第3章 第2节 基因工程的基本操作程序（教用Word）-【金榜题名】2025-2026学年高二生物选择性必修3 生物技术与工程同步学案（人教版）

本讲义聚焦基因工程的基本操作程序这一核心知识点，系统梳理目的基因的筛选与获取、表达载体构建、导入受体细胞及检测鉴定的完整流程，通过学习目标、素养要求、自学诊断等模块搭建阶梯式学习支架。 资料以科学思维和探究实践为特色，通过PCR与DNA复制比较培养分析能力，设计“提出基因工程构想”任务强化探究能力，结合抗虫棉检测等实例。课中助力教师通过问题链和典题突破重难点，课后自学诊断与核心语句必背帮助学生巩固知识、查漏补缺。

第2节　基因工程的基本操作程序 学习目标 素养要求 阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的获取、基因表达载体的构建、目的基因导入受体细胞和目的基因及其表达产物的检测与鉴定等步骤。 1.结合生产实际，举例说出基因工程的基本操作程序。(科学思维) 2．针对人类生产和生活的某一需求，尝试提出初步的基因工程构想，完成初步设计。(科学探究) 完整的基因工程流程主要需要四个步骤：目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。 一、目的基因的筛选与获取 1．目的基因：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。主要是指编码蛋白质的基因。 2．筛选目的基因的方法：从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选是最有效的方法之一。 3．利用PCR获取和扩增目的基因 (1)原理：DNA半保留复制。 (2)条件： ①在缓冲液中进行，需提供DNA模板，分别与两条模板链结合的2种引物，4种脱氧核苷酸和耐高温的DNA聚合酶。 ②通过控制温度使DNA复制在体外反复进行。 (3)过程： (4)结果：目的基因成指数形式扩增。 二、基因表达载体的构建 1．构建基因表达载体的目的 (1)使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代。 (2)使目的基因能够表达和发挥作用。 2．基因表达载体的组成 3．基因表达载体的构建 (1)先用一定的限制酶切割载体，使它出现一个切口。 (2)然后用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段。 (3)再利用DNA连接酶将目的基因片段拼接到载体的切口处，形成重组DNA分子。 三、将目的基因导入受体细胞 1．导入植物细胞 (1)花粉管通道法：有多种操作方式。 ①用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房。 ②将含目的基因的DNA溶液滴在剪去柱头的花柱切面上，借助花粉管通道进入胚囊。 (2)农杆菌转化法： ①原理：农杆菌Ti质粒上的T－DNA可整合到受体细胞的染色体DNA上。 ②适用范围：主要适用于双子叶植物和裸子植物。 2．导入动物细胞 (1)常用方法：显微注射技术。 (2)受体细胞：受精卵。 3．导入微生物细胞 (1)常用生物：原核生物，如大肠杆菌等。 (2)方法：用Ca2＋处理大肠杆菌细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，然后再将重组的基因表达载体导入其中。 四、目的基因的检测与鉴定 1．分子水平的检测 (1)通过PCR等技术检测受体细胞是否含有目的基因。例如，检测棉花的染色体DNA上是否插入了Bt基因。 (2)检测目的基因是否转录出了相应mRNA。例如，棉花体内是否发生Bt基因转录。 (3)进行抗原—抗体杂交，检测目的基因是否翻译产生相应的蛋白质。例如，检测Bt基因是否在棉花体内翻译成Bt抗虫蛋白。 2．个体生物学水平的鉴定。