第10单元 7 第49讲 DNA的粗提取与鉴定、PCR及电泳、蛋白质工程、生物技术的安全性与伦理问题（教师用书Word）-【金版新学案】2026年高考生物高三总复习大一轮复习讲义（人教版 广东专版）

该高中生物学高考复习讲义聚焦DNA粗提取与鉴定、PCR及电泳、基因工程应用、蛋白质工程、生物技术安全性等核心考点，按“实验技术-原理应用-伦理探讨”逻辑架构知识体系，通过考点梳理（如DNA提取流程、PCR原理）、方法指导（正误判断、情境分析）、真题训练（2023广东卷、2024山东卷等）环节，帮助学生构建系统知识网络，突破实验分析与技术应用难点。 讲义特色在于融合科学思维与探究实践，如设计疟原虫抗性基因引物选择情境分析，引导学生基于证据推理；设置分层练习（基础判断、语言组织、综合应用），配合真题精讲培养实验探究能力。通过生物技术安全性讨论渗透态度责任，助力学生高效掌握高考高频考点，为教师把控复习节奏提供清晰路径。

第49讲　DNA的粗提取与鉴定、PCR及电泳、蛋白质工程、生物技术的安全性与伦理问题 课标要求 1．说明基因工程在农牧、食品及医药等行业的广泛应用改善了人类的生活品质。　2．说明依据人类需要对原有蛋白质结构进行基因改造、生产目标蛋白的过程。　3．探讨转基因技术应用过程中带来的影响，说出生殖性克隆人面临的伦理问题。 考情分析 1．基因工程的应用(2022·广东卷T22；2024·河北卷T22；2024·江西卷T12；2024·江苏卷T20；2022·河北卷T24；2022·全国乙卷T38) 2．蛋白质工程的原理和应用(2022·湖南卷T22；2021·辽宁卷T14) 3．DNA的粗提取与鉴定，DNA片段的扩增与电泳鉴定(2023·广东卷T11；2024·山东卷T13；2024·安徽卷T14；2024·吉林卷T7；2023·江苏卷T22) 4．生物技术的安全性与伦理问题(2024·广东卷T18；2022·辽宁卷T12；2022·北京卷T21) 考点一　DNA的粗提取与鉴定、PCR扩增及电泳鉴定 1．DNA的粗提取与鉴定 (1)基本原理 (2)操作流程 2．DNA片段的扩增及电泳鉴定 (1)实验基础 ①PCR原理：利用了DNA的热变性原理。 ②电泳：DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。 ③PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。 (2)PCR实验操作步骤 (3)DNA的电泳鉴定：凝胶中的DNA分子通过染色，在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来。 [提醒]　①为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头等在使用前必须进行高压灭菌处理。②在向微量离心管中添加反应组 学生用书第363页 分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换，避免试剂的污染。③电泳时，DNA的相对分子量越大，迁移速率越慢；DNA的相对分子量越小，迁移速率越快。 1．正误判断 (1)(2023·广东卷)DNA鉴定：加入二苯胺试剂后即呈现蓝色。(×) (2)(2022·山东卷)粗提取DNA时的过滤液沉淀过程在4 ℃冰箱中进行是为了防止DNA降解。(√) (3)(2022·湖北卷)动、植物细胞DNA的提取必须在无菌条件下进行。(×) (4)(2022·辽宁卷)PCR技术中的DNA延伸过程无需引物参与即可完成半保留复制。(×) 2．