2026届高三生物一轮复习课件第54讲　基因工程的基本工具和基本操作程序

该高中生物学高考复习课件聚焦基因工程核心考点，依据高考评价体系梳理重组DNA技术工具（限制酶、DNA连接酶、载体）和基本操作程序（目的基因获取、PCR扩增、表达载体构建等），通过分析近5年真题明确工具作用机制、PCR原理等高频考点权重，归纳限制酶选择、双酶切应用等常考题型，体现备考针对性与实用性。 课件亮点在于“真题解析+技巧突破”，如结合2023新课标卷重组载体构建题，用科学思维对比单酶切自身环化与双酶切定向连接的优劣，通过PCR引物设计案例培养探究实践能力。特设易错点警示（如载体标记基因选择），助力学生掌握答题逻辑，教师可据此高效开展专题复习。

基因工程的基本工具和 基本操作程序 第 54 讲 目录 考点一 重组DNA技术的基本工具 核心要点·再研 典型例题·深研 目录 1.基因工程的概念 转基因 生 物产品 DNA分子 遗传性状 考点一　重组DNA技术的基本工具 核心要点·再研 目录 2.基因工程的工具 (1)限制性内切核酸酶——“分子手术刀” 磷酸二酯键 黏性末端 考点一　重组DNA技术的基本工具 核心要点·再研 目录 ①实例1——EcoRⅠ限制酶切割EcoRⅠ识别序列为GAATTC EcoRⅠ切割部位为GA之间的磷酸二酯键 黏性末端 黏性末端 ②实例2——SmaⅠ限制酶切割SmaⅠ识别序列为CCCGGG SmaⅠ切割部位为CG之间的磷酸二酯键 平末端 DNA两条单链的切口处，伸出几个核苷酸，刚好能互补配对，这样的切口叫黏性末端。 切口处是平整的，这样的切口叫平末端。 考点一　重组DNA技术的基本工具 核心要点·再研 目录 5 ①要想获得目的基因需要限制酶切几个切口？可产生几个黏性末端？ ②(源于选必3 P74“拓展应用”) 限制酶不切割原核生物本身DNA分子的原因： 要切两个切口，产生四个黏性末端 ③(源于选择性必修3 P71“旁栏思考”) 原核生物中存在限制酶的意义： 原核生物DNA分子中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。 当遭受外源DNA(如噬菌体)的入侵时，限制酶可切割外源DNA使之失效，以保证自身安全。 考点一　重组DNA技术的基本工具 核心要点·再研 目录 (2)DNA连接酶——“分子缝合针” 作用： 类型： 将两个DNA片段连接起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。 E.coli DNA连接酶 T4 DNA连接酶 缝合黏性末端和平末端 缝合黏性末端和平末端 来源： 大肠杆菌 作用： 来源： 作用： T4噬菌体 E.coli DNA连接酶连接平末端的DNA片段效率要远远低于T4 DNA连接酶 考点一　重组DNA技术的基本工具 核心要点·再研 目录 DNA连接酶 DNA聚合酶 相同 作用实质 化学本质 不 同 点 模板 作用对象 作用结果 用途 都能催化形成磷酸二酯键 都是蛋白质 不需要 需要DNA的一条链作模板 形成完整的重组DNA分子 形成DNA的一条链 DNA复制、基因工程 DNA复制、基因工程 在两个DNA片段间形成磷酸二酯键 将单个核苷酸连接到已有DNA片段，形成磷酸二酯键 DNA连接酶 vs DNA聚合酶 考点一　重组DNA技术的基本工具 核心要点·再研 目录 题后归纳 与DNA有关的酶的比较 名称 作用部位 作用对象 作用结果 限制酶 DNA连接酶 DNA聚合酶 DNA(水解)酶 解旋酶 RNA聚合酶 将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸 碱基对之 间的氢键 DNA 将双链DNA分子局部解旋为单链，形成两条长链 磷酸二酯键 核糖核苷酸 将单个核糖核苷酸依次连接到RNA单链末端 磷酸二酯键 磷酸二酯键 磷酸二酯键 磷酸二酯键 DNA 脱氧核苷酸 DNA片段 DNA 将DNA切成两个片段 将两个DNA片段连接为一个DNA分子 将单个脱氧核苷酸依次连接到DNA单链末端 考点一　重组DNA技术的基本工具 核心要点·再研 目录 ①DNA连接酶连接的是两个DNA片段，而DNA聚合酶是把单个的脱氧核苷酸连接到已有的DNA片段上。 ②DNA聚合酶起作用时需要以一条DNA链为模板，而DNA连接酶不需要模板。　　　 9 (3)基因进入受体细胞的载体——“分子运输车” 质粒 限制酶切割位点 质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。 