专题8 重难点6 PCR技术及其应用(课件PPT)-【精讲精练】2026年高考生物二轮专题辅导与训练（B版）

该高中生物学高考复习课件聚焦“生物技术与工程”专题，覆盖PCR技术及应用、RT-PCR、定点诱变等核心考点，对接高考评价体系，结合2025年黑龙江内蒙古卷等真题研析，分析考点权重，归纳引物设计、结果分析等常考题型，体现备考针对性。 课件亮点在于“真题训练+核心素养融合”，如通过实时荧光定量PCR的Ct值分析培养科学思维，以反向PCR引物选择指导探究实践，帮助学生掌握突变位点设计等答题技巧，教师可据此系统梳理考点，助力学生高效冲刺高考。

专题八　生物技术与工程 第一部分　专题强化突破 返回目录 第一部分 专题八　生物技术与工程 高考总复习（二轮）生物学 1 重难点6　PCR技术及其应用 返回目录 第一部分 专题八　生物技术与工程 高考总复习（二轮）生物学 1 返回目录 第一部分 专题八　生物技术与工程 高考总复习（二轮）生物学 1 返回目录 第一部分 专题八　生物技术与工程 高考总复习（二轮）生物学 1 返回目录 第一部分 专题八　生物技术与工程 高考总复习（二轮）生物学 1 返回目录 第一部分 专题八　生物技术与工程 高考总复习（二轮）生物学 1 返回目录 第一部分 专题八　生物技术与工程 高考总复习（二轮）生物学 1 返回目录 第一部分 专题八　生物技术与工程 高考总复习（二轮）生物学 1 返回目录 第一部分 专题八　生物技术与工程 高考总复习（二轮）生物学 1 返回目录 第一部分 专题八　生物技术与工程 高考总复习（二轮）生物学 1 返回目录 第一部分 专题八　生物技术与工程 高考总复习（二轮）生物学 1 返回目录 第一部分 专题八　生物技术与工程 高考总复习（二轮）生物学 1 返回目录 第一部分 专题八　生物技术与工程 高考总复习（二轮）生物学 1 返回目录 第一部分 专题八　生物技术与工程 高考总复习（二轮）生物学 1 返回目录 第一部分 专题八　生物技术与工程 高考总复习（二轮）生物学 1 返回目录 第一部分 专题八　生物技术与工程 高考总复习（二轮）生物学 1 返回目录 第一部分 专题八　生物技术与工程 高考总复习（二轮）生物学 1 返回目录 第一部分 专题八　生物技术与工程 高考总复习（二轮）生物学 1 返回目录 第一部分 专题八　生物技术与工程 高考总复习（二轮）生物学 1 返回目录 第一部分 专题八　生物技术与工程 高考总复习（二轮）生物学 1 返回目录 第一部分 专题八　生物技术与工程 高考总复习（二轮）生物学 1 返回目录 第一部分 专题八　生物技术与工程 高考总复习（二轮）生物学 1 返回目录 第一部分 专题八　生物技术与工程 高考总复习（二轮）生物学 1 返回目录 第一部分 专题八　生物技术与工程 高考总复习（二轮）生物学 1 返回目录 第一部分 专题八　生物技术与工程 高考总复习（二轮）生物学 1 返回目录 第一部分 专题八　生物技术与工程 高考总复习（二轮）生物学 1 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(2)进一步筛选构建的质粒，以1～4号菌株中提取的质粒为模板，使用引物1和引物2进行PCR扩增，电泳PCR产物，结果如图2。在第5组的PCR反应中，使用无菌水代替实验组的模板DNA，目的是检验PCR反应中是否有________的污染。初步判断实验组________(从“1～4”中选填)的质粒中成功插入了基因N，理由是___________________________________________________ ____________________________________________________________________。 (3)为提高香树脂醇合酶催化效率，将编码第240位脯氨酸或第243位苯丙氨酸的碱基序列替换为编码丙氨酸的碱基序列，丙氨酸的密码子有GCA等。