语言组织 PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来。 3．情境分析 PCR扩增的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定，思考下列问题。 (1)是否成功扩增出DNA片段，判断的依据是什么？ 提示：可以通过在紫外灯下直接观察DNA条带的分布及粗细程度来评价扩增的结果。 (2)进行电泳鉴定的结果如果不止一条条带，请分析产生这个结果的可能原因。 提示：如果扩增结果不止一条条带，可能的原因有：引物设计不合理，它们与非目的序列有同源性或容易聚合形成引物二聚体；复性温度过低；DNA聚合酶的质量不好等。 DNA粗提取与鉴定的实验分析 1．(2023·广东卷)“DNA粗提取与鉴定”实验的基本过程是：裂解→分离→沉淀→鉴定。下列叙述错误的是(　　) A．裂解：使细胞破裂释放出DNA等物质　 B．分离：可去除混合物中的多糖、蛋白质等 C．沉淀：可反复多次以提高DNA的纯度 D．鉴定：加入二苯胺试剂后即呈现蓝色 答案：D 解析：DNA粗提取与鉴定实验的基本过程是：裂解→分离→沉淀→鉴定。裂解的目的是使细胞破裂，释放出DNA等物质，A正确；DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精，利用这一原理，可以初步分离DNA与蛋白质，DNA分离过程中混合物中的多糖、蛋白质等可被去除，B正确；DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，通过控制NaCl溶液的浓度去除杂质，可反复多次以提高DNA的纯度，C正确；进行DNA鉴定时可以使用二苯胺试剂，但要进行沸水浴加热后才能观察到颜色变化，D错误。 PCR扩增与鉴定辨析 2．(2024·吉林卷)关于采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物的实验，下列叙述正确的是(　　) A．琼脂糖凝胶浓度的选择需考虑待分离DNA片段的大小 B．凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示DNA分子的具体位置 C．在同一电场作用下，DNA片段越长，向负极迁移速率越快 D．琼脂糖凝胶中的DNA分子可在紫光灯下被检测出来 答案：A 解析：琼脂糖凝胶的浓度会影响DNA分子在凝胶中的迁移率和分辨率，琼脂糖凝胶的浓度通常是根据所需分离的DNA片段大小来选择的。对于较大的DNA片段，比如基因组DNA或质粒DNA，通常选择较低浓度的琼脂糖凝胶，因为它们需要更大的孔径来有效迁移。而对于较小的DNA片段，比如PCR产物或酶切片段，则需要选择较高浓度的琼脂糖凝胶，以提供更好的分辨率和分离效果，A正确。凝胶载样缓冲液指示剂通常是一种颜色较深的染料，可以作为电泳进度的指示分子，当溴酚蓝(指示剂)到凝胶2/3处时(可看蓝色条带)，则停止电泳，B错误。DNA分子具有可解离的基因，在一定的pH下，这些基因可以带上正电荷或负电荷，在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动。在琼脂糖凝胶电泳中，当电场作用时，DNA片段实际上是向正极迁移的，而不是向负极迁移。同时，DNA片段的迁移速率与其大小成反比，即DNA片段越长，迁移速率越慢，C错误。琼脂糖凝胶中的DNA分子需染色后，才可在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来，D错误。 3．阅读下列材料，完成下面小题。 疟疾是一种严重危害人类健康的红细胞寄生虫病，可用氯喹治疗。