第10单元 6 第48讲 基因工程的基本工具和操作程序（教师用书Word）-【金版新学案】2026年高考生物高三总复习大一轮复习讲义（人教版 广东专版）

该高中生物学讲义聚焦基因工程核心考点，涵盖重组DNA技术工具（限制酶、DNA连接酶、载体）和操作程序（目的基因获取、表达载体构建等），按“理论基础-工具特性-程序步骤”逻辑架构知识，通过考点梳理（如工具酶作用对比）、方法指导（双酶切选择策略）、真题训练（2024年多省高考题）等环节，助力学生系统突破难点。 资料以科学思维和探究实践为导向，设计“限制酶切割末端分析”“PCR引物设计情境题”等活动，结合分层练习（正误判断、综合应用题）强化理解，有效提升学生解题能力，为教师精准把控复习节奏提供清晰教学路径。

第48讲　基因工程的基本工具和操作程序 课标要求 1．阐明DNA重组技术的实现需要三种基本工具。　2．阐明基因工程的基本操作程序。 考情分析 1．基因工程的基本工具(2024·湖南卷T5；2024·江西卷T19；2023·新课标卷T6；2021·全国乙卷T38；2021·湖北卷T7) 2．基因工程的基本操作程序(2024·广东卷T21；2024·新课标卷T38；2024·全国甲卷T38；2024·山东卷T25；2024·安徽卷T20；2024·甘肃卷T21；2024·湖南卷T21；2024·北京卷T20；2024·江西卷T19；2024·贵州卷T21；2024·重庆卷T20) 考点一　重组DNA技术的基本工具 1．基因工程的理论基础 2．重组DNA技术的基本工具 (1)限制性内切核酸酶(简称“限制酶”) (2)DNA连接酶 [提醒]　DNA连接酶和DNA聚合酶不是一回事：①DNA连接酶连接的是两个DNA片段，而DNA聚合酶是把单个的脱氧核苷酸连接到已有的DNA片段上。②DNA聚合酶起作用时需要以一条DNA链为模板，而DNA连接酶不需要模板。 (3)载体 [提醒]　具有能自我复制、有一个或多个限制酶切割位点、有标记基因及对受体细胞无害等特点的DNA分子才可以直接用作基因工程的载体。实际上天然的DNA分子一般不完全具备上述条件，往往需要进行人工改造后才能用于基因工程操作。 1．正误判断 (1)限制性内切核酸酶、DNA连接酶和质粒是基因工程中常用的三种工具酶。(×) (2)E.coli DNA连接酶既可连接平末端，又可连接黏性末端。(√) (3)限制酶也可以识别和切割RNA。(×) 2．情境分析 如图限制酶Ⅰ的识别序列和切点是，限制酶Ⅱ的识别序列和切点是，据图思考下列问题。 学生用书第353页 (1)请用图示法写出限制酶Ⅰ和限制酶Ⅱ切割后形成末端的过程。 提示：限制酶Ⅰ：； 限制酶Ⅱ：。 (2)切割图示中的目的基因和质粒应选用哪类限制酶？为什么？ 提示：用限制酶Ⅱ切割目的基因，用限制酶Ⅰ切割质粒。限制酶Ⅰ的识别序列包含限制酶Ⅱ的识别序列，因此限制酶Ⅱ也可切割限制酶Ⅰ的位点，故使用限制酶Ⅱ时，可在目的基因两端同时切割，从而切出“目的基因”，但若使用限制酶Ⅱ切割质粒，会同时破坏质粒中的两个“标记基因”，故只能使用限制酶Ⅰ切割质粒。 1．限制酶的选择 (1)不破坏目的基因原则：如图甲中可选择PstⅠ，而不选择SmaⅠ。 (2)保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则：质粒作为载体必须具备标记基因等，所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择SmaⅠ。若载体上有两个及以上的标记基因，则可合理对其中一些标记基因进行酶切破坏。 (3)善用“双酶切”，注意方向性：目的基因所在序列和载体上存在多种酶切位点时，一般需要选择在目的基因所在序列和载体上都存在切割位点的两种不同的限制酶，对目的基因所在序列和载体进行剪切，即“双酶切法”。其优点和作用是：①防止目的基因自身环化；②避免目的基因与载体反向连接，即用DNA连接酶连接后形成的重组DNA分子上，目的基因和载体启动子的方向(或描述为“RNA聚合酶的移动方向”)必须是相同的，否则目的基因导入后无法正常表达。如图甲、乙也可选择PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶。 (4)巧用“同尾酶”：同尾酶指来源不同，但能产生相同黏性末端的限制酶。当不适合选择某种限制酶时，可用其同尾酶替换，以获得相同的黏性末端。 2．标记基因可用于检测目的基因是否导入受体细胞 基因工程工具酶的使用 1．(2023·新课标卷)某同学拟用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA连接酶为工具，将目的基因(两端含相应限制酶的识别序列和切割位点)和质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。 下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是(　　) A．