第10单元 拓展突破5 基因组编辑技术及PCR的综合应用（课件PPT）-【正禾一本通】2026年新高考生物高三一轮总复习高效讲义（人教版 不定项）

该高中生物学高考复习课件聚焦生物技术与工程核心模块，覆盖基因组编辑技术、PCR原理及应用、基因工程操作等高考高频考点。对接高考评价体系，通过质粒结构分析、引物设计实例梳理考点权重，归纳实验流程图解、技术应用分析等常考题型，体现备考的系统性与针对性。 课件亮点在于“技术原理+实验探究+真题情境”的融合突破。如结合CRISPR-Cas9编辑过程示意图培养科学思维，通过Western blot实验结果分析强化探究实践能力，提供质粒构建中酶切位点选择等典型题型解题模板，助力学生掌握答题技巧，教师可据此精准定位学生薄弱环节，提升复习效率。

第十单元 生物技术与工程 正禾一本通高三一轮总复习 生物学 基因组编辑技术及PCR的综合应用 拓展突破5 热点突破 谢谢观看 86 【典例】(2023·辽宁高考)天然β­淀粉酶大多耐热性差，不利于工业化应用。我国学者借助PCR改造β­淀粉酶基因❷，并将改造的基因与pLN23质粒重组后导入大肠杆菌，最终获得耐高温的β­淀粉酶❶。回答下列问题： (1)上述过程属于__________工程。 (2)PCR中使用的聚合酶属于______(填写编号)。 ①以DNA为模板的RNA聚合酶 ②以RNA为模板的RNA聚合酶 ③以DNA为模板的DNA聚合酶 ④以RNA为模板的DNA聚合酶 (3)某天然β­淀粉酶由484个氨基酸构成，研究发现，将该酶第476位天冬氨酸替换为天冬酰胺，耐热性明显提升。❸在图1所示的β­淀粉酶基因改造方案中，含已替换碱基的引物是____(填写编号)。 (4)为了使上述改造后的基因能在大肠杆菌中高效表达，由图2所示的pLN23质粒构建得到基因表达载体。❹除图示信息外，基因表达载体中还应该有目的基因(即改造后的基因)和____________。 (5)目的基因(不含EcoRⅠ酶切位点)全长为1.5 kb，将其插入BamHⅠ位点。用EcoRⅠ酶切来自不同大肠杆菌菌落的质粒DNA❺，经琼脂糖凝胶电泳确定DNA片段长度，这一操作的目的是______________________。正确连接的基因表达载体被EcoRⅠ酶切后长度为______kb。 (6)采用PCR还能在分子水平上确定目的基因是否转录，根据中心法 则❻，可通过________反应获得PCR的模板。 【高效解读】 (1)关键信息❶→根据蛋白质的功能改变基因的结构，最终获得耐高温的β­淀粉酶，这属于蛋白质工程。 (2)关键信息❷→PCR的原理是DNA双链复制，利用的酶是耐高温的DNA聚合酶，合成子链时是以DNA为模板。 (3)关键信息❸＋图1→根据β­淀粉酶的编码序列，替换的碱基在编码序列中，则利用的引物应该把编码序列全部扩增在内，则所用的引物是②③。含已替换碱基的引物是②。 (4)关键信息❹＋图2→作为基因工程载体的质粒应该包含：复制原点、限制酶的切割位点、标记基因、启动子和终止子，根据图示的表达载体可知应还要包括目的基因和标记基因。 (5)关键信息❺＋图2→目的基因通过表达载体导入大肠杆菌中，大肠杆菌菌落的质粒DNA，经琼脂糖凝胶电泳确定DNA片段长度，这一操作的目的是筛选出导入目的基因的大肠杆菌。正确连接的基因表达载体只有一个EcoRⅠ酶切位点，则切割后的长度为4.2＋1.5＝5.7(kb)。 (6)关键信息❻→转录是以DNA为模板合成RNA的过程，通过PCR在分子水平上确定目的基因是否转录，则需要以RNA为模板逆转录出DNA作为PCR反应的模板。 一、基因组编辑技术 1.基因编辑的含义 对基因进行定点修改，以改变目的基因的序列和功能，进行基因治疗和物种改良。 2.应用最广泛的技术：CRISPR/Cas9基因编辑技术。 3.CRISPR/Cas9的组分及功能 短链RNA(sgRNA、向导RNA) 作为“向导”，部分序列通过碱基互补配对，与目的基因中希望被编辑的DNA序列结合 细菌的核酸酶Cas9 与短链RNA结合，切割与向导RNA结合的DNA，使DNA双链断裂 4.CRISPR/Cas9技术的主要应用 (1)基因敲除；(2)特异突变引入；(3)定点转基因。 