疟原虫pfcrt基因编码的蛋白，在第76位发生了赖氨酸到苏氨酸的改变，从而获得了对氯喹的抗性。对患者进行抗性筛查，区分氯喹敏感患者和氯喹抗性患者，以利于分类治疗。 研究人员根据pfcrt基因的序列，设计了F1、F2、R1和R2等4种备选引物，用于扩增目的片段，如图甲所示。为选出正确和有效的引物，以疟原虫基因组DNA为模板进行PCR，产物的电泳结果如图乙所示。 (1)下列关于引物F1、F2、R1和R2的叙述，错误的是(　　) 学生用书第364页 A．F1-R1引物可用于特异性地扩增目的片段 B．F1-R2引物不能用于特异性地扩增目的片段 C．F2为无效引物，没有扩增功能，无法使用 D．R2引物可用于特异性地扩增目的片段 (2)为了筛查疟原虫感染者，以及区分对氯喹的敏感性。现有6份血样，处理后进行PCR。产物用限制酶ApoⅠ消化，酶解产物的电泳结果如图所示。 1～6号血样中，来自于氯喹抗性患者的是(　　) A．1号和6号 B．2号和4号 C．3号和5号 D．1号、2号、4号和6号 答案：(1)D　(2)B 解析：(1)根据图乙结果显示可知，F1-R1引物只扩增出一条片段，说明能够用于特异性扩增目的片段，A正确；根据图乙信息可知，F1-R2引物扩增条带为三条，说明其不能用于特异性扩增目的片段，B正确；根据图乙信息可知，F1-R1能扩增目的片段，F2-R1无法扩增目的片段，所以F2为无效引物，没有扩增功能，无法使用，C正确；根据图乙显示可知，F1-R1引物只扩增出一条片段，F1-R2引物扩增条带为三条，说明R2引物无法特异性地扩增目的片段，D错误。(2)根据题干信息可知，疟原虫pfcrt基因编码的蛋白，在第76位发生了赖氨酸到苏氨酸的改变，从而获得了对氯喹的抗性。根据酶切位点可知，在具有氯喹抗性的基因组没有ApoⅠ酶切位点，而敏感性基因组中具有该酶切位点，因此对6份血样处理后进行PCR，产物用限制酶ApoⅠ消化，酶解产物的电泳出现两条带则为敏感性，只有一条带的为抗性，所以1～6号血样中，来自于氯喹抗性患者的是2号和4号，B正确。 考点二　基因工程的应用及蛋白质工程 1．基因工程的应用 (1)基因工程的一般应用 (2)乳腺生物反应器 [提醒]　乳腺生物反应器是利用转基因动物的乳汁生产药用蛋白，而膀胱生物反应器是利用转基因动物的尿液生产药用蛋白，乳腺生物反应器是处于生殖期的雌性动物才可生产药用蛋白，而膀胱生物反应器则是任何生长期的雌雄动物均可生产。 2．蛋白质工程的原理和应用 (1)蛋白质工程的概念 (2)蛋白质工程的基本原理 (3)蛋白质工程的应用 ①医药工业方面：研发药物，如延长干扰素的保存时间；降低小鼠单克隆抗体诱发免疫反应的强度。 ②其他工业方面：改进酶的性能或开发新的工业用酶。 ③农业方面：通过改造某些参与调控光合作用的酶，增加粮食产量；改造微生物蛋白质的结构，设计优良微生物农药，防治病虫害。 1．正误判断 (1)乳腺生物反应器是将药用蛋白基因导入动物的乳腺细胞中。(×) (2)用基因工程的方法，使外源基因得到高效表达的菌类一般称为基因工程菌。(√) (3)由大肠杆菌工程菌获得人的干扰素后可直接应用。(×) 学生用书第365页 2．情境分析 基因工程用于提高植物抗逆能力，请思考回答下列转基因抗虫棉的相关问题： (1)从环境保护角度出发，分析转基因抗虫棉与普通棉相比在害虫防治方面的优越性有哪些？ 提示：减少了化学农药的使用量，降低了环境污染。 (2)种植转基因抗虫棉若干年后，害虫会不会对转基因抗虫棉产生抗性呢？ 提示：会。害虫会因遗传物质发生改变产生对转基因抗虫棉的抗性。 基因工程的应用实例分析 1．(2024·江西卷)γ-氨基丁酸在医药等领域有重要的应用价值。利用L-谷氨酸脱羧酶(GadB)催化L-谷氨酸脱羧是高效生产γ-氨基丁酸的重要途径之一。