质粒和目的基因都用酶3切割，用E.coli DNA连接酶连接 B．质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4 DNA连接酶连接 C．质粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4 DNA连接酶连接 D．质粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E.coli DNA连接酶连接 答案：C 解析：酶3切割后得到的是平末端，E.coli DNA连接酶连接具有平末端的DNA片段的效率远低于T4 DNA连接酶，应该用T4 DNA连接酶连接，A错误；质粒用酶3切割后得到平末端，目的基因用酶1切割后得到的是黏性末端，二者不能连接，B错误；质粒和目的基因都用酶1和酶2切割后得到黏性末端，用T4 DNA连接酶连接后，还能保证目的基因在质粒上的连接方向，此重组表达载体的构建方案最合理且高效，C正确；若用酶2和酶4切割质粒和目的基因，会破坏质粒上的抗生素抗性基因，连接形成的基因表达载体缺少标记基因，无法进行后续的筛选，D错误。 载体的作用及特点 2．(2025·济南模拟)如图为某种质粒的简图，小箭头所指分别为限制性内切核酸酶EcoRⅠ、BamHⅠ的酶切位点，P为转录的启动部位。已知目的基因 学生用书第354页 的两端有EcoRⅠ、BamHⅠ的酶切位点，受体细胞为无任何抗药性的原核细胞。下列叙述正确的是(　　) A．将含有目的基因的DNA与质粒分别用EcoRⅠ酶切，在DNA连接酶作用下，生成的由两个DNA片段连接形成的产物有两种 B．DNA连接酶的作用是将酶切后得到的黏性末端连接起来，形成一个重组质粒时形成两个磷酸二酯键 C．为了防止目的基因反向连接和质粒自身环化，酶切时可选用的酶是EcoRⅠ和BamHⅠ D．能在含青霉素的培养基中生长的受体细胞中已成功导入该目的基因 答案：C 解析：根据题意，目的基因的两端有EcoRⅠ、BamHⅠ的酶切位点，将含有目的基因的DNA用EcoRⅠ酶切，会得到目的基因片段；根据质粒的简图可知，将质粒用EcoRⅠ酶切，会得到与质粒周长等长的链状DNA；因此将含有目的基因的DNA与质粒分别用EcoRⅠ酶切，在DNA连接酶作用下，可生成目的基因—目的基因片段、目的基因—质粒片段、质粒—质粒片段三种产物，A错误。DNA连接酶的作用是将酶切后得到的黏性末端连接起来形成一个重组质粒，该过程形成四个磷酸二酯键，B错误。EcoRⅠ和BamHⅠ的识别序列不同，获取目的基因和切割质粒时，同时选用EcoRⅠ和BamHⅠ切割，目的基因两端形成的末端不同，切割后的质粒两端形成的末端不同，再用DNA连接酶连接，可以防止目的基因反向连接和质粒自身环化，C正确。导入普通质粒和导入重组质粒的原核细胞都能在含青霉素的培养基中生长，因此能在含青霉素的培养基中生长的受体细胞不一定含有目的基因，D错误。 考点二　基因工程的基本操作程序 1．目的基因的筛选与获取 (1)目的基因：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。 (2)筛选合适的目的基因 ①从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。 ②利用序列数据库和序列比对工具等进行筛选。 (3)目的基因的获取 ①人工合成目的基因。 ②利用PCR获取和扩增目的基因 ③通过构建基因文库来获取目的基因。 [提醒]　PCR反应缓冲液中一般要添加Mg2+，以激活DNA聚合酶。引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。 2．基因表达载体的构建——基因工程的核心 (1)目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。 (2)基因表达载体的组成及作用 (3)构建过程 3．将目的基因导入受体细胞 生物 种类 植物 动物 微生物 常用 方法 农杆菌转化法、花粉管通道法 显微注射法 Ca2＋处理法 受体 细胞 体细胞或受精卵 受精卵 原核细胞 转化 过程 将目的基因插入Ti质粒的T-DNA中→农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞的染色体DNA上→表达 将含有目的基因的表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物 Ca2＋处理细胞→细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态→重组基因表达载体导入 [提醒]　(1)农杆菌特点：①能在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有侵染能力。②农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T-DNA转移到被侵染的细胞中，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。 (2)农杆菌转化法中的两次拼接：第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上，第二次拼接(非人工操作)是将插入目的基因的T-DNA拼接到受体细胞的染色体DNA上；两次导入：第一次导入是将含目的基因的Ti质粒导入农杆菌，第二次导入(非人工操作)是将含目的基因的T-DNA导入受体细胞。 (3)导入的目的基因，可能存在于细胞质中，也可能整合到染色体DNA上。存在于染色体DNA上的目的基因有可能通过花粉传播进入杂草或其他作物中，造成“基因污染”。 4．目的基因的检测与鉴定 1．正误判断 (1)引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。(√) (2)转化是指目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。(√) (3)抗虫基因即使成功地插入植物细胞染色体DNA上也未必能正常表达。(√) 2．情境分析 根据PCR反应过程示意图分析下列问题。 (1)什么是引物？DNA复制时为什么需要引物？ 提示：引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。在DNA扩增时，DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从引物的3′端延伸DNA链，因此复制DNA时应加入两种引物。 (2)某同学设计的图示两组引物，是否合理，请分别说明理由？ 提示：不合理。引物Ⅰ和引物Ⅱ局部发生碱基互补配对而失效，引物Ⅰ′自身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效。 (3)为检测目的基因Bt基因在转基因抗虫棉细胞中是否转录，科研人员提取棉花细胞中的总RNA，经逆转录过程获得总cDNA，通过PCR技术可在总cDNA中专一性地扩增出Bt基因的cDNA，原因是什么？ 提示：引物是依据Bt抗虫蛋白基因的一段已知序列设计合成的(或引物能与Bt基因的cDNA特异性结合)。 PCR技术和细胞内DNA复制的比较 学生用书第356页 基因表达载体的构建过程分析 1．(2023·湖北卷)用氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、四环素抗性基因(TetR)作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体(重组质粒)，并转化到受体菌中。下列叙述错误的是(　　) A．若用HindⅢ酶切，目的基因转录的产物可能不同 B．若用PvuⅠ酶切，在含Tet(四环素)培养基中的菌落，不一定含有目的基因 C．若用SphⅠ酶切，可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否 D．若用SphⅠ酶切，携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)和Tet的培养基中能形成菌落 答案：D 解析：若用HindⅢ酶切，目的基因可能正向插入，也可能反向插入，转录的产物可能不同，A正确；若用PvuⅠ酶切，重组质粒和质粒中都有四环素抗性基因(TetR)，因此在含Tet(四环素)培养基中的菌落，不一定含有目的基因，B正确；DNA凝胶电泳技术可以分离不同大小的DNA片段，重组质粒的大小与质粒不同，能够鉴定重组质粒构建成功与否，C正确；SphⅠ的酶切位点位于四环素抗性基因中，若用SphⅠ酶切，会破坏四环素抗性基因，重组质粒中含氨苄青霉素抗性基因(AmpR)，因此携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)的培养基中能形成菌落，在含Tet的培养基中不能形成菌落，D错误。 目的基因的检测与鉴定实例分析 2．(2024·梅州模拟)光敏色素基因在调节作物生长发育中具有重要作用。为探讨玉米中光敏色素基因A(含大约256个碱基对)在棉花种质资源创制中的利用价值，研究人员将A基因转入到棉花中，对棉花受体细胞进行检测，并通过电泳技术分析结果。该过程所用质粒与含光敏色素基因的DNA上相关限制酶的酶切位点分别如图甲、乙所示，电泳检测结果如图丙。下列相关叙述正确的是(　　) 　 A．为构建正确连接的表达载体，应选用BamHⅠ和HindⅢ这两种限制酶 B．PCR扩增目的基因过程中每次循环都要经历一次升温和两次降温 C．表达载体导入受体细胞后，可用含四环素的选择培养基进行初步筛选 D．