1.2.2 微生物的选择培养和计数课件-2024-2025学年高二下学期生物人教版选择性必修3

该高中生物学课件聚焦微生物的选择培养和计数，涵盖选择培养基、稀释涂布平板法、间接与直接计数方法，及土壤中分解尿素细菌的分离实验。通过自然界微生物分离难题导入，衔接无菌技术和培养基知识，构建从基础到应用的学习支架。 其亮点是以科学实例（如Taq酶发现）和实验探究为主线，通过问题讨论培养科学思维，实验操作（稀释涂布、对照设置）强化探究实践。帮助学生提升实验设计与数据分析能力，为教师提供系统的实验教学方案和评价标准，提升教学效率。

1.2.2微生物的选择培养和计数 高压蒸汽灭菌 液体培养基 微生物的基本培养技术 1、实验室培养微生物条件 1）提供微生物生长繁殖所需营养和环境条件 —培养基 2）确保其它微生物无法混入 —无菌技术 高压蒸汽灭菌 温故知新： 2、培养基的营养构成: 碳源、氮源、水、无机盐等 1）碳源： 无机碳源： CO2、CO32-、HCO3- 有机碳源： 葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨等 自养微生物 异养微生物 2）氮源： 无机氮源： NH4＋、NO3-、NH3等 有机氮源： 牛肉膏、蛋白胨、尿素、氨基酸等 注：含C、H、O、N的有机物是异养型微生物的碳源、氮源、能源 3）无机盐： Ca、K 、Mg为大量元素 Zn、Cu、Mn、Co、Mo等微量元素 类型 适用范围 操作方法 消 毒 灭 菌 较为温和理化方法，杀死部分微生物（不包括芽孢、孢子） 强烈的理化方法，杀死所有微生物（包括芽孢、孢子） 煮沸消毒法 日常生活 100 ℃煮沸5～6 min 巴氏消毒法 不耐高温的液体 62～65 ℃煮30 min或80-90 ℃煮30s-1 min 化学药剂 生物活体、水源等 擦拭等,如用酒精擦拭双手、用氯气消毒水源 紫外线 紫外线照射30 min 灼烧灭菌 接种的金属工具、接种时用的试管口或瓶口等 直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧 干热灭菌 耐高温、需要保持干燥的物品,如玻璃器皿和金属用具等 物品放入干热灭菌箱,160～170 ℃加热2～3h 湿热灭菌 培养基、培养皿等,生产和实验室常用 高压蒸汽灭菌锅内,100 kPa,温度121 ℃,15～30 min 无菌的方法： 接种室、接种箱，超净工作台 课题背景 自然界中微生物数量繁多，种类庞杂，要想从中分离出需要的特定微生物并不容易，尤其当要分离的微生物在混合菌群中不是优势种群时，更难实现。 稀释涂布平板法呈现的杂菌群 那么我们又如何达成这一目标呢？ 科学家们应用选择性培养基解决了这一难题。 1、 科学实例：寻找耐高温的DNA聚合酶 启示：寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。 筛选原因：因为热泉的高温条件淘汰了绝大多数微生物，使耐热的Taq细菌保留下来。 PCR是一种在体外DNA复制的技术，此项技术要求使用耐高温（930C）的DNA聚合酶。 1966年，布鲁克在美国黄石国家公园的一个热泉中发现了耐热的Taq细菌，并分离到耐高温的DNA聚合酶（Taq酶）。 耐高温的酶 耐高温生物体 高温环境（热泉、火山口） 寻找 寻找 （一）选择培养基 根据微生物对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。 2.筛选原则 耐寒微生物 耐热微生物 石油分解菌 结果：培养一定时间后，目的菌数量上升，再通过稀释涂布平板等方法对它进行纯化培养。 2、实验室中微生物的筛选原理： 人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。 允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的 培养基，叫做选择培养基。 （一）选择培养基 之后讲课本P22的最上面内容 培养基中加氨苄青霉素 没有氨苄青霉素抗性的细菌被淘汰 怎样选择出抗氨苄青霉素能力的细菌? 举例1 培养基+氨苄青霉素 培养基 加入青霉素： 不加氮源： 不加含碳有机物： ——分离出酵母菌、霉菌等真菌 (青霉素能杀死细菌、放线菌) ——分离出固氮菌 ——分离出自养型微生物 补充资料1-几种选择培养基举例 那么如果让你分离土壤中分解尿素的细菌，你应该怎么设计呢？ 