第3章 第2节 第1课时 目的基因的筛选与获取和基因表达载体的构建-【精讲精练】2025-2026学年高中生物选择性必修3 生物技术与工程教师用书word（人教版）

本高中生物学讲义聚焦基因工程基本操作程序的核心知识点，系统梳理目的基因的筛选与获取（涵盖PCR技术的原理、反应条件、扩增过程及产物鉴定）和基因表达载体的构建（包括构建目的、组成要素与操作过程），通过表格对比、过程图示、探究问题等学习支架，构建从获取目的基因到载体构建的完整知识脉络。 该资料以科学思维和探究实践为核心设计亮点，通过PCR与体内DNA复制的对比分析培养科学思维，结合限制酶选择、引物设计等探究活动提升科学探究能力，融入古生物DNA扩增等实际案例增强学科联系。课中助力教师引导学生深度理解技术原理，课后通过分层练习题（含高考题改编）帮助学生查漏补缺，强化知识应用。

第2节　基因工程的基本操作程序 第1课时　目的基因的筛选与获取和基因表达载体的构建 学习目标 1.阐明基因工程的原理和基本操作程序 科学思维 2.尝试进行PCR的基本操作并用电泳鉴定PCR的产物 科学探究 一、目的基因的筛选与获取 1．筛选合适的目的基因 2．利用PCR获取和扩增目的基因 (1)原理：DNA半保留复制 (2)PCR反应的条件 参与的组分 在DNA复制中的作用 DNA母链 提供DNA复制的模板 4种脱氧核苷酸 合成DNA子链的原料 解旋酶(体外用高温代替) 打开DNA双链 (耐高温的)DNA聚合酶 催化合成DNA子链 引物(长度通常为20～30个核苷酸) 分为2种，分别与两条模板链结合，使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸 温度 控制温度使DNA复制在体外反复进行 缓冲液(含Mg2＋) 真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2＋激活 (3)PCR扩增的过程(如图) (4)PCR产物的鉴定：常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定。 复性不一定均为引物与DNA模板结合。复性时，引物与DNA模板的结合是随机的，也存在DNA解开的两条链的结合。　 二、基因表达载体的构建 1．基因表达载体构建的目的 让目的基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。 2．基因表达载体的组成 3．基因表达载体的构建过程 (1)首先用一定的限制酶切割载体。 (2)然后用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段。 (3)再利用DNA连接酶将含目的基因的DNA片段拼接到载体的切口处(如图所示)。 目的基因插入位点不是随意的。基因表达载体需要启动子与终止子的调控，所以目的基因应插入启动子和终止子之间的部位。若目的基因插入启动子部位，启动子将失去原功能。　 聚合酶链式反应(PCR)是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点是能将微量的DNA大幅增加。因此，无论是化石中的古生物、历史人物的残骸，还是几十年前凶杀案中凶手所遗留的毛发、皮肤或血液，只要能分离出一丁点的DNA，就能用PCR加以放大，进行比对。结合所学知识判断： (1)DNA聚合酶能够从引物的5′端开始连接脱氧核苷酸(×) (2)PCR除需要耐高温的DNA聚合酶、解旋酶、4种脱氧核苷酸和DNA模板之外，还需要引物等基本条件(×) (3)每一次循环后目的基因的量可以增加一倍，呈指数形式扩增(√) (4)真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2＋激活。因此，PCR反应缓冲液中一般要添加Mg2＋(√) (5)终止子相当于一盏红色信号灯，使翻译在所需要的地方停下来(×) 探究点一　利用PCR获取和扩增目的基因 聚合酶链式反应是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，下图为PCR扩增中第一轮的变化，探究下列问题： (1)什么是引物？