3.1重组DNA技术的基本工具 课件 2024—2025学年高二下学期生物人教版选择性必修3

第3章 基因工程 (目的基因) 运载体 重组运载体 不抗虫的植物细胞 抗虫蛋白 抗虫性状 抗虫基因 苏云金芽孢杆菌 基因工程是指按照人们的愿望，通过①转基因等技术， ②赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。 从技术操作层面看，由于基因工程是在③DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫作④重组DNA技术。 变异类型----基因重组 定向改变生物性状 打破种间界限 1944 艾弗里 肺炎链球菌转化实验 遗传物质是DNA，DNA可在不同物种间转移 1958 证明DNA半保留复制 确立中心法则阐明遗传信息的流动 1953 沃森 克里克 DNA双螺旋结构 提出遗传物质自我复制的假说 1963 尼伦伯格 马太 破译第一个密码子 1970 在细菌中发现第一个限制酶 20C70Y 多种限制酶、DNA连接酶、逆转录酶发现 1967 细菌拟核之外DNA之外的质粒有复制能力，可在细菌间转移 1973 质粒可作基因工程载体，实现种间基因交流 1973 质粒可作基因工程载体，实现种间基因交流 1972 伯格 体外DNA改造，构建体外重组DNA分子 1983 农杆菌转化法，转基因烟草 1985 穆里斯 发明PCR 1990 人类基因组计划启动 基因工程的建立历程 知识准备1 DNA的组成 ①组成元素:　　　　　　　 ② DNA中文全称:　　　　　　　 ③基本单位: 磷酸二酯键 5’ 3’ 3’ 5’ C H O N P 脱氧核糖核酸 脱氧核糖核苷酸 = 磷酸 + 脱氧核糖 + 含氮碱基 脱氧核糖 磷酸 含氮碱基 A或G或C或T 1 2 3 4 5 腺嘌呤脱氧核苷酸 鸟嘌呤脱氧核苷酸 胞嘧啶脱氧核苷酸 胸腺嘧啶脱氧核苷酸 知识准备2 DNA的空间结构 ①DNA是由两条单链组成的，这两条链按___________方式盘旋成__________结构。 反向平行 双螺旋 ②__________和_________交替连接，排列在外侧，构成____________；_____________排列在内侧。 脱氧核糖 磷酸 基本骨架 碱基对 ③两条链上的碱基通过________连接成碱基对，且遵循____________________。 氢键 碱基互补配对原则 1.基因是什么？ 2.基因的功能是什么？ 基因通常是有遗传效应的DNA片段 基因通过控制蛋白质的合成，直接或间接控制生物的性状 转录 (RNA聚合酶) 翻译 酶 代谢过程 性状 性状 结构蛋白 基因 DNA 知识准备3 基因工程的理论基础 知识准备3 基因工程的理论基础 3.基因工程操作导致的基因重组与有性生殖中的基因重组的主要区别是什么？ 有性生殖中的基因重组是随机的，并且只能在同一物种间进行重组； 基因工程可以实现遗传物质在不同物种间进行重组，并且方向性强，可以定向地改变生物的性状 减数分裂Ⅰ后期，非同源染色体上非等位基因的自由组合。 减数分裂Ⅰ前期，同源染色体上非姐妹染色单体间的互换； A A B A A A a a a a a B B B B b b b b b 4.为什么不同生物的DNA分子能拼接起来？ ①DNA的单体都是4种脱氧核苷酸 ②DNA都有规则的双螺旋结构 5.为什么甲生物的基因可在B生物细胞内表达？ ①基因是控制性状的结构与功能单位 ②遗传信息传递都遵循中心法则 ③生物界共用一套遗传密码 知识准备3 基因工程的理论基础 第1节 重组DNA技术的基本工具 DNA双螺旋的直径只有2nm，对如此微小的分子进行操作，是一项非常精细的工作，更需要专门的“分子工具”。 番木瓜容易受番木瓜环斑病毒的侵袭。当番木瓜被这种病毒感染后，产量会大大下降。科学家通过精心设计， 用“分子工具”培育出了转基因番木瓜，它可以抵御番木瓜环斑病毒。 转基因番木瓜 非转基因番木瓜 在培育转基因番木瓜时，首先要在体外对含有所需要基因的DNA分子进行“切割”、改造和“拼接”；然后，将重组DNA分子导入番木瓜体细胞内，并使其在细胞中表达。 