5.CRISPR/Cas9技术的风险 (1)基因编辑技术本身存在着识别准确性等方面的问题。 (2)对人类基因进行“改造”时要严格遵守法律法规，不能违反人类的伦理道德。 【训练】1.基因编辑是指将外源DNA片段导入染色体DNA特定位点或删除基因内部片段，定点改造基因，获得预期的生物体基因序列发生遗传性改变的技术。下图是对某生物B基因进行基因编辑的过程，该过程中用sgRNA指引内切核酸酶Cas9结合到特定的靶位点。下列分析正确的是(　　) A.sgRNA通过碱基互补配对原则识别目标DNA分子，Cas9蛋白的功能与DNA连接酶相似 B.图中sgRNA1的碱基序列和sgRNA2的碱基序列完全相同 C.通过比较处理前后生物体的功能变化，可推测B基因的功能 D.Cas9可识别特定的核苷酸序列从而使核苷酸间的氢键断裂 解析：选C。sgRNA能够与目标DNA的部分碱基序列配对，sgRNA可指引Cas9结合到特定的靶位点，Cas9在特定的靶位点进行切割，使相应部位的脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键断裂，说明sgRNA能通过碱基互补配对原则识别目标DNA分子，Cas9蛋白的功能与限制酶相似，A、D错误；图中sgRNA1和sgRNA2识别的是B基因的不同部位，说明sgRNA1的碱基序列和sgRNA2的碱基序列存在差异，B错误；剪辑后的B基因较剪辑前少了Ⅱ片段，通过比较处理前后生物体的功能变化，可推测B基因的功能，C正确。 2.随着对CRISPR/Cas9系统的研究，越来越多的Cas9变体被发掘。CRISPR/Cas12a系统是近几年研究正热的系统，该系统是由crRNA和Cas12a(Cpf1)蛋白形成的复合体。crRNA能特异性识别并结合特定的DNA序列，引导Cas12a蛋白到相应位置剪切DNA。图1是CRISPR/Cas9系统、CRISPR/Cas12a系统的工作原理示意图。请回答下列问题。 注：PAM是一种短DNA序列，N表示任意碱基。PAM可以帮助Cas9、Cas12a识别和切割目标DNA序列。“”表示在相应位置剪切DNA。 (1)Cas9是一种内切核酸酶，能与____________组成的sgRNA(向导RNA)构成复合体，该复合体能与DNA分子特定碱基序列结合。Cas9催化__________水解，从而使DNA在PAM序列的上游被切断。一般来说，在使用CRISPR/Cas9系统对不同基因进行编辑时，应使用Cas9和______(填“相同”或“不同”)的sgRNA结合构成复合体进行相关基因的编辑。 (2)在CRISPR/Cas12a系统中，crRNA序列与目的基因特定碱基序列部分结合，结合区域最多含____种核苷酸。与CRISPR/Cas9系统相比，CRISPR/Cas12a系统中的__________能独立发挥引导功能，切割DNA后形成的是______(填“黏性”或“平”)末端。 (3)某科研团队基于CRISPR/Cas12a系统对宫颈癌细胞中的KIFC1基因进行敲除，来探讨KIFC1基因在宫颈癌细胞中的功能及对宫颈癌HeLa细胞增殖的影响。他们利用crRNA对应基因序列和PX458质粒(如图2)构建crRNA/Cas12a重组载体，转染至HeLa细胞进行相关研究。 ①为保证crRNA对应的基因序列与PX458质粒正确连接，应在扩增该基因序列的一对引物的5′端分别添加____________两种限制酶的识别序列。其中P1的碱基序列为5′__________3′(写出前9个碱基)。PX458质粒中利用U6、CMV两个启动子，而不共用同一个启动子的目的是__________________ ____________________________________。 ②将crRNA/Cas12a重组载体成功转染至HeLa细胞。