研究人员采用如图方法将酿酒酵母S的L-谷氨酸脱羧酶基因(gadB)导入生产菌株E.coli A，构建了以L-谷氨酸钠为底物高效生产γ-氨基丁酸的菌株E.coli B。下列叙述正确的是(　　) A．上图表明，可以从酿酒酵母S中分离得到目的基因gadB B．E.coli B发酵生产γ-氨基丁酸时，L-谷氨酸钠的作用是供能 C．E.coli A和E.coli B都能高效降解γ-氨基丁酸 D．可以用其他酶替代NcoⅠ和KpnⅠ构建重组质粒 答案：D 解析：不能直接从酿酒酵母S中分离得到目的基因gadB，只能分离得到含有目的基因gadB序列的染色体DNA，如题图所示，若要获取目的基因，需要进行PCR，A错误；题意显示，用L-谷氨酸脱羧酶(GadB)催化L-谷氨酸脱羧是高效生产γ-氨基丁酸的重要途径之一，E.coli B中能表达L-谷氨酸脱羧酶(GadB)，因此可用E.coli B发酵生产γ-氨基丁酸，该过程中L-谷氨酸钠的作用不是供能，B错误；由题意可知，构建的E.coli B可以高效生产γ-氨基丁酸，未提及E.coli A和E.coli B能高效降解γ-氨基丁酸，C错误；图中质粒下方括号内备注含多克隆位点，表明质粒上含有多种限制酶的识别序列，除了NcoⅠ和KpnⅠ外还有其他的限制酶可选，此外，PCR产物也未必非要用这两种酶，而是可以用同尾酶替代，D正确。 蛋白质工程应用实例 2．(2025·福州模拟)胰岛素用于治疗糖尿病，但胰岛素注射后易在皮下堆积，需较长时间才能进入血液，进入血液后又易被分解，因此治疗效果受到影响。下图是新的速效胰岛素的生产过程，有关叙述正确的是(　　) A．新的胰岛素的产生是依据基因工程原理完成的 B．新的胰岛素生产过程中不涉及中心法则 C．新的胰岛素产生过程中最困难的一步是由胰岛素分子结构推测氨基酸序列 D．若用大肠杆菌生产新的胰岛素，常用Ca2+处理大肠杆菌 答案：D 解析：新的胰岛素的产生是依据蛋白质工程原理完成的，A错误；新的胰岛素生产过程中涉及转录、翻译的过程，其涉及中心法则，B错误；新的胰岛素产生过程中最困难的一步是设计新的胰岛素分子的空间结构，C错误；把目的基因导入大肠杆菌，常用Ca2+处理大肠杆菌，使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，利于重组质粒的进入，D正确。 考点三　转基因产品的安全性，关注生殖性克隆人、禁止生物武器 1．对转基因产品安全性的争论 2．关注生殖性克隆人 (1)生殖性克隆与治疗性克隆 ①生殖性克隆是指通过克隆技术产生独立生存的新个体。 ②治疗性克隆是指利用克隆技术产生特定的细胞、组织和器官，用它们来修复或替代受损的细胞、组织和器官，从而达到治疗疾病的目的。 (2)生殖性克隆人面临的伦理问题 ①生殖性克隆人“有违人类尊严”。 ②生殖性克隆人是人为地制造在心理上和社会地位上都不健全的人。 学生用书第366页 ③克隆技术还不成熟，生殖性克隆人会面临流产、死胎和畸形儿等问题。 3．警惕用新技术研究生殖性克隆人 (1)利用化学诱导多能干细胞技术，有可能产生人的iPS细胞，从而产生克隆人。 (2)如果按照“人类基因组编写计划”合成人类的整个基因组，就有可能造出“无父母”人类或者拥有相同基因组的“克隆人”。 4．禁止生物武器 (1)种类：包括致病菌类、病毒类和生化毒剂类等。 (2)特点：致病能力强、攻击范围广。 (3)散布途径：直接或者通过食物、生活必需品和带菌昆虫等散布，经由呼吸道、消化道和皮肤等侵入人、畜体内，造成大规模伤亡，也能大量损害植物。 1．正误判断 (1)通过转基因技术生产药物只是转基因微生物方面的应用。