由图丙电泳结果可知，1、2、3、4号转基因棉花均培育成功 答案：C 解析：由图可知，构建基因表达载体时，应选用BclⅠ和HindⅢ这两种限制酶，若用BamHⅠ，则会破坏质粒上的两种标记基因，不利于后续的筛选，A错误；PCR反应过程中每次循环都要经历目的各不相同的两次升温(第一次使目的基因变性，第二次使目的基因延伸)和一次降温(使目的基因复性)，B错误；在构建基因表达载体的过程中，卡那霉素抗性基因被破坏，而四环素抗性基因在目的基因表达载体中存在，因此，在表达载体导入受体细胞后，可用含四环素的选择培养基进行初步筛选，而后再通过含有卡那霉素的培养基进行再次筛选，筛选出含有目的基因的受体细胞，C正确；光敏色素基因A含大约256个碱基对，由图丙电泳结果可知，1、2、3、4号均成功导入光敏色素基因A，但转基因棉花是否培育成功还需要进行个体生物学水平的鉴定，D错误。 学生用书第357页 1．(2024·广东卷)关于技术进步与科学发现之间的促进关系，下列叙述正确的是(　　) A．电子显微镜的发明促进细胞学说的提出 B．差速离心法的应用促进对细胞器的认识 C．光合作用的解析促进花期控制技术的成熟 D．RNA聚合酶的发现促进PCR技术的发明 答案：B 解析：电子显微镜的发明是在细胞学说提出之后，细胞学说的提出主要基于光学显微镜下的观察和研究，A错误；差速离心法可以通过不同的离心速率将细胞内大小、密度不同的细胞器分离开来，促进对细胞器的认识，B正确；光合作用的解析主要是对植物的光合作用机制进行研究，而花期控制技术更多地涉及到植物激素、环境因素等方面的知识，光合作用的解析与花期控制技术的成熟关系不大，C错误；PCR技术的发明并非直接由于RNA聚合酶的发现，PCR技术的关键在于耐高温的DNA聚合酶的应用，D错误。 2．(2024·湖南卷)某同学将质粒DNA进行限制酶酶切时，发现DNA完全没有被酶切，分析可能的原因并提出解决方法。下列叙述错误的是(　　) A．限制酶失活，更换新的限制酶 B．酶切条件不合适，调整反应条件如温度和酶的用量等 C．质粒DNA突变导致酶识别位点缺失，更换正常质粒DNA D．酶切位点被甲基化修饰，换用对DNA甲基化不敏感的限制酶 答案：B 解析：限制酶失活会使DNA完全没有被酶切，此时应更换新的限制酶，A正确；酶切条件不合适可能使酶失活，无法发挥作用，但限制酶的用量过多或过少都不会出现DNA完全没有被酶切的情况，B错误；质粒DNA突变会导致限制酶识别位点缺失，进而造成限制酶无法进行切割，此时应更换为正常质粒，C正确；质粒DNA上酶切位点被甲基化修饰，会导致对DNA甲基化敏感的限制酶无法进行酶切，此时应换用对DNA甲基化不敏感的限制酶，D正确。 3．(2024·山东卷)制备荧光标记的DNA探针时，需要模板、引物、DNA聚合酶等。在只含大肠杆菌DNA聚合酶、扩增缓冲液、H2O和4种脱氧核苷酸(dCTP、dTTP、dGTP和碱基被荧光标记的dATP)的反应管①～④中，分别加入如表所示的适量单链DNA。已知形成的双链DNA区遵循碱基互补配对原则，且在本实验的温度条件下不能产生小于9个连续碱基对的双链DNA区。能得到带有荧光标记的DNA探针的反应管有(　　) 反应管 加入的单链DNA ① 5′-GCCGATCTTTATA-3′ 3′-GACCGGCTAGAAA-5′ ② 5′-AGAGCCAATTGGC-3′ ③ 5′-ATTTCCCGATCCG-3′ 3′-AGGGCTAGGCATA-5′ ④ 5′-TTCACTGGCCAGT-3′ A．①② B．②③ C．①④ D．③④ 答案：D 解析：分析反应管①～④中分别加入的适量单链DNA可知，①中两条单链DNA分子之间具有互补的序列，但双链DNA区之外的3′端无模板，因此无法进行DNA合成，不能得到带有荧光标记的DNA探针；②中单链DNA分子内具有自身互补的序列，由于在本实验的温度条件下不能产生小于9个连续碱基对的双链DNA区，故一条单链DNA分子不发生自身环化，但两条链可以形成双链DNA区，由于DNA合成的链中不含碱基A，不能得到带有荧光标记的DNA探针；③中两条单链DNA分子之间具有互补的序列，且双链DNA区之外的3′端有模板和碱基T，因此进行DNA合成能得到带有荧光标记的DNA探针；④中单链DNA分子内具有自身互补的序列，一条单链DNA分子不发生自身环化，两条链可以形成双链DNA区，且双链DNA区之外的3′端有模板和碱基T，因此进行DNA合成能得到带有荧光标记的DNA探针。综上，能得到带有荧光标记的DNA探针的反应管有③④。 4．(2024·重庆卷)大豆是重要的粮油作物，提高大豆产量是我国农业领域的重要任务。我国研究人员发现，基因S在大豆品种DN(种子较大)中的表达量高于品种TL(种子较小)，然后克隆了该基因(两品种中基因S序列无差异)及其上游的启动子序列，并开展相关研究。 (1)基因S启动子的基本组成单位是_______________________________。 (2)通过基因工程方法，将DN克隆的“启动子D＋基因S”序列导入无基因S的优质大豆品种YZ。根据题图所示信息(不考虑未标明序列)判断构建重组表达载体时，为保证目标序列的完整性，不宜使用的限制酶是　　　　；此外，不宜同时选用酶SpeⅠ和XbaⅠ。