2026届高三生物一轮复习课件23 重组DNA技术的基本工具

该高中生物学高考复习课件聚焦基因工程工具及DNA粗提取鉴定核心考点，依据高考评价体系梳理限制酶作用、载体条件等高频考点，通过近五年真题分析明确"工具酶比较""载体筛选"等占比超60%的考查重点，归纳选择、填空等常考题型，体现备考针对性。 课件亮点在于真题训练与素养融合，如结合2019江苏卷真题解析DNA提取实验易错点，通过限制酶与DNA连接酶对比培养科学思维，提供标记基因筛选等答题模板，助力学生掌握得分技巧，教师可据此精准突破考点，提升复习效率。

1 3.1 基因工程（一） ——重组DNA技术的基本工具 1 基因工程 1944年艾弗里等人证明了DNA可以在同种生物的不同个体之间转移。 1950年埃特曼发明了一种测定氨基酸序列的方法。 1958年梅塞尔森和斯塔尔用实验证明了DNA的半保留复制。 1953年沃森和克里克建立了DNA双螺旋结构模型。 1961年尼伦伯格和马太破译了第一个编码氨基酸的密码子。 1967年，科学家发现，在细菌拟核DNA之外的质粒有自我复制能力，并可以在细菌细胞间转移。 1970年科学家在细菌中发现了第一个限制性内切核酸酶（简称限制酶）。 20世纪70年代初，多种限制酶、DNA连接酶和逆转录酶被相继发现。 1972年，伯格成功构建了第一个体外重组DNA分子。 1973年，证明质粒可以作为基因工程的载体，构建重组DNA，导入受体细胞，使外源基因在原核细胞中成功表达，基因工程正式问世。 1977年，桑格等科学家发明了DNA序列分析的方法。此后，DNA合成仪的问世为体外合成DNA提供了方便。 1982年，第一个基因工程药物-重组人胰岛素被批准上市。 1983年，科学家采用农杆菌转化法培育出世界上第一例转基因烟草。 1984年，我国科学家朱作言领导的团队培育出世界上第一条转基因鱼。 1985年，穆里斯等人发明了PCR。 1990年，人类基因组计划启动。2003年完成 21世纪以来，科学家发明了多种高通量测序技术，加速了人们对基因组序列的了解。 2013年，华人科学家张锋及其团队首次报道利用最新的基因组编辑技术编辑了哺乳动物基因组。该技术可以实现对特定基因的定点插入、敲除或替换。 基因工程发展历程 基因工程 　　指按照人们的愿望，进行严格的设计并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫作DNA重组技术。 工程别名： 操作对象： 操作水平： 工程实质： 操作环境： DNA重组技术 基因 DNA分子水平 基因重组 什么是基因工程？ 【归纳定义】 生物体外 DNA的基本组成单位相同(都是四种脱氧核苷酸) 都遵循碱基互补配对原则 DNA分子的空间结构都是规则的双螺旋结构 基因是控制生物性状的结构与功能单位 遗传信息传递都遵循中心法则 生物界几乎共用一套遗传密码 基因工程的理论基础 1. 为什么不同生物的DNA分子能拼接起来？ 2. 为什么一种生物的基因可以在另一种生物细胞内表达？ DNA RNA 蛋白质 转录 翻译 复制 “分子手术刀” 准确切割DNA分子 “分子缝合针” “分子运输车” 将DNA片段连接起来 将体外重组好的DNA分子导入受体细胞 基因工程的基本工具 (2) 主要来源： 主要是从原核生物中分离纯化出来的。 全称——限制性内切核酸酶 简称——限制酶 1 限制性内切核酸酶——“分子手术刀” (1) 全称和简称 你能推测限制酶存在于原核生物中的作用是什么吗？ 原核生物易受自然界外源DNA的入侵 防御工具:限制酶 当外源DNA侵入时，会利用限制酶将外源DNA切割掉，以保证自身的安全。 (2) 主要来源： 主要是从原核生物中分离纯化出来的。 全称——限制性内切核酸酶 简称——限制酶 1 限制性内切核酸酶——“分子手术刀” (1) 全称和简称 为什么限制酶不剪切细菌本身的DNA？