如果在某基因组定位了一个目的基因X，但是其核苷酸序列未知，现已知X邻近区域的上、下游的部分DNA序列，此时如何设计引物？ 提示　引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸；虽然目的基因X的核苷酸序列未知，但X临近区域的上、下游的部分DNA序列已知，因此可根据X临近区域的上、下游已知序列设计引物。 (2)结合下图分析PCR过程中为什么需要引物？DNA链复制的方向是怎样的？ 提示　DNA聚合酶不能从头合成子链，只能把游离的脱氧核苷酸连接到已经存在的片段上。加入引物，能够使DNA聚合酶从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸。DNA链复制的方向总是从子链的5′端向3′端延伸。 (3)PCR扩增目的基因时，复性温度的设定是成败的关键。复性温度过高会破坏引物与模板的碱基配对，复性温度过低又会造成引物不能与DNA模板链的特定部位结合。复性温度的设定与引物长度、碱基组成有关，假设引物的长度相同，在GC含量高时，对复性温度的设定有什么要求？说明理由。 提示　在引物的GC含量高时，设定的复性温度要高一些。因为DNA分子中G—C之间有三个氢键，A—T之间有两个氢键。 (4)在利用PCR获取和扩增目的基因时，从第几轮循环才会产生完整的目的基因(可用相关图解解释)? 提示　第3轮，如图所示： 请从酶的角度分析PCR技术扩增DNA与DNA体内复制的不同点。 提示　①PCR技术扩增DNA不需要解旋酶；②PCR技术需要的DNA聚合酶应具有耐高温性。 1．生物体内DNA复制与PCR反应的比较 2．PCR中与引物有关的易错点 (1)设计引物的依据通常是目的基因两端的核苷酸序列。 (2)用于PCR的引物长度通常为20～30个核苷酸。若引物长度过短，则引物与模板链结合的特异性较差。 (3)两种引物需符合以下要求，否则引物失效，得不到扩增产物。 ①每种引物内部不能发生局部碱基互补配对，否则会导致自身折叠； ②两种引物之间不能在局部发生碱基互补配对，否则会导致引物自连。 (4)为了便于扩增的DNA片段与表达载体连接，需在引物的5′端加上限制酶的酶切位点，且常在两种引物设计上加入不同的酶切位点，主要目的是保证目的基因与载体的正向连接。 1．(多选)(2025·邯郸调研)关于PCR技术的说法不正确的是(　　) A．PCR技术获取目的基因的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列 B．PCR过程中只需要两个引物分子 C．PCR的主要过程包括变性、复性、延伸，其中延伸阶段需要耐高温的DNA聚合酶 D．PCR过程中子链的延伸方向是从3′端到5′端 解析　PCR技术获取目的基因的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列，用于延伸子链，A正确；PCR过程中只需要两种引物分子，每条新的子链延伸都需要一个引物，B错误；PCR的主要过程包括变性、复性、延伸，其中延伸阶段需要耐高温的DNA聚合酶，C正确；PCR过程中子链延伸的方向是从5′端到3′端，D错误。 答案　BD 2．下列有关体内DNA复制与PCR技术比较的叙述，错误的是(　　) A．二者子链的延伸方向相同，均为5′端→3′端 B．二者均需要解旋酶破坏氢键来实现解旋 C．体内DNA复制需要能量，PCR反应也需要能量 D．二者遵循的碱基互补配对原则相同 解析　DNA体内复制与利用PCR技术扩增DNA时，子链的延伸方向相同，均为5′端→3′端，A正确；PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，在高温条件下氢键断裂，B错误；DNA体内复制与利用PCR扩增DNA时都需要能量，但两者所需能量来源不同，C正确；DNA体内复制与利用PCR扩增DNA时，遵循的碱基互补配对原则相同，D正确。 答案　B 探究点二　基因表达载体的构建 目的基因导入受体细胞之前，需构建基因表达载体，图甲、乙表示质粒及目的基因所在DNA片段，图中箭头表示相关限制酶的切割位点。探究下列问题： (1)构建基因表达载体时需要使用的工具酶为限制酶和DNA连接酶。 (2)用图中质粒和DNA构建基因表达载体时，不能使用SmaⅠ切割，原因是SmaⅠ会破坏质粒的抗生素抗性基因和外源DNA中的目的基因。 (3)构建基因表达载体时，可用EcoRⅠ同时切割质粒和DNA，但会导致目的基因和质粒的自身环化、目的基因不能定向连接等问题，为避免以上问题出现，应使用BamHⅠ和Hind_Ⅲ(或EcoRⅠ和Hind_Ⅲ)两种限制酶。 (4)构建好的基因表达载体在目的基因前要加上启动子，其是RNA聚合酶识别和结合的部位。 (5)请简要描述基因表达载体的构建过程。 提示　用相同的限制酶分别切割载体和含目的基因的DNA片段，产生末端相同的切口，再利用DNA连接酶将目的基因片段拼接到载体的切口处。 限制酶的选择技巧 (1)根据目的基因两端的限制酶切割位点确定限制酶的种类 ①应选择切割位点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择PstⅠ。 ②不能选择切割位点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择SmaⅠ。 ③为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切割位点)。 (2)根据质粒的特点确定限制酶的种类 3．(2023·新课标卷)某同学拟用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA连接酶为工具，将目的基因(两端含相应限制酶的识别序列和切割位点)和质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。 下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是(　　) A．质粒和目的基因都用酶3切割，用E.coli DNA连接酶连接 B．质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4 DNA连接酶连接 C．质粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4 DNA连接酶连接 D．质粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E.coli DNA连接酶连接 解析　只用一种限制酶切割质粒和目的基因，会使质粒和目的基因发生自身环化或者使目的基因在质粒中反向连接，A错误；质粒用酶3切割后得到平末端，目的基因用酶1切割后得到的是黏性末端，二者不能连接，B错误；质粒和目的基因都用酶1和酶2切割后得到黏性末端，用T4 DNA连接酶连接后，还能保证目的基因在质粒上的连接方向，此重组表达载体的构建方案最合理且高效，C正确；酶2和酶4切割后产生的黏性末端相同，易导致目的基因和质粒自身环化或者使目的基因在质粒中反向连接，并且用酶4切割会破坏标记基因，D错误。 答案　C 4．(多选)如图是利用基因工程技术构建重组表达载体的过程示意图，其中PstⅠ、SmaⅠ、EcoRⅠ、ApaⅠ为四种限制酶。下列相关叙述正确的是(　　) A．需要用限制酶PstⅠ和EcoRⅠ来切割质粒 B．表达载体中的抗青霉素基因在受体细胞中能复制 C．表达载体中抗原基因的终止子位于抗青霉素基因的下游 D．表达载体中目的基因的上游有启动子 解析　限制酶SmaⅠ的识别序列位于目的基因中，因此表达载体构建时不能用限制酶SmaⅠ，应用限制酶PstⅠ、EcoRⅠ，A正确；表达载体中的抗青霉素基因在受体细胞中能稳定存在且能遗传给下一代，B正确；表达载体中抗原基因的终止子位于抗青霉素基因的上游，C错误；表达载体中目的基因的上游有启动子，是RNA聚合酶识别和结合的部位，D正确。 答案　ABD [构建课堂要点] [检测学习效果] 1．基因工程主要操作步骤的顺序是(　　) ①基因表达载体的构建　②将目的基因导入受体细胞　③目的基因的检测与鉴定　④目的基因的筛选与获取 A．③②④① B．②④①③ C．④①②③ D．③④①② 解析　基因工程的主要操作步骤顺序是：④目的基因的筛选与获取→①基因表达载体的构建→②将目的基因导入受体细胞→③目的基因的检测与鉴定。 