2026届高三生物一轮复习课件23 (2)基因工程的基本操作程序

1 3.2 基因工程（二） ——基因工程的基本操作程序 1 培育转基因抗虫棉的简要过程 与载体拼接 普通棉花 （无抗虫特性） 棉花细胞 抗虫棉 （有抗虫特性） 导入 抗虫基因 重组DNA分子 1.目的基因的筛选与获取 2.基因表达载体的构建 3.将目的基因导入受体细胞 4.目的基因的 检测与鉴定 2 目的基因的筛选与获取 基因表达载体的构建 将目的基因导入受体细胞 目的基因的检测与鉴定 3 1 2 3 4 3 用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因就是目的基因 1. 目的基因： 主要指编码蛋白质的基因 如：与生物抗逆性、优良品质、生产药物、毒物降解和工业用酶等相关的基因 4 第一步：目的基因的筛选与获取 5 第一步：目的基因的筛选与获取 如何筛选目的基因呢？ 基因片段 非基因片段 编码区：编码蛋白质的合成 非编码区 非编码区 启动子：RNA聚合酶的识别和结合位点 开始转录 编码区 原核细胞基因 终止子：终止转录 非编码区 组成：编码区上游与编码区下游 功能：不能编码蛋白质，调控遗传信息的表达 启动子：RNA聚合酶结合位点，转录起始的信号 终止子：终止RNA的合成 6 编码区 非编码区 非编码区 启动子：RNA聚合酶的识别和结合位点 开始转录 编码区 真核细胞基因 终止子：终止转录 非编码区 组成：编码区上游与编码区下游 功能：不能编码蛋白质，调控遗传信息的表达 启动子：RNA聚合酶结合位点，转录起始的信号 终止子：终止RNA的合成 7 1 2 3 4 5 外显子 内含子 外显子： 内含子： 能编码蛋白质的序列 不能编码蛋白质的序列 非编码区 非编码区 启动子：RNA聚合酶的识别和结合位点 开始转录 编码区 真核细胞基因 终止子：终止转录 8 1 2 3 4 5 外显子 内含子 mRNA前体 成熟mRNA 转录 加工 8  项目 启动子 终止子 起始密码子 终止密码子 化学 成分 位置 作用 DNA片段 DNA片段 mRNA上 三个相邻碱基 mRNA上 三个相邻碱基 目的基因首端 目的基因尾端 mRNA首端 mRNA尾端 RNA聚合酶识别和结合的部位,驱动基因转录出RNA 决定转录 的结束 翻译的 起始信号 决定翻译过程的结束 启动子和终止子 vs 起始密码子和终止密码子 1. 非编码序列： 包括非编码区和内含子 2. 如果把一个真核生物的基因导入原核细胞中表达，一定会产生原来的蛋白质吗？ 一般不能产生原来的蛋白质 原核细胞与真核细胞的基因结构比较 原核细胞 真核细胞 不同点 编码区是_______的 编码区是间隔的、________的 相同点 都由能够编码蛋白质的________和具有调控作用的________区组成的 连续 不连续 编码区 非编码 10 原因：①原核生物细胞里没有相应的酶来去除内含子； ②原核生物没有真核的蛋白质加工系统（如内质网、高尔基体等） 从相关的已知结构和功能清晰的基因中筛选目的基因 科学家已经明确Bt基因的序列信息，也对Bt抗虫蛋白有深入了解 利用序列数据库（如GenBank）、序列对比工具（如BLAST）等，找到合适的目的基因 明确了目的基因后，该怎么获得它? 2. 筛选合适的目的基因 11 第一步：目的基因的筛选与获取 DNA测序仪 序列数据库（如GenBank） 核苷酸序列比对 氨基酸序列比对 序列比对工具（如BLAST） 3. 获取目的基因的方法 （一）人工合成 （二）从基因文库中获取； （三）利用PCR技术获取和扩增； 前提：基因比较小、核苷酸序列已知 方法：通过DNA合成仪用化学方法直接合成 12 第一步：目的基因的筛选与获取 DNA合成仪 4. 从基因文库中获取目的基因 将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入到受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。 基因文库 包括 生物材料 获取目的基因 DNA cDNA 一定大小范围的DNA mRNA 基因组文库 cDNA文库 限制酶 酶切 逆转录 导入受体菌中保存 包含一种生物的所有基因 包含一种生物的一部分基因 13 第一步：目的基因的筛选与获取 5. 