(×) (2)转基因抗虫植物也抗病，种植过程中可以不施农药。(×) (3)如转基因植物的外源基因来源于自然界，则不会存在安全性问题。(×) (4)生殖性克隆人冲击了现有的一些有关婚姻、家庭和两性关系的伦理道德观念。(√) (5)天花病毒、波特淋菌、霍乱弧菌和炭疽杆菌都可以用来制造生物武器。(√) 2．情境分析 下面是试管婴儿及克隆人的培育流程图，回答下列问题。 Ⅰ.试管婴儿与设计试管婴儿的培育过程： Ⅱ.克隆人的培育过程： (1)Ⅰ中，①②③是试管婴儿的培育过程，①②④⑤是设计试管婴儿培育的过程。 (2)试管婴儿技术与克隆技术在技术环节上的主要差异是什么？ 提示：前者需要经过体外受精，后者需要用到动物细胞核移植技术。试管婴儿技术属于有性生殖，克隆技术属于无性生殖。 (3)治疗性克隆与生殖性克隆过程中胚胎的处理方式相同吗？有什么区别？ 提示：不相同。治疗性克隆获得的早期胚胎主要用于获得胚胎干细胞，然后诱导胚胎干细胞分化出所需的特定的组织、细胞和器官；在生殖性克隆过程中，获得的胚胎移入母体的子宫内发育成婴儿。 转基因产品的安全性 1．(2025·太原模拟)对转基因生物的安全性发生争论，与科学发展水平的限制有密切关系。下面关于基因的相关知识中，不可能是争论原因的是(　　) A．对基因的结构和调控机制等的了解仍相当有限 B．所转移的基因有不少是异种生物的基因 C．外源基因插入宿主基因组的部位往往是随机的 D．DNA重组技术需要有精心设计的“分子工具” 答案：D 解析：转基因生物是否安全关键在转移后的基因，而技术操作过程中所需的“分子工具”与转基因生物的安全性的关系不大，D符合题意。 理性看待克隆人 2．(2024·珠海模拟)人们利用生物技术对生物体进行不同层次的设计、控制、改造或模拟，产生巨大生产力的同时，也带来了多种涉及安全和伦理的问题。下列相关叙述合理的是(　　) A．如果有证据表明某种转基因食品有害，就应该禁止转基因技术的应用 B．试管婴儿技术已经成熟，移植前可对胚胎进行遗传学诊断和基因改造 C．利用转基因技术制造的新型致病菌具有极大的危害性，原因是人体不会对它们产生免疫反应 D．转基因马铃薯培育中，除目的基因外还导入了能使花粉失去活性的基因，从而减少基因污染的发生 答案：D 解析：转基因技术本身是中性的，如果确实有证据表明某种转基因食品有害，就应该禁止产品的使用，不应该禁止转基因技术的应用，A错误；试管婴儿技术已经成熟，移植前可对胚胎进行遗传学诊断，不涉及基因改造，B错误；转基因技术制造的新型致病菌，致病能力和传染能力以及抗药能力等大幅度增加，因而具有极大的危害性，C错误；转基因马铃薯培育中，除目的基因外还导入了能使花粉失去活性的基因，例如α-淀粉酶基因，可以阻断淀粉储藏使花粉失去活性，从而减少基因污染的发生，D正确。 有关禁止生物武器的理解 3．(2025·南京模拟)下列关于生物武器的说法，错误的是(　　) A．我们对待生物武器的态度应明确而坚定，坚决禁止研制生物武器 B．生物武器是利用致病菌、病毒或生化毒剂等形成杀伤力的 C．为了国家安全，可以进行必要的小范围的生物武器研究 D．生物武器不只是对敌方人员有伤害 答案：C 解析：生物武器几乎对所有人都具有杀伤力，是一种不人道的武器，应坚决禁止，C错误。 学生用书第367页 1．(2024·山东卷)关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法正确的是(　　) A．整个提取过程中可以不使用离心机 B．研磨液在4 ℃冰箱中放置几分钟后，应充分摇匀再倒入烧杯中 C．鉴定过程中DNA双螺旋结构不发生改变 D．