实现这一精确的操作 过程至少需要三种“分子工具”： 准确切割DNA分子的 “分子手术刀”、 将DNA片段再连接起来的“分子缝合针” 将体外重组好的DNA分子导入受体细胞的“分子运输车”。 分子运输车 分子手术刀 分子缝合针 运 切 连 重组DNA技术所需三种基本工具 1、限制性内切核酸酶----“分子手术刀” 切割DNA分子的工具是限制性内切核酸酶，简称限制酶。 这类酶主要是从原核生物中分离纯化出来的。迄今分离的限制酶有数千种。 能够识别双链 DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开 原核生物易受外源DNA入侵， 限制酶能切割外源DNA，使之失效 5’ 3’ 3’ 5’ 磷酸二酯键 是一类酶，不是一种酶 P71 你能根据所掌握的知识，推测限制酶存在于原核生物中的主要作用是什么吗？ 用生物属名的头一个字母与种加词的头两个字母，组成了3个字母的略语，以此来表示这个酶是从哪种生物中分离出来的。 一种限制酶是从大肠杆菌（Escherichia coli）的R型菌株分离来的，就用字母EcoR表示；如它是从大肠杆菌R型菌株中分离出来的第一种限制酶，则进一步表示成EcoRⅠ。 B st E Ⅱ 种名 Stearothermophilus 属名 Baccillus 株系 ET 在此类细菌中第二个被发现 如：流感嗜血杆菌中先后分离到3种限制酶，则分别命名为: HindⅠ HindⅡ Hind Ⅲ 限制酶的由来 大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成。例如， EcoRⅠ、SmaⅠ限制酶的识别序列均为6个核苷酸。 也有少数限制酶的识别序列由4个、8个或其他数量的核苷酸组成。 中轴线 特点1：都可以找到一条中轴线； 特点2：中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的 ，称为回文序列。 特点3：正向读与另一条链反向读的碱基顺序完全一致 中轴线 中轴线 DNA分子经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式----黏性末端和平末端。 EcoRⅠ (在G与A之间切割) SamⅠ (在G与C之间切割) 5’ 5’ 5’ 5’ 3’ 3’ 3’ 3’ 黏性末端 平末端 当限制酶在它识别序列的中心轴线两侧将DNA分子的两条链分别切开时，产生的是黏性末端； 当限制酶在它识别序列的中心轴线处切开时，产生的是平末端。 黏性末端相同 1.请结合限制酶的作用特点，回答问题： (1)限制酶能切开RNA分子的磷酸二酯键吗？ 理由是：_______________________ 这说明酶在发挥作用时，具有________性。 限制酶只能识别特定的DNA碱基序列并从特定的切口切开DNA 专一 (2)请结合图示，推断限制酶切割一次可断开几个磷酸二酯键？ 产生多少个游离的磷酸基团？ 产生几个黏性末端？ 消耗几分子水？ 2个 2个 2个 2个 不能 2.写出下列限制酶切割形成的黏性末端 (1) BamHⅠ________ EcoRⅠ_______ HindⅢ________ BglⅡ ________ GATC AATT AGCT GATC (2)你从中发现什么现象？_____________________________________ 不同限制酶切割出的黏性末端一般不同 不同限制酶也可切割出相同的黏性末端 P74 拓展应用 1.想一想，为什么限制酶不切割细菌本身 的DNA分子？ 含某种限制酶的细菌的DNA分子不具备该酶的识别序列 该限制酶所识别序列的碱基被甲基化了，使限制酶不能将其切开。 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 DNA水解酶与限制酶的区别 DNA水解酶： 打断任意处的磷酸二酯键 形成脱氮核苷酸 限制酶： 识别特定碱基序列，特定切口打断磷酸二酯键 形成DNA片段 2、DNA连接酶----“分子缝合针” 将切下来的DNA片段拼接成新的DNA分子，是靠DNA连接酶来完成的。 