例如，通过饲喂法判断棉花的抗虫特性以及抗性的程度。 [自学效果诊断] 1．判正误 (1)基因工程操作的核心步骤是目的基因的获取。( × ) (2)启动子和终止密码子均在胰岛素基因的转录中起作用。( × ) (3)转基因抗虫棉植株抗虫效果的鉴定必须通过分子检测才能达到目的。( × ) (4)将重组表达载体导入动物受精卵常用显微注射法。( √ ) (5)农杆菌感染植物的机理：Ti质粒上的T－DNA可转移到植物受伤细胞内，并且与其染色体DNA整合在一起。( √ ) (6)从大肠杆菌细胞中获得人胰岛素基因的mRNA，说明目的基因完成了表达。( × ) 2．微思考 (1)PCR过程中需要解旋酶吗？所需要的DNA聚合酶应具有什么特点？ 提示：PCR过程中，DNA双链解开是在高温下完成的，不需要解旋酶；由于PCR过程温度较高，所以需要能耐高温的DNA聚合酶。 (2)基因工程的四个步骤都涉及碱基互补配对，对吗？ 提示：第三步将目的基因导入受体细胞没有涉及碱基互补配对。 新知探究一　利用PCR获取和扩增目的基因 　聚合酶链式反应是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，下图为PCR扩增中第一轮的变化，结合所学回答下列问题： (1)PCR的原理是什么？ 提示：DNA半保留复制原理。 (2)利用PCR扩增目的基因时，为什么要用2种不同的引物？ 提示：DNA是两条反向平行的双链结构，而复制时只能从固定的方向(模板链的3′端)开始，所以引物的碱基序列是不同的。 (3)PCR过程中若模板DNA分子中G、C碱基对含量较多，则变性时间会怎样？ 提示：若模板DNA分子中G、C碱基对含量较多，则DNA分子中的氢键增多，破裂氢键需要能量增多，变性时间会延长。 (4)引物是单链还是双链？其基本单位是什么？ 提示：单链。基本单位是脱氧核苷酸或核糖核苷酸。 (5)一轮PCR有哪三个步骤？ 提示：变性，复性，延伸三个步骤。 [核心归纳] 　PCR技术与生物体内DNA复制的比较 比较项目 PCR技术 DNA复制 区别 解旋方式 DNA在高温作用下变性解旋 解旋酶催化 场所 细胞外(在PCR扩增仪内) 细胞内(主要在细胞核内) 酶 耐高温的DNA聚合酶 DNA解旋酶、普通的DNA聚合酶等 温度条件 需控制温度，在较高温度下进行 细胞内温和条件 合成的对象 DNA片段或基因 DNA分子 联系 ①模板：均需要脱氧核苷酸链作为模板进行物质合成 ②原料：均为四种脱氧核苷酸 ③酶：均需要DNA聚合酶进行催化 ④引物：均需要引物，使DNA聚合酶从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸 [典题应用] 1．下图表示PCR技术的操作过程，有关说法中不正确的是(　　) A．PCR是一项在生物体外复制特定的DNA片段的核酸合成技术 B．PCR技术的原理是DNA双链复制 C．利用PCR技术获取目的基因的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列 D．PCR扩增中必须有解旋酶才能解开双链DNA 解析 ：选D　PCR是在生物体外复制特定的DNA片段的核酸合成技术，A正确；PCR技术的原理是DNA双链复制，B正确；要有一段已知目的基因的核苷酸序列作为模板进行DNA复制，C正确；PCR扩增中，目的基因受热变性后解旋为单链，不需要解旋酶，D错误。 2．新型冠状病毒的检测可以采用实时荧光RT－PCR(逆转录聚合酶链式反应)的方法，RT－PCR的具体过程如图。下列有关叙述错误的是(　　) A．过程①以mRNA为模板合成单链DNA B．过程②③拟对单链cDNA进行n次循环的扩增，理论上需要n个引物B C．该技术用于对某些微量RNA病毒的检测，可提高检测的灵敏度 D．