第1章 第2节 第2课时 微生物的选择培养和计数（教用Word）-【金榜题名】2025-2026学年高二生物选择性必修3 生物技术与工程同步学案（人教版）

本讲义聚焦微生物的选择培养和计数核心知识点，系统梳理选择培养基原理（如以尿素为唯一氮源筛选分解尿素细菌）、分离纯化方法（稀释涂布平板法、平板划线法）及数量测定技术（稀释涂布平板法、显微镜直接计数法），构建从原理到操作再到实验应用的完整学习支架。 该资料以“土壤中分解尿素的细菌分离与计数”实验为主线，通过系列稀释、涂布平板等探究实践培养科学思维，结合自学诊断、典题应用强化生命观念。课中辅助教师开展实验教学，课后助力学生通过核心归纳与方法技巧查漏补缺，提升科学探究与数据分析能力。

第2课时　微生物的选择培养和计数 学习目标 素养要求 1.举例说明通过调整培养基的配方可有目的地培养某种微生物。 2．概述平板划线法和稀释涂布平板法是实验室中进行微生物分离和纯化的常用方法。 3．概述稀释涂布平板法和显微镜计数法是测定微生物数量的常用方法。 1.理解微生物的选择培养和计数的原理。(生命观念) 2．开展稀释涂布平板法的操作和土壤中分解尿素的细菌的分离与计数实验。(科学探究) 一、选择培养基 1．自然界中目的菌株的筛选 (1)依据：根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。 (2)实例：PCR技术过程中用到的耐高温的Taq_DNA聚合酶，就是从热泉中筛选出来的Taq细菌中提取出来的。 2．实验室中目的菌株的筛选 (1)原理：人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物的生长。 (2)方法：利用选择培养基分离。 ①选择培养基：允许特定种类的微生物生长，同时阻止或抑制其他种类微生物生长的培养基。 ②实例：选择分解尿素的细菌的培养基，以尿素作为唯一氮源，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。 二、微生物的选择培养 1．铲取土样，将样品装入纸袋中。 2．将10 g土样加入盛有90 mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀。取1 mL上清液加入盛有9 mL无菌水的试管中，依次等比稀释。 3．稀释涂布平板法 (1)操作步骤 ①系列稀释操作 a．将分别盛有9 mL水的6支试管灭菌，并按101～106的顺序编号。 b．用移液管吸取 1 mL培养的菌液，注入101倍稀释的试管中。用手指轻压移液管上的橡皮头，吹吸3次，使菌液与水充分混匀。 c．从101倍稀释的试管中吸取 1 mL稀释液，注入102倍稀释的试管中，重复b步的混匀操作。依次类推，直到完成最后一支试管的稀释。 ②涂布平板操作 待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，放入30～37 ℃的恒温培养箱中培养1～2 d。在涂布有合适浓度菌液的平板上就可以观察到分离的单菌落。 三、微生物的数量测定 1．方法一：稀释涂布平板法 (1)原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个单菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。 (2)计数原则：一般选择菌落数为30～300的平板进行计数。样品的稀释度将直接影响平板上的菌落数目。在同一稀释度下，应至少对 3个平板进行重复计数，然后求出平均值。 (3)注意事项：统计的菌落数往往比活菌的实际数目少，这是因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。 2．方法二：直接计数法 利用显微镜进行直接计数，也是一种常用的、快速直观的测定微生物数量的方法。该方法利用特定的细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下观察、计数，然后再计算一定体积的样品中微生物的数量，统计的结果一般是活菌数和死菌数的总和。 四、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 1．土壤取样 从富含有机质、酸碱度接近中性且潮湿的土壤取样。先铲去表层土，在距地表约 3～8 cm的土壤层取样。 2．样品的稀释 (1)稀释原因：样品的稀释度直接影响平板上生长的菌落数目。 (2)稀释标准：选用一定稀释范围的样品液进行培养，保证获得菌落数在 30～300之间，便于计数。 (3)第一次做实验时，可以将稀释度的范围放宽一点。 3．微生物的培养与观察 (1)培养：不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。 (2)观察：每隔 24_h统计一次菌落数目，最后选取菌落数目稳定时的记录作为结果。 4．操作提示 (1)无菌操作 ①取土样的用具在使用前都需要灭菌。 ②应在火焰旁称取土壤，并在火焰附近将称好的土样倒入锥形瓶中，塞好棉塞。 ③在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁操作。 (2)做好标记：本实验使用的平板和试管比较多。为避免混淆，最好使用前就做好标记。 (3)制定计划：对于耗时较长的生物实验，要事先制定计划，以便提高工作效率。 [自学效果诊断] 1．判正误 (1)因为土壤中各类微生物的数量不同，所以，为获得不同类型的微生物要按不同的稀释倍数进行分离。( √ ) (2)转换划线角度后需要灼烧接种环再进行划线。( √ ) (3)筛选分解尿素的细菌所用的培养基为液体培养基。( × ) (4)用平板划线法培养计数，应选择有10～100菌落数的平板。( × ) (5)统计菌落数目时，统计的菌落数就是活菌的实际数目。( × ) (6)只要培养基中有尿素即可筛选出分解尿素的细菌。( × ) (7)分解尿素的细菌在分解尿素时，可以将尿素转化为氨，使得培养基的pH降低。( × ) 2．微思考 (1)在纯化大肠杆菌操作中，如何验证培养基灭菌是否彻底？ 提示：将接种后的培养基和一个未接种的培养基，都放在37 ℃恒温箱中培养，观察并记录结果。 (2)如果你在培养基上观察到了不同形态的菌落，你认为是由什么原因造成的？ 提示：培养基灭菌不彻底或接种过程中感染了杂菌。 新知探究一　选择培养基及微生物的选择培养 1．要想将土壤稀释液中能分解尿素的细菌分离出来，培养基的配方该如何设计？ 提示：尿素作为培养基的唯一氮源。 2．涂布平板的所有操作为什么都应在火焰附近进行？ 提示：在酒精灯火焰旁操作可以保证无菌，防止杂菌污染。 3．利用稀释涂布平板法纯化分解尿素的细菌时，经培养后发现培养基上出现多种菌落，可能的原因有哪些？ 提示：出现杂菌污染的可能原因有：培养基制备过程中被杂菌污染；接种过程中，无菌操作不符合要求；系列稀释时，无菌操作不符合要求等。 [核心归纳] 1．两种纯化微生物的方法的比较 项目 平板划线法 稀释涂布平板法 纯化 原理 通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面 将菌液进行一系列的梯度稀释，稀释度足够高时，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞 续表 项目 平板划线法 稀释涂布平板法 主要步骤 平板划线操作 系列稀释操作和涂布平板操作 接种 工具 接种环 涂布器 平板示意图 单细胞菌落的获得 从后划线的区域挑取 只有合适的稀释度才能得到单细胞菌落 应用 分离纯化微生物 分离纯化微生物，并计数 2.稀释涂布平板法注意事项 (1)每支试管及其中的9 mL水、移液管等均需灭菌；操作时，试管口和移液管应在离酒精灯火焰1～2 cm处。 (2)涂布器用体积分数为70%酒精消毒，取出时，让多余酒精在烧杯中滴尽，然后将沾有少量酒精的涂布器在酒精灯火焰上引燃。 (3)不要将过热的涂布器放在盛放酒精的烧杯中，以免引燃其中的酒精。 (4)酒精灯与培养皿距离要合适，移液管管头不要接触任何物品。 [典题应用] 1．关于平板划线法、稀释涂布平板法叙述错误的是(　　) A．均将微生物接种在固体培养基的表面 B．获得的每个菌落均是由一个细胞繁殖而来的子细胞群 C．都应在酒精灯火焰附近进行操作，以防止杂菌污染 D．稀释分散菌种的原理不同，均能达到分离纯化微生物的目的 解析：选B　将微生物接种到固体培养基中的方法通常为平板划线法和稀释涂布平板法，A正确；用稀释涂布平板法时，如果稀释得当，在平板表面或琼脂培养基中就可出现分散的单个菌落，这个菌落可能是由一个细菌细胞繁殖形成的，B错误；平板划线法和稀释涂布平板法都应在火焰附近进行操作，以防止杂菌污染，C正确；平板划线法和稀释涂布平板法稀释分散菌种的原理不同，但是能达到分离纯化微生物的目的，D正确。 2．某些土壤细菌可将尿素分解成CO2和NH3，供植物吸收和利用。回答下列问题： (1)有些细菌能分解尿素，有些细菌则不能，原因是前者能产生____________。能分解尿素的细菌不能以尿素的分解产物CO2作为碳源，原因是________________。但可用葡萄糖作为碳源，进入细菌体内的葡萄糖的主要作用是__________________________(答出两点即可)。 (2)为了筛选可分解尿素的细菌，在配制培养基时，应选择________(填“尿素”“NH4NO3”或“尿素＋NH4NO3”)作为氮源，不选择其他两组的原因是_____________________________________________。 (3)用来筛选分解尿素细菌的培养基含有KH2PO4和Na2HPO4，其作用有________________________________________(答出两点即可)。 解析：(1)能分解尿素的细菌体内应含有脲酶；能分解尿素的细菌是异养型生物，不能利用CO2来合成有机物，可用葡萄糖等有机物作为碳源。进入细菌体内的葡萄糖既能为细胞的生命活动提供能量，又可为其他有机物的合成提供原料。(2)筛选可分解尿素的细菌，应选择以尿素为唯一氮源的培养基，而能分解尿素的细菌和不能分解尿素的细菌都能利用NH4NO3，其他两组不能起到筛选作用。(3)用来筛选分解尿素的细菌的培养基含有KH2PO4和Na2HPO4，这两种物质既可为细菌生长提供无机营养，又可作为缓冲剂保持细菌生长过程中pH的相对稳定。 答案：(1)脲酶　分解尿素的细菌是异养生物，不能利用CO2来合成有机物　为细胞的生命活动提供能量；为其他有机物的合成提供原料　(2)尿素　其他两组都含有NH4NO3，能分解尿素的细菌和不能分解尿素的细菌都能利用NH4NO3，不能起到筛选作用　(3)为细菌生长提供无机营养；作为缓冲剂保持细菌生长过程中pH稳定 [方法技巧]　选择培养基四种常见制备方法或实例 新知探究二　微生物的数量测定 　甲、乙两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。在对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下两种统计结果。 (1)甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230，该同学的统计结果是否真实可靠？为什么？ 提示：不真实。为增加实验的说服力与准确性，应设置重复实验，在同一稀释度下涂布3个平板，统计结果后计算平均值。 (2)乙同学在该浓度下涂布了3个平板，统计的菌落数分别为21、212、256，该同学将21舍去，然后取平均值。该同学对实验结果的处理是否合理？为什么？ 提示：不合理。微生物计数时，如果实验中出现重复实验的结果不一致的情况，应分析实验过程中可能的影响因素，找出差异的原因，需重新实验，而不能简单地舍弃后进行计数。 (3)某同学在三种稀释度下吸取0.1 mL的菌液涂布平板，统计菌落数，得到了以下的数据，试计算1 g样品的活菌数。 平板 稀释度 平板1 平板2 平板3 104 320 360 356 105 212 234 287 106 21 23 18 提示：105的稀释度下取0.1 mL涂布的三个平板上的菌落数在30～300，计算其平均值为(212＋234＋287)/3≈244。进一步可以换算出1 g样品中活菌数为(244÷0.1)×105＝2.44×108。 [核心归纳] 1．统计菌落数目的方法 微生物数目的测定有计数法、重量法、生理指标法等方法，但是一般使用计数法，计数法可分为直接计数法和间接计数法。二者的比较如下表所示： 项目 直接计数法 间接计数法 原理 利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量 当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌 主要 用具 显微镜、细菌计数板 培养基 计数 数据 菌体本身 培养基上菌落数 优点 计数方便、操作简单 计数的是活菌 缺点 死菌、活菌都计算在内 操作较复杂，有一定误差 2.稀释涂布平板法的注意事项 (1)稀释涂布平板法所选择倒平板的稀释度很重要，一般以3个稀释度中的第二个稀释度倒平板，所出现的平均菌落数在50个左右的为最好。 (2)在设计实验时，一定要涂布至少3个平板作为重复组。 (3)在分析结果时，一定要考虑所设置的重复组的结果是否一致，如果差别过大，则意味着操作有误，需要重新实验。 [典题应用] 3．下列有关稀释涂布平板法的叙述，错误的是(　　) A．首先将菌悬液进行一系列的梯度稀释 B．然后将不同稀释度的菌悬液分别涂布到琼脂固体培养基的表面 C．在适宜条件下培养 D．结果都可在培养基表面形成单个的菌落 解析：选D　稀释涂布平板法是将菌悬液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌悬液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，在适宜条件下培养。只有在稀释度足够高的菌悬液里，聚集在一起的微生物才能被分散成单个细胞，从而在培养基表面形成单个的菌落。 4．下列有关“土壤中分解尿素的细菌的分离与计数实验”的叙述，正确的是(　　) A．只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素 B．筛选分解尿素的细菌时，应以尿素作为培养基中唯一的营养物质 C．