仅设置一个对照组不能排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰 答案：A 解析：在DNA的粗提取与鉴定实验中，可将获得的研磨液用纱布过滤后，在4 ℃的冰箱中放置几分钟，再取上清液，也可以直接将研磨液用离心机进行离心后取上清液，A正确；研磨液在4 ℃冰箱中放置几分钟后，DNA在上清液中，应取上清液倒入烧杯中，B错误；鉴定过程中用沸水浴加热，DNA双螺旋结构会发生改变，C错误；加入二苯胺试剂后沸水浴处理的时间至少5分钟，且要等到冷却后再观察结果，这样才可以观察到较为明显的实验结果，仅设置一个对照组可以排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰，D错误。 2．(2024·河北卷)下列相关实验操作正确的是(　　) A．配制PCR反应体系时，加入等量的4种核糖核苷酸溶液作为扩增原料 B．利用添加核酸染料的凝胶对PCR产物进行电泳后，在紫外灯下观察结果 C．将配制的酵母培养基煮沸并冷却后，在酒精灯火焰旁倒平板 D．将接种环烧红，迅速蘸取酵母菌液在培养基上划线培养，获得单菌落 答案：B 解析：PCR的原理是DNA半保留复制，DNA的单体是脱氧核糖核苷酸，配制PCR反应体系时，加入4种脱氧核糖核苷酸的等量混合液作为扩增原料，A错误；琼脂糖凝胶制备中加入的核酸染料能与DNA分子结合，凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来，B正确；将配制的酵母培养基高压蒸汽灭菌，冷却到不烫手(50 ℃左右)后，在酒精灯火焰旁倒平板，C错误；将接种环烧红，待冷却后(避免菌种被烫死)，蘸取酵母菌液在培养基上划线培养，获得单菌落，D错误。 3．(2024·安徽卷)下列关于“DNA粗提取与鉴定”实验的叙述，错误的是(　　) A．实验中如果将研磨液更换为蒸馏水，DNA提取的效率会降低 B．利用DNA和蛋白质在酒精中的溶解度差异，可初步分离DNA C．DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同，该原理可用于纯化DNA粗提物 D．将溶解的DNA粗提物与二苯胺试剂反应，可检测溶液中是否含有蛋白质杂质 答案：D 解析：研磨液有利于DNA的溶解，换为蒸馏水，DNA提取的效率会降低，A正确；DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精，可初步分离DNA，B正确；DNA在NaCl溶液中的溶解度随着NaCl浓度的变化而改变，因此可用不同浓度的NaCl溶液对DNA进行粗提取的纯化，C正确；在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会变蓝色，二苯胺试剂用于鉴定DNA，D错误。 4．(2023·广东卷)种子大小是作物重要的产量性状。研究者对野生型拟南芥(2n＝10)进行诱变，筛选到一株种子增大的突变体。通过遗传分析和测序，发现野生型DA1基因发生一个碱基G到A的替换，突变后的基因为隐性基因，据此推测突变体的表型与其有关，开展相关实验。 学生用书第368页 回答下列问题： (1)拟采用农杆菌转化法将野生型DA1基因转入突变体植株，若突变体表型确由该突变造成，则转基因植株的种子大小应与　　　　植株的种子大小相近。 (2)用PCR反应扩增DA1基因，用限制性内切核酸酶对PCR产物和 　　　　进行切割，用DNA连接酶将两者连接。为确保插入的DA1基因可以正常表达，其上下游序列需具备　　　　。 (3)转化后，T-DNA(其内部基因在减数分裂时不发生交换)可在基因组单一位点插入也可以同时插入多个位点。