游离的脱氧核苷酸只能从引物的3′端开始连接 解析：选B　过程①是由mRNA形成单链DNA的过程，表示逆转录，A正确；决定实时荧光RT－PCR扩增片段的是引物；过程②、③拟对单链cDNA进行n次循环的扩增，根据DNA分子半保留复制特点可知，该过程理论上至少需要2n＋1个引物B，B错误；利用实时荧光RT－PCR技术对某些微量RNA病毒进行检测时可提高检测的灵敏度，是因为增加了待测RNA逆转录产生的DNA的数量(或浓度)，便于检测，C正确；游离的脱氧核苷酸只能从引物的3′端开始连接，D正确。 新知探究二　基因表达载体的构建 　分析基因表达载体模式图，回答下面问题。 (1)为什么切割含有目的基因的DNA片段和载体要选用同一种限制酶？是否只能用同一种限制酶？ 提示：选用同一种限制酶切割会产生相同的黏性末端，可以在DNA连接酶的作用下将切割的目的基因和载体连接起来。也可以使用能产生相同末端的限制酶切割。 (2)构建基因表达载体的目的是什么？ 提示：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。 (3)基因表达载体的组成有哪几部分？ 提示：目的基因、启动子、终止子、标记基因等。 (4)标记基因的作用是什么？常用什么基因来作标记基因？ 提示：标记基因的作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。常见的标记基因为抗生素抗性基因，如氨苄青霉素抗性基因，四环素抗性基因。 (5)构建基因表达载体时，目的基因应在哪个位置？为什么？ 提示：由图知，目的基因要插入启动子和终止子之间，这是因为启动子使转录开始，是RNA聚合酶识别和结合的部位；终止子位于基因的尾端，使转录终止；只有顺序正确目的基因才能正常转录。 (6)为什么不能将目的基因插入载体的标记基因中？ 提示：标记基因用于鉴定受体细胞是否成功导入目的基因，以便将含目的基因的细胞筛选出来，若有目的基因插入，则标记基因被破坏，无法进一步筛选。 [核心归纳] 1．基因表达载体的构建过程 将切下的目的基因片段插入质粒的切口处，再加入适量DNA连接酶，形成一个重组DNA分子(重组质粒)。构建过程如下图所示： 2．载体上标记基因的作用 载体上的标记基因一般是一些抗生素的抗性基因。目的基因要转入的受体细胞没有抵抗相关抗生素的能力。当含有抗生素抗性基因的载体进入受体细胞后，抗性基因在受体细胞内表达，使受体细胞能够抵抗相应抗生素，所以在受体细胞的培养体系中加入该种抗生素就可以只保留转入载体的受体细胞，原理如图所示： [典题应用] 3．下图为基因表达载体的模式图，下列有关基因工程中载体的说法错误的是(　　) A．基因表达载体的构建是在生物体外完成的 B．任何基因表达载体的构建都是一样的，没有差别 C．图中启动子位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位 D．抗生素抗性基因的作用是作为标记基因，用于鉴别受体细胞中是否导入了目的基因 解析：选B　由于受体细胞有植物、动物和微生物之分，以及目的基因导入受体细胞的方式不同，所以基因表达载体的构建也会有所差别，不可能千篇一律。 4．图1为某种质粒简图，图2表示某外源DNA上的目的基因，小箭头所指分别为限制性内切核酸酶EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ、Hind Ⅲ的酶切位点。下列有关叙述错误的是(　　 ) A．在基因工程中若只用一种限制酶完成对质粒和外源DNA的切割，则可选EcoR Ⅰ B．如果将一个外源DNA分子和一个质粒分别用EcoR Ⅰ酶切后，再用DNA连接酶连接，形成一个含有目的基因的重组DNA，此重组DNA中EcoR Ⅰ酶切点有1个 C．为了防止质粒和含目的基因的外源DNA片段自身环化，酶切时可使用BamH Ⅰ和Hind Ⅲ两种限制酶同时处理 D．