a是诱变第240位脯氨酸编码序列的引物(GCA为诱变序列)，b、c、d其中一条是诱变第243位苯丙氨酸的引物，其配对模板与a的配对模板相同。据此分析，丙氨酸的密码子除GCA外，还有________。 a：5′－…GCA/CCC/GAG/TTC/TGG/CTG/TTT/CCC/TCT/TTC/TTC…－3′ b：5′－…GAA/CTG/TGG/GAC/ACC/CTG/AAC/TAC/TTC/TCT/GAG…－3′ c：5′－…GCC/TGG/CTG/TTT/CCC/TCT/TTC/TTC/CCC/TAC/CAC…－3′ d：5′－…GAT/AAT/AAG/ATC/CGA/GAG/AAG/GCC/ATG/CGA/AAG…－3′ (4)进一步检测转基因酵母菌发酵得到的______含量并进行比较，可以选出最优的香树脂醇合酶基因的改造方案。 解析　(1)GenBank是目前国际上广泛使用的序列数据库之一，它的数据主要是各国的实验室、测序机构等发布的序列信息。利用这个数据库，我们可以便捷地检索到基因和蛋白质的序列信息；故可从DNA序列数据库或基因序列数据库中查询基因N的编码序列，设计特定引物。保证基因N与质粒pYL正确连接，需要使用双酶切法，为了目的基因能正确表达，目的基因需要插入质粒的启动子和终止子之间，且质粒和目的基因需要使用相同的酶或能产生相同黏性末端的酶；分析图1可知，质粒pYL应该选用SpeⅠ和XhoⅠ酶切，由于目的基因N含有SpeⅠ识别序列，故N基因不能使用SpeⅠ酶切，但XbaⅠ与其具有相同的黏性末端，基因N酶切时可以用XbaⅠ替换SpeⅠ，即N基因两端应该含有Xba Ⅰ和XhoⅠ识别序列；题干信息：N基因a链为转录模板链，才有引物1和引物2扩增N基因，则扩增后模板链的5′端含有引物1序列，而编码链的5′端含有引物2序列，结合质粒pYL上的启动子和终止子方向，可知应该在引物2需要5′端添加XbaⅠ、引物1 5′端添加XhoⅠ识别序列。PCR扩增基因N，特异性酶切后，利用DNA连接酶连接DNA片段，构建重组质粒，大小约9.5 kb(kb为千碱基对)，假设构建重组质粒前后，质粒pYL对应部分大小基本不变。 (2)在第5组的PCR反应中，使用无菌水代替实验组的模板DNA，目的是检验PCR反应中是否有外源DNA的污染。质粒pYL大小为7.2 kb，重组质粒大小约9.5 kb，假设构建重组质粒前后，质粒pYL对应部分大小基本不变，基因N大小为二者的差值，约为2.3 kb(2～2.3 kb)，结合图2电泳结果可知，实验组1的电泳条带大小约为2300 bp，说明实验组1的质粒中成功插入了基因N。 (3)a是诱变第240位脯氨酸编码序列的引物(GCA为诱变序列)，b、c、d其中一条是诱变第243位苯丙氨酸的引物，其配对模板与a的配对模板相同，分析题图bcd序列可知c是诱变第243位苯丙氨酸的引物，根据a引物5′端首位GCA为240位，则c引物5′端GCC为243位，故据此分析，丙氨酸的密码子除GCA外，还有GCC。 (4)题干研究目的是通过在酵母菌中表达外源香树脂醇合酶基因N，可高效生产香树脂醇；由此可知，进一步检测转基因酵母菌发酵得到的香树脂醇含量并进行比较，可以选出最优的香树脂醇合酶基因的改造方案。 答案　(1)基因序列数据库或DNA序列数据库　XhoⅠ　XbaⅠ　DNA连接酶 (2)外源DNA(或外源基因、基因N)　1　基因N大小为重组质粒大小和质粒pYL大小的差值，约为2.3 kb，对应实验组1的电泳条带(或实验组1电泳条带大小加质粒pYL大小约等于重组质粒大小) (3)GCC (4)香树脂醇 2．(2025·浙江1月卷)3－磷酸甘油脱氢酶(GPD)是酵母细胞中甘油合成的关键酶。利用某假丝酵母菌株为材料，克隆具有高催化效率的3－磷酸甘油脱氢酶的基因(Gpd)。采用的方案是先通过第1次PCR扩增出该基因的中间部分，再通过第2次PCR分别扩增出该基因的两侧，经拼接获得完整基因的序列，如图所示。