNA复制类似。下列叙述错误的是（　　） A.耐高温的DNA聚合酶总将游离的脱氧核苷酸连接到3'端 B.在第三轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段 C.引物之间或引物自身发生碱基互补配对，则不能有效扩增目的基因 D.从理论上推测，第三轮循环产物中含有引物A的DNA片段占3/4 解析：D　由图可知，以原来的每条母链为模板经第一轮合成的两个DNA分子中，只含有引物A或引物B，而以新合成的子链为模板合成新DNA分子时，两种引物都含有，故第三轮循环共产生8个DNA分子，其中含有引物A的分子是7个，即占7/8，D错误。 知识点二　基因表达载体的构建 6.（2024·黑龙江齐齐哈尔期中）基因工程的核心是构建基因表达载体，下列不属于载体作用的是（　　） A.载体能防止目的基因被受体细胞限制酶“切割” B.载体能协助目的基因在受体细胞中复制 C.载体含有启动子和终止子可协助目的基因表达 D.载体具有标记基因，便于筛选含目的基因的受体细胞 解析：A　载体不能防止目的基因被受体细胞限制酶“切割”，A错误；载体在受体细胞中能够稳定存在，并且自我复制，使目的基因数量扩大，B正确；启动子是RNA聚合酶的识别和结合的位点，能启动转录过程，终止子控制着转录的结束，所以载体含有的启动子和终止子可协助目的基因的表达，C正确；载体具有标记基因，标记基因便于筛选含有目的基因的受体细胞，D正确。 7.（2024·黑龙江哈尔滨期末）蜘蛛丝是天然蛋白纤维，其机械性能高于常用于制作防弹衣的凯夫拉纤维，有广泛的应用前景。中国科学家利用质粒（如图）成功构建了蛛丝蛋白基因的重组质粒，并在家蚕丝腺细胞中获得大量蛛丝蛋白。下列有关说法错误的是（　　） A.为防止目的基因自身环化，可以用限制酶XbaⅠ和SacⅠ来切割目的基因 B.构建表达载体时选用蚕丝蛋白基因的启动子利于基因在家蚕丝腺细胞中表达 C.启动子是RNA聚合酶的识别和结合部位，可以驱动遗传信息的复制和转录 D.基因表达载体中的标记基因可以鉴别与选择含有蛛丝蛋白基因的受体细胞 解析：C　用限制酶XbaⅠ和SacⅠ来切割目的基因，可以使目的基因两端产生不同的黏性末端，防止目的基因自身环化，A正确；为能从蚕丝腺细胞中提取蛛丝蛋白，基因表达载体中目的基因的上游必须含有使其能在蚕丝腺细胞中转录的启动子，即构建表达载体时选用蚕丝蛋白基因的启动子利于基因在家蚕丝腺细胞中表达，B正确；启动子只能驱动基因转录，不能驱动其复制，C错误；基因表达载体中的标记基因的作用是鉴别与选择含有蛛丝蛋白基因的受体细胞，D正确。 8.图甲、乙中的箭头表示三种限制性内切核酸酶的酶切位点，AmpR表示氨苄青霉素抗性基因，neo表示新霉素抗性基因。下列叙述不正确的是（　　） A.在构建重组质粒时，可用PstⅠ和Hind Ⅲ 切割质粒和外源DNA B.在酶切过程中，不能破坏质粒中全部的标记基因 C.若只用PstⅠ处理质粒和外源DNA分子片段，无法避免自身环化和反向连接 D.导入重组质粒的大肠杆菌可以在含氨苄青霉素的培养基中生长 解析：D　切割目的基因时，用BamHⅠ切割会破坏目的基因，只用PstⅠ切割目的基因和质粒载体，会出现目的基因和质粒的自身环化，或目的基因和质粒的反向连接，而用PstⅠ和Hind Ⅲ 进行酶切，能确保目的基因和质粒的正向连接，并且质粒上保留新霉素抗性基因作为标记基因，A、C正确；在酶切过程中，不能破坏质粒中全部的标记基因，至少需保留其中的一个，B正确；用PstⅠ切割后，质粒上氨苄青霉素抗性基因被破坏了，导入重组质粒的大肠杆菌不可以在含氨苄青霉素的培养基中生长，D错误。 9.如图是利用基因工程技术培育转基因植物，生产可食用疫苗的部分过程示意图，其中Pst Ⅰ、Sma Ⅰ、EcoR Ⅰ、Apa Ⅰ为四种限制性内切核酸酶。下列说法错误的是（　　） A.