专题8 大题突破(五) 生物技术与工程类(Word教参)-【精讲精练】2026年高考生物二轮专题辅导与训练（B版）

该高中生物学讲义聚焦基因工程核心考点，涵盖基因表达载体构建、PCR技术、限制酶选择等高考重点，按“原理-操作-应用”逻辑梳理知识联系。通过考点精讲、方法归纳、真题解析及分层练习，系统帮助学生突破难点，提升复习针对性。 讲义以科学思维和探究实践为导向，创新采用“真题情境问题链”教学，如结合酵母双杂交实验分析蛋白质相互作用，培养学生逻辑推理能力。设置基础巩固与能力提升分层训练，配合即时反馈，高效提升学生应考能力，为教师把控复习节奏提供清晰指引。

(2025·山东卷)种子休眠是抵御穗发芽的一种机制。通过对Ti质粒的改造，利用农杆菌转化法将Ti质粒上的T－DNA随机整合到小麦基因组中，筛选到2个种子休眠相关基因的插入失活纯合突变体。与野生型相比，突变体种子的萌发率降低。小麦基因组序列信息已知。 注：LB/RB表示T－DNA的边界序列；Kanr表示卡那霉素抗性基因；bp表示碱基对 甲　Ti质粒与抗除草剂基因信息 (1)Ti质粒上与其在农杆菌中的复制能力相关的结构为________。选用图甲中的SmaⅠ对抗除草剂基因X进行完全酶切，再选择SmaⅠ和______对Ti质粒进行完全酶切，将产生的黏性末端补平，补平时使用的酶是________。利用DNA连接酶将酶切后的包含抗除草剂基因X的片段与酶切并补平的Ti质粒进行连接，构建重组载体，转化大肠杆菌；经卡那霉素筛选并提取质粒后再选用限制酶________进行完全酶切并电泳检测，若电泳结果呈现一长一短2条带，较短的条带长度近似为______bp，则一定为正向重组质粒。 (2)为证明这两个突变体是由T－DNA插入小麦基因组中同一基因导致的，提取基因组DNA，经酶切后产生含有T－DNA的基因组片段(图乙)。在此酶切过程中，限于后续PCR难以扩增大片段DNA，最好使用识别序列为______(填“4”“6”或“8”)个碱基对的限制酶，且T－DNA中应不含该酶的酶切位点。需首先将图乙的片段________，才能利用引物P1和P2成功扩增未知序列。PCR扩增出未知序列后，进行了一系列操作，其中可以判断出2条片段的未知序列是否属于同一个基因的操作为________(填“琼脂糖凝胶电泳”或“测序和序列比对”)。 注：P1、P2表示引物 乙　基因组DNA酶切后含T－DNA的片段 (3)通过农杆菌转化法将构建的含有野生型基因的表达载体转入突变植株，如果检测到野生型基因，________(填“能”或“不能”)确定该植株的表型为野生型。 [解题路径] 1．涉及必备知识：基因表达载体的组成和构建、PCR操作及应用。 2．涉及题干新知：种子休眠与基因表达的关系限制酶的作用位点。 3．分析解题过程：根据SmaⅠ限制酶识别序列可知，酶切形成的是平末端，若质粒仅用SmaⅠ酶切，抗除草剂基因和质粒可以正向接入也可以反向接入，且无法区分，为了确定是否是正向重组质粒，因此在构建重组质粒时需要用到另一种限制酶，抗除草剂因需要插入到启动子和终止子之间，因此不能选择BamHⅠ，因为该限制酶会破坏终止子，因此可选择XbaⅠ和SmaⅠ进行酶切，XbaⅠ酶切会形成黏性末端，需要用DNA聚合酶聚合脱氧核糖核苷酸单体将产生的黏性末端补平(可使重组质粒最小，同时PstⅠ酶切后产生的黏性末端无法用DNA聚合酶抹平，因为DNA聚合酶只能从3′延伸子链)。利用DNA连接酶将酶切后的包含抗除草剂基因X的片段与酶切并补平的Ti质粒进行连接，构建重组载体，转化大肠杆菌。重组的T－DNA片段上含有一个SmaⅠ酶切位点和一个SpeⅠ酶切位点，可以选择用SmaⅠ和SpeⅠ进行酶切，转录的方向是从模板的3′→5′，和质粒对应的方向相同，经过两种酶的酶切后并电泳呈现一长一短2条带，较短的条带长度近似为550 bp，若反向接，较短的条带长度近似为200 bp。 [满分答案] (1)复制原点　XbaⅠ　DNA聚合酶　SmaⅠ和SpeⅠ　550　(2)4　环化　测序和序列比对 (3)不能 [提分规则] (1)重视实验结果的分析，实验结果无论哪种呈现形式，都要遵循单一变量原则分析问题。 (2)重视推测、作用、原因等长句设问表述，推测找准依据，作用要表述到位，原因要注意理清完整的逻辑链。 1．