利用PCR获取和扩增目的基因 PCR是聚合酶链式反应的缩写, 根据DNA半保留复制的原理，在体外（PCR扩增仪）提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。 14 第一步：目的基因的筛选与获取 体内DNA复制参与的组分 在DNA复制中的作用 PCR中参与的组分 打开DNA双链 提供DNA复制的模板 合成DNA子链的原料 催化合成DNA子链 使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸 解旋酶 DNA母链 4种脱氧核苷酸 DNA聚合酶 引物 无需解旋酶，用高温代替 DNA母链 4种脱氧核苷酸(dNTP) 耐高温的DNA聚合酶 引物（人工合成） 反应还需要其它条件，如缓冲液等 一般添加Mg2+ (激活真核细胞和细菌的DNA聚合酶） 15 第一步：目的基因的筛选与获取 3′ 5′ DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有链的3′-端，即子链的延伸方向是5 ′→3 ′。 由于DNA聚合酶不能将单个的核苷酸链连接成链，因此子链合成需要引物。 引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。 DNA聚合酶 3′ 5′ 模板链 16 既作为原料又提供能量 脱氧核苷三磷酸（dNTP），包括：dATP、dTTP、dGTP、dCTP 用作DNA复制的原料 为DNA复制提供能量 17 第一步：目的基因的筛选与获取 dNTP在PCR中的作用有哪些？ 18 第一步：目的基因的筛选与获取 耐高温的DNA聚合酶(Taq DNA聚合酶） 4种脱氧核苷酸（dNTP） 引物 待扩增的DNA片段（模板） 5’ 5’ 变性 复性 延伸 温度上升到90℃以上，双链DNA解聚为单链 当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。 温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下合成新的DNA链。 5′ 3′ 5′ 3′ 5′ 3′ 5′ 3′ 5′ 3′ 5′ 3′ 变性 复性 延伸 5′ 5′ 5′ 5′ 3′ 3′ 3′ 3′ 目的基因 5′ 5′ 3′ 3′ 5′ 3′ 5′ 5′ 3′ 3′ 5′ 3′ DNA热变性 复性是模板链与引物配对，必需引物相对于模板过量才能尽可能保证这一点。 PCR反应过程 19 5′ 5′ 5′ 3′ 3′ 3′ 5′ 3′ 5′ 5′ 3′ 3′ 5′ 3′ 5′ 3′ 5′ 5′ 3′ 3′ 5′ 3′ 5′ 3′ 5′ 3′ 5′ 3′ 5′ 5′ 3′ 5′ 3′ 5′ 3′ 5′ 3′ 5′ 3′ 5′ 3′ 5′ 3′ 5′ 3′ 5′ 3′ 5′ 3′ 5′ 3′ 5′ 3′ 5′ 3′ 第一轮 第二轮 3′ PCR技术获取目的基因时至少要经过几次循环才能从DNA分子中分离出目的基因？ PCR技术获取目的基因时至少要经过几次循环才能从DNA分子中分离出目的基因？ 21 第一步：目的基因的筛选与获取 PCR技术 DNA复制 相同点 原则 条件 不同点 解旋方式 场所 酶 结果 碱基互补配对 模板、能量、酶 DNA在高温下变性解旋 解旋酶催化 体外复制 细胞内（主要在细胞核内） 耐高温的DNA聚合酶 解旋酶、DNA聚合酶 大量的DNA片段 形成整个DNA分子 22 PCR技术与DNA复制过程比较 mRNA不可以直接扩增，需要将它逆转录成cDNA再进行扩增。 逆转录酶 核酸酶H DNA聚合酶 单链RNA 杂交双链 单链DNA 双链DNA RNA链 DNA链 23 用PCR可以扩增mRNA吗？ PCR的结果 由于一个循环得到的产物又可以作为下一个循环的模板，因而每一次循环后目的基因的量可以增加一倍。 即形成 形式扩增（约为 ，其中n为 ） PCR产物的鉴定 常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定 2n 指数 扩增循环的次数 24 第一步：目的基因的筛选与获取 (1) PCR反应中温度的周期性改变是为了DNA聚合酶催化不同的反应(　　) (2) PCR扩增技术中，需用解旋酶使双链DNA解聚(　　) (3) PCR过程使用的DNA聚合酶的特点是耐高温(　　) (4) PCR技术中，DNA模板链上碱基G和C的比例越高，DNA变性解链的温度就越高 (　　) 判断正误 × × √ √ 25 1．