与对照组相比，实验组中KIFC1蛋白表达量、细胞数目的变化如图3所示，由此得出的结论是________________________。根据________________________________ ________，可证明HeLa细胞中KIFC1基因敲除成功；实验组细胞数目显著低于对照组，表明KIFC1敲除可使HeLa细胞增殖能力下降。 解析：(1)结合图示可知，Cas9能与tracrRNA、crRNA组成的sgRNA(向导RNA)构成复合体，该复合体能与DNA分子特定碱基序列结合。DNA相邻核苷酸之间通过磷酸二酯键相连，Cas9催化磷酸二酯键水解，从而使DNA在PAM序列的上游被切断。sgRNA的组成部分之一是crRNA，crRNA通过碱基互补配对原则与目标基因的碱基序列互补配对，从而实现精准的切割，不同的基因核苷酸序列不同，因此需要使用Cas9和不同的sgRNA结合构成复合体进行相关基因的编辑。 (2)crRNA序列与目的基因特定碱基序列部分结合，结合区域包含了单链DNA和RNA，DNA的基本单位是四种脱氧核苷酸，RNA的基本单位是四种核糖核苷酸，因此结合区域最多含8种核苷酸。结合图示中的CRISPR/Cas9系统和CRISPR/Cas12a系统可知，CRISPR/Cas12a系统中的crRNA能独立发挥引导功能，切割DNA后形成的是黏性末端。 (3)①质粒上含有3种限制酶识别序列，若选择KpnⅠ限制酶识别序列，对质粒进行切割时会破坏Cas12a基因，因此应选择PvitⅡ、EcoRⅠ对质粒进行酶切获得黏性末端，保证目的基因准确接入完成转录，应在扩增该基因序列的一对引物的5′端分别添加PvitⅡ、EcoRⅠ两种限制酶的识别序列。扩增目的基因时，引物需要与模板链的3′端结合，按照碱基互补配对原则保证子链从5′向3′延伸，结合图示可知，P1的碱基序列为5′CAGCTGCTC3′。PX458质粒中利用U6、CMV两个启动子，而不共用同一个启动子的目的是实现两种基因的独立表达，有利于crRNA、Cas12a各自发挥作用。 ②结合实验结果可知，对照组KIFC1蛋白表达量多于实验组，对照组的细胞数量多于实验组，对照组和实验组的差异是KIFC1基因的有无，因此可得出的结论是KIFC1基因可以促进HeLa细胞的增殖。证明HeLa细胞中KIFC1基因敲除成功的依据是实验组的KIFC1蛋白表达量明显下降，两组的参照蛋白表达量没有明显差异。 答案：(1)tracrRNA、crRNA　　磷酸二酯键　不同　(2)8　crRNA　黏性　(3)①PvitⅡ、EcoRⅠ　CAGCTGCTC　实现两种基因的独立表达，有利于crRNA、Cas12a各自发挥作用　②KIFC1基因可以促进HeLa细胞的增殖　实验组的KIFC1蛋白表达量明显下降，两组的参照蛋白表达量没有明显差异 二、PCR的综合应用 (一)PCR定点突变技术 1.重叠延伸PCR (1)此技术共需四个引物 引物2和引物3的突起处代表与模板链不能互补的突变位点，而这两条引物有部分碱基(包括突变位点)是可以互补的。 (2)分别利用引物1和引物2，引物3和引物4进行PCR，得到两个DNA片段。 (3)得到的DNA片段可以通过引物2和引物3互补的碱基杂交在一起，它们再在DNA聚合酶的作用下延伸，就能成为一条完整的DNA片段。 (4)最后，用引物1和引物4进行扩增得到含有突变位点的DNA片段。 【训练】3.重叠延伸PCR可实现定点基因诱变，其操作过程如图所示(凸起处代表突变位点)。下列说法正确的是(　　) A.过程①需要把两对引物同时加入一个扩增体系以提高扩增效率 B.过程①需要2轮PCR才能得到图中所示PCR产物 C.过程②的产物都可以完成延伸过程 D.若过程④得到16个突变基因，则需要消耗15个通用引物RP2 解析：选D。两种突变引物能互补配对，因此过程①必须分两个反应系统进行，A错误；过程①至少需要3轮PCR才能得到图中所示PCR产物，B错误；过程②获得的产物不都可以完成延伸过程，因为子链只能从引物的3′端开始延伸，C错误；若过程④得到16个突变基因，由于模板中不含有通用引物，则产生16个突变基因共需要消耗16×2－2＝30(个)通用引物，而需要通用引物RP2的数量为30÷2＝15(个)，D正确。 