统计菌落数应注意选择菌落数在30～100的平板进行计数 D．以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，若指示剂变蓝，则表明筛选到了分解尿素的细菌 解析：选A　只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，A正确；筛选分解尿素的细菌时，应使用以尿素为唯一氮源的选择培养基培养，培养基的成分除了氮源，还有碳源、水、无机盐等，B错误；统计菌落数应注意选择菌落数在30～300的平板进行计数，C错误；以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，若指示剂变红，则表明筛选到了分解尿素的细菌，D错误。 5．果醋发酵菌种为醋酸菌，测定发酵液中醋酸菌的数目有利于控制发酵进程。下表是四个生物兴趣小组测定醋酸菌数目的统计结果，分析回答下列问题： 组别 平板个数 菌落数 一 1 240 二 3 230、250、240 三 3 210、520、250 四 4 280、31、270、290 (1)四个小组中，最合理的是第________组，理由是____________________。 (2)分析第三组统计的结果，可能出现的原因有________________________(答出两条即可)。若进一步分析原因，可以通过观察________________作出判断。 (3)分析第四组统计的结果，出现这种结果可能的原因有_____________________________________________。 解析：(1)微生物计数时，一定要涂布至少三个平板作为重复组，且每个平板上的菌落数应为30～300个。(2)第三组统计的结果中，有一个平板上的菌落数过多，可能的原因：培养基被杂菌污染、涂布用的菌液稀释倍数错误、接种过程被杂菌污染。若要进一步分析原因，可通过观察菌落的特征作出判断，若菌落一致，则可能是菌液稀释倍数错误，若出现多种菌落，则可能被杂菌污染。(3)第四组统计的结果中，有一个平板上的菌落数过少，可能的原因：涂布用的菌液稀释倍数错误、涂布平板时涂布器温度过高，杀死菌种。 答案：(1)二　在微生物计数时，一定要涂布至少三个平板作为重复组，且每个平板上的菌落数应为30～300个　(2)培养基被杂菌污染、涂布用的菌液稀释倍数错误、接种过程被杂菌污染　菌落特征 (3)涂布用的菌液稀释倍数错误；涂布平板时涂布器温度过高，杀死菌种 [核心语句必背] 1．实验室中微生物筛选的原理：人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)同时抑制或阻止其他微生物的生长。 2．在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称做选择培养基。 3．测定微生物数量的常用方法有活菌计数法和显微镜直接计数法。稀释涂布平板法常用来统计活菌的数目，但统计结果往往比活菌的实际数目低。 4．只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，因此可用尿素作为唯一氮源的选择培养基分离能分解尿素的细菌。 1．用稀释涂布平板法来统计样品中尿素分解菌的数目，为了提高实验结果的可信度，往往要设置对照实验，对于对照组的要求不包括以下哪项(　　) A．对照组培养基也要严格灭菌，且不接种任何微生物 B．对照组和实验组培养基放在相同条件下培养 C．所用培养基成分及pH大小完全与实验组一致 D．在对微生物进行培养前，需要对菌液和培养基进行灭菌 解析：选D　对照组培养基也要严格灭菌，且不接种任何微生物，为空白对照，A正确；对照组和实验组的培养基都要置于相同条件下培养，以保证单一变量，B正确；对照组所用培养基的成分及pH应与实验组完全一致，C正确；在对微生物进行培养前，需要对培养基进行灭菌，不能对含目的菌的菌液进行灭菌，D错误。 2．下图为“土壤中分解尿素的细菌的分离和计数”实验中样品稀释示意图。据图分析正确的是(　　) A．3号试管的稀释倍数为103倍 B．4号试管中稀释液进行平板培养得到的菌落平均数恰为5号试管的10倍 C．5号试管的结果表明每克土壤中的菌株数为1.7×109个 D．该实验方法统计得到的结果往往会比实际活菌数目要高 解析：选C　2号试管中样品液的稀释倍数为103倍，A错误；4号中稀释液进行平板培养，稀释倍数比5号的低10倍，如果稀释倍数适当，得到的菌落平均数可能是5号的10倍，B错误；5号试管进行稀释涂布平板法计数的结果表明每克土壤中的菌株数为(168＋175＋167)÷3÷0.1×106＝1.7×109(个)，C正确；稀释涂布平板得到的菌落可能存在两个或多个细菌细胞长成一个菌落，使该实验方法统计得到的结果往往会比实际活菌数目要低，D错误。 3．