用PCR扩增下面的DNA片段： 5'-GACCTGTGGAAGC…… CATACGGGATTG3-' 3'-CTGGACACCTTCG……GTATGCCCTAAC-5' 供选择的引物有： ①5'-GACCTGTGGAAGC-3'、②5'-CATACGGGATTG-3'、 ③5'-GTATGCCCTAAC-3' 和④5'-CAATCCCGTATG-3' 共四种，应选择（    ） A．①② B．②③ C．③④ D．①④ 练习 D 26 26 27 产物为 _________ DNA双链 产物为 _________ DNA双链 产物为 _________ DNA双链 以 ________ 为模板 以 ________ 为模板 以 ________ 为模板 复制后多一条 ________ 复制后多一条 ________ 复制后多一条 ________ 以 ________ 为模板 以 ________ 为模板 以 ________ 为模板 长链 中链 短链 长-中 中-短 短-短 目的基因 中链 短链 短链 28 第n次 DNA单链数 2n+1 长链 2 中链 2n 短链 2n+1-2(n+1) DNA总数 2n 长-中 2 中-短 2(n-1) 短-短（目的基因） 2n-2n n次循环： 其中消耗引物A： 消耗的2种引物的总数量： 含有引物A的DNA双链数量： 含有2种引物的DNA双链数量： 2n-1 2n-2 2n-1 2n+1-2 引物B： 2n-1 以DNA双链为模板！ 只有一条长-中双链没有A 只有长-中双链没有两种引物 29 第n次 DNA单链数 2n 长链 1 中链 n 短链 2n-(n+1) DNA总数 2n-1 长-中 1 中-短 (n-1) 短-短（目的基因） 2(n-1)-n 其中消耗引物A： 消耗的2种引物的总数量： 含有引物A的DNA双链数量： 含有2种引物的DNA双链数量： 2(n-1) 2(n-1)-1 2(n-1) 2n-1 引物B： 2(n-1)-1 以DNA单链为模板！ 只有DNA双链的一半 n次循环： 引物A与cDNA上片段互补 含有引物B的DNA双链数量： 2(n-1)-1 所有双链都有A 只有1条双链没有B 所有双链都有A 只有1条双链没有B 2. 通过引物设计运用PCR技术可以实现目的基因的定点突变，如图为基因工程中获取突变基因的过程，其中引物1序列中含有一个碱基T不能与目的基因片段配对，但不影响引物与模板链的整体配对，反应体系中引物1和引物2的5′端分别设计增加限制性内切酶a和限制性内切酶b的识别位点。有关叙述正确的是（    ） A．两种引物中设计两种限制酶识别位点有利于目的基因的定向插入 B．在PCR反应体系中还需要加入4种游离核糖核苷酸、解旋酶、Taq DNA聚合酶、ATP等 C．第2轮PCR，引物1与图中②结合并且形成两条链等长的突变基因 D．在第3轮PCR结束后，含突变碱基对且两条链等长的DNA占1/8 练习 A 30 30 练习 31 (2021·湖北，16)某实验利用PCR技术获取目的基因，实验结果显示除目的基因条带(引物与模板完全配对)外，还有2条非特异条带(引物和模板不完全配对)。为了减少反应非特异条带的产生，以下措施中有效的是 A.增加模板DNA的量 B.延长热变性的时间 C.延长延伸的时间 D.提高复性的温度 √ 31 练习 32 (2022辽宁卷)抗虫和耐除草剂玉米双抗12-5是我国自主研发的转基因品种。为给监管转基因生物安全提供依据，采用PCR方法进行目的基因监测，反应程序如图所示。下列叙述正确的是（    ） A．预变性过程可促进模板DNA边解旋边复制 B．后延伸过程可使目的基因的扩增更加充分 C．延伸过程无需引物参与即可完成半保留复制 D．转基因品种经检测含有目的基因后即可上市 B 32 练习 33 (2020·北京，12)为了对重金属污染的土壤进行生物修复，研究者将从杨树中克隆的重金属转运蛋白(HMA3)基因与外源高效启动子连接，导入杨树基因组中(如图)。为检测获得的转基因杨树苗中是否含有导入的HMA3基因，同时避免内源HMA3 基因的干扰，在进行PCR扩增时， 应选择的引物组合是 A.