最常用的载体——质粒 考点一　重组DNA技术的基本工具 核心要点·再研 目录 1.根据限制酶切割位点的位置确定限制酶的种类 （1）不破坏目的基因原则： 如图甲中可选择PstⅠ，而不选择SamⅠ。 （2）保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则： 所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择SmaⅠ。 （3）确保出现相同黏性末端原则： 通常选择与切割目的基因相同的限制酶切割质粒，如图中PstⅠ； 为避免目的基因和质粒自身环化和随意连接（或为了保证目的基因和质粒发生定向连接），可选用什么限制酶？ 可选择PstⅠ和EcoRⅠ两种不同的限制酶分别切割目的基因和质粒。 典型例题·深研 目录 考点一　重组DNA技术的基本工具 2.根据质粒的特点确定限制酶的种类 典型例题·深研 目录 考点一　重组DNA技术的基本工具 3.根据Ti质粒的T－DNA片段选择限制酶 图中甲、乙、丁Ti质粒均不宜选取，而丙Ti质粒宜选取(切割目的基因的限制酶为XbaⅠ和SacⅠ)，分析如下： 典型例题·深研 目录 考点一　重组DNA技术的基本工具 载体上标记基因的标记原理 载体上的标记基因一般是一些抗生素的抗性基因。目的基因要转入的受体细胞没有抵抗相应抗生素的能力。当含有抗生素抗性基因的载体进入受体细胞后，抗性基因在受体细胞内表达，使受体细胞能够抵抗相应抗生素，所以在受体细胞的培养体系中加入该种抗生素就可以只保留转入载体并已表达的受体细胞，原理如图所示： 典型例题·深研 目录 考点一　重组DNA技术的基本工具 考向1　分析基因工程的三种工具，考查科学思维 1.(2024·江西卷，12)γ－氨基丁酸在医药等领域有重要的应用价值。利用L－谷氨酸脱羧酶(GadB)催化L－谷氨酸脱羧是高效生产γ－氨基丁酸的重要途径之一。研究人员采用如下图方法将酿酒酵母S的L－谷氨酸脱羧酶基因(gadB)导入生产菌株E.coliA，构建了以L－谷氨酸钠为底物高效生产γ－氨基丁酸的菌株E.coliB。下列叙述正确的是(　　) A 典型例题·深研 目录 考点一　重组DNA技术的基本工具 A.图中表明，可以从酿酒酵母S中分离得到目的基因gadB B.E.coliB发酵生产γ－氨基丁酸时，L－谷氨酸钠的作用是供能 C.E.coliA和E.coliB都能高效降解γ－氨基丁酸 D.可以用其他酶替代NcoⅠ和KpnⅠ构建重组质粒 典型例题·深研 目录 考点一　重组DNA技术的基本工具 2.(2023·新课标卷，6)某同学拟用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA连接酶为工具，将目的基因(两端含相应限制酶的识别序列和切割位点)和质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。 典型例题·深研 目录 考点一　重组DNA技术的基本工具 下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是(　　) A.质粒和目的基因都用酶3切割，用E.coli DNA连接酶连接 B.质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4 DNA连接酶连接 C.质粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4 DNA连接酶连接 D.质粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E.coliDNA连接酶连接 C 典型例题·深研 目录 考点一　重组DNA技术的基本工具 考向2　结合载体的作用及特点，考查科学思维 3.(2025·广东广州模拟)下列有关基因工程中载体的说法，正确的是(　　) A.在进行基因工程操作中，被用作载体的质粒都是天然质粒 B.所有的质粒都可以作为基因工程中的载体 C.质粒是一种独立于细菌染色体外的链状DNA分子 D.作为载体的质粒DNA分子上应有对重组DNA进行鉴定和选择的标记基因 D 典型例题·深研 目录 考点一　重组DNA技术的基本工具 4.(不定项)(2024·江苏常州期中)微生物常被用于基因工程中，下列有关叙述错误的是(　　 ) A.从耐热的细菌中可获取PCR所需的DNA聚合酶 B.大肠杆菌、酵母菌等微生物是基因工程常用的载体 C.作为载体的DNA分子需具有合成抗生素的基因 D.