原因是___________________________________ _________________________________________________________________。 (3)为验证“启动子D＋基因S”是否连接在表达载体上，可用限制酶对重组表达载体酶切后进行电泳。电泳时，对照样品除指示分子大小的标准参照物外，还应有　　　　　　　　　　　　　　　。经验证的重组表达载体需转入农杆菌，检测转入是否成功的技术是　　　　。 (4)用检测后的农杆菌转化品种YZ所得再生植株YZ-1的种子变大。同时将从TL克隆的“启动子T＋基因S”序列成功导入YZ，所得再生植株YZ-2的种子也变大，但小于YZ-1。综合分析，大豆品种DN较TL种子大的原因是_________________________________________________________________ _________________________________________________________________。 答案：(1)脱氧核糖核苷酸(脱氧核苷酸)　(2)EcoRⅠ　酶切后形成的片段黏性末端相同，易自身环化；不能保证目标片段与载体定向连接(正向连接)　(3)酶切后的空载体片段，启动子D＋基因S片段　PCR　(4)品种DN的基因S上游启动子效应比TL的强，使得基因S表达量更高，种子更大 解析：(1)启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，用于启动DNA的转录，是一段DNA片段，其基本组成单位是四种脱氧核糖核苷酸。(2)①根据图示信息可知，“启动子D＋基因S”的DNA序列上存在EcoRⅠ的识别序列，若使用限制酶EcoRⅠ，会使目标序列被破坏。②根据图中限制酶的识别序列可知，酶SpeⅠ和XbaⅠ切割产生的黏性末端相同，若用这两种限制酶切割，形成的DNA片段在构建基因表达载体时，容易出现自身环化，以及无法保证目的基因片段与载体片段正向连接，影响目的基因在受体细胞中的表达。(3)①DNA电泳可以分离不同大小的DNA片段，用限制酶对重组表达载体酶切后的产物不仅有“启动子D＋基因S”片段，还有酶切后的空载体片段，因此电泳时，对照样品除指示分子大小的标准参照物外，还应有酶切后的空载体片段和“启动子D＋基因S”片段。②在分子水平上检测目的基因是否转入成功，可通过PCR等技术检测受体细胞的DNA上是否插入目的基因或目的基因是否转录出mRNA。(4)根据(4)题目信息可知，再生植株YZ-1导入的目的基因为取自品种DN的“启动子D＋基因S”序列，再生植株YZ-2导入的目的基因为取自品种TL的“启动子T＋基因S”序列，结合题干信息“两品种中基因S序列无差异”可推测：品种DN的基因S上游的启动子D的效应强于品种TL的启动子，启动子D使基因S表达量更高，因而种子更大。 学生用书第358页 丙酮酸羧化酶(PEP)是控制油菜中蛋白质与油脂比例的关键酶。PEP反义基因是指反向连接在启动子之后的PEP基因，其在转录时的模板链为PEP基因模板链的互补链。PEP反义基因可抑制PEP基因的表达，从而提高油菜籽中的油脂含量。图甲为某种质粒的结构，其中neo 为新霉素抗性基因，gus基因控制合成的酶能使β-葡萄糖苷酸水解为蓝色物质，图乙为PEP基因的结构。 角度一　获取信息，解答问题 (1)为方便将PEP反义基因与质粒连接，一般将限制酶的识别序列设计在引物上，在图乙中，与PEP基因上游结合的引物中应引入　　　　的识别序列。 角度二　原理分析，长句表达 (2)质粒上neo 的作用是　　　　　　　　　　　　　　　　。将质粒和PEP反义基因连接后，再与农杆菌菌液温育一段时间，涂布到含有新霉素和β-葡萄糖苷酸的平板上。一段时间后，在平板上长出白色和蓝色两种菌落，其中符合要求的是　　　　，理由是__________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________。 (3)PEP反义基因可有效抑制PEP基因的表达，推测其原理是_________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________。 答案：(1)SacⅠ　(2)便于重组DNA分子筛选　白色菌落　PEP反义基因需连接在质粒的启动子2的后面，构建重组DNA分子时已将gus基因切除，含重组DNA分子的细胞不能合成使β-葡萄糖苷酸水解的酶　(3)PEP反义基因转录的RNA可与PEP基因转录的mRNA结合，从而抑制了PEP基因的表达 (2024·山东卷)研究发现基因L能够通过脱落酸信号途径调控大豆的逆境响应。利用基因工程技术编辑基因L，可培育耐盐碱大豆品系。在载体上的限制酶BsaⅠ切点处插入大豆基因L的向导DNA序列，将载体导入大豆细胞后，其转录产物可引导核酸酶特异性结合基因组上的目标序列并发挥作用。载体信息、目标基因L部分序列及相关结果等如图所示。 (1)用PCR技术从大豆基因组DNA中扩增目标基因L时，所用的引物越短，引物特异性越　　　　(填“高”或“低”)。