（P74拓展应用1） 不存在识别序列：细菌中含有某种限制酶的细胞，其DNA分子中不具备这种限制酶的识别切割序列； 识别序列被修饰：如通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。 (2) 主要来源： 主要是从原核生物中分离纯化出来的。 全称——限制性内切核酸酶 简称——限制酶 能识别双链 DNA 分子的特定核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的 断开。 大肠杆菌的EcoRⅠ限制酶只能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开。 黏性末端 黏性末端 1 限制性内切核酸酶——“分子手术刀” (1) 全称和简称 (3) 作用： 磷酸二酯键 (2) 主要来源： 主要是从原核生物中分离纯化出来的。 全称——限制性内切核酸酶 简称——限制酶 能识别双链 DNA 分子的特定核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的 断开。 大肠杆菌的EcoRⅠ限制酶只能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开。 黏性末端 黏性末端 1 限制性内切核酸酶——“分子手术刀” (1) 全称和简称 (3) 作用： 磷酸二酯键 (4) 种类与命名 现在已经从约300种微生物中分离出了约4000种限制性内切核酸酶。 流感嗜血杆菌的d菌株( Haemophilus influenzae d )中先后分离到3种限制酶，则分别命名为:____________________________ Hind Ⅰ、Hind Ⅱ、 Hind Ⅲ 资料卡： 限制酶的命名：用生物属名的头一个字母与种加词的头两个字母，组成了3个字母的略语，以此来表示这个酶是从哪种生物中分离出来的。例如，一种限制酶是从大肠杆菌( Escherichia coli)的R型菌株分离来的，就用字母EcoR表示；如果它是从大肠杆菌R型菌株中分离出来的第一种限制酶，则进一步表示成EcoR I。 粘质沙雷氏杆菌（Serratia marcesens）中分离的第一种限制酶即_______ Sma Ⅰ 1 限制性内切核酸酶——“分子手术刀” 练习： 大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成，也有少数限制酶的识别序列由4个、8个或其他数量的核苷酸组成。 EcoR Ⅰ 5’…G-A-A-T-T-C…3’ 3’…C-T-T-A-A-G…5’ Sma Ⅰ 5’…C-C-C-G-G-G…3’ 3’…G-G-G-C-C-C…5’ BamH Ⅰ 5’…G-G-A-T-C-C…3’ 3’…C-C-T-A-G-G…5’ Taq Ⅰ 5’……T-C-G-A……3’ 3’……A-G-C-T……5’ 限制酶所识别的序列的特点是：呈现碱基互补对称，无论是6个碱基还是4个碱基，都可以找到一条中心轴线，中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的，称为回文序列。 在切割部位，一条链正向读的碱基顺序与另一条链反向读的顺序完全一致。 1 限制性内切核酸酶——“分子手术刀” (5) 识别序列： 【拓展】 1 限制性内切核酸酶——“分子手术刀” (6) 切割结果： 　 黏性末端　　　　 黏性末端 只能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开。 被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，他们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。 EcoR I限制酶的切割： 限制酶　　 1 限制性内切核酸酶——“分子手术刀” (6) 切割结果： Sma I限制酶的作用： 只能识别CCCGGG序列，并在C和G之间切开。 