可用氯化钠溶液处理大肠杆菌，使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态 BCD 典型例题·深研 目录 考点一　重组DNA技术的基本工具 5.(2025·湖北襄阳四中联考)大肠杆菌pUC118质粒是基因工程中常用的一种载体，具有氨苄青霉素抗性基因，该质粒中某限制酶的唯一切点位于lacZ基因中。在特定的选择培养基中，若lacZ基因没有被破坏，则大肠杆菌菌落呈蓝色；若lacZ基因被破坏，则菌落呈白色。关于图中操作的叙述正确的是(　　) B A.试管1中应加入限制酶和DNA连接酶 B.试管2中将重组质粒导入大肠杆菌，需用Ca2＋处理大肠杆菌 C.能在氨苄青霉素培养基中存在的菌落均呈现白色 D.试管3应选择蓝色菌落内的大肠杆菌进行扩大培养 典型例题·深研 目录 考点一　重组DNA技术的基本工具 考点二　 基因工程的基本操作程序 核心要点·再研 典型例题·深研 目录 1.目的基因的筛选与获取 (1)筛选合适的目的基因 编码蛋白质 结构 功能 考点二　基因工程的基本操作程序 目录 核心要点·再研 （3）利用PCR获取和扩增目的基因 （1）从基因文库中获取 （2）通过DNA合成仪直接合成 基因组文库 cDNA文库 （包含一种生物的所有基因） （包含一种生物的一部分基因） 前提： 基因比较小、核苷酸序列已知 DNA 合成仪 原理：DNA半保留复制，在体外对目的基因的核苷酸序列进行大量复制 (2)获取目的基因的方法 考点二　基因工程的基本操作程序 目录 核心要点·再研 cDNA文库是某生物特定发育时期转录的全部mRNA经反转录生成的互补DNA（cDNA）片段，与载体连接后导入宿主细胞形成的克隆集合。 24 PCR(聚合酶链式反应)是一项根据 的原理，在 提供参与DNA复制 的 与 ，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。 DNA半保留复制 体外 各种组分 反应条件 条件 DNA模板： 引物(2种): 四种脱氧核苷酸： 一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸 (dNTP) 提供DNA复制的模板 合成子链DNA的原料 Taq DNA聚合酶: 缓冲溶液: 一般添加Mg2+,激活真核细胞和细菌的DNA聚合酶 耐高温的DNA聚合酶(催化形成磷酸二酯键) 也能为DNA合成提供能量 在细胞中为一段单链RNA，在PCR中为一段人工合成的单链DNA。 高温： 在体外代替解旋酶打开 双链 (3)利用PCR获取和扩增目的基因 考点二　基因工程的基本操作程序 目录 核心要点·再研 25 两种引物 耐高温的DNA 聚合酶 指数形式 琼脂糖凝胶电泳 考点二　基因工程的基本操作程序 目录 核心要点·再研 5’ 3’ 5’ 5’ 第一次循环 第二次循环 3’ 5’ 第三次循环 3’ 3’ 思考2： PCR技术获取目的基因时至少要经过几次循环才能从DNA分子中分离出目的基因？ 考点二　基因工程的基本操作程序 目录 核心要点·再研 1.体内DNA复制与PCR技术的比较 考点二　基因工程的基本操作程序 目录 典型例题·深研 考点二　基因工程的基本操作程序 目录 典型例题·深研 2.引物设计应注意的问题 (1)设计引物的依据：目的基因两端的核苷酸序列。 (2)引物设计时既要考虑目的基因序列，又要考虑载体序列，原因：为了便于扩增的DNA片段与表达载体连接，需在引物的5′端加上限制酶的酶切位点。 (3)使用的一对引物的序列不相同,因为目的基因两端具有不同的核苷酸序列。 (4)引物设计的要求(或引物失效的原因)：每种引物内部不能发生局部碱基互补配对；两种引物之间不能在局部发生碱基互补配对。 ①每种引物内部不能发生局部碱基互补配对的原因：防止引物自身折叠。 ②两种引物之间不能在局部发生碱基互补配对的原因：防止引物之间配对，导致引物不能同模板链结合。 (5)两种引物都结合在DNA模板链的3′端；脱氧核苷酸连接在引物的3′端进行延伸。 考点二　基因工程的基本操作程序 目录 典型例题·深研 [深度思考] 1.设计引物是PCR技术关键步骤之一。某同学设计的两组引物(只标注了部分碱基序列)都不合理(如图)，请分别说明理由。 ①第1组：___________________________________________________________； ②第2组：___________________________________________________________。 