4.科研人员将高产基因和抗除草剂草甘膦基因作为目的基因，利用重叠延伸PCR技术构建融合基因，从而培育既高产又抗草甘膦的转基因大豆。融合基因构建过程如图1所示，所用Ti质粒及限制酶识别序列如图2所示。回答下列问题： (1)图1中，两条杂交链的获得都至少需要经过____次扩增循环。PCR1与PCR2的产物能够形成杂交链的条件是_____________________________。 PCR3过程不需要引物，其原因是____________________________________ _______________________________。 (2)若要将获得的融合基因用于构建基因表达载体，应选用引物________对融合基因进行PCR扩增，为了保证扩增后的融合基因能正向插入到Ti质粒中，在设计这两种引物时应满足的条件是____________________________ ______________________________________。 (3)将融合基因导入农杆菌需用Ca2＋先处理农杆菌，目的是____________________；利用农杆菌转化法将融合基因导入农杆菌、大豆细胞的过程中，需要筛选两次，这两次筛选分别是_______________________ ___________________________________________。 解析：(1)图1中，目的基因经过一次循环可得到含有引物P2或引物P3的单链，但引物P2端和引物P3端都为相应链的5′端，不可直接延伸子链。为了使杂交链顺利延伸子链，至少需要经过2次循环才能得到如图所示的引物P2端和引物P3端都为相应链的3′端的杂交链。为实现PCR1的产物能与PCR2的产物融合，设计引物时应该考虑引物P2的5′端与引物P3的5′端的一小段DNA序列互补配对。据图可知，杂交链的两条母链起始段位置的碱基序列可以作为子链合成的引物，为DNA聚合酶提供3′端，因此PCR3过程中不需要引物。 (2)据图分析，扩增获得的融合基因，需要引物P1和P4。构建基因表达载体时，融合基因应插入到Ti质粒的启动子和终止子之间，因此需用限制酶NheⅠ、XmaⅠ切割质粒。要保证融合基因能够正向插入到Ti质粒中，融合基因在扩增后能够被限制酶NheⅠ、XmaⅠ切割，且插入的融合基因的转录方向应与质粒上启动子的方向一致，因此需在引物P1的5′端加上限制酶NheⅠ的识别序列，在引物P4的5′端加上限制酶XmaⅠ的识别序列。 (3)用Ca2＋先处理农杆菌，其目的是使农杆菌处于能够吸收周围环境中DNA分子的生理状态。第一步：分析融合基因导入农杆菌细胞时可能存在的情况。将融合基因导入农杆菌时存在三种情况：一种是农杆菌未导入任何质粒、一种是导入普通质粒、还有一种是导入含基因表达载体的重组质粒。第二步：分析重组质粒的筛选情况。构建基因表达载体时，重组质粒中卡那霉素抗性基因被破坏，潮霉素抗性基因完整，因此需筛选出能在含潮霉素培养基上生长而不能在含卡那霉素培养基上生长的农杆菌。第三步：筛选导入目的基因的大豆细胞。用该农杆菌去感染大豆细胞，由于融合基因中含有草甘膦抗性基因，因此在添加草甘膦的培养基中能够生长的大豆细胞即为导入融合基因的细胞。 答案：(1)2　引物P2和引物P3的5′端存在部分互补配对的碱基序列　两条母链起始段位置的碱基序列可以作为子链合成的引物，为DNA聚合酶提供3′端　(2)P1和P4　　在引物P1的5′端加上限制酶NheⅠ的识别序列，在引物P4的5′端加上限制酶XmaⅠ的识别序列　(3)使其能够吸收周围环境中的DNA　先筛选出能在含潮霉素培养基上生长而不能在含卡那霉素培养基上生长的农杆菌，再用含草甘膦的培养基筛选出导入融合基因的大豆细胞 2.大引物PCR (1)大引物PCR需要用到三条引物进行两轮PCR，这三条引物分别是突变上游引物、常规上游引物和常规下游引物。 (2)首先利用突变上游引物和常规下游引物进行扩增，得到不完整的含有突变位点的DNA片段。 (3)利用第一轮扩增产物片段中的一条DNA链作为下游大引物，它与常规上游引物一起扩增得到完整的含有突变位点的DNA。 【训练】5.IKK激酶参与动物体内免疫细胞的分化。临床上发现某重症联合免疫缺陷(SCID)患儿的IKKβ基因编码区第1 183位碱基T突变为C。为研究该患儿发病机制，研究人员应用大引物PCR定点诱变技术获得突变基因，如图所示。下列说法错误的是(　　) A.PCR1中使用的引物有引物A、引物C B.PCR2中使用的引物有引物B、大引物b链 C.PCR1过程需要扩增3轮才能获得目标产物 D.PCR2过程中，为减少错误DNA片段的产生可适当升高复性温度 解析：选C。在PCR1中，需要两种引物，将来在切取IKKβ基因时，在基因的左侧需要用限制酶HindⅢ来切割，在基因的右侧用限制酶SacⅠ切割，因此在PCR1中结合到基因右端的引物选择引物C，从题图中看，另一个引物应含有突变碱基C，所以选择引物A，A正确；在PCR2中，有一个引物结合到了基因的左端，应含有限制酶HindⅢ识别的序列，所以要用到引物B，而另外的一个引物就是大引物中的一条链，它应该结合到基因的右端，且从5′端到3′端的序列中开始部位应含有SacⅠ识别的序列，从图中看，它是大引物的b链，B正确；PCR1过程主要是为了获得大引物，则扩增2轮即可获得目标产物，C错误；由于大引物较长，含C与G的碱基较多，为减少非目的基因的获得，在PCR2复性过程中应适当提高温度，便于引物与模板链的结合，D正确。 6.(2024·天津高考)金黄色葡萄球菌(简称Sa)是人体重要致病细菌、不规范使用抗生素易出现多重抗药性Sa。 (1)Sa产生抗药性可遗传变异的来源有____________________________ _______(至少答出2点)。 (2)推测Sa产生头孢霉素抗性与其R基因有关。为验证该推测，以图1中R基因的上、下游片段和质粒1构建质粒2，然后通过同源重组(质粒2中的上、下游片段分别与Sa基因组中R基因上、下游片段配对，并发生交换)敲除Sa的R基因。 ①根据图1信息，简述质粒2的构建过程(需包含所选引物和限制酶)：______________________________________________________，然后回收上、下游片段，再与Sac Ⅱ 酶切质粒1所得大片段连接，获得质粒2。 ②用质粒2转化临床分离的具有头孢霉素抗性、对氯霉素敏感的Sa，然后涂布在含__________的平板上，经培养获得含质粒2的Sa单菌落。 ③将②获得的单菌落多次传代以增加同源重组敲除R基因的概率，随后稀释涂布在含______的平板上，筛选并获得不再含有质粒2的菌落。从这些菌落分别挑取少许菌体，依次接种到含________________的平板上，若无法增殖，则对应菌落中细菌的R基因疑似被敲除。 ④以③获得的菌株基因组为模板，采用不同引物组合进行PCR扩增，电泳检测结果如图2，表明R基因已被敲除的是______。 解析：(1)Sa为原核生物，产生抗药性可遗传变异的来源有基因突变、基因重组、表观遗传等。(2)①由图1可知，质粒2上依次接有SacⅡ、EcoRⅠ、SacⅡ三个酶切位点，而质粒1上只有SacⅡ酶切位点，R基因的上下游依次含有SacⅡ、EcoRⅠ、EcoRⅠ、SacⅡ酶切位点，若要构建质粒2，可以采用引物1和4进行PCR扩增可得到整个R基因，以及上下游片段(或采用引物1和3以及引物2和4分别进行PCR扩增)，用SacⅡ和EcoRⅠ对PCR产物进行酶切，然后回收上、下游片段，再与SacⅡ酶切质粒1所得大片段连接，获得质粒2。 ②用质粒2转化临床分离的具有头孢霉素抗性、对氯霉素敏感的Sa，因为重组的质粒2上含有氯霉素抗性基因，所以可以将重组后的含质粒2的菌落涂布在含氯霉素(或氯霉素＋头孢霉素)的平板上，能生存下来的菌落就是含质粒2的Sa单菌落。③推测Sa产生头孢霉素抗性与其R基因有关。