平末端　　　平末端 当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开的DNA两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫平末端。 限制酶　　 当限制酶在它识别序列的中轴线两侧将DNA分子的两条链分别切开时，产生的是黏性末端； 当限制酶在它识别序列的中轴线处切开时，产生的是平末端； EcoR Ⅰ 中轴线 黏性末端 平末端 Sma Ⅰ 1 限制性内切核酸酶——“分子手术刀” (6) 切割结果： 现学现用：写出下列限制酶切割形成的黏性末端 BamH Ⅰ________ EcoR Ⅰ________ Hind Ⅲ________ Bgl Ⅱ ________ GATC AATT AGCT GATC 你从中发现什么现象？ 不同的限制酶可能切割形成相同的黏性末端 1 限制性内切核酸酶——“分子手术刀” 练习 1.下面哪项不具有限制酶识别序列的特征（ ） A．GAATTC B．GGGGCCCC CTTAAG CCCCGGGG C．CTGCAG D．CTAAATC GACGTC GATTTAG D ①…CTGCA …G ②…G …CTTAA ③ G… ACGTC… ④ AATTC… G… A. ①③；②④ B. ①②；③④ C. ①④；②③ D.以上都不对 2.下面哪两个可能是由同一个限制酶切开的黏性末端？ 要破坏4个磷酸二酯键，产生4个黏性(平)末端。 会产生相同的黏性(平)末端 缺口怎么办？ C G G C C G T T A A A A T T G C T A T A 1 限制性内切核酸酶——“分子手术刀” 用限制酶获得某个特定性状的目的基因，需要破坏几个磷酸二酯键？可产生几个黏性(平)末端？ 如果把两种来源不同的DNA用同种限制酶来切割，会怎样？ 可以进行碱基互补配对 将两个DNA片段连接起来，恢复被限制酶切开的磷酸二酯键。 2 DNA连接酶—“分子缝合针” (1) 作用： 注意：不是连接氢键（氢键的形成不需要酶的催化）。 (2) 种类： E·coli DNA连接酶 T4 DNA连接酶 大肠杆菌 T4噬菌体 可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，即恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。 E·coli DNA连接酶或T4DNA连接酶连接粘性末端 2 DNA连接酶—“分子缝合针” (3) 缝合作用： DNA连接酶　　 2 DNA连接酶—“分子缝合针” E·coli DNA连接酶或T4DNA连接酶连接粘性末端 (3) 缝合作用： E·coli DNA连接酶和T4 DNA连接酶可把平末端之间的缝隙“缝合”起来，E·coli DNA连接酶效率低 DNA连接酶　　 种类 E·coli DNA连接酶 T4 DNA连接酶 来源 功能特性 相同点 大肠杆菌 T4噬菌体 能将具有互补黏性末端的DNA片段连接起来，可以连接双链DNA片段的平末端（但连接平末端的效率比T4 DNA连接酶低） 既可以连接双链DNA片段互补的黏性末端，又可以连接双链DNA片段的平末端（但连接平末端的效率相对较低） 恢复的都是磷酸二酯键 2 DNA连接酶—“分子缝合针” E·coli DNA连接酶与T4 DNA连接酶比较 2 DNA连接酶—“分子缝合针” DNA连接酶和DNA聚合酶是一回事吗？ DNA聚合酶 DNA聚合酶 DNA聚合酶 DNA聚合酶 DNA聚合酶 A A T T G A A T T A A T T C DNA连接酶 DNA聚合酶 相同点 作用实质 化学本质 不 同 点 模板 作用对象 作用结果 用途 都能催化形成磷酸二酯键 都是蛋白质 不需要 需要DNA的一条链作模板 形成完整的重组DNA分子 形成DNA的一条链 基因工程 DNA复制 只能将单个核苷酸连接到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯键 在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键 2 DNA连接酶—“分子缝合针” DNA连接酶与DNA聚合酶的比较 名称 作用部位 底物 作用结果 限制酶 磷酸二酯键 DNA 将DNA切成两个片段 DNA连接酶 磷酸二酯键 DNA片段 将两个DNA片段连接为一个DNA分子 DNA聚合酶 磷酸二酯键 脱氧核苷酸 将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端 DNA(水解)酶 磷酸二酯键 DNA 将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸 解旋酶 碱基对之间的氢键 DNA 将双链DNA分子局部解旋为单链，形成两条长链 2 DNA连接酶—“分子缝合针” 与DNA分子相关的几种酶的比较 b 根据所学知识，完成以下填空： ①限制酶 ②解旋酶 ③DNA连接酶 ④DNA聚合酶 A.切断a处的酶为_______ B.连接a处的酶为_______ C.切断b处的酶为_______ ① ③④ ② a：磷酸二酯键；b：氢键 2 DNA连接酶—“分子缝合针” a 2 DNA连接酶—“分子缝合针” …TATCGTACGATAGGTACTTAA …ATAGCATGCTATCCATG AATTCGGCATAC… GCCGTATG… …TCCTAG …AGGATCTTAA GAGCCATACTTAA AATTCTCGGTATG AATTCCATAC… GGTATG… GAGCCATACTTAA AATTCTCGGTATG 实践活动二：用剪刀模拟EcoRⅠ剪切质粒，用胶带模拟DNA连接酶，将目的基因连接进质粒中，构建重组质粒 你得到的重组质粒是唯一的吗？有其他的重组方式吗？ 由于用同种限制酶切割，会产生相同黏（平）性末端，则可能导致目的基因、质粒的自身环化以及目的基因与质粒反向连接。 怎样避免上述情况，确保目的基因与运载体定向连接？ 使用两种限制酶去切割目的基因和运载体 2 DNA连接酶—“分子缝合针” 质粒的自身环化与反向连接 由于用同种限制酶切割，会产生相同黏性末端，则可能导致目的基因、质粒的自身环化以及目的基因与质粒反向连接。 将外源基因送入受体细胞&在受体细胞内对目的基因进行大量复制。 质粒、噬菌体和动植物病毒等。它们的来源不同，在大小、结构、复制方式以及可以插入外源DNA片段的大小上也有很大差别。 最常用的载体——质粒：一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。 拟核DNA 质粒 氨苄青霉素抗性基因 目的基因插入位点 复制原点 大肠杆菌及质粒结构模式图 3 基因进入受体细胞的载体—“分子运输车” (1) 作用： (2) 种类： (3) 载体需具备的条件 在基因工程操作中，真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。 氨苄青霉素抗性基因 目的基因插入位点 复制原点 ④ 对受体细胞无害、易分离 3 基因进入受体细胞的载体—“分子运输车” ① 有一个至多个限制酶切割位点 作用：供外源DNA片段（基因）插入其中 ② 能在受体细胞中自我复制或整合到受体DNA上， 随受体DNA同步复制 作用：使外源基因在受体细胞中稳定存在并复制 ③ 有特殊的标记基因 作用：便于重组DNA分子的筛选 标记基因的筛选原理：载体上的标记基因一般是某种抗生素的抗性基因，而受体细胞没有抵抗该抗生素的能力。将含有某抗生素抗性基因的载体导入受体细胞，抗性基因在受体细胞内表达，受体细胞对该抗生素产生抗性。在含有该抗生素的培养基上，能够生存的是被导入了载体的受体细胞。 