引物Ⅰ和引物Ⅱ局部发生碱基互补配对而失效 引物Ⅰ′自身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效 考点二　基因工程的基本操作程序 目录 核心要点·再研 题型一　PCR技术的相关计算 1.PCR扩增过程中的循环图示与规律 P341 2.若一个DNA分子在PCR中经过n轮循环，理论上需要消耗多少个引物？第n轮循环需要消耗多少个引物数？ 考点二　基因工程的基本操作程序 目录 典型例题·深研 2.PCR中的数量关系 复制次数 1 2 3 n DNA分子数 2 4 8 2n 含其中一种引物的数量 1 3 7 2n－1 同时含两种引物的数量 0 2 6 2n－2 共消耗引物的数量 2 6 14 2n＋1－2 考点二　基因工程的基本操作程序 目录 典型例题·深研 [例1] (2025·湖南岳阳模拟)“X基因”是DNA分子上一个有遗传效应的片段，若要用PCR技术特异性地拷贝“X基因”，需在PCR反应中加入两种引物，两种引物及其与模板链的结合位置如图1所示。下列叙述错误的是(　　) C A.第一轮复制得到2个DNA分子， 即①②各一个 B.第二轮复制得到4个DNA分子， 即①②③④各一个 C.第四轮复制得到16个DNA分子，其中有4个X基因 D.经五轮循环后产物中有五种不同的DNA分子 考点二　基因工程的基本操作程序 目录 典型例题·深研 (1)基因表达载体的组成及作用 质粒 标记基因 复制原点 启动子 终止子 限制酶切位点 位于基因的上游，紧挨转录起始位点，是RNA聚合酶识别和结合的部位，具有驱动基因转录的作用。 位于基因下游，使转录在所需的地方停止下来。 供目的基因插入载体中 便于重组DNA的筛选 载体DNA复制的起始点 2.基因表达载体的构建——核心 考点二　基因工程的基本操作程序 目录 核心要点·再研 载体 （质粒） DNA分子 （含目的基因） 限制酶处理 带有黏性末端或平末端的切口 带有相同黏性末端或平末端的目的基因片段 DNA连接酶 重组DNA分子(重组质粒) 同一种 (2)基因表达载体的构建过程 2.基因表达载体的构建——核心 考点二　基因工程的基本操作程序 目录 核心要点·再研 载体 自身环化 片段间 的连接 目的基因自身环化 质粒自身环化 目的基因与质粒连接 目的基因与目的基因连接 质粒与质粒连接 正向连接 反向连接 目的基因 1 1’ 2 2’ 1 2 2’ 1’ 2 2’ 1’ 1 ①质粒、目的基因自身环化； ②质粒与目的基因随意连接 单酶切法缺点： 考点二　基因工程的基本操作程序 目录 核心要点·再研 总结：如果用同一种限制酶分别切割目的基因和质粒，再用DNA连接酶处理后会出现几种产物？(只考虑两两结合) 37 如何防止目的基因和质粒自身环化以及目的基因反向连接？ a b a b 双酶切的优点: 防止质粒、目的基因自身环化 防止质粒与目的基因随意连接 选择两种不同的限制酶同时对目的基因和质粒切割，使基因两端产生两个不同的粘性末端 方案二：双酶切法 a酶： b酶： 考点二　基因工程的基本操作程序 目录 核心要点·再研 没办法避免目的基因和目的基因的反向连接 38 思考：若目的基因两端无合适的限制酶切割位点怎么办？ 5' 3' 3' 5' 5' 3' 3' 5' 5' 3' 5' 3' 5' 5' 3' 3' 3' 3' 引物1 引物2 引入限制酶识别序列 引入限制酶识别序列 5' 3' 3' 5' 3' 3' 5' 3' 3' 3' 5' 3' 3' 5' 3' 5' 3' 5' 3' 3' 5' 3' 5' 3' 3' 5' 3' 3' 使用引物设计引入酶切位点，通过PCR扩增实现突变。 考点二　基因工程的基本操作程序 目录 核心要点·再研 若从平末端两侧，则需两次，如果目的基因两端还有序列，则需三次 39 3.将目的基因导入受体细胞 细胞种类 植物细胞 动物细胞 微生物细胞 常用方法       受体细胞       转化过程 花粉管通道法 农杆菌转化法 显微注射法 Ca2＋处理法 体细胞或受精卵 受精卵 通常选原核细胞 将目的基因插入Ti质粒的T­DNA上 ↓ 转入农杆菌中 ↓ 导入植物细胞 ↓ 整合到受体细胞DNA上 提纯含目的基因 的表达载体 ↓ 显微注射 ↓ 早期胚胎培养、胚胎移植 ↓ 获得具有新性状的个体 Ca2＋处理细胞 ↓ 感受态细胞 ↓ 基因表达载体与 感受态细胞混合 ↓ 感受态细胞吸收DNA分子 考点二　基因工程的基本操作程序 目录 核心要点·再研 农杆菌转化法 农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T-DNA（可转移的DNA）转移到被侵染的细胞、并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。 