加高浓度食盐 ——金黄色葡萄球菌 选择培养基 特殊成分 加入某种化学物质 目的 抑制其他微生物生长，促进目的微生物的生长 用途 举例 鉴别培养基 加入某种指示剂 发生特定颜色反应 分离出特定微生物 鉴别不同的微生物 用尿素作唯一氮源的培养基来筛选尿素分解菌 伊红—美蓝培养基 鉴定大肠杆菌 选择培养基和鉴别培养基 总结 思考-讨论 选择培养基配方的设计 尿素的立体结构 尿素［CO(NH2)2］含氮量高，化学性质稳定，是现代农业生产中一种重要的氮肥。尿素被土壤中某些细菌分解成NH3,再被转化为NO3-、NH4+等被植物吸收。 这些细菌之所以能分解尿素，是因为能合成脲酶，来催化尿素分解。 讨论： 1、你如何设计培养基配方，将土壤稀释液中能分解尿素的细菌分离出来？ 2、该培养基与普通培养基有哪些共同点和不同点？ 培养基添加尿素作唯一氮源，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素、缺乏氮源而不能生长发育繁殖，所以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。 牛肉膏 5.0g 蛋白胨 10.0g NaCl 5.0g 琼脂 20.0g 蒸馏水 定容到1000ml KH2PO4 1.4g NaH2PO4 2.1g MgSO4·7H2O 0.2g 葡萄糖 10.0g 尿素CO(NH2)2 1.0g 琼脂 15.0g 蒸馏水 定容到1000ml 配方一：培养细菌 配方二：培养可以分解尿素的细菌 补充资料2-普通培养基与选择培养基的比较 1、从物理性质看此培养基属于哪类？从用途上属于哪类培养基？ 固体培养基 配方二是以尿素作唯一氮源的选择培养基 2、KH2PO4和Na2HPO4的作用是： ①提供无机盐；②调节pH。 （二）微生物的选择培养 如果想知道1g土壤中有多少能分解尿素的细菌，还需对土壤菌液进行稀释及科学的微生物数量测定方法---稀释涂布平板法。 2、实验的具体操作： 2）土壤取样 从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。 取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌 1）制备培养基： 制备以尿素为唯一氮源的选择培养基 1、稀释涂布平板法 是将菌液进行一系列梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。 ①铲取土样，将样品装入纸袋中 ②将10g土样加入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀，制成稀释10倍的土壤菌液。 1mL 1ⅹ10 90mL无菌水 1ⅹ107 1ⅹ105 1ⅹ106 1ⅹ103 1ⅹ102 1ⅹ104 1mL 1mL 1mL 1mL 6支试管，分别加入9ml无菌水 1mL ③取1mL上清液加入盛有9mL无菌水的试管中，依次等比稀释。 3.稀释涂布平板法的操作过程 菌液配置 ⑥取0.1mL菌液，滴加到培养基表面。 ④将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中。 ⑤将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器冷却后，再进行涂布。 ⑦用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀。 待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，培养 菌液涂布培养基 浸 灼 滴 涂 各梯度分别涂布3个平板 1个不涂布作空白对照 放入37℃恒温箱中培养1～2d 4培养与观察 稀释103倍 稀释104倍 稀释105倍 空白对照 恒温培养箱 19 3.平板划线法和稀释涂布平板法的比较 (1)单菌落的获得 ①利用平板划线法接种时,单菌落从后划线的区域挑取; ②利用稀释涂布平板法接种时,只有合适的稀释度才能得到单菌落。 (2)两种接种方法的应用 两种方法都能将微生物分散到固体培养基表面,以获得单菌落,达到分离纯化微生物的目的; 稀释涂布平板法还能对微生物进行计数,而平板划线法不能用于微生物的计数。 （三）微生物的数量测定 稀释涂布平板法除用于分离微生物外，也常用于统计样品中活菌数。