透析图表 (1)审图思路 基因工程考题常涉及引物、限制酶的选择及相关的原理分析： Ⅰ.引物的选择及应用 ①设计引物时需要避免引物之间碱基互补配对而造成引物自连。 ②书写引物序列，一般从引物的5′端向3′端书写，避免误判。 ③添加酶切位点，构建基因表达载体：将真核生物基因导入原核生物质粒中构建基因表达载体，常需要在真核生物目的片段两端加上限制酶识别序列。子链延伸从引物3′端开始，一般不对引物3′端进行修饰，限制酶切割位点应加在5′端。 Ⅱ.限制酶的选择原则 ①首先要确保目的基因和质粒上有所选酶的切割位点；其次应选择切割位点位于目的基因上、下游的限制酶，以及切割位点位于启动子、终止子之间的酶。如图b可选择EcoR Ⅰ或BamH Ⅰ和Hind Ⅲ，图a中可选择EcoR Ⅰ和Sau3A Ⅰ。 ②不能选择切割位点位于目的基因内部的限制酶，也不可以选择切割位点位于质粒中启动子、终止子、标记基因、复制原点内部的限制酶，如图b不能选择Sma Ⅰ。 ③为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图b可选择用BamH Ⅰ和Hind Ⅲ两种限制酶进行切割。 ④注意转录方向正确，如图b不能选择EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ。 (2)思维解读 第一步 第二步 第三步 观察图示细节，寻找切入点 联系已知，定位关键点 联系模型构建，确定答题点 2.解码长句 本块考查的试题常设置原因分析、依据反推和机理分析等问题，频繁出现的考题形式是给出某一现象或结果，要求回答出现这些现象(或结果)的事实或理论支撑。解题思路是在题干中找“现象”(因)和“结果”(果)，然后基于所学的生物学原理向前反推导致该“结果”的可能原因，关键点是需形成完整的逻辑链条，逻辑链条不能跳跃。 答题时注意下面技巧： (1)选择一个合理的逻辑构架 ①链式逻辑：有逻辑的起点和终点，在起点和终点中间找到关键词来构建完整的一句话。 ②三段论逻辑：这是逻辑学中最重要的方法，包括以教材为依托的大前提和以题干中的信息为主干的小前提，进而推出相应的结论。 ③比较逻辑：实验中的原因解释一般通过比较两种不同实验变量得到结论。 ④反证逻辑：实在找不到逻辑的题目，不能用上述方法来完成逻辑推理，就需要用硬证法固定的语句“只有……才能……”或者用反证法固定的语句“若非……则是…… ”。 (2)使用恰当的关键词 ①教材中的专有名词；②题目中的专有名词。 (3)答题模板 1．(2025·山东济宁期中)研究两种蛋白质(如 X 和 Y) 能否相互作用常用酵母双杂交技术 。BD 和 AD 是构成 GAL4转录因子的两个独立结构域，X 和 Y 能相互作用时，BD 和 AD 在空间上才能靠近，形成完整的 GAL4 转录因子， 激活酵母菌报告基因的转录(如图甲所示) 。酵母菌生存所必需的四种营养物质——组氨酸 、色氨酸 、亮氨酸 、腺嘌呤， 分别由 His3 、Trp1 、Leu2 和 Ade2 四种基因控制合成 。科研人员用酵母双杂交技术探究植物中的 WRKY17 蛋白能否与 MPK3 蛋白相互作用。用于实验的酵母菌经过基因改造后不能产生 GAL4 转录因子，也不能合成上述四种营养物质。BD 质粒上携带 Trp1基因，AD 质粒上携带 Leu2 基因。 (1)首先利用PCR 分别获取 MPK3 和 WRKY17 两种目的基因，设计引物时常需添加保护碱基以提高酶切效率， 保护碱基最好添加在引物的______(填“ 3′端 ”或“ 5′端”) 。然后分别将 MPK3 基因和WRKY17 基因拼接到 BD 和 AD 质粒上。 (2)将不同类型的质粒导入酵母菌进行双杂交实验， 结果如图乙所示。 Ⅰ.四组酵母菌均可在只缺少亮氨酸和色氨酸的培养基上生长，说明__________。该实验的报告基因为__________。 Ⅱ.结果显示 WRKY17 与 MPK3____________(填“能”或“不能”)相互作用， 判断理由是__________________________________。 Ⅲ.设置实验组②的目的是__________________________________。 