催化DNA片段间 磷酸二酯键 的形成 碱基对间的氢键自动形成 G A A T T C C T T A A T G A A T T C C T T A A T A A T T C C T T A A G G C T T A A G A A T T C G EcoR Ⅰ EcoR Ⅰ A A T T C G C T T A A G A A T T C C T T A A G G C T T A A G A A T T C G DNA连接酶 在基因工程操作中，DNA连接酶主要有两类： 一类是从大肠杆菌中分离得到的，称为E.coli DNA连接酶； 另一类是从T4噬菌体中分离出来的，称为T4 DNA连接酶。 这两类酶都能将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的磷酸二酯键 …A – C – G …T – G – C – T – T – A – A A – A – T – T – C – G – T… G – C – A… …A – C – G …T – G – C – T – T – A – A A – A – T – T – C – G – T… G – C – A… E.coli DNA接酶 E.coli DNA接酶 G G G G G G C C C C C C T4 DNA连接酶 E.coli DNA连接酶只能将具有互补黏性末端的DNA片段连接起来，不能连接具有平末端的DNA片段。 T4 DNA连接酶既可以“缝合”双链DNA片段互补的黏性末端，又可以“缝合”双链DNA片段的平末端，但连接平末端的效率相对较低。 …A – C – G …T – G – C – T – T – A – A A – A – T – T – C – G – T… G – C – A… …A – C – G …T – G – C – T – T – A – A A – A – T – T – C – G – T… G – C – A… E.coli DNA接酶 E.coli DNA接酶 G G G G G G C C C C C C T4 DNA连接酶 T4 DNA连接酶 DNA连接酶的种类 种类 来源 作用 差别 只连接____________ 缝合___________和____________ E.coli DNA连接酶 T4 DNA连接酶 都能将双链DNA片段“缝合“起来， 恢复被限制酶切开的磷酸二酯键。 黏性末端 黏性末端 平末端 大肠杆菌 T4 噬菌体 G C T T A A A A T T C G 3’ 5’ 5’ 5’ 3’ 3’ 3’ 5’ DNA聚合酶 DNA聚合酶 解旋酶 DNA连接酶 核苷酸 P52 DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗？ 为什么？ DNA连接酶： 基因工程 连接的是DNA片段 DNA聚合酶： DNA复制 逐个连接脱氧核苷酸 共同点： 都是蛋白质 催化磷酸二酯键形成 DNA连接酶和DNA聚合酶是一回事吗？为什么？ DNA连接酶 DNA聚合酶 相同 作用实质 化学本质 不 同 点 模板 作用对象 作用结果 用途 都能催化形成磷酸二酯键 都是蛋白质 不需要 需要DNA的每条母链作模板 在两个DNA片段间形成磷酸二酯键 将单个核苷酸连接到已有DNA片段，形成磷酸二酯键 形成完整的重组DNA分子 形成DNA的一条子链 基因工程 DNA复制 名称 作用部位 作用结果 限制酶    DNA连接酶 DNA聚合酶 DNA水解酶 解旋酶 逆转录 磷酸二酯键 将DNA切成两个片段 比较与DNA相关的几种酶 磷酸二酯键 将两个DNA片段连接为一个DNA分子 磷酸二酯键 将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端 磷酸二酯键 将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸 氢键 将双链DNA分子局部解旋为单链 磷酸二酯键 以RNA为模板，形成DNA单链 反馈练习 1.