2026届高三一轮复习生物：基因表达载体导学案

该高中生物学高考复习学案聚焦基因表达载体构建专题，系统整合传统酶切连接技术（组成、工具酶、限制酶选择原则）与无缝克隆新技术（原理、外切酶特性、步骤优缺点），通过基础填空、问题链（如“限制酶选择原则”“传统方法缺点”）引导学生自主梳理知识网络，形成从基础到进阶的认知层次。 亮点在于诊断性自测（开篇8道基础填空题）与真题演练（江苏卷等高考题）结合，通过“总结限制酶原则”“对比传统与无缝技术”等任务培养科学思维与探究实践素养。每个模块设方法指导（如引物设计依据），帮助学生自主诊断薄弱点，教师可借答题情况精准指导，实现个性化复习与因材施教。

高三生物二轮复习微专题学案 微专题：基因表达载体的构建 一、夯实基础 1.基因工程的基本操作程序中，核心步骤是_______________________________________,其目的是______________________________________________________。 2.基因表达载体的组成:___________________________________________。 3.启动子的功能:__________________,标记基因的作用:_______________。 4.构建重组质粒的传统方法中会用到__________酶和_________________酶。 5.PCR的过程中，引物设计的依据是:_______________________________,引物会与DNA模板链的______端结合，DNA新链延伸的方向为____________，通常会在引物的________端添加限制酶识别序列。 6.叙述传统构建表达载体的过程？ 例1.某真菌的w基因可编码一种高效降解纤维素的酶，已知图中w基因转录方向为从左往右。为使放线菌产生该酶，以图中质粒为载体，进行转基因。 限制酶主要是从______________中分离纯化出来的。应使用限制酶______________切割图中质粒，使用限制酶______________切割图中含w基因的DNA片段，以获得能正确表达w基因的重组质粒。 7.尝试总结限制酶的选择原则？ 8.概括传统酶切酶连构建基因表达载体的缺点？ 二、凸显能力 无缝克隆技术 1. 原理：在目的基因两端构建与线性化质粒末端相同的DNA序列(即同源序列，通常为15~20bp)，然后用核酸外切酶制造出黏性末端，黏性末端互补配对后，借助DNA聚合酶和DNA连接酶进行修复缺口，即可实现无缝连接。 2. 外切酶的种类 ①T5核酸外切酶(______________外切酶活性) ②In-Fusion酶(_________________外切酶活性) ③T4DNA 聚合酶 在反应体系中没有添加 dNTP 情况下具有______________外切酶活性； 在反应体系中添加 dNTP 情况下具有聚合酶活性； 在反应体系中仅添加某种特定的dNTP 原料(如dATP)，T4 DNA 聚合酶也具有3'→5'外切酶活性，且外切 到dAMP时，外切酶活性和聚合酶活性同时发挥作用，从而竞争性终止反应，产生指定长度的单链黏性末端。 3. 步骤 第一步：载体线性化，可采用_________________________________________________方法线性化。 第二步：获得目的基因，可采用______________去扩增，关键在于__________上，设计的引物5‘端需要和_________________末端有15-20bp的重叠，那么由此得到的PCR产物两端便分别带上了15-20个与载体序列同源性的碱基。 第三步：用______________将线性化载体和目的基因水解出______________。 第四步：线性化载体和目的基因连接修复（体内修复或体外修复）,需要_______________酶参与。 4. 优点： 5. 缺点： 例2.(2023·江苏卷)为了将某纳米抗体和绿色荧光蛋白基因融合表达，运用重组酶技术构建质粒，如图1所示。请回答下列问题： (1)分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时，配制的两个反应体系中不同的有__________(2分)，扩增程序中最主要的不同是____________。 (2)有关基因序列如图2。引物F2－F、F1－R应在下列选项中选用________(2分)。 A． －ATGGTG…CAACCA－ B．－TGGTTG…CACCAT－ C．－GACGAG…CTGCAG－ D．－CTGCAG…CTCGTC－ (3)将PCR产物片段与线性质粒载体混合后，在重组酶作用下可形成环化质粒，直接用于转化细菌。这一过程与传统重组质粒构建过程相比，无需使用的酶主要有________________________(2分)。 三、巩固训练 1.