回答下列问题： (1)分析不同物种的GPD蛋白序列，确定蛋白质上相同的氨基酸区段，依据这些氨基酸所对应的________，确定DNA序列，进而设计1对引物。以该菌株基因组DNA为模板进行第1次PCR，利用________凝胶电泳分离并纯化DNA片段，进一步测定PCR产物的序列。在制备PCR反应体系时，每次用微量移液器吸取不同试剂前，需要确认或调整刻度和量程，还需要____________。 (2)若在上述PCR扩增结果中，除获得一条阳性条带外，还出现了另外一条条带，不可能的原因是________。 A．DNA模板被其他酵母细胞的基因组DNA污染 B．每个引物与DNA模板存在2个配对结合位点 C．在基因组中Gpd基因有2个拷贝 D．在基因组中存在1个与Gpd基因序列高度相似的其他基因 (3)为获得完整的Gpd基因，分别用限制性核酸内切酶PstⅠ和SalⅠ单酶切基因组DNA后，各自用DNA连接酶连接形成环形DNA，再用苯酚—氯仿抽提除去杂质，最后加入____________沉淀环形DNA。根据第一次PCR产物测定获得的序列，重新设计一对引物，以环形DNA为模板进行第二次PCR，最后进行测序。用于第二次PCR的一对引物，其序列应是DNA链上的________(A.P1和P2　B．P3和P4　C．P1和P4　D．P2和P3)。根据测序结果拼接获得完整的Gpd基因序列，其中的启动子和终止子具有__________功能。 (4)为确定克隆获得的Gpd基因的准确性，可将获得的基因序列与已建立的__________进行比对。将Gpd基因的编码区与________连接，构建重组质粒，再将重组质粒导入酿酒酵母细胞中，实现利用酿酒酵母高效合成甘油的目的。 解析　(1)已知GPD蛋白的氨基酸序列，可根据中心法则推测出这些氨基酸所对应的密码子，推测出mRNA序列，再推测出DNA序列，进而设计1对引物。可利用琼脂糖凝胶电泳对DNA进行分离、纯化。在使用移液器时，每次吸取不同试剂前都要更换枪头，避免污染。 (2)DNA模板被其他酵母细胞的基因组DNA污染，可能扩增出其他DNA，从而出现另外一条条带，A不符合题意；每个引物与DNA模板存在2个配对结合位点，可扩增出不同的DNA片段，从而出现另外一条条带，B不符合题意；在基因组中Gpd基因有2个拷贝，扩增出的DNA是相同的，电泳时只会出现一条条带，C符合题意；在基因组中存在1个与Gpd基因序列高度相似的其他基因，可能将该相似的基因扩增出来，从而出现另外一条条带，D不符合题意。 (3)DNA在预冷的95%乙醇中溶解度较低，可用冷的95%乙醇沉淀DNA。PCR过程中，子链的延伸方向为5′→3′，第二次PCR的目的是扩增出基因的两侧序列，因此第二次PCR的一对引物的扩增方向应该朝着基因的两端进行扩增，即选择P2和P3引物。启动子是RNA聚合酶的结合位点，调控基因转录的启动，而终止子则调控基因转录的结束，二者具有调控基因转录的功能。 (4)为确定克隆获得的Gpd基因的准确性，可将获得的基因序列与已建立的基因数据库进行对比，若二者相同，则说明克隆获得的Gpd基因准确。Gpd基因的编码区不含启动子和终止子，为了实现Gpd基因在酿酒酵母细胞中高效表达，需将其与含有启动子和终止子的表达载体连接，构建重组质粒并导入酿酒酵母细胞中使之表达，实现利用酿酒酵母高效合成甘油的目的。 答案　(1)密码子(遗传密码)　琼脂糖　更换移液器枪头 (2)C (3)预冷的95%乙醇　D　调控基因转录 (4)基因数据库(序列数据库)　表达载体 考法1　RT­PCR、实时荧光定量PCR与反向PCR 情境资料1　实时荧光定量PCR简称qPCR，适用于新发传染病的快速筛查和诊断。在反应体系加入Taq man探针，Taq man探针两端连有荧光基团(R)和抑制荧光发出的淬灭基团(Q)，完整的Taq man探针不发出荧光，当探针被水解后R基团会发出荧光，随着循环次数的增加，荧光信号强度增加，通过实时检测荧光信号强度，可得Ct(每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数)值。 (3)一般来说确诊者出现症状时，Ct值和检测样本中病毒浓度较低还是较高？ 提示　一般来说确诊者出现症状时，Ct值较低，检测样本中病毒浓度较高。 1．(1)某种病毒的核酸是RNA，利用PCR扩增前，要使RNA形成cDNA，需要加入哪一种酶？ 提示　逆转录酶。 (2)qPCR过程中，Taq DNA聚合酶的两个作用分别是什么？ 提示　催化合成DNA子链；催化探针水解。 情境资料2　反向PCR是一种通过已知序列设计引物对未知序列进行扩增的技术，其过程如下图所示。 (3)上述PCR过程中使用了哪些酶？ 提示　限制酶、DNA连接酶和耐高温的DNA聚合酶。 2．(1)要扩增未知序列，应选择哪两种引物？ 提示　引物1和引物4。 (2)上述PCR产物是环状DNA分子还是链状DNA分子？ 提示　链状DNA分子。 1．RT­PCR：即逆转录PCR，是将RNA的逆转录(RT)和cDNA的聚合酶链式反应(PCR)相结合的技术。首先经逆转录酶的作用从RNA合成cDNA再以cDNA为模板，在DNA聚合酶的作用下扩增合成目的片段。 [提醒] 由于RNA不稳定，因此PCR不能直接扩增RNA；需要先将RNA逆转录得到cDNA，再进行PCR扩增。 2．实时荧光定量PCR(Taq man探针法)：指在PCR反应体系中加入荧光基团，通过连续监测荧光信号出现的先后顺序以及信号强弱的变化，即时分析目的基因的初始量，该技术的发明实现了PCR从定性到定量的飞跃。 (1)原理：探针完整时，报告荧光基团发射的荧光信号被淬灭荧光基团吸收，PCR扩增时，Taq DNA聚合酶的5′→3′外切酶活性将探针催化降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而使荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物的形成完全同步。 (2)荧光信号变化规律 ①早期：扩增产物较少，荧光信号不易检测到。 ②指数期：荧光值随循环次数增加呈指数增加。 ③线性期：荧光值随循环次数增加呈线性增加。 ④平台期：荧光值随循环次数增加几乎不增加。 (3)Ct值 Ct值是指PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的循环数。 如图，两个不同样品(样品1和2)DNA经过PCR扩增，得到的Ct值为Ct1和Ct2。 eq \x(因此，样品1中的DNA含量较样品2中的DNA含量多) 　　　　　　 eq \x(样品中DNA的含量越多，其Ct值就越小) 　　　　　　 eq \x(样品中DNA模板DNA的量与Ct值呈线性关系负相关) 　　　　　　 eq \x(根据样品扩增的Ct值就可以计算出样品所含的模板DNA量) [提醒] ①Taq DNA聚合酶作用：既可以在引物后延伸子链，也可以催化Taq man探针的降解。 ②Ct值：达到荧光检测线阈值的最小循环数，Ct值越小，原始模板数越多。 ③平台期：由于Taq man探针、引物、原料有限，荧光检测会出现平台期。 3．反向PCR：反向PCR是用反向的互补引物来扩增两引物以外的未知序列的片段，而常规PCR扩增的是已知序列的两引物之间的DNA片段。 (1)原理 ①酶切：选择已知序列内部没有切点的限制性内切核酸酶对该段DNA进行酶切； ②连接：用DNA连接酶使靶序列环化连接； ③扩增：用一对反向的引物进行PCR，其扩增产物将含有两引物外的未知序列。 (2)应用 通过反向PCR扩增已知序列两侧的未知序列，并可将仅知部分序列的全长cDNA进行分子克隆，建立全长的DNA探针。 [提醒] ①选择限制酶时，要保证其在已知序列内部没有限制酶切割位点。 ②选择引物时，要选择反向引物对相对于已知序列；若选择的是相向引物对，则扩增的是已知序列。 1．