解析　(1) 由于PCR过程中在合成子链DNA时是从5′端向3′端延伸的，保护碱基添加在5′端不会影响PCR扩增的效率；Mg2＋能够激活耐高温的DNA聚合酶，从而提高PCR反应的效率和特异性，故PCR反应缓冲液中一般要添加。然后分别将 MPK3 基因和WRKY17 基因拼接到 BD 和 AD 质粒上。 (2)Ⅰ.题意显示，酵母菌中的His3、Trp1、Leu2和Ade2四个基因分别合成组氨酸、色氨酸、亮氨酸、腺嘌呤等生存必需的营养物质，而四组酵母菌均可在只缺少亮氨酸和色氨酸的培养基上生长，说明两种质粒均转入酵母菌并成功表达Trp1和Leu2基因，且酵母菌能够利用质粒上的Trp1和Leu2基因合成色氨酸和亮氨酸；分析题意，只有当GAL4转录因子形成时，His3和Ade2基因才会被激活，酵母菌才能在缺少对应氨基酸的培养基上生长，故该实验的报告基因为His3和Ade2。 Ⅱ.只有第④组酵母菌能在四缺培养基上生长，说明His3和Ade2这两个报告基因成功表达，WRKY17与MPK3可以相互作用。 Ⅲ.实验组②中添加AD和MPK3­BD，目的是排除AD与MPK3的相互作用。 答案　(1)5′端 (2)Ⅰ.两种质粒均转入酵母菌并成功表达Trp1和Leu2基因，合成色氨酸和亮氨酸　His3和Ade2　Ⅱ.能　只有第④组酵母菌能在四缺培养基上生长，说明His3和Ade2这两个报告基因成功表达，WRKY17与MPK3可以相互作用 Ⅲ.排除AD与MPK3的相互作用 2．(2025·天津河西一模)中国“干扰素之父”侯云德院士于1982年成功研发我国第一个基因工程创新药物—干扰素。干扰素是一种白细胞产生的具有抗病毒能力的分泌蛋白。研究人员从感染病毒的鸡白细胞提取全基因组mRNA，利用PCR技术获取鸡干扰素基因，图1表示鸡干扰素蛋白有关的基因片段，序号①～④表示引物。然后将获取的目的基因连接在大肠杆菌的pET32a质粒(5900 bp，注：bp表示碱基对)上，图2表示pET32a质粒及其上部分限制酶切割位点。最后将重组质粒导入大肠杆菌后获得成熟干扰素。 (1)利用鸡白细胞中mRNA获得干扰素蛋白基因，需要在________酶的作用下先合成相应的DNA片段。图1表示成熟干扰素蛋白序列及其前端的信号肽序列，信号肽是分泌蛋白合成过程中开始合成的一段肽链，其在干扰素合成中的作用是引导游离的核糖体转移到________上继续肽链的合成。 (2)为了获取不含信号肽序列的干扰素基因，在进行PCR扩增时需要用到的一对引物是________，为了将目的基因准确连接到pET32a质粒上需要在目的基因的两端添加________两种限制酶的序列。PCR扩增过程除了引物，还需要的条件有4种游离的脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶和________等。 (3)为了检测目的基因是否插入pET32a质粒，利用目的基因两端添加的限制酶切割质粒，然后对产物进行电泳，结果如图3，样品________最可能是插入了目的基因的重组质粒。 解析　(1)利用鸡白细胞中mRNA获得干扰素蛋白基因，需要经过RNA变成相应的DNA逆转录过程，需要逆转录酶的作用下先合成cDNA。图1表示成熟干扰素蛋白序列及其前端的信号肽序列，信号肽是分泌蛋白合成过程中开始合成的一段肽链，指导新生的多肽链和核糖体与内质网膜结合，使蛋白质的合成和加工在粗面内质网上进行，所以其在干扰素合成中的作用是引导游离的核糖体转移到内质网上继续肽链的合成。 (2)为了获取不含信号肽序列的干扰素基因，在进行PCR扩增时需要用到的一对引物是②④，其他引物会导致含信号肽序列的干扰素基因的合成，为了将目的基因准确连接到pET32a质粒上，需要在目的基因两端添加可以与质粒酶切位点互补的限制酶识别序列，需要在目的基因的两端添加EcoRⅠ、XhoⅠ限制酶的序列，PCR扩增过程除了引物，还需要的条件有相应的模板；原料是4种游离的脱氧核苷酸(dNTP)；耐高温的DNA聚合酶；含Mg2＋缓冲液。 (3)为了检测目的基因是否插入pET32a质粒，利用目的基因两端添加的限制酶切割质粒，然后对产物进行电泳，结果如图3，因为一个切割位点只会将环状的质粒切割成一条线性的DNA，有两个切割位点才能切成2条片段，根据题图分析EcoRⅠ、XhoⅠ可以把重组质粒切成约500 bp和5800 bp的两个片段，所以样品2最可能是插入了目的基因的重组质粒。 