答案　C 2．下列关于PCR反应体系中所加物质作用的叙述，错误的是(　　) A．耐高温的DNA聚合酶用于催化DNA子链的合成 B．引物使Taq DNA聚合酶能从引物的5′端延伸DNA链 C．目标DNA的双链用作合成DNA复制的模板 D．四种脱氧核苷酸为PCR提供原料 解析　在复制时，引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后，DNA聚合酶从引物的3′端开始延伸DNA链，因此DNA合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸，B错误。 答案　B 3．肿瘤坏死因子(TNF)在体内和体外均能杀死某些肿瘤细胞或抑制肿瘤细胞的增殖，科研人员欲大量生产TNF，用于临床上疾病的治疗。已知HindⅢ、BamHⅠ、BglⅡ和Pst Ⅰ为限制酶，且识别的序列均不相同。下列关于基因工程中重组质粒构建的说法，正确的是(　　) A．可选用Pst Ⅰ、BglⅡ和HindⅢ、BglⅡ两种组合切割质粒和目的基因 B．可用DNA连接酶或DNA聚合酶连接TNF基因和切割开的质粒 C．启动子指的就是起始密码子，可驱动TNF基因的转录过程 D．四环素抗性基因属于标记基因，便于鉴别受体细胞中是否含有目的基因 解析　据图可知，限制酶Pst Ⅰ 切割质粒时，会将质粒切成两段，而且会破坏标记基因，因此不能选用Pst Ⅰ、Bgl Ⅱ这一组合，A错误；不能使用DNA聚合酶连接目的基因和切割开的质粒，应使用DNA连接酶，B错误；起始密码子位于mRNA上，启动子是一段具有特殊序列的DNA片段，是RNA聚合酶识别和结合的位点，可驱动TNF基因的转录过程，C错误；四环素抗性基因属于标记基因，便于鉴别受体细胞中是否含有目的基因，D正确。 答案　D 4．(2025·安徽卷)质粒K中含有β－半乳糖苷酶基因，将该质粒导入大肠杆菌细胞后，其编码的酶可分解X­gal，产生蓝色物质，进而形成蓝色菌落，如图所示。科研小组以该质粒作为载体，采用基因工程技术实现人源干扰素基因在大肠杆菌中的高效表达。下列叙述错误的是(　　) A．使用氯化钙处理大肠杆菌以提高转化效率，可增加筛选平板上白色和蓝色菌落数 B．如果筛选平板中仅含卡那霉素，生长出的白色菌落不可判定为含目的基因的菌株 C．因质粒K中含两个标记基因，筛选平板中长出的白色菌落即为表达目标蛋白的菌株 D．若筛选平板中蓝色菌落偏多，原因可能是质粒K经酶切后自身环化并导入了大肠杆菌 解析　使用氯化钙处理大肠杆菌，可使其处于感受态，提高转化效率，即更多的大肠杆菌能吸收质粒，无论吸收的是含目的基因的重组质粒(可能形成白色菌落)还是未重组的质粒K(形成蓝色菌落)，都可增加筛选平板上白色和蓝色菌落数，A正确；如果筛选平板中仅含卡那霉素，能生长出的菌落都具有卡那霉素抗性，白色菌落可能是导入了重组质粒(含目的基因)，也可能是其他情况导致β－半乳糖苷酶基因不能正常表达而呈现白色，所以不可判定为含目的基因的菌株，B正确；因质粒K中含两个标记基因，筛选平板中长出的白色菌落应为含目的基因的菌株，能否表达相应蛋白，需进一步检测，C错误；若筛选平板中蓝色菌落偏多，原因可能是质粒K经酶切后自身环化并导入了大肠杆菌，因为自身环化的质粒K中β－半乳糖苷酶基因完整，能表达活性β－半乳糖苷酶，分解X­gal形成蓝色菌落，D正确。 答案　C 5．(多选)(2025·太原五中调研)下列有关基因表达载体的叙述，正确的是(　　) A．具有复制原点，使目的基因能在受体细胞内扩增 B．具有启动子，使DNA聚合酶识别并开始转录 C．具有标记基因，有利于鉴别受体细胞中是否含有目的基因 D．具有目的基因，以产生特定的基因产物 解析　基因表达载体中具有复制原点，使目的基因能在受体细胞内扩增，A正确；基因表达载体中具有启动子，使RNA聚合酶识别并开始转录，B错误；标记基因的作用是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来，所以基因表达载体中具有标记基因，有利于鉴别受体细胞中是否含有目的基因，C正确；基因表达载体中应具有目的基因，以产生特定的基因产物，D正确。 答案　ACD [基础达标练] 1．