图示过程是基因工程的核心步骤 B.表达载体构建时需要用到限制酶SmaⅠ C.抗卡那霉素基因的存在有利于将含有抗原基因的细胞筛选出来 D.除图示组成外，表达载体中还应该含有启动子和终止子等结构 解析：B　图示过程为基因表达载体的构建过程，是基因工程中的核心步骤；构建过程中需要将目的基因完整切割下来，此时要用到限制酶PstⅠ、EcoRⅠ；抗卡那霉素基因是标记基因，目的是便于鉴定和筛选含有目的基因的细胞；基因表达载体包括复制原点、启动子、目的基因、终止子和标记基因等。 10.（2024·陕西咸阳期末）PCR引物的3'端为结合模板DNA的关键，5'端无严格限制，可用于添加限制酶切点等序列，dNTP是DNA合成的原料，还可供能。下列相关说法错误的是（　　） A.图示环节所需的温度比上一个环节的低 B.引物的设计要有一段已知目的基因的核苷酸序列 C.耐高温的DNA聚合酶只能从引物的3'端开始延伸DNA链 D.1个循环后，子代DNA双链的脱氧核苷酸数量相同 解析：D　图示环节为引物与模板碱基互补配对，表示的是复性环节，复性的上一环节为变性，复性的温度比变性的温度低，A正确；引物的设计要有一段已知目的基因的核苷酸序列，保证其与已知模板能碱基配对，在后续扩增的过程中才能进行子链的延伸，B正确；子链是从5'端向3'端延伸的，耐高温的DNA聚合酶只能从引物的3'端开始延伸DNA链，C正确；由于两个引物均不在该片段的端点，因此一个循环后，子代DNA双链的脱氧核苷酸数量不相同，D错误。 11.“X基因”是DNA分子上一个有遗传效应的片段，若要用PCR技术特异性地拷贝“X基因”，需在PCR反应中加入两种引物，两种引物及其与模板链的结合位置如图1所示。经4轮循环后产物中有五种不同的DNA分子，如图2所示，其中第⑤种DNA分子有几个（　　） A.2 B.4 C.6 D.8 解析：D　该DNA复制4次共形成16个DNA，其中①②分别有1个，③④分别有3个，⑤有8个，D正确。 12.聚合酶链式反应（PCR）是一种用于扩增特定DNA片段的分子生物学技术。下列关于PCR引物的叙述不正确的是（　　） A.为保证模板链与引物结合的效率，两种引物之间尽量避免存在互补序列 B.为了便于将扩增的DNA片段与载体连接，可在引物的3'端加上限制酶识别序列 C.在两种引物上设计加入不同的限制酶识别序列，主要目的是使目的基因定向插入载体并可避免目的基因自身环化 D.复性所需的温度、时长和延伸所需的温度、时长均与引物有关 解析：B　引物自身不应存在互补序列，否则会出现引物与自身配对、引物跟引物配对的情况，降低PCR的效率，A正确；引物引导子链合成的方向是5'端→3'端，因此为了便于扩增的DNA片段与载体连接，需要在引物的5'端加上限制酶识别序列，B错误；设计引物时需要避免引物之间碱基互补配对而造成引物自身环化的现象，为了便于扩增的DNA片段与载体连接，常在两条引物上设计加入不同的限制酶识别位点，主要目的是使目的基因能定向插入表达载体，避免目的基因自身环化，C正确；复性所需的温度、时长和延伸所需的温度、时长均与引物有关，如引物中G与C含量高，需要设定更高的复性和延伸温度，D正确。 13.某病毒的检测可以采用实时荧光RT-PCR（逆转录聚合酶链式反应）的方法，RT-PCR的具体过程如图。下列有关叙述错误的是（　　） A.过程①以mRNA为模板合成单链DNA B.过程②③拟对单链cDNA进行第n次循环的扩增，理论上需要n个引物B C.该技术用于对某些微量RNA病毒的检测，可提高检测的灵敏度 D.游离的脱氧核苷酸只能从引物的3'端开始连接 解析：B　过程①是以mRNA形成单链DNA的过程，表示逆转录，A正确；过程③拟对单链cDNA进行第n次循环的扩增，根据DNA分子半保留复制特点可知，该过程理论上至少需要2n－1个引物B，B错误；利用实时荧光RT-PCR技术对某些微量RNA病毒进行检测时可提高检测的灵敏度，是因为增加了待测RNA逆转录产生的DNA的数量（或浓度），便于检测，C正确；游离的脱氧核苷酸只能从引物的3'端开始连接，D正确。 