在插入片段均遵循基因分离及自由组合定律的前提下，选出单一位点插入的植株，并进一步获得目的基因稳定遗传的植株(如图)，用于后续验证突变基因与表型的关系。 ①农杆菌转化T0代植株并自交，将T1代种子播种在选择培养基上，能够萌发并生长的阳性个体即表示其基因组中插入了　　　　　　　　　　　　　　。 ②T1代阳性植株自交所得的T2代种子按单株收种并播种于选择培养基，选择阳性率约　　　　%的培养基中幼苗继续培养。 ③将②中选出的T2代阳性植株　　　　(填“自交”“与野生型杂交”或“与突变体杂交”)所得的T3代种子按单株收种并播种于选择培养基，阳性率达到　　　　%的培养基中的幼苗即为目标转基因植株。 为便于在后续研究中检测该突变，研究者利用PCR扩增野生型和突变型基因片段，再使用限制性内切核酸酶X切割产物，通过核酸电泳即可进行突变检测，相关信息见下，在电泳图中将酶切结果对应位置的条带涂黑。 答案：(1)野生型　(2)载体(基因表达载体)　启动子和终止子　(3)①DA1基因和卡那霉素抗性基因　②75　③自交　100 解析：(1)根据题干信息可知，突变后的基因为隐性基因，则野生型DA1基因为显性基因，因此采用农杆菌转化法将野生型DA1基因转入突变体植株，若突变体表型确由该突变造成，则转基因植株的种子大小应与野生型植株的种子大小相近。(2)利用PCR技术扩增DA1基因后，应该用同种限制性内切核酸酶对DA1基因和载体进行切割，再用DNA连接酶将两者连接起来；在基因表达载体中，启动子位于目的基因的首端，终止子位于目的基因的尾端，因此为确保插入的DA1基因可以正常表达，其上下游序列需具备启动子和终止子。(3)①根据题图分析，将T0代植株的花序浸没在农杆菌(T-DNA上含有DA1基因和卡那霉素抗性基因)菌液中转化，再将获得的T1代种子播种在选择培养基(含有卡那霉素)上，若在选择培养基上有能够萌发并生长的阳性个体，则说明含有卡那霉素抗性基因，即表示其基因组中插入DA1基因和卡那霉素抗性基因。②T1代阳性植株都含有DA1基因，由于T-DNA(其内部基因在减数分裂时不发生交换)可在基因组单一位点插入也可以同时插入多个位点，所以不确定是单一位点插入还是多位点插入，若是单一位点插入，相当于一对等位基因的杂合子，其自交后代应该出现3∶1的性状分离比，而题干要求选出单一位点插入的植株，因此应该选择阳性率约75%的培养基中幼苗继续培养。③将以上获得的T2代阳性植株自交，再将得到的T3代种子按单株收种并播种于选择培养基上，若某培养基上全部为具有卡那霉素抗性的植株即为需要选择的植株，即阳性率达到100%的培养基中的幼苗即为目标转基因植株。据图分析，野生型和突变型基因片段的长度都是150 bp，野生型的基因没有限制酶X的切割位点，而突变型的基因有限制酶X的切割位点，结合图中的数据分析可知，电泳图中，野生型只有150 bp，突变型有50 bp和100 bp，如答案图示。 CRISPR/Cas9基因编辑系统是由Cas9核酸酶与单链向导RNA(sgRNA)形成的稳定核糖核蛋白复合物，能识别和切割特定的核苷酸片段，该系统可用于基因的敲除、编辑、表达调控等诸多领域。如图为酿脓链球菌Cas9核酸酶(SpyCas9)在sgRNA指导下，对靶位点进行切割产生DNA双链断裂的过程示意图。 角度一　获取信息，解答问题 (1)CRISPR/Cas9系统所含有的化学组分与细胞内的　　　　(细胞器)相似，研究发现该系统仅存在于细菌和古菌中，是这些原核生物经过长期进化形成的抵御　　　　、　　　　等入侵的免疫机制。 (2)早期CRISPR/Cas9基因编辑技术的应用有一些限制条件：首先，待编辑的区域附近需要存在相对保守的PAM序列(NGG，N为任意碱基)；其次，sgRNA的　　　　端要与PAM上游的序列碱基互 学生用书第369页 补配对。