在稀释度足够高时，培养基上表面生长的一个单菌落来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，可推测出样品中大约有多少活菌。 1、原理： 2、计数原则： 一般选择菌落数在30—300的平板上进行计数。 1.间接计数法（活菌计数法） — 稀释涂布平板法 注意事项 ①为了保证结果准确，一般选择菌落数在30—300的平板上进行计数。 ②为增强实验说服力与准确性，以减少偶然因素对实验结果的影响。设计实验时，需要涂布至少三个平板作为重复组。 ③统计的菌落往往比活菌的实际数目低。 ④统计的结果一般用菌落数而不是活菌数； ⑤恰当的稀释度、涂布是否均匀是成功统计菌落数目的关键。 ⑥分析实验结果时，要考虑重复组结果是否接近，如果相差太大，意味着操作 有误，需重新实验。 因为当两个或多个细胞连在一起时，繁殖后形成的还是一个菌落 提示：若平板上菌落数过多，说明稀释度过低，菌体的密度大，就会出现更多的两个或两个以上的菌体形成的菌落，结果不准确，且计数较困难。若平板上菌落数过少，菌落形成的偶然性大，结果也不准确。 讲完第1点后讲课本P22中间楷体字内容引出2、3、4、内容 实例分析1： 3、计算： 每克样品中的菌落数＝(C÷V)×M C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数， V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(ml)， M代表稀释倍数。 某同学在稀释倍数为106 的培养基中测得平板上菌落数的平均数为234，那么每g样品中的菌落数是（涂布平板时所用稀释液的体积为0.1mL) ( ) A. 2.34×108 B. 2.34×109 C. 234 D. 23.4 B 两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。从对应稀释 倍数为106的培养基中，得到以下两种统计结果。 1、甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230。 2、乙同学在该浓度下涂布了A、B、C三个平板，统计的菌落数分别为21、 212、256，该同学以这三个平板上菌落数的平均值163作为统计结果。 你认为这两位同学的作法正确吗？如果有问题，错在哪？ 甲：没有重复实验（至少涂布3个平板） 乙：其中一个平板计数结果与其他两个相差太大，操作过程可能出现了错误。 实例分析2： 这种方法是利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量 每毫升原液所含细菌数＝ 每小格平均细菌数×400×10000×稀释倍数 缺点： 不能区分死菌与活菌（数值偏大） 不适于对运动细菌的计数 需要相对高的细菌浓度； 个体小的细菌在显微镜下难以观察； 2.显微镜直接计数 —计数板计数法 讲完第1点后讲课本P22中间楷体字内容引出2、3、4、内容 项目 直接计数法 间接计数法(稀释涂布平板法) 原理 利用特定的细菌计数板或血细胞计数板,在显微镜下观察计数,计算一定体积的样品中微生物的数量 当样品的稀释度足够高时,培养基表面生长的一个单菌落,来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数,就能推测出样品中大约含有多少活菌 主要 用具 显微镜、细菌计数板或血细胞计数板 培养基 计数 数据 菌体本身 培养基上菌落数 优点 计数方便、操作简单 计数的是活菌 缺点 死菌、活菌都计算在内 操作较复杂,有一定误差 计算公式 每毫升原液含菌数＝每小格平均菌体数×400×10 000×稀释倍数 每毫升原液含菌数＝培养基上平均菌落数×稀释倍数÷涂布液体积 归纳提升:统计菌落数目的方法 微生物生长量的测定有计数法、重量法、生理指标法等方法,但是一般使用计数法,计数法可分为直接计数法和间接计数法。二者的比较如下表所示。 思考-讨论 土壤中分解尿素的细菌的分离和计数 尿素的立体结构 1)课题目的 1、从土壤中分离出能够分解尿素的细菌 2、统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌 2)研究思路 土壤取样 制备培养基 样品稀释与取样涂布 微生物的培养与观察 1、土壤取样 1）取样的位置： 细菌适宜在酸碱度接近中性的潮湿土壤中生长，绝大多数的细菌分布距地表3∼8cm的土壤层。 