①＋③ 　　　B.①＋② C.③＋② 　　　D.③＋④ √ 33 练习 34 [2021全国甲卷，38，15分]PCR技术可用于临床的病原菌检测。为检测病人是否感染了某种病原菌，医生进行了相关操作:①分析PCR扩增结果；②从病人组织样本中提取DNA;③利用PCR扩增DNA片段;④采集病人组织样本。回答下列问题: 1） 若要得到正确的检测结果，正确的操作顺序应该是___________（用数字序号表示）。 ④②③① 2） 操作③中使用的酶是_____________。PCR反应中的每次循环可分为变性、复性、_______三步， 其中复性的结果是_____________________________________。 DNA聚合酶 延伸 引物通过碱基互补配对与单链DNA结合 3） 为了做出正确的诊断，PCR反应所用的引物应该能与_____________特异性结合。 病原菌DNA 4） PCR（多聚酶链式反应）技术是指____________________________________________。该技术目前被广泛地应用于疾病诊断等方面。 在生物体外大量快速扩增特定DNA片段的技术 34 将生物的所有DNA直接导入受体细胞不是更简便吗？如果这么做，效果会怎样？ 有人采用总DNA注射法进行遗传转化，即将一个生物的总DNA提取出来，通过注射或花粉管通道法导入受体植物，没有进行基因表达载体的构建。这种方法针对性差，完全靠运气，也无法确定哪些基因导入了受体植物。 （1）确保基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代； （2）使目的基因能够表达和发挥作用。 1. 基因表达载体的目的 ☆基因表达载体的构建是基因工程的核心工作。 2. 基因表达载体的组成 目的基因：能控制表达所需要的特殊性状 启动子： 位置：基因的上游 功能：RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA。 复制原点： DNA复制的起始位点 终止子： 位置：基因的下游 功能：终止转录 标记基因：便于重组DNA分子的筛选和鉴定。 36 第二步：基因表达载体的构建 同种限制酶或产生相同黏性末端的限制酶切割 DNA 连接酶 目的基因 限制酶切割位点 获取目的基因 限制酶切割位点 质粒 重组 DNA分子 限制酶 限制酶 目的基因与运载体的结合过程，实际上是不同来源的基因重组的过程。 第二步：基因表达载体的构建 3. 基因表达载体的构建过程 37 请结合下图，回答问题： 1. 构建基因表达载体时，能否用Sma Ⅰ酶切割质粒？为什么？ 不能；因为SmaⅠ会破坏质粒的抗性基因。质粒上的抗性基因是标记基因，便于重组DNA分子的筛选，若被破坏，无法进一步筛选。 38 第二步：基因表达载体的构建 将同一种限制酶切割获得的目的基因和质粒混合后加DNA连接酶会出现的连接方式有： 质粒 目的基因 自连 片段间的连接 目的基因自连 质粒自连 目的基因与质粒连接 目的基因与目的基因连接 质粒与质粒连接 第二步：基因表达载体的构建 请结合下图，回答问题： 2. 与只使用EcoR Ⅰ相比较，使用BamH Ⅰ和Hind Ⅲ 两种限制酶同时处理质粒、外源DNA的优点是什么？ 可以防止质粒和目的基因的自身环化以及目的基因与载体的反向连接。 40 第二步：基因表达载体的构建 限制酶的选择原则 1. 不破坏目的基因 2. 保留标记基因、启动子、终止子、复制原点 3. 确保质粒与目的基因出现相同末端 通常选择与切割目的基因相同的限制酶切割质粒，如图中Pst Ⅰ；为避免目的基因和质粒自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图也可选择Pst Ⅰ和EcoR Ⅰ两种限制酶。 × × 怎么导入受体细胞呢？ 第二步：基因表达载体的构建 第二步：基因表达载体的构建 除抗药性筛选法外，显色筛选也是常用的方法。很多大肠杆菌的质粒上含有lacZ’标记基因,其表达的酶蛋白可将一种无色的化合物(X-gal)水解成蓝色产物。若重组DNA技术常用的大肠杆菌质粒pUC18同时携带Ampr(氨苄青霉素抗性基因)和LacZ’两个标记基因，限制酶识别序列在lacZ’基因上据图分析，若想筛选出重组质粒，配制的固体培养基上，需含有               ，经转化、扩增、涂布，图4中含重组质粒的是            （白色/蓝色）菌落。 