问题1：农杆菌具有怎样的结构基础，利于目的基因进入植物细胞？（p81） 农杆菌是生活在土壤中的微生物，自然条件下可侵染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有侵染能力。 冠瘿瘤 （1） 农杆菌： 考点二　基因工程的基本操作程序 目录 核心要点·再研 为使目的基因在受体细胞中稳定存在，在构建基因表达载体时，应将目的基因插入哪里？ 41 两次拼接 第一次拼接： 目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上。 第二次拼接： 被插入目的基因的T-DNA拼接到受体细胞染色体的DNA上。 两次导入 第一次导入： 将含目的基因的重组Ti质粒导入农杆菌。 第二次导入： 含含目的基因的T-DNA导入受体细胞(非人工操作)。 农杆菌转化法共有几次DNA分子的拼接，几次导入细胞？ 考点二　基因工程的基本操作程序 目录 核心要点·再研 VirB/D4系统的组装：农杆菌通过VirB/D4系统形成的通道（类似细菌Ⅳ型分泌系统）将T复合体从农杆菌转运至植物细胞内。该通道由多达12种蛋白质组成，包括两个主要部分：纤毛附属丝（或纤毛）和膜结合复合物。VirB1可在细菌膜上为T复合物运输器的装备提供位点；VirB2和VirB5可被移动到细胞表面形成纤毛；其余的VirB、VirD4为T复合物的运输提供能量。 42 2.如何筛选出含有目的基因的受体细胞 (1)原理：将目的基因插入含有两种抗生素抗性基因的载体时，如果目的基因插入某种抗生素抗性基因内部，则会导致该抗生素抗性基因失活。如图，目的基因插入了四环素抗性基因内部，则四环素抗性基因失活。 跳出题海P337 考点二　基因工程的基本操作程序 目录 典型例题·深研 (2)被转化的细菌有三种：含目的基因的细菌、含重组质粒的细菌、含质粒的细菌。 (3)筛选方法：将细菌先放在含氨苄青霉素的培养基上培养，能生长的是含重组质粒的细菌和含质粒的细菌，如图中1、2、3、4、5菌落，再利用灭菌的绒布影印到含有四环素的培养基上，如图能生长的菌落为2、3、4，则在含四环素培养基上不生长的即含有重组质粒的菌落，如图中1、5菌落。最后，可在含氨苄青霉素的培养基上挑取1、5菌落进行培养。　　　 考点二　基因工程的基本操作程序 目录 典型例题·深研 检测水平 检测目的 检测方法 分子水平 个体水平 目的基因是否转录出了mRNA 目的基因是否导入受体细胞 目的基因是否翻译出蛋白质 转基因生物是否表现出相应的特性 检测目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性 (1)目的： PCR扩增、 DNA分子杂交技术 抗原-抗体杂交技术 RT-PCR扩增、 RNA分子杂交技术 如抗虫、抗病的 接种实验 4.目的基因的检测与鉴定 考点二　基因工程的基本操作程序 目录 核心要点·再研 45 1.(2023·湖北卷，4)用氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、四环素抗性基因(TetR)作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体(重组质粒)，并转化到受体菌中。下列叙述错误的是(　　) D A.若用HindⅢ酶切，目的基因转录的产物可能不同 B.若用PvuⅠ酶切，在含Tet(四环素)培养基中的菌落， 不一定含有目的基因 C.若用SphⅠ酶切，可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否 D.若用SphⅠ酶切，携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)和Tet的培养基中能形成菌落 考点二　基因工程的基本操作程序 目录 典型例题·深研 2.(2024·新课标卷，35)某研究小组将纤维素酶基因(N)插入某种细菌(B1)的基因组中，构建高效降解纤维素的菌株(B2)。该小组在含有N基因的质粒中插入B1基因组的M1与M2片段；再经限制酶切割获得含N基因的片段甲，片段甲两端分别为M1与M2；利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术将片段甲插入B1的基因组，得到菌株B2。