14.（多选）用PCR技术特异性地拷贝“X基因”，经四轮循环后产物中有五种不同的DNA分子。下列有关叙述正确的是（　　） A.第一轮循环得到2个DNA分子，即①②各一个 B.第二轮循环得到4个DNA分子，即①②③④各一个 C.第三轮循环得到8个DNA分子，其中有2个是等长的，也就是有2个⑤ D.第四轮循环得到16个DNA分子，其中有4个⑤ 解析：ABC　第四轮循环得到的16个DNA分子中，两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段有24－2×4＝8（个），即有8个⑤，D错误。 15.下面几幅图与基因工程有关。图1为限制酶EcoR Ⅰ的识别序列，图2表示目的基因及限制酶切割位点，图3表示目的基因上的DNA片段，图4表示质粒。请回答下列问题： （1）获得图2中目的基因的方法除PCR技术外，还有从基因文库中获取、人工合成。 （2）采用PCR扩增目的基因的原理是DNA半保留复制，图2中A、B、C、D 4种单链DNA片段中，有B、C　两种引物（DNA复制方向由5'→3'）。 （3）图3为目的基因中的某一片段，下列有关叙述正确的是A。 A.该片段的基本骨架由脱氧核糖与磷酸交替连接而成 B.该片段含A—T碱基对比较多，故其结构比较稳定 C.若利用PCR扩增该片段，则需解旋酶将①氢键全部解开 D.若该目的基因复制6次，则需要碱基A的数量是252个 （4）在构建目的基因表达载体时，用Pst Ⅰ、EcoR Ⅰ 两种酶同时切割目的基因和质粒，是为了防止一种酶切割时产生目的基因与载体反向连接，从图2切割下目的基因需要消耗4个水分子。不选用限制酶PstⅠ和HindⅢ同时对质粒和目的基因进行切割的原因是会破坏标记基因。 解析：（1）获得目的基因的方法有PCR技术、从基因文库中获取、人工合成。（2）采用PCR扩增目的基因的原理是DNA半保留复制，由图2可知，DNA复制只能从5'端到3'端，因此构建前利用PCR技术扩增基因时，A、B、C、D四种单链DNA片段中应选取B和C作为引物。（3）DNA的基本骨架由脱氧核糖与磷酸交替连接而成，A正确；其结构中G—C碱基对越多，分子结构越稳定，B错误；PCR技术利用高温解开氢键，不需要解旋酶，C错误；由图3可知，目的基因碱基A有2个，复制6次需要碱基A的数量为26×2－2＝126个，D错误。（4）在构建目的基因表达载体时，用PstⅠ、EcoRⅠ两种酶同时切割目的基因和质粒，是为了防止一种酶切割时产生目的基因与载体反向连接。限制酶破坏的是磷酸二酯键，图中目的基因切割需要破坏4个磷酸二酯键，因此需要消耗4个水分子。由图可知，不选用限制酶PstⅠ和Hind Ⅲ同时对质粒和目的基因进行切割的原因是会破坏标记基因。 16.图1是某基因工程中构建重组质粒的过程示意图，载体质粒P0具有四环素抗性基因（TetR）和氨苄青霉素抗性基因（AmpR）。请回答下列问题： （1）EcoR Ⅴ酶切位点为…GAT↓ATC…，EcoR Ⅴ酶切出来的线性载体P1为平末端。 （2）用Taq DNA聚合酶进行PCR扩增获得的目的基因片段，其两端各自带有一个腺嘌呤脱氧核苷酸。载体P1用酶处理，在两端各添加了一个碱基为胸腺嘧啶（T）的脱氧核苷酸，形成P2；P2和目的基因片段在　DNA连接酶作用下，形成重组质粒P3。 （3）为筛选出含有重组质粒P3的菌落，采用含有不同抗生素的平板进行筛选，得到A、B、C三类菌落，其生长情况如下表（“＋”代表生长，“－”代表不生长）。根据表中结果判断，应选择的菌落是B（填表中字母）类，另外两类菌落质粒导入情况分别是A类菌落含有P0、C类菌落未转入质粒。 　　　　