根据所学知识，完成以下填空： ①限制酶 ②解旋酶 ③DNA连接酶 ④DNA聚合酶 ⑤RNA聚合酶 (1)切断a处的酶为_______ (2)连接a处的酶为_______ (3)切断b处的酶为_______ ① ③④ ② 2.如图为DNA分子在不同酶的作用下所发生的变化，图中依次表示限制酶、DNA聚合酶、DNA连接酶、解旋酶作用的正确顺序是______________ (用图中序号表示) ①④②③ 3、基因进入受体细胞的载体----“分子运输车” (1)作用： (2)种类 将目的基因导入受体细胞， 使其在受体细胞内进行大量复制和表达 质粒 动植物病毒 噬菌体 通常是利用质粒作为载体，将基因送入细胞。 质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。 大肠杆菌 拟核 质粒 氨苄青霉素抗性基因 目的基因插入位点 复制原点 (1)质粒DNA分子上有一个至多个限制酶切割位点，供外源DNA片段(基因)插入其中。 四环素抗性基因 氨苄青霉素抗性基因 质粒 BamH Ⅰ BamH Ⅰ Bcl Ⅰ Hind Ⅲ EcoRⅠ EcoRⅠ 目的基因 DNA连接酶 质粒 重组质粒 导入 (2)携带外源DNA片段的质粒进入受体细胞后，能在细胞中进行自我复制，或整合到受体DNA上， 随受体DNA同步复制。 增殖 ★载体需具备的条件 ★载体需具备的条件和载体的选择 抗生素抗性基因 (3)复制原点 目的基因插入位点 复制原点 双向复制 半保留复制 母链 子链 ★载体需具备的条件和载体的选择 (4)在基因工程操作中，真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。这些质粒上常有特殊的标记基因，如四环素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因等，便于重组DNA分子的筛选。 1. 标记基因的筛选原理 载体上的标记基因一般是某种抗生素的抗性基因，而受体细胞没有抵抗该抗生素的能力。 将含有某抗生素抗性基因的载体导入受体细胞，抗性基因在受体细胞内表达，受体细胞对该抗生素产生抗性。在含有该抗生素的培养基上，能够生存的是被导入了载体的受体细胞 目的基因 这样可根据标记基因控制的性状准确筛选出含有重组质粒的受体细胞。 当质粒上有两个标记基因时，可将目的基因插入其中一个标记基因中，也就是重组质粒上只含一个标记基因，普通质粒上含有两个标记基因。 没有导入质粒的受体细胞不具有标记基因控制的性状 导入普通质粒的受体细胞具有两个标记基因控制的性状 导入重组质粒的受体细胞只具有一个标记基因控制的性状。 抗链霉素基因 思考：为获得重组质粒，可选用哪些限制酶？ 组合 切割质粒 切割外源DNA 是否可行并说明理由 1 EcoRⅠ EcoRⅠ 2 Sma Ⅰ Sma Ⅰ 3 BamH Ⅰ BamH Ⅰ 4 Hind Ⅲ Hind Ⅲ 5 BamH Ⅰ、 Hind Ⅲ BamH Ⅰ、 Hind Ⅲ AATT GATC AGCT × 两个抗性基因均完整 × 破坏了目的基因 × 切不出目的基因，2个抗性基因 × 切不出目的基因 √ 例：某细菌质粒上有标记基因如图所示，通过标记基因可以推知外源基因(目的基因)是否转入成功。外源基因插入的位置不同，细菌在培养基上的生长情况也不同，如图所示是外源基因插入位置(插入点有a、b、c)示意图。请根据表中提供的细菌生长情况，推测①②③三种重组后细菌的外源基因插入点，正确的一组是 插入点 细菌在含氨苄青霉素的培养基上的生长状况 细菌在含四环素的培养基上的生长状况 ① 能生长 能生长 ② 能生长 不能生长 ③ 不能生长 能生长 A.①是c；②是b；③是a B.①是a和b；②是a；③是b C.①是a和b；②是b；③是a D.①是c；②是a；③是b a b c 同种限制酶切目的基因和载体，重新连接的类型？ 