酶切位点(Ⅰ～Ⅳ)、引物(P1～P4)的结合位置、片段甲替换区如下图所示，→表示引物5′→3′方向。回答下列问题。 考点二　基因工程的基本操作程序 目录 典型例题·深研 (1)限制酶切割的化学键是____________。为保证N基因能在菌株B2中表达，在构建片段甲时，应将M1与M2片段分别插入质粒的Ⅰ和Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ酶切位点之间，原因是___________________________________________________________ ___________________________________________________________________。 磷酸二酯键 保证N基因启动子、N基因、N基因终止子的完整性，确保N基因能够顺利表达 考点二　基因工程的基本操作程序 目录 典型例题·深研 (2)CRISPR/Cas9技术可以切割细菌B1基因组中与向导RNA结合的DNA。向导RNA与B1基因组DNA互补配对可以形成的碱基对有G—C和____________________。 (3)用引物P1和P2进行PCR可验证片段甲插入了细菌B1基因组，所用的模板是________________________；若用该模板与引物P3和P4进行PCR，实验结果是______________________。 C—G、U—A、A—T 菌株B2的基因组DNA 无PCR产物 考点二　基因工程的基本操作程序 目录 典型例题·深研 (4)与秸秆焚烧相比，利用高效降解纤维素的细菌处理秸秆的优点是_____________________________________________________________________ (答出2点即可)。 无空气污染；更安全，无火灾隐患；分解效率更高，高效利用秸秆资源等 考点二　基因工程的基本操作程序 目录 典型例题·深研 关键 · 真题必刷 目录 1.(2023·重庆卷，12)某小组通过PCR(假设引物长度为8个碱基，短于实际长度)获得了含有目的基因的DNA片段，并用限制酶进行酶切(如下图)，再用所得片段成功构建了基因表达载体。下列叙述错误的是(　　) B A.实验所用引物，其中一个序列为 5′－TGCGCAGT－3′ B.步骤①所用酶是SpeⅠ和CfoⅠ C.用步骤①的酶对载体进行酶切 至少获得了2个片段 D.酶切片段和载体连接时可使用E.coli连接酶或T4连接酶 关键·真题必刷 01 02 03 目录 2.(2024·黑吉辽卷，25)将天然Ti质粒改造成含有Vir基因的辅助质粒(辅助T－DNA转移)和不含有Vir基因、含有T－DNA的穿梭质粒，共同转入农杆菌，可提高转化效率。细菌和棉花对密码子偏好不同，为提高翻译效率，增强棉花抗病虫害能力，进行如下操作。回答下列问题。 注：F1－F3，R1－R3表示引物；T－DNA－LB表示左边界；T－DNA－RB表示右边界；Ori表示复制原点；KanR表示卡那霉素抗性基因；HygBR表示潮霉素B抗性基因。 关键·真题必刷 01 02 03 目录 (1)从苏云金杆菌提取DNA时，需加入蛋白酶，其作用是________________________ ____________________________________。 提取过程中加入体积分数为95%的预冷酒精，其目的是________________________ ____________________________________。 (2)本操作中获取目的基因的方法是______________和_________________。 注：F1－F3，R1－R3表示引物；T－DNA－LB表示左边界；T－DNA－RB表示右边界；Ori表示复制原点；KanR表示卡那霉素抗性基因；HygBR表示潮霉素B抗性基因。 水解蛋白质，使得DNA与 蛋白质分离 溶解蛋白质等物质，析出 不溶于酒精的DNA PCR技术扩增 人工合成 关键·真题必刷 01 02 03 目录 (3)穿梭质粒中p35s为启动子，其作用是___________________________________,驱动目的基因转录；插入两个p35s启动子，其目的可能是________________________。 注：F1－F3，R1－R3表示引物；T－DNA－LB表示左边界；T－DNA－RB表示右边界；Ori表示复制原点；KanR表示卡那霉素抗性基因；HygBR表示潮霉素B抗性基因。 