普通培养基 不含抗生素 选择培养基 50 µg/ml四环素 3 基因进入受体细胞的载体—“分子运输车” 例：选用下图载体将目的基因导入细菌中并将含有目的基因的细菌筛选出来。 ① 在培养细菌的培养基中添加抗生素B，则应该选择的限制酶为_______。 ② 在培养细菌的培养基中添加抗生素A，则应该选择的限制酶为_____。 ①或② ① 3 基因进入受体细胞的载体—“分子运输车” 限制酶 DNA连接酶 载体 ①对受体细胞无害； ②有一个至多个限制酶切割位点； ③有特殊的标记基因； ④能自我复制或能整合到宿主DNA上。 质粒、 λ噬菌体衍生物 、动植物病毒 基因工程的基本工具 作为载体的条件 种类: 磷酸二酯键 来源： 主要来源于原核生物 特点： 作用部位： 具有专一性 结果： 形成黏性末端或平末端 连接部位：磷酸二酯键 种类： E.coliDNA连接酶、T4 DNA连接酶 作用：把两条双链DNA片段拼接起来 小结 (1) 实验原理: ① 粗提取DNA的原理 a. 在酒精溶液中的溶解性： DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精。 利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分 初步分离DNA和蛋白质 4 DNA的粗提取与鉴定 (1) 实验原理: ① 粗提取DNA的原理 b. 在NaCl溶液中的溶解性： DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，能溶于2 mol/L NaCl溶液。 利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分 观察左图，如何通过控制NaCl溶液的浓度使DNA在盐溶液中溶解或析出？ 溶解DNA： 用2mol/L的NaCl溶液溶解DNA，能除去在高盐中不能溶解的杂质； 析出DNA： 用0.14mol/L的NaCl溶液使DNA析出，能除去溶解在低盐中的杂质。（但本实验不用这个浓度） 4 DNA的粗提取与鉴定 0 DNA溶解度 NaCl浓度 0.14mol/L 2mol/L 4 DNA的粗提取与鉴定 (1) 实验原理: ② 鉴定DNA的原理 DNA + 二苯胺 蓝色 沸水浴 DNA含量相对较高的生物组织，如新鲜洋葱、香蕉、菠菜、菜花和猪肝等。 不能 哺乳动物成熟的红细胞中无细胞核和线粒体，几乎不含DNA 。 能 鸡是鸟类动物 4 DNA的粗提取与鉴定 (2) 选材: 能否选用牛、羊、马、猪等哺乳动物的红细胞做实验材料？ 能否选用鸡血细胞做实验材料？ 研磨液： 体积分数为95%的冷酒精： 2mol/L 的NaCl 溶液： 二苯胺试剂： 析出DNA（即粗提取DNA） 溶解DNA（并去除部分杂质蛋白） 破坏细胞，释放出细胞内的物质。 ——鉴定DNA（要现配现用，用棕色瓶保存） 4 DNA的粗提取与鉴定 (3) 试剂及作用: 研磨液成分 作用 SDS 使蛋白质变性 EDTA 抑制DNA酶 Tris-HCl 缓冲液 稳定DNA 不用记成分，了解即可 材料的获取与研磨 DNA的鉴定 DNA鉴定的结果 去杂，析出DNA 4 DNA的粗提取与鉴定 (4) 方法步骤: ① 取材、研磨 称取30 g洋葱，切碎，然后放入研钵中，倒入10 mL研磨液，充分研磨 研磨的目的？ 破碎细胞，使核物质容易溶解在研磨液中 ② 去除滤液中的杂质 方案一 方案二 在漏斗中垫上纱布，将洋葱研磨液过滤到烧杯中，在4℃冰箱中放置几分钟后，再取上清液。 也可直接将研磨液倒入塑料离心管中，1500r/min的转速下离心5 min，再取上清液放入烧杯中。 低温放置几分钟的作用？ 抑制核酸水解酶的活性，进而抑制DNA降解。 4 DNA的粗提取与鉴定 (4) 方法步骤: ③ DNA的析出 方案一 方案二 在上清液中加入体积相等的、预冷的酒精溶液（体积分数为95%），静置2-3min，溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸去上面的水分。 