(2025·甘肃甘南期中)RT­PCR技术是反转录—聚合酶链式反应的简称，是指将RNA的反转录和cDNA的PCR相结合的技术。如图为RT­PCR技术过程示意图，据图分析，下列说法正确的是(　　) A．催化①②过程的酶都是DNA聚合酶 B．核酸酶H和③过程的作用结果相同 C．催化③⑤过程的酶都具有耐高温特性 D．④过程需要冷却至72 ℃左右 解析　①过程为逆转录过程，催化该过程的酶是逆转录酶；②过程DNA复制，催化该过程的酶是DNA聚合酶，A错误；核酸酶H和③过程的作用结果相同，都是将双链结构之间的氢键断开，B正确；③是变性，在高温条件下，DNA的双链打开，不需要酶的参与；⑤过程为延伸，所需的酶为Taq DNA聚合酶，该酶具有耐高温特性，C错误；④过程是复性，需要冷却至55 ℃左右，延伸是在70～75 ℃左右，D错误。 答案　B 2．(2025·福建厦门二模)实时荧光定量PCR是指在PCR反应体系中加入携带荧光基团的探针，利用荧光信号积累实时监测PCR反应进程的技术，可用于检测RNA病毒。提取病毒RNA，经逆转录形成cDNA，然后进行PCR，反应原理如下图所示。CT值表示PCR过程中荧光信号达到设定标准所需的循环次数。 下列叙述错误的是(　　) A．探针与cDNA单链的结合遵循碱基互补配对原则 B．耐高温的DNA聚合酶具有催化探针水解的作用 C．CT值越小，意味着提取到的病毒RNA含量越低 D．若病毒发生单个碱基的突变，可能不会影响检测结果 解析　探针中携带荧光基团，因而探针与cDNA单链的结合遵循碱基互补配对原则，A正确；结合题意可知，随着子链的延伸，探针与模板链的结合被破坏，进而发出荧光，因而推测，耐高温的DNA聚合酶具有催化探针水解的作用，B正确；CT值表示PCR过程中荧光信号达到设定标准所需的循环次数，CT值越小，说明达到设定标准需要的循环次数越小，因而意味着提取到的病毒RNA含量越高，C错误；若病毒发生单个碱基的突变，可能不会影响检测结果，因为单个碱基没有发生配对不会影响PCR进程，D正确。 答案　C 3．(2025·山西太原二模)反向PCR是一种用于扩增已知序列两侧的未知序列的技术，需要先将目标DNA进行环化，再以环化的DNA为模板进行扩增。现利用反向PCR技术来确定目的基因的插入位点，部分过程如下图所示，相关叙述正确的是(　　) A．过程②中根据目的基因两端的部分核苷酸序列设计引物2和3 B．过程③中复性是在72 ℃左右使两种引物与模板链结合 C．过程③所用的酶从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸 D．PCR第二轮循环即可获得两条链等长的未知序列 解析　反向PCR是扩增已知序列两侧的未知序列，过程②设计引物时，应根据已知序列(目的基因两侧的部分核苷酸序列)来设计引物1和4，而不是引物2和3，A错误；PCR过程中，复性的温度一般在55～60 ℃左右，而72 ℃左右是延伸的温度，所以过程③中复性不是在72 ℃左右，B错误；DNA聚合酶只能从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸，过程③PCR所用的酶也是从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸，C正确；PCR第一轮循环得到的两条DNA链长度不同，第二轮循环得到的DNA片段也都不等长，至少要到第三轮循环才可获得两条链等长的DNA片段，所以PCR第二轮循环不能获得两条链等长的未知序列，D错误。 答案　C 考法2　巢式PCR和不对称PCR (1)巢式PCR 巢式PCR是指先用1对引物在目的基因外侧完成PCR扩增，再以PCR产物为模板，根据其内部序列进一步设计一对新引物所做的PCR，如图所示： 巢式PCR中的第2轮扩增可减少或排除第1轮扩增中出现的非特异性扩增，是提高PCR扩增特异性常用的方法。 (2)不对称PCR 不对称PCR是在反应体系中只加入1种引物，只能扩增1条模板链。