下列有关获取目的基因的叙述错误的是(　　) A．目的基因就是编码蛋白质的基因 B．筛选和获取目的基因是基因工程的第一步 C．来自苏云金杆菌的Bt基因可作为转基因抗虫棉的目的基因 D．序列比对工具的应用为科学家找到合适的目的基因提供了更多的机会 解析　目的基因主要是指编码蛋白质的基因，A错误；目的基因的筛选与获取是实施基因工程的第一步，B正确；来自苏云金杆菌的Bt基因可作为培育转基因抗虫棉用到的目的基因，C正确；随着测序技术的发展，以及序列数据库和序列比对工具等的应用，越来越多的基因的结构和功能为人们所知，这为科学家找到合适的目的基因提供了更多的机会和可能，D正确。 答案　A 2．下列关于PCR技术的叙述，正确的是(　　) A．PCR技术建立在对扩增的目的基因序列完全已知的基础上 B．该技术需要解旋酶和耐高温的DNA聚合酶 C．该技术需要一对特异性的引物，要求一对引物的序列是互补的 D．该技术应用DNA半保留复制原理，也需要模板、原料、能量、酶等条件 解析　PCR技术扩增的目的基因序列不一定是完全已知的，只要知道部分核苷酸序列即可合成引物，A错误；该技术是通过高温来使DNA解旋的，不需要解旋酶，B错误；该技术需要的一对引物，分别能与模板DNA的两条链进行碱基互补配对，其序列不是互补的，C错误。 答案　D 3．(2025·邢台高二期末)如图为利用逆转录方法和PCR技术扩增目的基因片段的过程示意图。据图分析，相关说法错误的是(　　) A．③过程使用超过90 ℃的高温处理是为了让目的基因充分变性 B．⑤过程使用72 ℃的温度处理既可以防止DNA变性，还能促进子链的延伸 C．④过程两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合 D．若RNA单链中A与U之和占该链碱基含量的40%，则其逆转录合成的双链DNA中，A与U之和也占该DNA碱基含量的40% 解析　③过程为变性，变性过程使用超过90 ℃的高温处理是为了让目的基因的双链解开，充分变性，A正确；⑤过程为延伸，延伸过程使用72 ℃左右的温度处理既可以防止DNA变性，还能促进子链的延伸，B正确；④过程为复性，复性过程使用50 ℃左右的温度处理，使两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合，C正确；RNA中含有U，DNA中不含有U，含有T，D错误。 答案　D 4．下列哪项不是基因表达载体的组成部分(　　) A．启动子 B．终止密码子 C．标记基因 D．目的基因 解析　基因表达载体的组成为目的基因＋启动子＋终止子＋标记基因。终止子位于基因的尾端，是一段有特殊结构的DNA片段，可使转录在所需要的地方停止下来；终止密码子是mRNA上3个相邻的碱基，使翻译过程在相应的地方停止。 答案　B 5．关于基因表达载体的说法不正确的是(　　) A．基因表达载体的构建是基因工程的核心步骤 B．基因表达载体包含启动子、目的基因、终止子、标记基因等 C．启动子位于目的基因的上游，能够启动翻译 D．不同的目的基因所需的启动子不一定相同 解析　基因表达载体使目的基因在受体细胞中稳定存在并且可以遗传给下一代并表达和发挥作用，是基因工程的核心步骤，A正确；基因表达载体包括启动子、终止子、目的基因、标记基因等，其中启动子位于目的基因的上游，终止子位于目的基因的下游，B正确；启动子位于目的基因的上游，是启动转录的一段DNA，C错误；不同的目的基因具有不同的核苷酸序列，其启动子也不尽相同，D正确。 答案　C 6．在基因工程的操作过程中，获得重组质粒不需要(　　) ①DNA连接酶　②限制性内切核酸酶　③RNA聚合酶　④具有标记基因的质粒　⑤目的基因　⑥四种脱氧核苷酸 A．③⑥ B．②④ C．①⑤ D．①②④ 解析　构建重组质粒时，首先要用限制性内切核酸酶切割含有目的基因的DNA片段和质粒，其次需要用DNA连接酶将目的基因与质粒连接；RNA聚合酶催化转录过程，获得重组质粒时不需要RNA聚合酶；获得重组质粒时，需要具有标记基因的质粒作为载体；重组质粒是由目的基因与质粒形成的；四种脱氧核苷酸是合成DNA的原料，获得重组质粒不需要四种脱氧核苷酸。 答案　A 7．