限制酶在切开DNA双链时，形成的单链突出末端为黏性末端，若用BsaⅠ酶切大豆基因组DNA，理论上可产生的黏性末端最多有　　　　种。载体信息如图甲所示，经BsaⅠ酶切后，载体上保留的黏性末端序列应为5′-　　　　-3′和5′-　　　　-3′。 学生用书第359页 (2)重组载体通过农杆菌导入大豆细胞，使用抗生素　　　　筛选到具有该抗生素抗性的植株①～④。为了鉴定基因编辑是否成功，以上述抗性植株的DNA为模板，通过PCR扩增目标基因L，部分序列信息及可选用的酶切位点如图乙所示，PCR产物完全酶切后的电泳结果如图丙所示。据图可判断选用的限制酶是　　　　，其中纯合的突变植株是　　　　(填序号)。 (3)实验中获得1株基因L成功突变的纯合植株，该植株具有抗生素抗性，检测发现其体细胞中只有1条染色体有T-DNA插入。用抗生素筛选这个植株的自交子代，其中突变位点纯合且对抗生素敏感的植株所占比例为　　　　，筛选出的敏感植株可用于后续的品种选育。 [信息审读] 关键信息 信息加工 引物特异性 筛选到具有该抗生素抗性的植株 其体细胞中只有1条染色体有T-DNA插入。用抗生素筛选这个植株的自交子代 引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。用于PCR的引物长度通常为20～30个核苷酸，所用的引物越短，则引物的特异性就越低 基因表达载体中标记基因可用于目的基因的筛选，根据图示信息可知，(2)重组载体通过农杆菌导入大豆细胞当中的片段包含了卡那霉素抗性基因，因此可以通过使用卡那霉素筛选到具有该抗生素抗性的植株 (3)经过检测发现其体细胞中只有一条染色体含有T-DNA插入。根据图示可知，抗生素抗性基因在T-DNA片段上，因此如果用抗生素来筛选，该植株进行自交，可知其配子中含有抗生素抗性基因的比例为1/2，不含T-DNA(对抗生素敏感)的配子比例为1/2，因此突变位点纯合且对抗生素敏感的植株所占比例应该为1/2×1/2＝1/4，可以筛选出敏感植株用于后续的品种选育 [思维路径] [规范作答] (1)低　256　GTTT　CAAT (2)卡那霉素　SacⅠ　④ (3)1/4 [方法归纳]　“四步法”把控基因工程基本操作程序题 (1)三辨—分辨限制酶的种类、识别序列和切割位点。在切割目的基因和载体时，一般用不同的限制酶切割。 (2)三找—找出标记基因、目的基因及其插入位点。一般来说，质粒中至少有一个标记基因，如抗生素抗性基因。明确目的基因的插入位点是在标记基因内部还是在标记基因之外。 (3)一析—分析目的基因插入质粒后是否破坏了标记基因。如果质粒中有一个标记基因，则插入目的基因后不能破坏标记基因；如果质粒中有两个标记基因，则需看标记基因中是否有插入位点，如果某一标记基因中有插入位点，则目的基因插入质粒后该标记基因被破坏。 (4)一定—确定判断目的基因是否导入受体细胞的方法。一般用含有某种抗生素的培养基培养受体菌，如果有两种抗生素抗性基因，还需判断用哪一种抗生素来检测。 学生用书第360页 1．(2024·山东济南三模)基因SLC能控制合成5-羟色胺转运体(5-HTT蛋白)。机体缺氧可以诱导神经细胞PC12凋亡和5-HTT蛋白表达量升高。为探究5-HTT蛋白表达的变化对缺氧神经细胞的影响，科研人员构建了带有基因shSLC(其结构如图1所示)和绿色荧光蛋白基因GFP的重组质粒(如图2所示)并进行了相关检测。shSLC通过转录得到的shRNA(如图3所示)可用于干扰基因SLC翻译过程，而使其沉默。 (1)将图1中人工合成的大量A链和B链与缓冲液共同放入PCR仪中，经 　　　和　　　　过程可得到shSLC。 (2)shSLC可以和经AgeⅠ和EcoRⅠ双酶切的载体相连的原因是_________________________________________________________________ _________________________________________________________________。 对构建成功的载体鉴定时，最好使用　　　　(填“AgeⅠ”“EcoRⅠ”或“KpnⅠ”)完成酶切，然后通过凝胶电泳将酶切后产生的不同长度DNA片段分离出来，从而完成鉴定过程。若用A链做引物F1，B链做引物R1，其位置如上图所示。另有引物F2和引物R2，鉴定构建成功的载体，一般利用　　　　(填“F1和R2”或“F2和R2”)进行PCR并对扩增目的产物进行测序验证，使用所选引物的原因是____________________________________________________ _________________________________________________________________。 (3)表达载体转染PC12细胞后，可通过荧光显微镜下观察细胞　　　　的表达进行鉴定；据图4分析转染shSLC组中5-HTT蛋白表达量　　　　。 (4)检测发现对照组正常情况下细胞凋亡率6.30%，缺氧24 h后细胞凋亡率14.24%；转染shSLC组正常情况下细胞凋亡率6.38%，缺氧24 h细胞凋亡率9.10%。