实际操作时，为了使模板量增加，也可以加1对引物扩增，只是这一对引物在浓度上有差异，例如(50～100)∶1，就主要用来扩增一条链。 1．(2025·山东济南多校名校联盟质量检测)不对称PCR是用一对含量不相等的引物来产生大量单链DNA(ssDNA)的技术。这两种引物一少一多，比例一般为1∶50～1∶100，分别称为限制性引物与非限制性引物。另外，限制性引物的退火温度与非限制性引物的退火温度不同，在最初的10～15个循环中使用较低的退火温度，随后将退火温度提高，从而产生大量单链ssDNA。下列说法错误的是(　　) A．最初的10～15个循环中DNA分子数将会以指数形式增长 B．非限制性引物的退火温度应低于限制性引物的退火温度 C．限制性与非限制性引物的比例和退火温度都可影响ssDNA的产量 D．所得ssDNA可通过电泳分离、回收，然后作为DNA探针使用 解析　PCR原理是DNA复制，最初的10～15个循环中，其扩增产物最初主要是双链DNA，DNA分子数将会以2n指数形式增长，A正确；在PCR反应的最初10～15个循环中，其扩增产物最初主要是双链DNA，但当限制性引物消耗完后，非限制性引物引导的PCR就会产生大量的单链DNA，结合题干信息“在最初的10～15个循环中使用较低的退火温度，随后将退火温度提高”，说明非限制性引物的退火温度应高于限制性引物的退火温度，B错误；单链DNA(ssDNA)的产生需要用一对含量不相等的限制性引物与非限制性引物，限制性引物的退火温度与非限制性引物的退火温度不同，因此限制性与非限制性引物的比例和退火温度都可影响ssDNA的产量，C正确；所得到的ssDNA为单链DNA，探针也是单链DNA，单链DNA和双链DNA的分子量不同，因此可通过电泳分离、回收ssDNA，然后作为DNA探针使用，D正确。 答案　B 2．(多选)(2025·江苏苏州大学附属中学月考)巢式PCR是一种特殊的聚合酶链式反应，使用两组不同的引物实现目标DNA片段的扩增。第一组外引物扩增出的DNA片段(中间产物)长度超出目标区域，第二组内引物称为巢式引物，其结合部位在中间产物内部的目标区域，从而扩增出目标产物，具体过程如图所示。有关叙述正确的是(　　) A．巢式PCR反应体系中所用的两组引物需先后加入 B．巢式PCR过程中反应温度最低的一步是复性阶段 C．若直接用内引物对模板DNA扩增，不易得到目标产物 D．巢式PCR获得的产物与常规PCR相比特异性更低 解析　巢式PCR通过两轮PCR反应，使用两套引物特异性地扩增DNA片段，第二对引物的功能是特异性地扩增位于首轮PCR产物内的一段DNA片段。 第一轮扩增中，外引物用以产生扩增产物，此产物在内引物的作用下进行第二轮扩增，从而提高反应的特异性，获得的产物特异性更强，利用内引物扩增在错误片段上进行引物配对并扩增的概率提高，所以巢式PCR反应体系中所用的两组引物需先后加入，A正确；PCR过程包括高温变性、低温复性、中温延伸，故巢式PCR过程中反应温度最低的一步是复性阶段，B正确；若直接用内引物对模板DNA扩增，则内引物与模板的非目标区域进行碱基互补配对的概率会上升， 不易得到目标产物，C正确；巢式PCR中加入的组分与常规PCR相同，都含有模板、引物、Taq酶(热稳定的DNA聚合酶)、dNTP(四种游离的脱氧核苷酸)、缓冲液、Mg2＋等，第一轮扩增中，外引物用以产生扩增产物，此产物在内引物的存在下进行第二轮扩增，从而提高反应的特异性获得的产物特异性更强，D错误。 答案　ABC 考法3　PCR定点诱变技术 情境资料1　在基因工程实践中，常用重叠延伸PCR技术。 (3)为获得大量目的基因序列，进行PCR3时应选择哪两种引物？ 提示　引物1和引物4。 1．(1)操作中哪些引物应含有拟突变位点？ 提示　引物2和引物3。 (2)进行PCR1和PCR2时，应分别选择哪些引物？ 提示　进行PCR1时需选择引物1和引物2，进行PCR2时需选择引物3和引物4。 