(2025·福建三明四校联考)如果要用PCR扩增以下DNA模板中的基因1，需要的一对引物序列是(　　) A．5′－CTTCGAAATTC－3′、5′－TCTCCCGATCGG－3′ B．5′－CTTCGAAATTC－3′、5′－CCGATCGGGAGA－3′ C．5′－GAAGCTTTAAG－3′、5′－AGAGCAAAGGAT－3′ D. 5′－GAAGCTTTAAG－3′、5′－CCGATCGGGAGA－3′ 解析　DNA的复制需要引物，使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始延伸DNA链。将DNA分子的另一条链补全后，可设计得到如图所示引物。 基因1 答案　B 8．在核酸分子杂交技术中，常常使用已知序列的单链核酸片段作为探针(探针是指以放射性同位素、生物素或荧光染料等进行标记的已知核苷酸序列的核酸片段)。为了获得B链作探针，可应用PCR技术进行扩增，应选择的引物种类是(　　) A．引物1与引物2 B．引物3与引物4 C．引物2与引物3 D．引物1与引物4 解析　要获得B链，根据PCR中子链延伸方向为5′到3′，则需选择引物2与引物3进行扩增，故选C。 答案　C [素能提升练] 9．(多选)图甲、乙中的箭头表示三种限制性内切核酸酶的切割位点，ampr表示氨苄青霉素抗性基因，neo表示新霉素抗性基因。下列叙述正确的是(　　) A．图甲中的质粒用BamHⅠ切割后，含有2个游离的磷酸基团 B．在构建重组质粒时，可用PstⅠ和BamHⅠ切割质粒和外源DNA C．导入目的基因的大肠杆菌可在含氨苄青霉素的培养基中生长 D．用PstⅠ酶切，无法避免目的基因和载体的自身环化 解析　图甲中的质粒用BamHⅠ切割后，会打开一个切口，故有2个游离的磷酸基团，A正确；在构建重组质粒时，不能用BamHⅠ切割质粒和外源DNA，会破坏目的基因，B错误；导入目的基因的大肠杆菌不能在含氨苄青霉素的培养基上生长，可以在含新霉素的培养基上生长，C错误；用同一种限制酶酶切时，无法避免目的基因和载体的自身环化，D正确。 答案　AD 10．(多选)下图表示pBR322质粒和人生长激素基因所在片段的结构信息，将二者构建的重组质粒导入受体菌并进行筛选。下列叙述正确的是(　　) A．应选择的限制酶组合是酶F和酶G B．所选用的受体菌不能含有Apr和Tcr基因 C．用含氨苄青霉素的培养基筛选出的一定是含重组质粒的受体菌 D．同时用三种限制酶处理图中质粒 解析　为避免切割后DNA片段的自身环化，又保留质粒上的标记基因，切割时应选择的限制酶组合是酶F和酶G，A正确；所选用的受体菌不能含有Apr和Tcr基因，以便于对含有目的基因的受体菌的选择，B正确；用含氨苄青霉素的培养基筛选出的有导入重组质粒的受体菌和导入原质粒的受体菌，C错误；据图可知同时用三种限制酶处理图中质粒，因酶E有两个作用位点，故将质粒切割成了4个DNA片段，D正确。 答案　ABD 11．图1表示含有目的基因D的DNA片段长度(bp即碱基对)和部分碱基序列，图2表示一种质粒的结构和部分碱基序列。现有MspⅠ、BamHⅠ、MboⅠ、SmaⅠ4种限制性内切核酸酶切割的碱基序列和酶切位点分别为C↓CGG、G↓GATCC、↓GATC、CCC↓GGG。请回答下列问题： (1)若用限制酶SmaⅠ完全切割图1中DNA片段，其产物长度为________________________________________________________________________。 (2)若图1中虚线方框内的碱基对被T—A碱基对替换，那么基因D就突变为基因d。从隐性纯合子分离出图1及其对应的DNA片段，用限制酶SmaⅠ完全切割，产物中共有________种不同DNA片段。为了提高实验成功率，需要通过________技术扩增目的基因，以获得目的基因的大量拷贝，该技术原理为_____________________________________。 (3)若将图2中质粒和目的基因D通过同种限制酶处理后进行连接，形成重组质粒，那么应选用的限制酶是________。在导入重组质粒后，为了筛选出含质粒的大肠杆菌，一般需要用添加________的培养基进行培养，想进一步筛选出含重组质粒的受体细胞，还需要接种到含________的培养基中培养。 (4)假设用BamHⅠ切割DNA获取目的基因，用MboⅠ切割质粒，然后形成重组质粒，若将插入在抗生素B抗性基因处的目的基因重新切割下来，能否再次用BamHⅠ________(填“可以”“不可以”或“不一定”)，原因是________________________________________。 解析　(1)SmaⅠ的识别序列和酶切位点是CCC↓GGG，可知其切割产生的末端是平末端，产物长度是534＋3＝537 bp、796－3－3＝790 bp、658＋3＝661 bp。(2)若图1中虚线方框内的碱基对被T—A碱基对替换，则基因D就突变为基因d，且基因d只有一个SmaⅠ的酶切位点，因而基因d会被SmaⅠ切割形成两个片段(长度分别为1327 bp、661 bp)。为了提高实验成功率，可以通过PCR技术大量扩增目的基因，以获得目的基因的大量拷贝，该技术模拟了体内DNA复制的过程，原理为DNA半保留复制。(3)由图可知，目的基因D两侧都是限制酶BamHⅠ的识别序列，因此应选用限制酶BamHⅠ切割图1中含有目的基因D的外源DNA分子和图2中的质粒。用BamHⅠ切割质粒后会破坏抗生素A抗性基因，但不会破坏抗生素B抗性基因，因此一般需要用添加抗生素B的培养基进行培养；若想进一步筛选出含重组质粒的受体细胞，还需要接种到含抗生素A的培养基中培养筛选出含有重组质粒的大肠杆菌。(4)假设用BamHⅠ切割DNA获取目的基因，用MboⅠ切割质粒，然后形成重组质粒，若将插入在抗生素B抗性基因处的目的基因重新切割下来，再次用BamHⅠ不一定能将其切割，因为目的基因和抗生素B抗性基因的黏性末端随意连接，拼接处不一定出现GGATCC。 答案　(1)537 bp、790 bp、661 bp　(2)2　PCR　DNA半保留复制　(3)BamHⅠ　抗生素B　抗生素A　(4)不一定　因为目的基因和抗生素B抗性基因拼接处不一定出现GGATCC 12．下列几幅图与基因工程有关。图1为限制酶EcoRⅠ的识别序列，图2表示目的基因及限制酶切割位点，图3表示目的基因上的DNA片段，图4表示质粒。请回答下列问题： (1)采用PCR扩增目的基因的原理是______________________，图2中A、B、C、D 4种单链DNA片段中，有________两种引物(DNA复制方向由5′→3′)。 (2)图3为目的基因中的某一片段，下列有关叙述正确的是________(填字母)。 a．该片段的基本骨架由脱氧核糖与磷酸交替连接而成 b．该片段含A—T碱基对比较多，故其结构比较稳定 c．若利用PCR扩增该片段，则需解旋酶将①氢键全部解开 d．若该片段复制6次，则需要碱基A的数量至少是252个 (3)在构建目的基因表达载体时，用PstⅠ、EcoRⅠ两种酶同时切割目的基因和质粒，是为了防止一种酶切割时产生________，从图2切割下目的基因需要消耗________个水分子。不选用限制酶PstⅠ和Hind Ⅲ同时对质粒和目的基因进行切割的原因是_________________ ____________________________________________________。 解析　(1)采用PCR扩增目的基因的原理是DNA半保留复制，由图2可知，DNA复制只能从5′到3′，因此构建前利用PCR技术扩增基因时，A、B、C、D四种单链DNA片段中应选取B和C作为引物。(2)DNA的基本骨架由脱氧核糖与磷酸交替连接而成，a正确；其结构中G—C碱基对越多，分子结构越稳定，b错误；PCR技术利用高温解开氢键，不需要解旋酶，c错误；由图3可知，该片段碱基A有2个，复制6次至少需要碱基A的数量为26×2－2＝126个，d错误，故选a。(3)在构建目的基因表达载体时，用PstⅠ、EcoRⅠ两种酶同时切割目的基因和质粒，是为了防止一种酶切割时产生目的基因与载体反向连接。限制酶破坏的是磷酸二酯键，图中目的基因切割需要破坏4个磷酸二酯键，因此需要消耗4个水分子。由图可知，不选用限制酶PstⅠ和Hind Ⅲ同时对质粒和目的基因进行切割的原因是会破坏标记基因。 答案　(1)DNA半保留复制　B、C　(2)a (3)目的基因与载体反向连接　4　会破坏标记基因 学科网（北京）股份有限公司 $