一个图1所示的质粒分子经EcoR Ⅰ切割后，含有2个游离的磷酸基团 解析：选B　目的基因两侧都有，且质粒也有的限制酶是EcoR Ⅰ，所以在基因工程中若只用一种限制酶完成对质粒和外源DNA的切割，可选EcoR Ⅰ，A正确；如果将一个外源DNA分子和一个质粒分别用EcoR Ⅰ酶切后，再用DNA连接酶连接，形成一个含有目的基因的重组DNA，此重组DNA中EcoR Ⅰ酶切点有2个，B错误；为了防止质粒和含目的基因的外源DNA片段自身环化，酶切时可使用BamH Ⅰ和Hind Ⅲ两种限制酶同时处理，C正确；一个图1所示的质粒分子经EcoR Ⅰ切割后，产生两个黏性末端，含有2个游离的磷酸基团，D正确。 [方法技巧]　限制酶的选择技巧 (1)根据目的基因两端的限制酶切割位点确定限制酶的种类。 ①应选择切割位点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择PstⅠ。 ②不能选择切割位点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择SmaⅠ。 ③为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切割位点，如图乙)。 (2)根据质粒的特点确定限制酶的种类。 ①所选限制酶要与切割目的基因的限制酶一致，以确保产生相同的黏性末端。 ②质粒作为载体必须具备标记基因等，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中限制酶SmaⅠ会破坏标记基因；如果所选酶的切割位点不是一个，则切割重组后可能丢失某些片段，若丢失的片段含复制原点区，则切割重组后的片段进入受体细胞后不能进行自主复制。 新知探究三　将目的基因导入受体细胞 　转化是指目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。将目的基因导入受体细胞是实现转化的必要环节。请回答下列问题： (1)将目的基因导入植物细胞的方法主要有哪两种？其中最常用的是哪种？我国科学家独创的方法是哪种？ 提示：农杆菌转化法、花粉管通道法。农杆菌转化法最常见。我国科学家独创的方法是花粉管通道法。 (2)农杆菌Ti质粒有何特点？ 提示：农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T－DNA(可转移的DNA)转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。 (3)基因工程常用原核生物作为受体细胞的原因是什么？其中以哪种生物最为广泛？ 提示：原核生物的特点：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少等。大肠杆菌应用最为广泛。 [核心归纳] 　将目的基因导入受体细胞的方法比较 生物 类型 植物 动物 微生物 受体 细胞 体细胞 受精卵 原核细胞 常用 方法 花粉管通道法、农杆菌转化法 显微注射技术 感受态细胞法 转化 过程 以农杆菌转化法为例： 将目的基因插入Ti 质粒的T－DNA上 ↓ 转入农杆菌 ↓ 导入植物细胞 ↓ 整合到受体细胞的DNA上 提取含目的基因的表达载体 ↓ 显微注射 ↓ 受精卵发育 ↓ 具有新性 状的个体 Ca2＋处理细胞 ↓ 感受态细胞 ↓ 基因表达载体与感受态细胞混合 ↓ 感受态细胞吸收DNA分子 [典题应用] 5．下列关于目的基因导入受体细胞的描述，不正确的是(　　) A．基因枪法导入植物体细胞的方法比较经济有效 B．显微注射技术是转基因动物中采用最多的方法 C．大肠杆菌最常用的转化方法是使细胞的生理状态发生改变 D．农杆菌转化法是将目的基因导入植物细胞最常用的方法 解析：选A　本题综合考查了将目的基因导入细胞的方法。不同生物目的基因导入的方法不同，每种方法都有利有弊。目的基因导入植物细胞常用的方法是农杆菌转化法，该方法比较经济有效，还有基因枪法和花粉管通道法；目的基因导入动物细胞常用的方法是显微注射法；大肠杆菌细胞最常用的转化方法就是用钙离子处理细胞，使细胞的生理状态发生改变，完成转化过程。 6．