第10单元 6 第48讲 基因工程的基本工具和操作程序（课件PPT）-【金版新学案】2026年高考生物高三总复习大一轮复习讲义（人教版 多选）

该高中生物学课件聚焦“基因工程的基本工具和操作程序”高考核心考点，依据课标要求阐明限制酶、DNA连接酶等工具作用及操作程序，结合2024年湖南卷、新课标卷等考情分析，明确工具酶选择、载体构建等高频考点分布，归纳正误判断、情境分析等常考题型，体现备考针对性。 课件亮点在于“真题体验+情境命题+规范答题”策略，如2024年山东卷荧光探针制备题，通过科学思维分析限制酶切割与连接效率，用“四步法”突破操作程序题，培养探究实践能力。设易错点警示和答题模板，助力学生掌握得分技巧，教师可精准定位学情，实现高效复习。

第48讲　基因工程的基本工具和操作程序 第十单元 生物技术与工程 高三一轮复习讲义 人教版　(多选) 课标要求 1.阐明DNA重组技术的实现需要三种基本工具。 2.阐明基因工程的基本操作程序。 考情分析 1.基因工程的基本工具 (2024·湖南卷T5；2024·江西卷T19；2023·新课标卷T6；2021·全国乙卷T38；2021·湖北卷T7) 2.基因工程的基本操作程序 (2024·新课标卷T38；2024·全国甲卷T38；2024·山东卷T25；2024·广东卷T21；2024·安徽卷T20；2024·甘肃卷T21；2024·浙江6月选考T19；2024·湖南卷T21；2024·北京卷T20；2024·江西卷T19；2024·贵州卷T21；2024·重庆卷T20) 考点一　重组DNA技术的基本工具 考点二　基因工程的基本操作程序 知识小结 真题体验 课时测评 情境命题 内容索引 规范答题 重组DNA技术的基本工具 考点一 返回 必备知识 整合 1.基因工程的理论基础 2.重组DNA技术的基本工具 (1)限制性内切核酸酶(简称“限制酶”) 原核生物 数千 特定核苷酸序列 磷酸二酯键 黏性末端 (2)DNA连接酶 黏性末端 限制酶 提醒　DNA连接酶和DNA聚合酶不是一回事：①DNA连接酶连接的是两个DNA片段，而DNA聚合酶是把单个的脱氧核苷酸连接到已有的DNA片段上。②DNA聚合酶起作用时需要以一条DNA链为模板，而DNA连接酶不需要模板。 (3)载体 环状双链DNA分子 噬菌体 自我复制 标记 提醒　具有能自我复制、有一个或多个限制酶切割位点、有标记基因及对受体细胞无害等特点的DNA分子才可以直接用作基因工程的载体。实际上天然的DNA分子一般不完全具备上述条件，往往需要进行人工改造后才能用于基因工程操作。 1.正误判断 (1)限制性内切核酸酶、DNA连接酶和质粒是基因工程中常用的三种工具酶。 (　　) (2)E.coli DNA连接酶既可连接平末端，又可连接黏性末端。 (　　) (3)限制酶也可以识别和切割RNA。 (　　) 考教衔接 × √ × 2.情境分析 如图限制酶Ⅰ的识别序列和切点是 ，限制酶Ⅱ的识别序列和切点是 ，据图思考下列问题。 (1)请用图示法写出限制酶Ⅰ和限制酶Ⅱ切割后形成末端的过程。 提示：限制酶Ⅰ： ； 限制酶Ⅱ： 。 (2)切割图示中的目的基因和质粒应选用哪类限制酶？为什么？ 提示：用限制酶Ⅱ切割目的基因，用限制酶Ⅰ切割质粒。限制酶Ⅰ的识别序列包含限制酶Ⅱ的识别序列，因此限制酶Ⅱ也可切割限制酶Ⅰ的位点，故使用限制酶Ⅱ时，可在目的基因两端同时切割，从而切出“目的基因”，但若使用限制酶Ⅱ切割质粒，会同时破坏质粒中的两个“标记基因”，故只能使用限制酶Ⅰ切割质粒。 1.限制酶的选择 (1)不破坏目的基因原则：如图甲中可选择PstⅠ，而不选择SmaⅠ。 (2)保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则：质粒作为载体必须具备标记基因等，所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择SmaⅠ。