目的基因 质粒 DNA连接酶 自连 目的基因自连 质粒自连 片段间连接 2个目的基因环化 2个质粒环化 质粒和目的基因反向环化 质粒和目的基因同向环化 选择限制酶的原则 1、不破坏目的基因 2、保留部分标记基因、复制原点等，破坏部分标记基因 3、确保表达载体和目的基因出现相同贴性末端 4、为避免目的基因和质粒自身环化和随意连接，使用不同的限制酶 抗链霉素基因 在基因工程中使用的载体除质粒外，还有噬菌体、动植物病毒等。 它们的来源不同，在大小、结构、复制方式以及可以插入外源DNA片段的大小上也有很大差别。 这些基因工程载体，相当于一种运输工具，因此将它们比喻为 “分子运输车”。 目的基因 重组质粒 受体细胞 重组噬菌体 受体细胞 请你根据图3-3中的相关信息找到两条片段上EcoRⅠ的识别序列和切割位点。 然后，用剪刀进行“切割”。待切割位点全部切开后，将从下面那条DNA链上切下的片段重组到上面那条DNA链的切口处，并用透明胶条将切口粘连起来。 讨论 1.剪刀和透明胶条分别代表哪种“分子工具”？ 2.你制作的黏性末端的碱基能不能互补配对？ 如果不能，可能是什么原因造成的？ 3.你插入的DNA片段能称得上一个基因吗？ 【思考·讨论】 重组DNA分子 G AATTC ① ② ③ ④ ⑤ 限制酶、DNA连接酶 剪切位点或连接位点错误 有遗传效应的DNA片段，一般100对碱基以上 【实践·探究】 DNA的粗提取与鉴定 【基本思路】 DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面存在差异，可以利用这些差异，选用适当的物理或化学方法对它们进行提取。 【实验原理】 ①DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精，利用这一原理，可以初步分离DNA与蛋白质 ②DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，它能溶于2mol/L的NaCl溶液。 ③在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色，二苯胺试剂可以作为鉴定DNA的试剂。 DNA溶解度 NaCl浓度 0.14mol/L 2mol/L 0 材料用具 1.材料：新鲜洋葱（香蕉、菠菜、菜花或猪肝等作为实验材料，提取DNA的方法可能稍有不同） 研磨液、 体积分数为95%的酒精、2mol/L的NaCl溶液、二苯胺试剂和蒸馏水等。 目的要求 1.了解DNA的物理和化学性质，理解DNA粗提取和鉴定的原理。 2.学会DNA粗提取的方法以及用二苯胺试剂对DNA进行鉴定。 哺乳动物成熟的红细胞中没有细胞核和线粒体，几乎不含DNA。 溶解并提取DNA (使蛋白质变性、抑制DNA酶、稳定DNA) 析出DNA 析出DNA 鉴定DNA(现配现用) 方法步骤 1.研磨 称取约30g洋葱，切碎，然后放入研钵中，倒入10mL研磨液，充分研磨。 2.在漏斗中垫上纱布，将洋葱研磨液过滤到烧杯中，在4℃冰箱中放置几分钟后，再取上清液。也可以直接将洋葱研磨液倒入塑料离心管中，在1500r/min的转速下离心5min，再取上清液放入烧杯中。 研磨不充分，会使DNA分子不能从细胞核中释放出来，从而影响提取的DNA含量 不用滤纸，DNA会吸附到滤纸上而大量损失 防DNA变性 3.在上清液中加入体积相等的、预冷的酒精溶液（体积分数为95%），静置2〜3min，溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一个方向搅拌， 卷起丝状物，并用滤纸吸去上面的水分；或者将溶液倒入塑料离心管中，在10000 r/min的转速下离心5min，弃上清液，将管底的沉淀物（粗提取的DNA）晾干。 ①抑制核酸水解酶活性，防止DNA降解 ②低温利于减少DNA断裂 ③低温抑制DNA运动，更易析出 蛋白质溶解在酒精中，DNA不溶于酒精而析出 4.取两支20mL的试管，各加入2mol/L的NaCl溶液5mL。将丝状物或沉淀物溶于其中一支试管的NaCl溶液中。 向两支试管中各加入4mL的二苯胺试剂。 