据此可得出的结论是__________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________。 答案：(1)变性　复性　(2)载体被AgeⅠ和EcoRⅠ双酶切后产生了与shSLC相同的黏性末端　AgeⅠ　F2和R2　因为使用F1进行PCR易形成发卡结构，可能导致不会出现目标产物　(3)绿色荧光蛋白　降低　(4)正常条件下沉默SLC基因对细胞凋亡无影响，缺氧后沉默SLC基因的PC12细胞凋亡比例明显下降 解析：(1)PCR的过程包括变性、复性和延伸，因此将图1中人工合成的大量A链和B链与缓冲液共同放入PCR仪中，A链和B链可作为模板链进行DNA复制，经变性和复性过程可得到shSLC。(2)识图分析可知，载体经AgeⅠ和EcoRⅠ双酶切后产生了与shSLC相同的黏性末端，因此shSLC可以和经AgeⅠ和EcoRⅠ双酶切的载体相连。对构建成功的载体鉴定时，最好使用AgeⅠ完成酶切，酶切后可以产生带有基因shSLC和绿色荧光蛋白基因的片段，然后通过凝胶电泳将酶切后产生的不同长度DNA片段分离出来，分离得到带有基因shSLC和绿色荧光蛋白基因的片段从而完成鉴定过程。根据图示和题意可知，一般利用F2和R2进行PCR并对扩增目的产物进行测序验证，如果使用A链做引物F1，A链中含有发卡结构区，因此F1进行PCR易形成发卡结构，可能导致不会出现目标产物。(3)根据图示和题意可知，表达载体中含有绿色荧光蛋白基因GFP作为标记基因，因此表达载体转染PC12细胞后，可通过荧光显微镜下观察细胞绿色荧光蛋白的表达进行鉴定；据图4分析可知，与对照组相比，转染shSLC组中5-HTT蛋白表达量降低。(4)根据题意，对照组正常情况下细胞凋亡率6.30%，缺氧24 h后细胞凋亡率14.24%；转染shSLC组正常情况下细胞凋亡率6.38%，缺氧24 h细胞凋亡率9.10%。据此可知，与对照组相比，正常条件下沉默SLC基因对细胞凋亡无影响，缺氧后沉默SLC基因的PC12细胞凋亡比例明显下降。 2．(2024·济宁三模)PCR技术的实用性和极强的生命力使其成为生物科学研究的一种重要方法，极大地推动了分子生物学以及生物技术产业的发展。下面是两个具体实验中的PCR技术应用，请根据资料回答下列问题。 (1)重叠延伸PCR技术是一种通过寡聚核苷酸链之间重叠的部分互相搭桥、互为模板，通过多次PCR扩增，从而获得目的基因的方法。利用该技术可以实现基因的定点诱变。它在需要诱变的位置合成两个带有变异基因碱基的互补引物，然后分别与引物a和引物d做PCR，这样得到的两个PCR引物产物都带有变异基因，并且彼此重叠，再将重叠部位进行重组PCR就能得到诱变PCR产物，如图所示： ①PCR扩增DNA的过程中，引物a、b、c、d中，PCR1应选择图1中引物　　　　，大量扩增突变产物AD则应选择引物　　　　。 ②重叠延伸PCR通过　　　　　　　　　实现定点突变。PCR1和PCR2需要分别进行的原因是________________________________________________ _________________________________________________________________。 学生用书第361页 ③若正常基因可被限制酶DpnⅠ识别并切割，特定位点突变后的基因不能被DpnⅠ识别，请设计实验思路鉴定上述过程获得的突变产物AD是否为突变基因：_________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________。 (2)反向PCR可用于扩增未知序列，其原理如下图所示。下图链状DNA分子内侧是已知序列，外侧为未知序列。 ①不直接在图2中DNA分子的两端设计引物并进行扩增，原因是_________________________________________________________________ _________________________________________________________________。 ②图3中环状DNA进行PCR的过程中，沿引物A延伸子链的延伸方向是 　　　(填“顺时针”或“逆时针”)，PCR产物　　　　(填“含有”或“不含”)EcoRⅠ的酶切位点。 答案：(1)①a和b　a和d　②在引物b和c上引入突变　引物b和引物c可以互补配对，导致引物失效　③用限制酶DpnⅠ分别处理正常基因和上述过程获得的突变产物AD，然后进行电泳；若上述过程获得的突变产物AD的电泳条带只有一条且大于正常基因的电泳条带，则为突变基因　(2)①DNA两端序列未知，无法设计引物　②逆时针　含有 解析：(1)①PCR扩增DNA的过程中，新合成的两条单链延伸方向相反，根据图中引物的方向可知，PCR1应选择引物a和b，得到产物AB。PCR2应选择引物c和d，得到产物CD。突变产物AD扩增选择的引物是a和d。