菌落类型 平板类型　　　　　 A B C 无抗生素 ＋ ＋ ＋ 氨苄青霉素 ＋ ＋ － 四环素 ＋ － － 氨苄青霉素＋四环素 ＋ － － （4）为鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，拟设计引物进行PCR鉴定。图2所示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置，PCR鉴定时应选择的一对引物是乙、丙。某学生尝试用图中另外一对引物，结果从某一菌落的质粒中扩增出了400 bp片段，原因是目的基因反向连接。 解析：（1）从图中可以看出，EcoR Ⅴ酶切出来的载体质粒为平末端。（2）从图中可以看出，目的基因的两端各有一个游离的腺嘌呤脱氧核苷酸，由于载体P1为平末端，所以载体P1的两端应该各添加一个胸腺嘧啶脱氧核苷酸，这样在DNA连接酶的作用下才能把目的基因和载体P1连接起来。（3）由题意可知，构建重组质粒时四环素抗性基因被破坏，所以导入目的基因的菌落只能在没有抗生素或含有氨苄青霉素的培养基中存活，应该选B类菌落。A类菌落能在表中条件下存活，说明导入的是P0质粒。C类菌落只能在无抗生素的培养基中存活，说明C类菌落没有导入质粒。（4）据图分析，目的基因的外侧链只能用丙作引物，内侧链可用甲、乙作引物，如果用甲、丙作引物，则无论目的基因是否插入正确，都能通过PCR扩增大量目的基因，如果用乙、丙作为引物，当目的基因插入不正确（反向插入）时，则乙、丙两引物都结合在外侧，PCR不能正常进行，因此选用乙、丙作为引物可以进行PCR鉴定。若扩增出的DNA片段为400 bp，则正好是目的基因反向连接后，外侧链用乙作引物，内侧链用甲作引物扩增出的片段。 17.（2024·盐城实验高级中学高二期中）金属硫蛋白（MT）是一类广泛存在的金属结合蛋白，某研究小组计划通过聚合酶链式反应（PCR）扩增获得目的基因，构建转基因工程菌，用于重金属废水的净化处理。如图是PCR扩增过程的示意图，请回答下列问题： （1）从高表达MT蛋白的生物组织中提取mRNA，通过逆转录获得DNA用于PCR扩增。 （2）设计一对与MT基因两端序列互补配对的引物（引物1和引物2），为方便构建重组质粒，在引物中需要增加适当的限制性内切核酸酶（或限制酶）切割位点。设计引物时需要避免引物之间形成碱基互补配对，从而造成引物自连。 （3）图中步骤1代表变性，步骤2代表复性，步骤3代表延伸，这三个步骤组成一轮循环。 （4）PCR扩增时，复性温度的设定是成败的关键。复性温度过高会破坏引物与模板的碱基配对。复性温度的设定与引物长度、碱基组成有关，长度相同但G—C含量高的引物需要设定更高的复性温度。 （5）如果PCR得不到任何扩增产物，则可以采取的改进措施有②③（填序号）。 ①升高复性温度　②降低复性温度　③重新设计引物 解析：（1）PCR是在体外进行DNA扩增，提取的mRNA不能用于PCR扩增，需要经过逆转录获得DNA后才可用于PCR扩增。（2）设计一对与MT基因两端序列互补配对的引物（引物1和引物2），需要在引物中增加适当的限制性内切核酸酶（限制酶）的识别序列，便于构建重组质粒。为了避免引物自连，设计引物时需要避免引物之间形成碱基互补配对。（3）根据PCR的过程可知，图中步骤1为变性，步骤2为复性，步骤3为延伸，这三个步骤构成一轮循环。（4）复性温度的设定与引物长度、碱基组成有关，复性温度过高会破坏引物与模板的碱基配对。因G、C之间氢键数多于A、T之间氢键数，故在使用G—C含量高的引物时需要设定更高的复性温度。（5）如果PCR得不到任何扩增产物，可能的原因是复性温度过高使扩增效率降低；也可能是未按照目的基因两端的核苷酸序列来设计引物，需要重新设计。因此可采取的措施有降低复性温度、重新设计引物等。 18 / 18 学科网（北京）股份有限公司 $