为验证该推测需要敲除R基因，因为质粒2上含有Y(可被脱水四环素诱导表达的Sa致死基因)，所以将②获得的单菌落多次传代以增加同源重组敲除R基因的概率，随后稀释涂布在含脱水四环素的平板上，可诱导R基因死亡，若无法增殖，则对应菌落中细菌的R基因疑似被敲除。 ④以③获得的菌株基因组为模板，采用不同引物组合进行PCR扩增，电泳检测结果如图2，表明R基因已被敲除的是D组，由图1可知，R基因两侧含有的引物为2和3，所以扩增后含有引物2或3，或者2和3这三种情况的可能含有R基因，所以表明R基因已被敲除的是D组。 答案：(1)基因突变、基因重组、表观遗传等　(2)①采用引物1和4进行PCR扩增(或采用引物1和3以及引物2和4分别进行PCR扩增)，用SacⅡ和EcoRⅠ对PCR产物进行酶切　②氯霉素(或氯霉素＋头孢霉素)　③脱水四环素　头孢霉素　④D (二)利用PCR技术快速检测病原体 病原体检测是诊断和控制传染病的重要手段，为迅速而准确地确定病原体的存在和种类，发展了许多快速检测方法。PCR技术是一种基于DNA扩增原理的快速病原体检测方法，它能够在几小时内扩增和检测极小量的病原体DNA，并且具备高度的特异性和敏感性。 【训练】7.(2024·浙江6月选考)阅读下列材料，完成下面小题。 疟疾是一种严重危害人类健康的红细胞寄生虫病，可用氯喹治疗。疟原虫pfcrt基因编码的蛋白，在第76位发生了赖氨酸到苏氨酸的改变，从而获得了对氯喹的抗性。对患者进行抗性筛查，区分氯喹敏感患者和氯喹抗性患者，以利于分类治疗。 研究人员根据pfcrt基因的序列，设计了F1、F2、R1和R2等4种备选引物，用于扩增目的片段，如图甲所示。为选出正确和有效的引物，以疟原虫基因组DNA为模板进行PCR，产物的电泳结果如图乙所示。 (1)下列关于引物F1、F2、R1和R2的叙述，错误的是(　　) A.F1－R1引物可用于特异性地扩增目的片段 B.F1－R2引物不能用于特异性地扩增目的片段 C.F2为无效引物，没有扩增功能，无法使用 D.R2引物可用于特异性地扩增目的片段 解析：选D。根据图乙结果显示可知，F1－R1引物只扩增出一条片段，说明能够用于特异性扩增目的片段，A正确；根据图乙信息可知，F1－R2引物扩增条带为三条，说明其不能用于特异性扩增目的片段，B正确；根据图乙信息可知，F1－R1引物扩增出一条条带，F2－R1引物无法扩增目的条带，所以F2为无效引物，没有扩增功能，无法使用，C正确；根据图乙信息可知，F1－R1引物只扩增出一条片段，F1－R2引物扩增条带为三条，说明R2引物无法特异性的扩增目的条带，D错误。 (2)为了筛查疟原虫感染者，以及区分对氯喹的敏感性。现有6份血样，处理后进行PCR。产物用限制酶ApoⅠ消化，酶解产物的电泳结果如图所示。 1～6号血样中，来自氯喹抗性患者的是(　　) A.1号和6号 B.2号和4号 C.3号和5号 D.1号、2号、4号和6号 解析：选B。根据题干信息可知，疟原虫pfcrt基因编码的蛋白，在第76位发生了赖氨酸到苏氨酸的改变，从而获得了对氯喹的抗性。根据酶切位点可知，在具有氯喹抗性的基因组没有ApoⅠ酶切位点，而敏感性基因组中具有该酶切位点，因此对6份血样处理后进行PCR，产物用限制酶ApoⅠ消化，酶解产物的电泳出现两条带则为敏感型，只有一条带的为抗性，所以1～6号血样中，来自氯喹抗性患者的是2号和4号，B正确。 8.(2024·福建高考)病毒感染初期，机体会分泌干扰素并作用于细胞受体IFNAR来应对感染。麻疹是由麻疹病毒感染引起的急性传染病。已知人白细胞分化抗原46(hCD46)是麻疹病毒入侵细胞的主要受体，小鼠没有该受体，科研人员构建hCD46转基因小鼠用于相关研究，部分流程如图所示。回答下列问题： (1)利用PCR技术获取目的基因hCD46，复性温度下发生的扩增过程是________________________________________________________________________。 (2)将hCD46接入质粒应选用的限制酶组合是________________。