情境资料2　瑞典科学家斯万特·帕博凭借对已灭绝古人类基因组和人类进化的发现荣获2022年诺贝尔生理学或医学奖。他在研究过程中使用了大引物PCR构建定点突变。基因定点突变的目的是通过定向改变基因内一个或少数几个碱基来改变多肽链上一个或几个氨基酸。大引物PCR定点突变常用来研究蛋白质结构改变导致的功能变化。单核苷酸的定点诱变仅需进行两轮PCR反应即可获得，第一轮加诱变引物和侧翼引物，第一轮产物作为第二轮PCR扩增的大引物，过程如图所示。 (3)与常规引物相比，大引物有何特点？ 提示　大引物特异性高。 2．(1)第一轮PCR所用的引物有哪些？ 提示　诱变引物和侧翼引物。 (2)第二轮PCR所用的引物除了侧翼引物外，还有大引物。该大引物是第一次PCR扩增产物中的①链还是②链？ 提示　②链。 1．利用重叠延伸PCR技术引入突变位点——在目的基因内部引入突变位点 重叠延伸PCR是发展最早的PCR定点突变技术。如下图所示，该技术要使用四条引物。其中引物2和3的突起处代表与模板链不能互补的突变位点，而这两条引物有部分碱基(包括突变位点)是可以互补的。因此，分别利用引物1和2，引物3和4进行PCR后，得到的DNA片段可以通过引物2和3互补的碱基杂交在一起，再在DNA聚合酶的作用下延伸，就能成为一条完整的DNA片段。最后，用引物1和4进行扩增得到含有突变位点的DNA片段。通过测序可检验定点突变是否成功。 2．利用大引物PCR技术引入突变位点——在目的基因内部引入突变位点 大引物PCR需要用引物进行两次PCR，其操作步骤如下：①根据目的基因序列设计引物，得到两个常规引物，分别为常规上游引物和常规下游引物；②根据突变碱基所处序列设计突变上游引物，突变位点位于突变引物序列的中间位置；③由突变上游引物与常规下游引物进行第一次PCR反应得到下游大引物；④用得到的下游大引物和另一个常规上游引物进行第二次PCR扩增，得到突变目的基因序列。 1．(2025·四川眉山三模)t­PA 蛋白能高效降解血栓，是心肌梗死和脑血栓的急救药。然而，为心肌梗死患者注射大剂量的 t­PA会诱发颅内出血。研究证实，将 t­PA 蛋白第 84 位的氨基酸替换后，能显著降低出血副作用。请回答下列问题： (1)改造t­PA 基因序列可以利用如图 1 、2 所示的基因定点突变技术。图 1 表示重叠延伸 PCR 技术，其中第 1 对引物是指______，两对引物参与的 PCR过程不能在同一反应系统中进行，原因是______________________________。不选择产物 A 进一步延伸的原因是_____________________________________。 (2)图 2 表示 CBE 单碱基编辑系统，该系统由三个元件构成，其中“dCas9 蛋白＋胞苷脱氨酶”在 sgRNA的引导下，对结合区域第 4­8 位点的碱基 C 脱氨反应变成 U ，最终实现 C→T 的不可逆编辑。过程②______(填“发生”或“未发生”)磷酸二酯键的断裂和形成。CBE 单碱基编辑系统将靶位点胞嘧啶脱氨基后，细胞复制______次，子代 DNA 中靶位点碱基对由C—G 彻底替换成 A—T ，实现单碱基编辑。 (3)图3分别表示通过基因定点突变技术获得并酶切后的t­PA 改良基因、质粒 pCLY11与一些限制酶的识别序列和酶切位点。要想将t­PA 改良基因与质粒 pCLY11 高效连接，需用限制酶______切割质粒。 图3 解析　(1)第一对引物扩增右边一段DNA且对中间部分进行突变，因此第一对引物为突变引物 FP2 和通用引物 RP2；突变引物 FP2 和突变引物 RP1 之间能碱基互补配对，会造成引物形成双链，不能与模板链结合，降低扩增的效率；DNA 子链只能从引物的 3′端延伸，与产物 A 的方向相反，因此不选择产物 A 进一步延伸。 (2)CBE系统利用dCas9蛋白和胞苷脱氨酶将目标DNA序列中的胞嘧啶(C)转化为尿嘧啶(U)，不涉及DNA链断裂，因此过程②未发生磷酸二酯键的断裂和形成；由于U在DNA复制过程中被识别为胸腺嘧啶(T)，因此经过一次DNA复制后，形成两个DNA且对应位点配对为U—A、G—C，经过两次DNA复制后，产生的四个DNA为U—A、A—T、G—C、C—G，因此经过2次复制后，靶位点碱基对由C—G彻底替换成A—T，实现单碱基编辑。 (3)结合t­PA 改良基因两侧的黏性末端，质粒应选择XmaⅠ 、Bgl Ⅱ进行切割，以产生相同的黏性末端，便于连接，形成重组质粒。 答案　(1) 突变引物 FP2 和通用引物 RP2　突变引物 FP2 和突变引物 RP1 之间能碱基互补配对，会造成引物形成双链，不能与模板链结合，降低扩增的效率　DNA 子链只能从引物的 3′端延伸，与产物 A 的方向相反 (2)未发生　2　 (3)Xma Ⅰ、BglⅡ 2．(2025·四川成都三模)“生物钢”是一种蛛丝蛋白，其强度是钢的45倍，且有蚕丝般的柔软和光泽，在纺织、医疗等多领域具有广阔的应用前景。科学家从蜘蛛中获取蛛丝蛋白基因并将其植入山羊体内，使得羊奶中含有蛛丝蛋白，再利用特殊的纺丝技术，将羊奶中的蛛丝蛋白纺成丝。回答以下问题： 注：①图1为蛛丝蛋白基因DNA片段结构示意图；②图2是基因工程中所使用的载体示意图，图中KpnⅠ、XbaⅠ、EcoR Ⅰ均表示相应限制酶识别位点；③蛛丝蛋白基因转录的模板链位于b链(图3中标识b链碱基序列)。 (1)为使目的基因与载体正确连接，利用PCR技术获取和扩增蛛丝蛋白基因时所需要的两种引物的序列分别为________、________(注意标明5′端和3′端)。 (2)若要构建A山羊乳腺生物反应器，则受体细胞常选择________，同时结合基因表达载体结构组成分析，载体中P应为_______________，其功能是________________________________。 (3)研究人员发现，若将蛛丝蛋白31号位的色氨酸替换为酪氨酸(注：色氨酸的密码子为UGG；酪氨酸的密码子为UAC和UAU)；蛛丝韧性可提高50%。研究人员欲利用大引物PCR技术对蛛丝蛋白基因进行定点诱变(过程见图3)，则拟突变位点对应的基因结构为________(标明5′端和3′端)。第一次PCR的产物DNA中碱基序列与b链________(填“相同”或“互补”)的链作为第二次PCR所用的引物。与X射线诱变相比，该突变技术的优点是________(答出一点即可)。 解析　(1)结合DNA结构可知—OH所在一端为3′端，— (2)乳腺生物反应器的受体细胞常选择受精卵，为保障蛛丝蛋白基因在乳腺细胞中表达，需要在基因表达载体中添加乳腺中特异表达的基因的启动子，该启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动蛛丝蛋白基因在乳腺细胞中转录出mRNA。 (3)科研人员欲将蛛丝蛋白31号位的色氨酸替换为酪氨酸，以达到提高蛛丝蛋白韧性的目的，由于色氨酸的密码子为UGG，酪氨酸的密码子为UAC和UAU，因此拟突变位点对应的基因结构为eq \b\lc\ \rc\ (\a\vs4\al\co1(5′­GG­3′a链,3′­CC­5′b链))；引物碱基序列与母链3′端碱基序列互补，即大引物的碱基序列与a链碱基3′­TA­5′b链序列互补，a链碱基序列又与b链碱基序列互补，故大引物与b链5′端碱基序列相同。大引物PCR技术对蛛丝蛋白基因的诱变属于定点诱变，具有目的性强、突变概率高等特点。 答案　(1)5′­TCTAGACTTGGATGAT­3′ 5′­GGTACCTCTGTTGAAT­3′ (2) 受精卵　乳腺中特异表达的基因的启动子(乳腺特异性启动子)　作为RNA聚合酶识别和结合部位，驱动(蛛丝蛋白)基因(在乳腺细胞中)转录出mRNA，最终表达出人类需要的蛋白质 (3)eq \b\lc\ \rc\ (\a\vs4\al\co1(5′­GG­3′a链,3′­CC­5′b链))　相同　目的性强(定向突变)、突变概率高 $