抗药性筛选法、显色筛选同时使用与单用抗药性筛选法两者有何区别？你认为哪种方法更具有优势？为什么？ X-gal 白色 抗药性筛选法、显色筛选同时使用更有优势，因为经过一次筛选就判断一种或多种标记基因的出未转化菌、导入未重组质粒菌以及导入重组质粒菌。 (1)基因工程操作程序的核心步骤是目的基因的获取(　　) (2)基因表达载体中有的含有启动子和终止密码子(　　) (3)标记基因不一定是抗生素抗性基因(　　) × √ 判断正误 × 43 将目的基因导入受体细胞的方法 将目的基因导入 植物细胞 将目的基因导入 动物细胞 将目的基因导入 微生物细胞 农杆菌转化法 花粉管通道法 ——Ca2+转化法 病毒介导法 显微注射法 转化是指目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。 44 第三步：将目的基因导入受体细胞 44 （1）常用方法： Ca2+处理 原核细胞（常选择大肠杆菌） 目的：可使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。 （2）受体细胞： 优点：繁殖快，多为单细胞，遗传物质相对较少，易于培养。 Ca2+ 感受态细胞 吸收 45 第三步：将目的基因导入受体细胞 3.目的基因导入微生物细胞 （1）花粉管通道法（我国科学家独创） 方法2：在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。 方法1：用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中 适用生物：开花植物 1.目的基因导入植物细胞 花粉 卵细胞 精子 花粉管 子房壁 46 第三步：将目的基因导入受体细胞 46 1. 农杆菌特点： ②农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T-DNA（可转移的DNA）转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。 ①在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有侵染能力。 Ti质粒 T-DNA 随着转化方法的突破，用农杆菌侵染水稻、玉米等多种 植物也取得了成功。 转入了目的基因的植物细胞，通过 技术可培育出转基因植株， 其原理是 。 单子叶 植物组织培养 植物细胞具有全能性 （2）农杆菌转化法 47 第三步：将目的基因导入受体细胞 47 目的基因 Ti质粒 表 达 载 体 农杆菌 植物细胞 植物细胞 染色体DNA 新性状植株 构建 转入 导入 插入 表达 2. 步骤 (1)两次拼接：第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T－DNA上；第二次拼接(非人工操作)指被插入目的基因的T－DNA拼接到受体细胞染色体的DNA上。 (2)两次导入：第一次导入是将含目的基因的重组Ti质粒导入农杆菌；第二次导入(非人工操作)是指含目的基因的T－DNA导入受体细胞。 第三步：将目的基因导入受体细胞 48 （1）导入方法： （2）受体细胞: 显微注射法 受精卵 为什么常选用受精卵作为受体细胞呢？ ①体积大，易操作。 ②易表现出全能性。 （3）过程： 49 第三步：将目的基因导入受体细胞 2.目的基因导入动物细胞 构建基因表达载体并提纯 利用显微注射将基因表达载体注入动物的受精卵中 早期胚胎培养 胚胎移植 获得具有新性状的动物 按前面三个步骤进行了操作，是否可以确定目的基因进入了受体细胞并能维持稳定？是否可以确定目的基因一定能够进行表达？是否可以确定得到了新的性状？ 抗虫基因 重组DNA分子 导入受体细胞 ? 结合基因表达的过程，推测可以从哪些方面进行检测与鉴定？ Bt基因 mRNA Bt抗虫蛋白 抗虫棉 PCR等技术检测 抗原 - 抗体杂交技术 分子 水平 抗虫鉴定 （个体水平） 51 第四步：目的基因的检测与鉴定 转基因生物 提取DNA PCR操作 是否扩增出目的基因 (1) PCR扩增 -基因是否插入染色体DNA（存在） 电泳操作 1. 