为提高转基因效率，同时避免标记基因进入胚胎体内，应选用________________限制酶组合将重组质粒变为线性DNA。 (3)为获取大量胚胎用于移植，可用激素处理小鼠a，使其__________。将胚胎移植到小鼠c的子宫中，应选用桑葚胚的原因是_________________ __________________。 (4)利用PCR技术对子代小鼠进行hCD46基因检测，应设置不加DNA模板的对照组，目的是______________________________________________ ____________________。 (5)若能进一步构建既表达hCD46受体又敲除IFNAR基因的小鼠，则该小鼠对麻疹病毒具有高易感性，原因是________________________________ _________。 解析：(1)利用PCR技术获取目的基因hCD46，复性温度下发生的变化是两种引物分别与解开的两条模板链进行碱基互补配对，为子链的延伸做准备，即表现为两种引物分别与含hCD46基因的两条模板链结合。(2)结合图示可知，质粒中以及目的基因的两端含有限制酶EcoRⅠ和NotⅠ的识别序列，且这两个序列位于启动子和终止子之间，因此，将hCD46接入质粒应选用的限制酶组合是EcoRⅠ和NotⅠ。为提高转基因效率，同时避免标记基因进入胚胎体内，应选用AgeⅠ和HindⅢ限制酶组合将重组质粒变为线性DNA，因为这两种限制酶可以将重组质粒分为含目的基因的片段和含有标记基因的片段。 (3)为获取大量胚胎用于移植，可用激素处理小鼠a，使其超数排卵，为获取大量的供体胚胎做准备。将胚胎移植到小鼠c的子宫中，通常选用桑葚胚的原因是因为桑葚胚易于在小鼠子宫着床，进而可以提高胚胎的存活率。(4)利用PCR技术对子代小鼠进行hCD46基因检测，应设置不加DNA模板的对照组作为空白对照，这样可以排除PCR体系中外源DNA的污染，提高实验结果的可信度。(5)若能进一步构建既表达hCD46受体又敲除IFNAR基因的小鼠，则该转基因小鼠能接受抗原刺激，进而机体会分泌干扰素，但干扰素无法与相应的受体结合，因为转基因小鼠的受体IFNAR无法表达，因而干扰素无法起作用，因此，该小鼠对麻疹病毒具有高易感性。 答案：(1)两种引物分别与含hCD46基因的两条模板链结合　(2)EcoRⅠ和NotⅠ　AgeⅠ和HindⅢ　(3)超数排卵　桑葚胚易于在小鼠子宫着床　(4)排除PCR体系中外源DNA的污染　(5)该小鼠能被麻疹病毒感染，且干扰素无法作用于IFNAR以应对感染 (三)利用PCR技术鉴定目的基因的连接方式 检测目的基因在受体细胞内是否稳定存在是基因工程操作的重要步骤，可以借助载体上的标记基因、PCR技术和核酸分子杂交技术等方法鉴定受体细胞中是否转入了目的基因。在实际操作中，PCR技术不仅可以精准地鉴定受体细胞是否转入目的基因，还可以通过引物的巧妙设计鉴定目的基因的连接方式。 【训练】9.(2025·山东济南模拟)为研究水稻D基因的功能，研究者将T－DNA插入D基因中，致使该基因失活，失活后基因记为d。为验证F植株基因型(DD、Dd、dd)，研究者根据D基因T－DNA的序列设计了3种引物。随机选取F植株若干，提取各植株的总DNA分别用引物“Ⅰ＋Ⅲ”组合(A组)及“Ⅱ＋Ⅲ”组合(B组)进行PCR扩增，检测是否扩增(完整的T－DNA过大，不能完成PCR扩增)。下列叙述错误的是(　　) A.引物的作用是使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸 B.PCR扩增需要2种引物，确保特异地复制处于两个引物之间的DNA序列 C.若A组进行PCR可完成扩增，B组不能，则相应植株的基因型是DD D.若A、B组进行PCR均可完成扩增，则相应植株的基因型是Dd 解析：选C。DNA聚合酶只能够从脱氧核苷酸链的3′端开始连接脱氧核苷酸，故需要加入引物，A正确。PCR扩增是以两条链为模板，两条链两端碱基序列不同，故需要2种引物，确保特异地复制处于两个引物之间的DNA序列，B正确。