重叠延伸时，可以分别以AB上链和CD下链为引物进行延伸，所以不需要引物。②重叠延伸PCR通过在引物b和c上引入突变实现定点突变，引物b和c分别和第一代DNA的两条单链的对应碱基互补，则其上的碱基应互补配对。由于引物b和引物c可以互补配对，导致引物失效，所以PCR1和PCR2需要分别进行。③据题意可知，正常基因可被限制酶DpnⅠ识别并切割，特定位点突变后的基因不能被DpnⅠ识别，因此要鉴定获得的突变产物AD是否为突变基因，实验设计思路为：用限制酶DpnⅠ分别处理正常基因和上述过程获得的突变产物AD，然后进行电泳；若上述过程获得的突变产物AD的电泳条带只有一条且大于正常基因的电泳条带，则为突变基因。(2)①利用PCR技术扩增目的基因的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列作为引物，由于该DNA分子两端的脱氧核苷酸序列未知，故无法设计引物，所以不能直接在图1中DNA分子的两端设计引物并进行扩增。②据图中未知序列的位置可知，图3中环状DNA进行PCR的过程中，沿引物A逆时针延伸子链，沿引物a顺时针延伸子链，才能扩增到未知序列，由于碱基互补配对，环化后的DNA分子含有EcoRⅠ的切割位点，则PCR产物含有EcoRⅠ的酶切位点。 3．(2023·北京昌平二模)研究者利用基因组编辑技术，将Bcl-2(抗凋亡)基因定点敲入FUT8(岩藻糖转移酶)基因，从而改造中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。 (1)Cas9蛋白和sgRNA是基因组编辑工具(图1)，为筛选进行高效编辑的sgRNA，需根据　　　　基因相应序列，设计并合成多个sgRNA链。分别构建sgRNA/Cas9表达质粒，并通过　　　　法导入CHO细胞。 (2)Cas9蛋白与靶序列结合并将DNA双链切断，随后细胞会通过DNA损伤修复机制，将断裂处两端的序列连接起来，但在缺口处会发生碱基错配。T酶能特异性识别并切割错配的双链DNA，通过T酶的酶切实验检测sgRNA在CHO细胞内编辑效率。对图2电泳结果分析，　　　　组实现sgRNA的高效编辑。 (3)将含目的基因表达框和sgRNA/Cas9表达质粒(1∶1)共转染CHO细胞，实现同步敲入敲除基因，具体过程如图3。 ①目的基因表达框中含基因表达所需的元件，元件顺序依次为：同源序列Ⅰ－　　　　－同源序列Ⅱ，　　　　元件导致FUT8基因靶点后序列没有成功转录。(填选项) a．T2A(连接子)　 b．启动子 c．转录终止信号　 d．Bcl-2基因　　　 e．FUT8基因 f．绿色荧光蛋白基因 ②选取具有　　　　特征的细胞，进一步提取基因组DNA，并对图3中片段　　　　进行PCR，筛选出在FUT8靶基因处成功整合目的基因表达框的单克隆细胞。若PCR扩增产物的电泳结果出现　　　　　　　　　　　　，表明筛选出的单克隆细胞为成功定点整合的纯合细胞。 (4)CHO细胞是基因工程中生产抗体的常用受体细胞，FUT8负责将岩藻糖转移至表达抗体上，而岩藻糖的存在会极大地降低抗体的作用。请分析利用改造后的CHO细胞株进行抗体生产的优势：___________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________ _________________________________________________________________。 答案：(1)FUT8　显微注射　(2)2、3、4　(3)①b－d－a－f－c　c　②绿色荧光　1、2、3　长度约4 768 bp的(明亮)单一条带　(4)改造后的CHO细胞株具有Bcl-2基因不易发生细胞凋亡，利于进行抗体的大规模生产；同时其生产的抗体无岩藻糖修饰，利于发挥抗体的作用 解析：(1)据图可知，需要进行基因编辑，需构建含sgRNA基因和Cas基因的重组DNA分子(重组质粒，基因表达载体)，并导入受体细胞。需根据FUT8基因相应序列，设计并合成多个sgRNA链，并通过显微注射法导入CHO细胞。(2)对图2电泳结果分析，2、3、4组电泳片段最多，由于T酶能特异性识别并切割错配的双链DNA，通过T酶的酶切实验检测sgRNA在CHO细胞内编辑效率，可知2、3、4组实现sgRNA的高效编辑。(3)①目的基因表达框中含基因表达所需的元件，元件顺序依次为：同源序列Ⅰ－b－d－a－f－c－同源序列Ⅱ，c元件导致FUT8基因靶点后序列没有成功转录。②选取具有绿色荧光特征的细胞，进一步提取基因组DNA，对图3中片段目的基因1、2、3进行PCR，筛选出在FUT8靶基因处成功整合目的基因表达框的单克隆细胞。若PCR扩增产物的电泳结果出现长度约4 768 bp的(明亮)单一条带，表明筛选出的单克隆细胞为成功定点整合的纯合细胞。(4)利用改造后的CHO细胞株进行抗体生产的优势是：改造后的CHO细胞株具有Bcl-2基因不易发生细胞凋亡，利于进行抗体的大规模生产；同时其生产的抗体无岩藻糖修饰，利于发挥抗体的作用。 学科网（北京）股份有限公司 $