分子水平检测 M：marker；1-阳性质粒； 2：原始品系；3-9转Bt品系； 转Bt基因品系PCR琼脂糖凝胶电泳检测结果 第四步：目的基因的检测与鉴定 52 (1) PCR扩增 -基因是否转录 Bt M3 C0 T-9 T-2 T-51 T-5 T-23 T-11 T-20 T-21 T-34 T-10 10个PCR阳性棉花植株中，有四株Bt基因发生转录 转基因生物 提取mRNA PCR操作 是否扩增出目的基因 电泳操作 逆转录为cDNA，以cDNA为模板PCR 第四步：目的基因的检测与鉴定 1. 分子水平检测 (2) DNA分子杂交技术 -基因是否插入染色体DNA（存在）//基因是否转录 第四步：目的基因的检测与鉴定 1. 分子水平检测 原因：带标记的基因探针，与目的基因DNA单链在一定条件互补配对，结合成双链，从而出现杂交带。 (3) 抗原-抗体杂交 检测目的基因是否翻译成蛋白质 苏云金芽孢杆菌 提取 Bt毒蛋白 注射小鼠体内 抗体 标记抗体 提取蛋白 电泳分离 抗原 抗体 杂交 第四步：目的基因的检测与鉴定 1. 分子水平检测 接种棉铃虫观察性状表现，或采摘抗虫棉的叶子饲喂棉铃虫，观察抗虫效果 第四步：目的基因的检测与鉴定 2. 个体水平检测 类型 检测内容 方法 分子水平的检测 个体生物学水平的鉴定 受体细胞的染色体DNA上是否插入了目的基因 目的基因是否转录出了mRNA PCR等技术 目的基因是否翻译成蛋白质 抗原-抗体杂交技术 个体是否具有相应性状 抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等 目的基因的检测与鉴定方法总结 57 获取质粒、噬菌体等载体 筛选和获得目的基因 用限制酶切割载体和含有目的基因的DNA片段，然后用DNA连接酶连接，构建基因表达载体 将含有目的基因的表达载体导入受体细胞 检测和鉴定目的基因是否稳定维持和表达其遗传特性 基因工程的基本操作程序 58 (1)为培育抗除草剂的作物新品种，导入抗除草剂基因时只能以受精卵为受体细胞(　　) (2)Ti质粒上的T－DNA可转移到植物细胞内，并且与其染色体DNA整合在一起(　　) (3)可以将目的基因直接导入受体细胞(　　) (4)检测目的基因是否成功表达可用抗原—抗体杂交技术(　　) (5)基因工程是否成功需进行个体生物学水平的鉴定(　　) 判断正误 59 × × √ √ √ 探究.实践 DNA片段的扩增及电泳鉴定 PCR仪 DNA分子电泳 1.DNA体外扩增的原理 PCR利用了DNA热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。 PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器，一次PCR一般要经历30次循环。 2.DNA片段电泳鉴定的原理 DNA分子具有可解离的基团，在一定的PH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。 在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构像等有关。 凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来。 探究.实践 （1）仪器 （2）材料 PCR 仪、微量离心管、微量移液器、一次性吸液枪头、电泳装置（包括电泳仪电泳槽等） 4种脱氧核苷酸的等量混合液、2种引物、DNA 聚合酶、模板 DNA 、扩增缓冲液、无菌水、电泳缓冲液、凝胶载样缓冲液、琼脂糖和核酸染料等 PCR仪 微量离心管 微量移液器 3、材料用具 探究.实践 3、材料用具 PCR反应体系的配方 10倍浓缩的扩增缓冲液 5ul 20mmol/l 的4种脱氧核苷酸的等量混合液 1ul 20umol/l 的引物I 2.5ul 20umol/l 的引物II 2.5ul H2O 28-33ul 1-5U/ul 的Taq DNA聚合酶 1-2U 模板DNA 5-10ul 总体积 50ul 注：模板DNA的用量为1pg-1ug 探究.实践 4、实验步（PCR） 用微量移液器按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书，在微量移液管中依次加入各组分。 