(2021·江苏卷)某小组为研究真菌基因m的功能，构建了融合表达蛋白M和tag 标签的质粒。请结合实验流程回答下列问题： 重组质粒的构建 ①将SmaⅠ切开的载体A与添加同源序列的m混合，用特定DNA酶处理形成黏性末端，然后降温以促进____________________，形成A－m结合体。将A－m结合体导入大肠杆菌，利用大肠杆菌中的DNA聚合酶及______________酶等，完成质粒的环化。 ②若正确构建的重组质粒A－m仍能被SmaⅠ切开，则SmaⅠ的酶切位点可能在________________________________(2分)。 2.磷脂酸（PA）是调节植物生长发育和逆境响应重要信使物质。为了解植物细胞中PA的动态变化，研究人员用无缝克隆技术将高度专一的PA结合蛋白（PABD）基因与绿色荧光蛋白（GFP）基因融合，构建有效监测细胞PA变化的荧光探针，并测定拟南芥细胞内PA含量。无缝克隆技术连接DNA片段的机理和构建荧光探针表达载体过程如图所示，请回答下列问题。 （1）无缝克隆时，T5核酸外切酶沿_________的方向水解DNA，其目的是形成_________________。T5核酸外切酶催化的最适温度为37℃，而过程①选择的温度为50℃，目的是降低酶活性，___________。 （2）过程②两个片段退火后存在“缺口”的原因是__________，过程③所需的酶有____________。 （3）与传统的酶切再连法相比无缝克隆技术构建重组质粒的优点有________________________。 A. 不受限制酶切位点的限制 B. 不会引入多余碱基 C. 操作时间短，成功率高 D. 有利于多个小片段（小于50bp）连接 （4）PCR扩增PABD基因时需依据______________________________________________设计引物R1。据图分析扩增目的片段的引物F1和R2对应于下表中的_______________________________。 1 5'-TCCGGACTCAGATCTCGAGC-3' 2 5'-AGCTATAGTTCTAGATCTAGATTAACTAGTCTTAGTGGCGTC-3' 3 5'-TATCGATGGCGCCAGCTGAGGATGGTGAGCAAGGGCGA-3' 4 5'-GCTCGAGATCTGAGTCCGGACTTGTACAGCTCGTCCA-3' 参考答案： 一、夯实基础1-6（略） 7.(1)根据目的基因两端的限制酶切割位点确定限制酶的种类 应选择切割位点位于目的基因两端的限制酶，不能选择切割位点位于目的基因内部的限制酶 (2)根据质粒的特点确定限制酶的种类 要与切割目的基因的限制酶产生相同的末端；如果是2种限制酶则是保证目的基因的正向连接、避免质粒和质粒之间、目的基因和目的基因之间的自身连接。 一定不能破坏启动子、终止子和复制原点，当质粒具有2个或多个标记基因时，一定要根据信息确定不能破坏的标记基因，必须保证重组的质粒至少有一个标记基因。 8. 在构建一个重组质粒的过程，要经过：PCR、酶切、T4 DNA Ligase连接、转化，中间任一环节出了问题，都要N次重来，最后结果阳性率往往还是很低。 而且由于挑选的酶切位点不能存在于插入片段中间，有时候我们会发现质粒载体上可用的酶切位点很少。如果用单酶切的话，一方面不太容易切开，另一方面单酶切的载体在连接片段时不能保证片段插入的方向性且单酶切的载体容易发生自连。同时会引入多余序列。麻烦，着实是麻烦！ 例1. 原核生物 MfeⅠ、HindⅢ EcoRⅠ、HindⅢ 二、凸显能力 无缝克隆技术 2. ①5'→3' ②3'→5' ③ 3'→5' 3.酶切或是直接PCR方式去扩增整个载体 PCR 方式去扩增 引物设计 线性化载体 核酸外切酶 黏性末端 DNA聚合酶、DNA连接 4. ①单次插入片股：传统分子克隆一轮只能能插入一个片段：无缝克隆单个至多个（小于等于5）： ②不受限于酶切位点 ③不引入多余序列 ④流程简单、时间短 ⑤克隆效率较高。 5.（1）载体克隆位点选择尽量选择无重复序列，且 GC 含量比较均匀的区域进行克隆； （2）如果载体或目的基因有多个同源重复序列可能会导致克隆含有错误的插入片段； （3）由于载体和目的基因比例问题以及如果同源区域没有暴露，In-Fusion 反应也不会成功 例2.（1）模板、引物 退火温度 （2）CD （3）限制酶、DNA连接酶 三、巩固训练 1.黏性末端碱基配对 DNA连接 基因m的连接处、基因m的内部 2.（1）5′→3′黏性末端 防止过度水解DNA(或控制水解速度，或控制黏性末端合适长度) （2）过程①切割的长度大于同源序列长度(，确保同源序列的高效碱基互补配对) DNA聚合酶和DNA连接酶 （3） ABC （4） PABD基因一端的核苷酸序列和载体一端的核苷酸序列(或PABD基因一端的核苷酸序列和同源序列) 1、4 高三生物 第 1 页 共 2 页 学科网（北京）股份有限公司 $