混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min。待试管冷却后，比较两支试管中溶液颜色的变化 水浴加热 对照组 加入2mol/L氯化钠溶液 不加入丝状物 加入4mL二苯胺试剂 水浴加热 实验组 加入2mol/L氯化钠溶液 加入丝状物 加入4mL二苯胺试剂 水浴加热 蓝色 结果分析与评价 如何提高DNA含量和纯度？ 1、用鸡血等作材料，易提取 2、提取液中加入蛋白酶 3、用不同浓度NaCl反复溶解和提取 P74 1.DNA连接酶是重组DNA技术常用的一种工具酶。下列相关叙述正确的是 A.能连接DNA分子双链碱基对之间的氢键 B.能将单个脱氧核苷酸加到DNA片段的末端，形成磷酸二酯键 C.能连接用同种限制酶切开的两条DNA片段，重新形成磷酸二酯键 D.只能连接双链DNA片段互补的黏性末端，不能连接双链DNA片段的平末端 2.在重组DNA技术中，将外源基因送入受体细胞的载体可以是 A.大肠杆菌的质粒 B.切割DNA分子的酶 C.DNA片段的黏性末端 D.用来识别特定基因的DNA探针 2.有2个不同来源的DNA片段A和B，A片段用限制酶SpeⅠ进行切割，B片段分别用限制酶HindⅢ、XbaⅠ、EcoRⅤ和XhoⅠ进行切割。各限制酶的识别序列和切割位点如下。 (1)哪种限制酶切割B片段产生的DNA片段能与限制酶SpeⅠ切割A片段产生的DNA片段相连接？ 为什么？ (2)不同的限制酶切割可能产生相同的黏性末端，这在基因工程操作中有什么意义？ XbaⅠ 产生相同的黏性末端 防止切断目的基因 防止质粒民目的基因反向环化 (1)基因工程可以实现遗传物质在不同物种间的转移，人们可以定向选育新品种(　　) (2)限制性内切核酸酶均能特异性地识别6个核苷酸序列(　　) (3)DNA连接酶能将两个碱基通过氢键连接起来(　　) (4)限制酶和解旋酶的作用部位相同(　　) (5)作为载体的质粒通常采用抗生素合成基因作为筛选标记基因(　　) (6)质粒是环状双链DNA分子，是基因工程常用的载体(　　) (7)载体(如质粒)和细胞膜中的载体蛋白的成分相同(　　) (8)重组DNA技术所需要的工具酶有限制酶、DNA连接酶和载体(　　) √ × × × × √ × × 1 .以下是几种不同限制酶切割DNA分子后形成的部分片段。下列叙述正确的是 A.以上DNA片段是由4种限制酶切割后产生的 B.②片段是在识别序列为 的限制酶作用下形成的 C.①和④两个片段在DNA聚合酶的作用下可形成重组DNA分子 D.限制酶和DNA连接酶作用的部位都是磷酸二酯键 2.质粒是基因工程中最常用的目的基因运载工具。下列有关叙述正确的是 A.质粒是只存在于细菌细胞质中能自我复制的小型环状双链DNA分子 B.在所有的质粒上总能找到一个至多个限制酶切割位点 C.携带目的基因的重组质粒只有整合到受体细胞的染色体DNA上才会随后者的复制而复制 D.质粒上的抗性基因常作为标记基因供重组DNA分子的筛选 3.如图为DNA的粗提取与鉴定实验的部分操作流程。下列相关叙述正确的是 A.将图1中的研磨液过滤后保留沉淀 B.图2过程中，用玻璃棒进行交叉搅拌会使DNA析出更快 C.图2析出得到的白色丝状物只能溶于2 mol/L的NaCl溶液中 D.图3对提取后的DNA进行鉴定，两支试管中均要加入二苯胺试剂 4.关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法错误的是 A.过滤液沉淀过程在4 ℃冰箱中进行是为了防止DNA降解 B.离心研磨液是为了加速DNA的沉淀 C.在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色 D.粗提取的DNA中可能含有蛋白质 5.下列与“DNA的粗提取与鉴定”实验相关的说法，错误的是 A.研磨液中应加入DNA酶的抑制剂，以防细胞破碎后DNA酶降解DNA B.研磨时需要控制好时间，以防影响DNA的提取量 C.鉴定时加入二苯胺试剂后沸水浴即可观察到较为明显的显色反应 D.鉴定时溶液蓝色的深浅与DNA含量的多少有关 $