待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子。将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在离心管的底部。 参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。 移液 离心 扩增 探究.实践 4、实验步骤（电泳鉴定） 根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比0.8%-1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀。 将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜。 配制琼脂糖溶液 制备凝胶 探究.实践 将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物（Marker）。 加样 电泳、观察 接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳。取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。 4、实验步骤（电泳鉴定） 探究.实践 注意： 1.为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。 2.该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在-20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。 3.在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。 4.在进行操作时，一定要戴好一次性手套。 5.PCR扩增不能随意加大试剂用量。 探究.实践 原理 1.你是否成功扩增出DNA片段？判断的依据是什么？ 2.你进行电泳鉴定的结果是几条条带？如果不止一条条带，请分析产生这个结果的可能原因。 可以在紫外灯下直接观察到DNA条带的分布及粗细程度来评价扩增的结果。 如果扩增不成功，可能的原因有：漏加了PCR的反应成分，各反应成分的用量不当，PCR程序设置不当等。 如果扩增结果不止一条条带，可能的原因有：引物设计不合理，它们与非目的序列有同源性或容易形成二聚体；退火温度过低；DNA聚合酶的质量不好等。 M：marker；1-阳性质粒；2：原始品系；3-9转Bt品系； 转Bt基因品系PCR琼脂糖凝胶电泳检测结果 70 一种双链DNA分子被三种不同的限制酶切割,切割产物通过电泳分离,用大小已知的DNA片段的电泳结果作为分子质量标记。关于该双链DNA,下列说法错误的是 (　　) A.呈环状结构 B.分子质量大小为10 kb C.有一个NotⅠ和两个EcoRⅠ切点 D.其NotⅠ切点与EcoRⅠ切点的最短距离为2 kb D 71 71 (2022·北京朝阳区高二期末)为优化目的基因(700 bp)的PCR条件，研究者设计不同的复性温度进行实验，产物的琼脂糖凝胶电泳结果如下图。据图分析，下列表述错误的是 A.对照组可用无菌蒸馏水代替模板， 其他成分相同 B.电泳条带的宽度、亮度与扩增产物 大小呈正相关 C.复性温度的高低会影响PCR扩增产物的纯度 D.58 ℃是本实验中扩增该基因的最佳复性温度 √ 72 （2022·河北·高考）蛋白酶抑制剂基因转化是作物抗虫育种的新途径。某研究团队将胰蛋白酶抑制剂（NaPI）和胰凝乳蛋白酶抑制剂（StPinlA）的基因单独或共同转化棉花，获得了转基因植株。回答下列问题： (1)蛋白酶抑制剂的抗虫机制是________________________________________。 (2)_________________是实施基因工程的核心。 (3)利用农杆菌转化法时，必须将目的基因插入到质粒的________上，此方法的不足之处是______________________ 。 (4)为检测目的基因在受体细胞基因组中的整合及其转录和翻译，可采用的检测技术有________________________________________ （写出两点即可）。 