根据题干子链延伸的方向总是5′→3′，当使用引物“Ⅰ＋Ⅲ”组合进行PCR时，碱基互补配对关系如下图所示。 由图可知，二者可扩增出从D基因的左端到T－DNA之间的部分序列(省略号代表大量碱基)，表明该植株含有d基因。故若仅引物“Ⅰ＋Ⅲ”组合(A组)进行PCR能完成扩增，而“Ⅱ＋Ⅲ”组合(B组)不能完成扩增，则相应植株的基因型为dd，C错误。 当使用引物“Ⅱ＋Ⅲ”组合进行PCR时，碱基互补配对关系如下图所示。 由图可知，当未插入T－DNA可扩增出从D基因左端的CCGTGT到右端的ATGCCT之间的序列，再结合C选项可知，若“Ⅰ＋Ⅲ”(A组)、“Ⅱ＋Ⅲ”(B组)进行PCR均可完成扩增，则相应植株的基因型是Dd，D正确。 10.(2024·江苏高考)为了高效纯化超氧化物歧化酶(SOD)，科研人员将ELP50片段插入pET－SOD构建重组质粒pET－SOD－ELP50，以融合表达SOD－ELP50蛋白，过程如图1。其中，ELP50是由人工合成的DNA片段，序列为：限制酶a识别序列－(GTTCCTGGTGTTGGC)50－限制酶b识别序列，50为重复次数。请回答下列问题： (1)步骤①双酶切时，需使用的限制酶a和限制酶b分别是________________。 (2)步骤②转化时，科研人员常用________处理大肠杆菌，使细胞处于感受态；转化后的大肠杆菌采用含有________的培养基进行筛选。用PCR技术筛选成功导入pET－SOD－ELP50的大肠杆菌，应选用的一对引物是________________。 (3)步骤③大肠杆菌中RNA聚合酶与________结合，驱动转录，翻译SOD－ELP50蛋白。已知蛋白质中氨基酸残基的平均相对分子质量约为0.11 kDa，将表达的蛋白先进行凝胶电泳，然后用SOD抗体进行杂交，显示的条带应是________(从图2的“A～D”中选填)。 (4)步骤④为探寻高效纯化SOD－ELP50蛋白的方法，科研人员研究了温度、NaCl对SOD－ELP50蛋白纯化效果的影响，部分结果如图3。 (ⅰ)20 ℃时，加入NaCl后实验结果是____________________________。 (ⅱ)100 ℃时，导致各组中所有蛋白都沉淀的原因是_________________ ____________。 (ⅲ)据图分析，融合表达SOD－ELP50蛋白的优点有_________________ ______________。 解析：(1)目的基因应插入启动子和终止子之间，结合题意可知，ELP50应插入SOD之后，由图可知，限制酶a和限制酶b分别是EcoRⅠ、HindⅢ。(2)将目的基因导入细菌时常用CaCl2处理细菌，使其处于感受态。由图可知，重组DNA含有标记基因卡那霉素抗性基因，所以转化后的大肠杆菌采用含有卡那霉素的培养基进行筛选。成功导入pET－SOD－ELP50的大肠杆菌中同时含有pET－SOD和ELP50，结合图示可知，选引物S－F和E－R可特异性对pET－SOD－ELP50进行扩增。 (3)RNA聚合酶与启动子结合后，启动转录。由图可知，决定SOD－ELP50融合蛋白的基因长度为462＋750＝1 212 bp，编码1 212÷3＝404个氨基酸，已知蛋白质中氨基酸残基的平均相对分子质量约为0.11 kDa，融合蛋白的相对分子质量约为404×0.11＝44.44(kDa)，电泳后应该为条带C。(4)(ⅰ)由图可知，20 ℃时，较不加NaCl，加入NaCl后纯化蛋白数量更多。(ⅱ)100 ℃时，温度过高，导致蛋白质变性而沉淀。(ⅲ)20 ℃，加入NaCl时，较SOD，SOD－ELP50组沉淀中蛋白质相对含量较高，说明低温下添加NaCl有利于SOD蛋白纯化，杂蛋白较少，有利于酶活性的保持。 答案：(1)EcoRⅠ、HindⅢ　(2)CaCl2　卡那霉素　S－F和E－R　(3)启动子　C　(4)SOD－ELP50组纯化蛋白数量更多　高温使蛋白变性　低温下添加NaCl有利于SOD蛋白纯化，杂蛋白较少，有利于酶活性的保持 $