sgRNA双链区和识别序列的杂合区相比较，后者特有的碱基配对方式是　　　　。对PAM序列的依赖妨碍了CRISPR/Cas9的应用，研究人员尝试通过突变的方法拓宽PAM序列的范围，研制出的SpG突变体需要的PAM序列为NGN，该突变将PAM序列的范围扩大到原来的　　　　倍。 角度二　原理分析，长句表达 (3)CRISPR/Cas9基因编辑技术可用于外源基因导入，与传统的基因工程相比，其明显的优点是___________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________。 虽然CRISPR/Cas9基因编辑技术在科学研究中有着广泛的应用，但是科学界仍然反对对人类进行基因编辑。你认为可能的原因是_________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________。 同时，CRISPR/Cas9基因编辑技术有时存在编辑对象出错而造成脱靶。实验发现，向导RNA的序列长短影响成功率，序列越短脱靶率越高。试分析脱靶最可能的原因：________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________。 答案：(1)核糖体　噬菌体　质粒　(2)5′　A—T　4　(3)该技术目的性强，靶向准确，避免了因目的基因随机插入宿主细胞DNA引起的生物安全性问题　一方面存在伦理道德方面的问题，另一方面是技术本身还是存在一些不完善的地方，比如生物体内的基因和性状并非一一对应，被敲除基因可能存在一因多效的现象，从而影响其他性状的表达过程　由于向导RNA序列短，特异性不够高，其他DNA序列也含有与向导RNA互补配对的序列，造成向导RNA错误结合而脱靶 解析：(1)CRISPR/Cas9系统是由一条单链向导RNA和Cas9核酸酶组成的核糖核蛋白复合物，核糖体也是由RNA和蛋白质组成的，故细胞中与CRISPR/Cas9系统在物质组成上最相似的结构是核糖体。由于该基因编辑系统能识别和切割特定的核苷酸片段，即能将外源DNA切断，使其不能表达，所以该系统仅存在于细菌和古菌中，是这些原核生物经过长期进化形成的抵御噬菌体、质粒等入侵的免疫机制。(2)根据图示可知，sgRNA的5′端要与PAM上游的序列碱基互补配对。sgRNA双链区是由RNA和RNA配对形成的(碱基配对方式为A—U、U—A、G—C、C—G)，而其识别序列的杂合区是RNA和DNA的碱基配对(碱基配对方式为A—T、U—A、G—C、C—G)，所以后者特有的碱基配对方式是A—T。早期CRISPR/Cas9基因编辑技术应用时，待编辑的区域附近需要存在相对保守的PAM序列(NGG，N为任意碱基)；若SpG突变体需要的PAM序列为NGN，即PAM序列由NGG变为NGA、NGC、NGG、NGT，所以该突变将PAM序列的范围扩大到原来的4倍。(3)CRISPR/Cas9基因编辑技术可用于外源基因导入，与传统的基因工程相比，其明显的优点是该技术目的性强，靶向准确，避免了因目的基因随机插入宿主细胞DNA引起的生物安全性问题。虽然基因编辑技术在科学研究中有着广泛的应用，但是科学界仍然反对对人类进行基因编辑，其原因是一方面存在伦理道德方面的问题，另一方面是技术本身还是存在一些不完善的地方，比如生物体内的基因和性状并非一一对应，被敲除基因可能存在一因多效的现象，从而影响其他性状的表达过程。脱靶的原因可能是由于向导RNA序列短，特异性不够高，其他DNA序列也可能含有与向导RNA互补配对的序列，所以容易造成向导RNA错误结合而脱靶。 学科网（北京）股份有限公司 $