调节害虫蛋白酶活性，从而使害虫不能正常消化食物达 到抗虫的目的 基因表达载体的构建 T-DNA 该方法不适用于单子叶植物 基因--DNA分子杂交技术、mRNA--分子杂交技术、抗原-抗体杂交技术 73 (5)确认抗虫基因在受体细胞中稳定表达后，还需进一步做抗虫的________以鉴定其抗性程度。下图为三种不同遗传操作产生的转基因棉花抗虫实验结果，据结果分析________（填“NaPI”或“StPinlA”或“NaPI＋StPinlA”）转基因棉花的抗虫效果最佳，其原因是________________________ 。 (6)基因突变可产生新的等位基因，在自然选择的作用下，昆虫种群的基因频率会发生________。导致昆虫朝着一定的方向不断进化。提此推测，胰蛋白酶抑制剂转基因作物长期选择后，某些害虫具有了抗胰蛋白酶抑制剂的能力，其分子机制可能是________（写出两点即可）。 害虫发生基因突变，产生了能催化抑制剂水解的酶，使抑制剂水解失效；害虫的胰蛋白酶基因发生突变，酶空间结构发生变化，胰蛋白酶抑制剂无法发挥作用。 效果 NaPI 饲喂NaPI转基因的虫体质量较对照组差，且每株棉铃数较对照组少 定向改变 1.研究人员将一种海鱼的抗冻蛋白基因afp整合到土壤农杆菌的Ti质粒上，然后用它侵染番茄细胞，获得了抗冻的番茄品种。判断下列相关表述是否正确。 （1）afp基因是培育抗冻番茄用到的目的基因。 （ ） （2）构建含有afp基因的Ti质粒需要限制酶、DNA连接酶和核酸酶（ ） （3）只要检测出番茄细胞中含有afp基因，就代表抗冻番茄培育成功（ ） 2.利用PCR既可以快速扩增特定基因，也可以检测基因的表达。下列有关PCR的叙述错误的是 （ ） A.PCR用的DNA聚合酶是一种耐高温酶 B.变性过程中双链DNA的解开不需要解旋酶 C.复性过程中引物与模板链的结合遵循碱基互补配对原则 D.延伸过程中需要DNA聚合酶、ATP和 4种核糖核苷酸 √ × × 练习与应用（P83） D 74 1.研究人员在研究转基因烟草中外源卡那霉素抗性基因的遗传稳定性时，发现44株转基因烟草中有4株该基因的遗传不符合孟德尔遗传规律，在它们的自交后代中出现了较多的没有卡那霉素抗性的植株。请查找相关资料，尝试对这个问题作出解释。 ①插入位点不确定性：可能为单位点插入，或者同一染色体多位点插入，或者不同染色体多位点插入。大多数情况下，插入的位点难以做到定点插入； ②插入的拷贝数也是随机的。 ③外源基因丢失、基因重排等也都可能影响外源基因的稳定性。 外源基因在转基因植物中的遗传是很复杂的。 练习与应用（P83） 75 2.八氢番茄红素合酶（其基因用psy表示） 和胡萝卜素脱饱和酶（其基因用crtⅠ表示）参与β-胡萝卜素的合成。pmi为磷酸甘露醇异构酶基因，它编码的蛋白质可使细胞在特殊培养基上生长。科学家将psy和crtⅠ基因转入水稻，使水稻胚乳中富含β-胡萝卜素，由此生产出的大米称为 “黄金大米”。请根据以上信息回答下列问题。 练习与应用（P83） （1）科学家在培育“黄金大米”时，将ctrⅠ和psy基因导入含pmi基因的质粒中，构建了质粒pSYN12424。该项研究的目的基因是 ， 标记基因是 ，质粒pSYN12424的作用是 。 ctrⅠ基因和psy基因 pmi基因 将目的基因送入水稻细胞 （2）在构建质粒载体时，目的基因序列中能否含有用到的限制酶的识别序列？为什么？ 不能。 如果目的基因序列中含有用到的限制酶的识别序列，限制酶可能将它切断。 76 (3)请查找相关资料，了解科学家为什么 要培育“黄金大米”以及当前关于“是否要推广 '黄金大米’”的各种争论。你还可以提出自己的看法，并与同学交流讨论。 维生素A在人体内具有非常重要的生理功能，对视力、骨骼生长、免疫功能等都有调节作用。但是，人体不能合成维生素A，需要从食物中摄取。维生素A缺乏症是南亚地区常见的由营养不良导致的疾病，该地区的居民一般以籼稻作为主食。β-胡萝ト素是维生素A的前体，在人体内它可以转化为维生素A。因此，科学家将两个参与β-胡萝ト素合成的酶的基因转入了籼稻中，使其胚乳中富含β-胡萝ト素，期望让人们通过日常食用主食就能补充足够量的维生素A，从而降低维生素A缺乏症的患病率。关于“是否要推广'黄金大米'”的争论主要围绕其安全性、有效性等方面展开。 77 Lavf59.16.100 $