基因工程中因受体细胞不同，目的基因导入的方法也不同，下列叙述不正确的是(　　) A．将目的基因导入棉花细胞内常用花粉管通道法 B．将目的基因导入老鼠细胞内常用显微注射法 C．将目的基因导入大肠杆菌内常用感受态细胞转化法 D．将目的基因导入小麦细胞内常用农杆菌转化法 解析：选D　小麦是单子叶植物，其受伤后不能分泌酚类物质，农杆菌对它没有感染能力。 [核心语句必背] 1．基因工程的基本操作程序有：(1)目的基因的筛选与获取；(2)基因表达载体的构建；(3)将目的基因导入受体细胞；(4)目的基因的检测与鉴定。 2．基因表达载体由目的基因、启动子、复制原点终止子和标记基因等组成。 3．将目的基因导入植物细胞的方法有：(1)农杆菌转化法；(2)花粉管通道法。将目的基因导入动物细胞常用的方法是显微注射法。 4．目的基因的检测方法有分子水平的检测和个体生物学水平的鉴定。 1．基因工程主要操作步骤的顺序是(　　) ①基因表达载体的构建 ②将目的基因导入受体细胞 ③目的基因的检测与鉴定 ④目的基因的获取 A．③②④①　　　　　 B．②④①③ C．④①②③ D．③④①② 解析：选C　基因工程的主要操作步骤顺序是：目的基因的获取→基因表达载体的构建→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测和鉴定。 2．基因工程的核心是(　　) A．目的基因的获取 B．基因表达载体的构建 C．将目的基因导入受体细胞 D．目的基因的检测与鉴定 解析：选B　基因表达载体的构建是基因工程的核心步骤。 3．下列哪项不是基因表达载体的组成部分(　　) A．启动子 B．终止密码子 C．标记基因 D．目的基因 解析：选B　基因表达载体的组成为：目的基因＋启动子＋终止子＋标记基因。终止子位于基因的尾端，是一段有特殊结构的DNA片段，可使转录在所需要的地方停止下来；终止密码子是mRNA上3个相邻的碱基，使翻译过程在相应的地方停止。 4．目前将目的基因导入动物细胞最常用、最有效的方法是(　　) A．显微注射法 B．农杆菌转化法 C．基因枪法 D．花粉管通道法 解析：选A　显微注射法是迄今为止转基因动物中采用最多、最有效的一种将目的基因导入动物细胞的方法。 5．农杆菌是一种在土壤中生活的微生物，能在自然条件下感染植物，因而在植物基因工程中得到了广泛的应用。下图为农杆菌转化法的示意图，试回答下列问题： (1)一般情况下农杆菌不能感染的植物是____________，利用农杆菌能在自然条件下感染植物的特点，能实现__________________________。具体原理是在农杆菌的Ti质粒上存在T－DNA片段，它具有可转移到受体细胞并整合到受体细胞的________上的特点，因此只要将携带外源基因的DNA片段插入____________(部位)即可。 (2)根据T－DNA这一转移特点，猜测该DNA片段上可能含有控制____________________(酶)合成的基因。 (3)图中c过程中，能促进农杆菌移向植物细胞的物质是________类化合物。 (4)植物基因工程中将目的基因导入受体细胞的方法除了农杆菌转化法之外，还可采取______________。 解析：(1)一般农杆菌不能感染的植物是单子叶植物，可感染双子叶植物和裸子植物。利用其感染性，可实现将目的基因导入植物细胞。真正可转移至受体细胞并整合到受体细胞染色体的DNA上的是农杆菌T－DNA片段，因此目的基因必须插入该部位才能成功。(2)根据T－DNA这一转移特点，可以推测该DNA片段能控制合成DNA连接酶、限制酶以实现与双子叶植物细胞染色体DNA的整合。(3)植物细胞受伤后可产生酚类物质，促进农杆菌向植物细胞转移。(4)植物基因工程中除了农杆菌转化法之外，还有花粉管通道法。 答案：(1)单子叶植物　将目的基因导入植物细胞　染色体的DNA　T－DNA片段(内部)　(2)DNA连接酶、限制酶　(3)酚 (4)花粉管通道法 学科网（北京）股份有限公司 $