2）取样要求：先铲去表层土3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。 取土样时用的铁铲和取样袋在使用前都需要灭菌。 操作完成后，一定要洗手。 2、制备培养基 准备选择培养基（以尿素为唯一氮源）和牛肉膏蛋白胨培养基。 每个稀释度下需要3个选择培养基，1个牛肉膏蛋白胨培养基以及各一个空白对照。 在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落数目，应明显多于选择培养基。 用以分离并计数能分解尿素的细菌 用以判断选择培养基是否具有选择作用 用以验证培养基中是否含有杂菌 3、样品的稀释 测土壤中细菌数量，一般选用1x104 、1x105 和1x106倍的稀释液进行平板培养。 由于初次实验，对于稀释的范围没有把握，因此选择了一个比较宽的范围，将1×103～1×107倍稀释的稀释液分别涂布到平板上培养，以保证能从中选择出菌落数在30～300的平板进行计数 不同微生物在土壤中含量不同，分离不同的微生物采用不同的稀释度，以保证获得菌落数在30～300之间，适于计数的平板。 测细菌数：一般用104、105、106稀释液 测放线菌：一般用103、104、105稀释液 测真菌数：一般用102、103、104稀释液 4、微生物的培养与观察 ②在菌落计数时，每隔24h统计一次菌落数目。 选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。 ③一般来说，在相同的培养条件下，同种微生物表现出稳定的菌落特征，如形状、大小和颜色等。 ①培养不同微生物往往需要不同培养温度。 细菌： 30～37℃培养1～2d 放线菌：25～28℃培养5～7d 霉菌： 25～28℃的温度下培养3～4d。 3)操作提示 2）无菌操作 3）做好标记 本实验使用的平板和试管比较多，为避免混淆，使用前要做好标记 4）制定计划 对于耗时较长的生物实验，要事先规划时间，以便提高工作 效率，在操作时更加有条不紊 1）不要将过热的涂布器放在盛有酒精的烧杯中，以免引燃酒精。 a、取土用的小铁铲的盛土样的信封在使用前都需要灭菌。 b、应在火焰旁称取土壤。在火焰附近将称好的土样倒入 锥形瓶中，塞好棉塞。 c、在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁操作。 4)结果分析与评价 （一）培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是否筛选出菌落 空白对照的培养皿在培养过程中没有菌落生长，说明培养基没有被杂菌污染。 牛肉膏蛋白胨培养基的菌落数目明显大于选择培养基的数目，说明选择培养基已筛选出一些菌落。 （三）在以尿素作为唯一氮源的培养基中分离出的微生物都是能分解尿素的吗？ （二）样品的稀释操作是否成功？ 如果得到了2个或2个以上菌落数目在30～300的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数。 不一定。因为有些微生物可以利用其他微生物的代谢产物进行生长繁殖。 CO(NH2)2+H2O 脲酶 CO2+2NH3 补充拓展： 脲酶阴性 脲酶阳性 土壤中分解尿素的细菌的鉴定 在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂。培养某种细菌后，如果pH升高，指示剂将变红，说明该细菌能够分解尿素。 （四）在做分解尿素的细菌的筛选与统计菌落数目的实验时，A同学从对应的106倍稀释的培养基中筛选出大约150个菌落，但是其他同学在同样的稀释度下只选择出大约50个菌落，分析其原因。 原因：（1）土样不同（2）培养基污染或操作失误 小结：通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少的。 方案一：由其他同学用与A同学相同土样进行实验。如果结果与A同学一致，则证明A无误；如果结果不同，则证明A同学存在操作失误或培养基的配制有问题。 方案二：将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。 特别提醒 实验设计原则 (1)设立重复组:统计某一稀释度下平板上的菌落数时,要至少涂布3个平板作重复组,以增强实验结果的说服力与准确性。 (2)设立两种对照组: ①判断选择培养基中是否有杂菌污染,需同时将未接种的选择培养基进行培养; ②判断选择培养基是否具有筛选作用,需同时设立牛肉膏蛋白胨培养基进行接种后培养,观察两种培养基上的菌落数目,进行对比得出结论。 探究点一 探究点二 2.土壤中分解尿素的细菌的分离与计数结果分析与评价 内　容 现　　象 结　　论 有无污染 的判断 对照的培养基中无菌落生长 未被杂菌污染 培养物中菌落数偏高 培养物中混入其他氮源 菌落形态多样,菌落数偏高 被杂菌污染 选择培养基的筛选作用 牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数目大于选择培养基上的数目 选择培养基具筛选作用 样品的稀释操作 得到2个或2个以上菌落数目为30~300的平板 操作成功 重复组的结果 若选取同一种土样,统计结果应接近 课堂小结 微生物的数量测定 选择培养基的作用 微生物选择培养获取纯培养物的方法-稀释涂布平板法 微 生 物 的 选 择 培 养 和 计 数 选择培养基 微生物的选择培养 科学实例 筛选原则 选择培养基的概念及举例 稀释涂布平板法的操作过程 间接计数法 — 稀释涂布平板法 直接计数 —计数板计数法 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 培养基的制备 实验设计 （1）土壤取样 （2）样品的稀释 （3）稀释涂布平板法接种 （4）微生物的培养与观察 实验设计 不同菌落的颜色与形状 3.用来判断选择培养基是否起到了选择作用,需要设置的对照是(　　) A.未接种的选择培养基 B.未接种的牛肉膏蛋白胨培养基 C.相同条件下接种了的牛肉膏蛋白胨培养基 D.相同条件下接种了的选择培养基 答案C 解析 将菌液稀释相同的倍数并接种,相同培养条件下牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数目应明显多于选择培养基上的菌落数目,因此,应选择接种了的牛肉膏蛋白胨培养基作为对照。对照实验遵循单一变量原则,所以牛肉膏蛋白胨培养基要与选择培养基在相同条件下接种、培养。 2.分离土壤中分解尿素的细菌,对培养基的要求是(　　) ①加尿素　②不加尿素　③加琼脂　④不加琼脂　⑤加葡萄糖　⑥不加葡萄糖　⑦加硝酸盐　⑧不加硝酸盐 A.①③⑤⑦ B.②④⑥⑧ C.①③⑤⑧ D.①④⑥⑦ 答案C 解析要分离土壤中分解尿素的细菌,培养基中尿素应是唯一的氮源,不能加硝酸盐;在固体培养基上形成菌落,要加琼脂作凝固剂;分解尿素的细菌是异养微生物,要加有机碳源(如葡萄糖)。 3.某同学在稀释倍数为106的培养基上测得平板上的菌落数的平均值为234个,那么每毫升样品中菌落数是(涂布平板时所用稀释液的体积为0.1 mL)(　　) A.2.34×108个 B.2.34×109个 C.234个 D.23.4个 答案B 解析平板上菌落数的平均值×稀释倍数÷涂布液体积=每毫升样品中的菌落数,即234×106÷0.1=2.34×109(个)。 探究点一 探究点二 典例剖析 选择培养基可以从混杂的微生物群体中分离出所需的微生物,通过不含有机物的培养基、缺氮培养基、含尿素(不含其他氮源)的培养基,可从土壤中分离出的微生物依次是(　　) A.硝化细菌、放线菌、根瘤菌 B.根瘤菌、青霉菌、固氮菌 C.异养细菌、放线菌、硝化细菌 D.自养细菌、固氮菌、分解尿素的细菌 答案D 解析不含有机物的培养基可以选择自养微生物,缺少氮元素的培养基可以选择固氮微生物,含尿素(不含其他氮源)的培养基可以选择能分解尿素的微生物。 探究点一 探究点二 活学活练 分离土壤中分解尿素的细菌,对培养基的要求是(　　) 注 “+”表示加入,“-”表示不加 答案C 解析分离土壤中分解尿素的细菌,培养基中要有碳源,且以尿素作为唯一的氮源,故不能添加硝酸盐。 选项 尿素 琼脂 葡萄糖 硝酸盐 A + + + + B - - - - C + + + - D + - - + (2)稀释涂布平板法： ①稀释操作时：每支试管及其中的9 mL水、移液管等均需灭菌；操作时，试管口和移液管应在离火焰1～2 cm处。 ②涂布平板时： a．涂布器浸在体积分数为70%的酒精中，取出时，让多余酒精在烧杯中滴尽，然后将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃。 b．不要将过热的涂布器放在盛放酒精的烧杯中，以免引燃其中的酒精。 c．酒精灯与培养皿距离要合适，移液管管头不接触任何物体。 $