用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数，在对应稀释倍数为106培养基中得到以下几种统计结果，正确的是(　　) A．涂布1个平板，统计菌落数是230 B．涂布2个平板，统计的菌落数是303和287，取平均值295 C．涂布3个平板，统计的菌落数分别是21、212、256，取平均值163 D．涂布3个平板，统计的菌落数分别为210、240、250，取平均值233 解析：选D　用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数时，在每一个梯度浓度内，至少要涂布3个平板，确定对照组无菌后，选择菌落数在30～300的进行记数，求其平均值，再通过计算得出土壤中细菌总数。 4．取9个洁净培养皿，均分为三组(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)，各组分别加入等量的不同培养基，每个平板均接种0.1mL大肠杆菌菌液，37℃培养36小时后，统计菌落数(见表)，以下相关叙述错误的是(　　) 组别 培养基 各平板的菌落数 1 2 3 Ⅰ 琼脂、C6H12O6、NH4NO3 30 31 27 Ⅱ 琼脂、C6H12O6、NH4NO3、维生素 169 178 193 Ⅲ 琼脂、NH4NO3、维生素 0 0 1 A.Ⅰ组和Ⅱ组说明维生素可以促进大肠杆菌生长繁殖 B．Ⅱ组和Ⅲ组说明大肠杆菌正常生长需要葡萄糖 C．三组实验均采用了平板划线法，以便菌落计数 D．三组实验所使用的培养基均需121 ℃、30 min灭菌 解析：选C　由分析可知：Ⅰ组和Ⅱ组对照，变量是维生素，说明维生素可以促进大肠杆菌生长，A正确；Ⅱ组和Ⅲ组对照，自变量是葡萄糖的有无，说明大肠杆菌正常生长需要葡萄糖，B正确；该实验的因变量是菌落的数目，接种都采用了稀释涂布平板法，平板划线法不能用来计数，C错误；三组实验所使用的培养基均需高压蒸汽灭菌，D正确。 5．水污染是全球性的环境问题，微生物降解是水污染治理的有效手段之一。聚乙烯醇(PVA)是存在于化工污水中的一种难以降解的大分子有机物，PVA 分解菌能产生 PVA酶分解 PVA，PVA 与碘作用时能产生蓝绿色复合物，当 PVA 被分解时蓝绿色复合物消失，形成白色透明斑，请回答下列问题： (1)要从土壤中筛选出能高效分解 PVA 的细菌，应采用以________作为唯一碳源的选择培养基，实验中还应设置对照组。将菌液稀释相同的倍数，对照组培养基上生长的菌落数目应明显________(填“多于”或“少于”)选择培养基上的数目，从而说明选择培养基具有筛选作用。 (2)要测定土壤稀释液中微生物的数目，可在显微镜下用________计数板直接计数。若将 100 mL含有 PVA 分解菌的土壤样品溶液稀释104倍后，取 0.1 mL稀释液均匀涂布在选择培养基表面，测得菌落数的平均值为160 个，空白对照组平板上未出现菌落，则 100 mL原菌液中有PVA分解菌________个，该方法的测量值与实际值相比一般会________(填“偏大”“偏小”或“相等”)。 (3)要鉴定分离出的细菌是否为PVA分解菌，培养 PVA 分解菌的培养基中除了加入必需的营养物质外还需要加入________用于鉴别 PVA 分解菌。要比较不同菌株降解PVA 能力的大小，用含相同 PVA 浓度的上述培养基来培养不同菌株，一定时间后，通过测定______________来确定不同菌株降解 PVA 能力的大小。 解析：(1)要从土壤中筛选出能高效分解PVA的细菌，应采用以聚乙烯醇(PVA)作为唯一碳源的选择培养基，目的是淘汰不能分解聚乙烯醇(PVA)的细菌。实验中设置的对照组培养基上生长的菌落数目应明显多于选择培养基上的数目，因为对照组没有淘汰不能分解聚乙烯醇(PVA)的细菌。(2)在显微镜下计数微生物细胞的数量可直接用血细胞计数板计数。根据题意，100 mL原菌液中有PVA分解菌的数目为160÷0.1×104×100＝1.6×109。由于该方法得到的菌落可能是两个或多个细菌共同产生的一个菌落，导致统计的菌落数较实际菌落数偏少，所以该方法的测量值与实际值相比一般会偏小。(3)根据题干中鉴定PVA分解菌的原理“PVA与碘作用时能产生蓝绿色复合物，当PVA被分解时蓝绿色复合物消失，形成白色透明斑”可知，要鉴定分离出的细菌是否为PVA分解菌，培养PVA分解菌的培养基中除了加入必需的营养物质外还需要加入碘液用于鉴别PVA分解菌。要比较不同菌株降解PVA能力的大小，用含相同PVA浓度的上述培养基来培养不同菌株，一定时间后，通过测定白色透明斑的大小(或直径)来确定不同菌株降解PVA能力的大小。 答案：(1)聚乙烯醇(或PVA)　多于　(2)血细胞　1.6×109　偏小　(3)碘液　白色透明斑的大小(或直径) 学科网（北京）股份有限公司 $