答案　(1) 逆转录　内质网 (2)②④　EcoRⅠ、XhoⅠ　模板、含Mg2＋缓冲液 (3)2 3．(2025·黑龙江哈尔滨二模)杜鹃花园艺品种在炎热夏季常出现高温热害症状，RhRCA1基因编码的蛋白质能恢复光合酶部分活性。科研人员从耐热性好的海南杜鹃中获取了RhRCA1基因启动子(prRCA1)并构建了基因表达载体prRCA1­LUS(荧光素酶基因)，为研究其调控机制提供了依据，请回答下列问题： (1)可用__________试剂对从海南杜鹃中提取的DNA进行初步鉴定。prRCA1的作用是________________________________________________________________________________________________________________________________________________。 (2)prRCA1内部有限制酶SpeⅠ的识别序列，所用载体示意图如图，图中载体还缺少的组成元件是__________，构建prRCA1­LUS表达载体过程中需用到限制酶和__________ 酶，应选择限制酶__________对质粒进行切割。设计引物对prRCA1进行PCR扩增时，限制酶的识别序列应加在引物的__________端。已知转录时非模板链的碱基序列为5′­CTACTACCAAGCACCTCCGC……(多个碱基)……AACAGACCCTTGATTTCT­3′，若引物a与prRCA1转录时的模板链互补，请写出引物a的前10个碱基的序列5′­__________­3′。 (3)据图可知，将prRCA1基因转入拟南芥(一种植物)叶片中所用方法为__________法。2 d后分别进行25 ℃和37 ℃处理3 h。在叶片反面涂抹萤火虫荧光素后发现，高温37 ℃热胁迫处理后的拟南芥叶片荧光强度显著高于对照25 ℃，说明_____________________________ __________________________________________________________________(答出一点)。 (4)将转化后收获的拟南芥种子消毒后播种在含有物质__________的培养基中，以筛选抗性苗。后发现第二代植株中抗性分离比为3∶1，说明目的基因最可能插入了________(填“一对同源染色体中的1条”或“两对同源染色体中的1条”)上。 解析　(1)可用二苯胺试剂对从海南杜鹃中提取的DNA进行初步鉴定，prRCA1作为启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA，最终表达出人类需要的蛋白质。 (2)图中载体还缺少的组成元件是复制原点，构建prRCA1­LUS表达载体过程中需用到限制酶和DNA连接酶，由于prRCA1内部含SpeⅠ位点，应选择不切开prRCA1内部的限制酶，如Hind Ⅲ和Nco Ⅰ对质粒进行切割。在设计引物时，限制酶识别序列一般加在引物5′端。给出的非模板链5′­CTACTACCAAGCAC…­3′，其模板链互补序列为3′­GATGATGGTT…­5′。若引物a与模板链配对，则引物a(5′→3′)前10个碱基应与非模板链相同，为5′­AAGCTTCTAC­3′。 (3)据图可知，将目的基因导入拟南芥叶片最常用的方法是农杆菌转化法。高温37 ℃下荧光增强，说明prRCA1能够驱动LUS基因表达，具有启动子活性；而且prRCA1能够响应高温胁迫，是热诱导型启动子。 (4)基因载体带有草氨磷抗性基因，故应在含草氨磷的培养基上筛选转基因植株。第二代植株中出现3∶1的抗性分离比，说明目的基因最可能插入在一对同源染色体中的1条上。 答案　(1) 二苯胺　RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA，最终表达出人类需要的蛋白质 (2)复制原点　DNA连接　Hind Ⅲ和Nco Ⅰ　5′　AAGCTTCTAC (3)农杆菌转化　prRCA1能够驱动LUS基因表达，具有启动子活性；而且prRCA1能够响应高温胁迫，是热诱导型启动子 (4)草氨膦　一对同源染色体中的1条 学科网（北京）股份有限公司 $