RNA聚合酶识别并结合的部位 提高目的基因的转录效率 关键·真题必刷 01 02 03 目录 (4)根据图中穿梭质粒上的KanR和HygBR两个标记基因的位置，用________基因对应的抗生素初步筛选转化的棉花愈伤组织。 (5)为检测棉花植株是否导入目的基因，提取棉花植株染色体DNA作模板，进行PCR，应选用的引物是________和________。 注：F1－F3，R1－R3表示引物；T－DNA－LB表示左边界；T－DNA－RB表示右边界；Ori表示复制原点；KanR表示卡那霉素抗性基因；HygBR表示潮霉素B抗性基因。 HygBR F3 R2 关键·真题必刷 01 02 03 目录 (6)本研究采用的部分生物技术属于蛋白质工程，理由是________(单选)。 A.通过含有双质粒的农杆菌转化棉花细胞 B.将苏云金杆菌Bt基因导入棉花细胞中表达 C.将1～1 362基因序列改变为棉花细胞偏好密码子的基因序列 D.用1～1 362合成基因序列和1 363～1 848天然基因序列获得改造的抗虫蛋白 注：F1－F3，R1－R3表示引物；T－DNA－LB表示左边界；T－DNA－RB表示右边界；Ori表示复制原点；KanR表示卡那霉素抗性基因；HygBR表示潮霉素B抗性基因。 D 关键·真题必刷 01 02 03 目录 3.(2024·重庆卷，19)大豆是重要的粮油作物，提高大豆产量是我国农业领域的重要任务。我国研究人员发现，基因S在大豆品种DN(种子较大)中的表达量高于品种TL(种子较小)，然后克隆了该基因(两品种中基因S序列无差异)及其上游的启动子序列，并开展相关研究。 ①表达载体 限制酶识别位点(HindⅢ，SpeⅠ，EcoRⅠ，XbaⅠ) 关键·真题必刷 01 02 03 目录 ②启动子D＋基因S 5′C……TAGAATTCCA……3′ 3′……ATCTTAAGGT……5′ ③四种限制酶识别序列及切割位点 注：箭头表示酶的切割位置。 关键·真题必刷 01 02 03 目录 (1)基因S启动子的基本组成单位是_____________________________。 (2)通过基因工程方法，将DN克隆的“启动子D＋基因S”序列导入无基因S的优质大豆品种YZ。根据题图所示信息(不考虑未标明序列)判断构建重组表达载体时，为保证目标序列的完整性，不宜使用的限制酶是________；此外，不宜同时选用酶SpeⅠ和XbaⅠ，原因是________________________________________ ____________________________________________________________________。 脱氧核糖核苷酸(脱氧核苷酸) EcoRⅠ 酶切后形成的片段黏性末端相同，易自我环化；不能保证目标片段与载体定向连接(或反向连接) 关键·真题必刷 01 02 03 目录 (3)为验证“启动子D＋基因S”是否连接在表达载体上，可用限制酶对重组表达载体酶切后进行电泳。电泳时，对照样品除指示分子大小的标准参照物外，还应有________________________________________。经验证的重组表达载体需转入农杆菌，检测转入是否成功的技术是________。 (4)用检测后的农杆菌转化品种YZ所得再生植株YZ－1的种子变大。同时将从TL克隆的“启动子T＋基因S”序列成功导入YZ，所得再生植 株YZ－2的种子也变大，但小于YZ－1。综合分析，大豆品种DN较TL种子大的原因是_____________________________________________________________ ____________________________________________________________________。 酶切后的空载体片段、“启动子D＋基因S”片段 PCR 品种DN的基因S上游启动子效应比TL强，使得基因S表达量更高，种子更大 关键·真题必刷 01 02 03 目录 PCR技术 体内DNA复制 相同点 原则 碱基互补配对 条件 DNA母链作为模板、引物(体内引物RNA、体外引物DNA)、4种脱氧核苷酸为原料 延伸方向 新链都是从5′端向3′端延伸 PCR技术 体内DNA复制 不同点 解旋方式 90 ℃以上高温解旋 解旋酶催化 场所 PCR扩增仪 主要在细胞核 延伸用酶 耐高温的DNA聚合酶 DNA聚合酶 温度 控制温度、需要在不同温度下进行 细胞内温和 条件过程 结果 大量的DNA片段(或目的基因) 形成完整的子代DNA $