搅拌时应轻缓、并沿一个方向？ 减少DNA断裂，以便获得较完整的DNA分子。 或将溶液倒入塑料离心管中，在10000 r/min的转速下离心5 min，弃上清液，将管底的沉淀物（粗提取的DNA）晾干。 4 DNA的粗提取与鉴定 (4) 方法步骤: 4 DNA的粗提取与鉴定 (4) 方法步骤: DNA + 二苯胺 蓝色 沸水浴 鉴定时，如何设置对照？ 在等体积NaCl溶液中加入二苯胺试剂，将试管置于同等沸水浴中加热5min ④ DNA的鉴定 加入2mol/L氯化钠溶液 不加入丝状物 加入4ml二苯胺试剂 加入2mol/L氯化钠溶液 实验组 对照组 水浴加热 加入丝状物 加入4ml二苯胺试剂 评价结果？ ——看提取物颜色 ——看与二苯胺反应颜色的深浅 DNA纯度 DNA的量 →纯的DNA为白色丝状物 4 DNA的粗提取与鉴定 DNA + 二苯胺 蓝色 沸水浴 (4) 方法步骤: ④ DNA的鉴定 ① 利用动物细胞提取DNA破碎细胞的方法：动物细胞无细胞壁，可直接吸水涨破。 ② 不能选用哺乳动物成熟的红细胞作为实验材料，原因是哺乳动物成熟的红细胞无细胞核。 ③ 提纯DNA时，选用体积分数为95%的冷酒精的原因：体积分数为95%的冷酒精提纯效果更佳。 预冷的酒精具有以下优点： a.可抑制核酸水解酶的活性，进而抑制DNA降解； b.抑制分子运动，使DNA易形成沉淀析出； c.低温有利于增加DNA分子的柔韧性，减少其断裂。 4 DNA的粗提取与鉴定 (5) 注意事项: 4 DNA的粗提取与鉴定 (6) 结果分析与评价 1.你提取出白色丝状物或沉淀物了吗？用二苯胺鉴定结果如何？ 提示：观察提取的DNA的颜色，如果不是白色丝状物，说明DNA中的杂质较多。二苯胺试剂鉴定呈现蓝色说明实验基本成功；如果不呈现蓝色，可能的原因有所提取的DNA含量低，或者在实验操作过程中出现了失误等。 2.你能分析出粗提取的DNA中可能含有哪些杂质吗？ 本实验粗提取的DNA可能仍然含有核蛋白、多糖等杂质。 练习 (2019·江苏，10)下列关于DNA粗提取与鉴定的叙述，错误的是 A.用同样方法从等体积兔血和鸡血中提取的DNA量相近 B.DNA析出过程中，搅拌操作要轻柔以防DNA断裂 C.预冷的酒精可用来进一步纯化粗提的DNA D.用二苯胺试剂鉴定DNA需要进行水浴加热 √ 一、概念检测 1. DNA连接酶是重组DNA技术常用的一种工具酶。下列相关叙述正确的是 A.能连接DNA分子双链碱基对之间的氢键 B.能将单个脱氧核苷酸加到DNA片段的末端，形成磷酸二酯键 C.能连接用同种限制酶切开的两条DNA片段，重新形成磷酸二酯键 D.只能连接双链DNA片段互补的黏性末端，不能连接双链DNA片段的平末端 2. 在重组DNA技术中，将外源基因送入受体细胞的载体可以是 A.大肠杆菌的质粒 B.切割DNA分子的酶 C.DNA片段的黏性末端 D. 用来识别特定基因的DNA探针 C A 练习 2.有2个不同来源的DNA片段A和B，A片段用限制酶Spe I进行切割，B片段分别用限制酶Hind Ⅲ、Xba I、EcoR V和Xho I进行切割。各限制酶的识别序列和切割位点如下。 (1) 哪种限制酶切割B片段产生的DNA片段能与限制酶Spe I切割A片段产生的DNA片段相连接 ? 为什么 ? Xba Ⅰ 因为Xba I与Spe I切割产生了相同的黏性末端。 练习 二、拓展应用 (2) 不同的限制酶切割可能产生相同的黏性末端，这在基因工程操作中有什么意义？ 构建载体时，扩大了切割位点的选择范围。 练习 二、拓展应用 知识回顾-DNA CH2 H H H H H O O H P O O O H O - N N H H N H H N N A 49 知识回顾-DNA CH2 H H H H H O O H P O O O H O - N N H N O N N H H G 50 $