若载体上有两个及以上的标记基因，则可合理对其中一些标记基因进行酶切破坏。 核心归纳 (3)善用“双酶切”，注意方向性：目的基因所在序列和载体上存在多种酶切位点时，一般需要选择在目的基因所在序列和载体上都存在切割位点的两种不同的限制酶，对目的基因所在序列和载体进行剪切，即“双酶切法”。其优点和作用是：①防止目的基因自身环化；②避免目的基因与载体反向连接，即用DNA连接酶连接后形成的重组DNA分子上，目的基因和载体启动子的方向(或描述为“RNA聚合酶的移动方向”)必须是相同的，否则目的基因导入后无法正常表达。如图甲、乙也可选择PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶。 (4)巧用“同尾酶”：同尾酶指来源不同，但能产生相同黏性末端的限制酶。当不适合选择某种限制酶时，可用其同尾酶替换，以获得相同的黏性末端。 2.标记基因可用于检测目的基因是否导入受体细胞 考向1 基因工程工具酶的使用 1.(2023·新课标卷)某同学拟用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA连接酶为工具，将目的基因(两端含相应限制酶的识别序列和切割位点)和质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体。限制酶的 切割位点如图所示。 下列重组表达载体构建方 案合理且效率最高的是 A.质粒和目的基因都用 酶3切割，用E.coli DNA 连接酶连接 B.质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4 DNA连接酶连接 C.质粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4 DNA连接酶连接 D.质粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E.coli DNA连接酶连接 关键能力 提升 √ 酶3切割后得到的 是平末端， E.coli DNA连接 酶连接具有平末 端的DNA片段的 效率远低于T4 DNA连接酶，应该用T4 DNA连接酶连接，A错误；质粒用酶3切割后得到平末端，目的基因用酶1切割后得到的是黏性末端，二者不能连接，B错误； 质粒和目的基因都 用酶1和酶2切割后 得到黏性末端，用 T4 DNA连接酶连 接后，还能保证目 的基因在质粒上的 连接方向，此重组表达载体的构建方案最合理且高效，C正确；若用酶2和酶4切割质粒和目的基因，会破坏质粒上的抗生素抗性基因，连接形成的基因表达载体缺少标记基因，无法进行后续的筛选，D错误。 考向2 载体的作用及特点 2.(多选)(2025·济南模拟)如图为某种质粒的简图，小箭头所指分别为限制性内切核酸酶EcoRⅠ、BamHⅠ的酶切位点，P为转录的启动部位。已 知目的基因的两端有EcoRⅠ、BamHⅠ的酶切位点，受体细胞为无任何抗药性的原核细胞。下列叙述错误的是 A.将含有目的基因的DNA与质粒分别用EcoRⅠ酶切，在DNA 连接酶作用下，生成的由两个DNA片段连接形成的产物有两种 B.DNA连接酶的作用是将酶切后得到的黏性末端连接起来，形 成一个重组质粒时形成两个磷酸二酯键 C.为了防止目的基因反向连接和质粒自身环化，酶切时可选用的酶是EcoRⅠ和BamHⅠ D.能在含青霉素的培养基中生长的受体细胞中已成功导入该目的基因 √ √ √ 根据题意，目的基因的两端有EcoRⅠ、BamHⅠ的 酶切位点，将含有目的基因的DNA用EcoRⅠ酶切， 会得到目的基因片段；根据质粒的简图可知，将质 粒用EcoRⅠ酶切，会得到与质粒周长等长的链状 DNA；因此将含有目的基因的DNA与质粒分别用EcoRⅠ酶切，在DNA连接酶作用下，可生成目的基因－目的基因片段、目的基因－质粒片段、质粒－质粒片段三种产物，A错误。DNA连接酶的作用是将酶切后得到的黏性末端连接起来形成一个重组质粒，该过程形成四个磷酸二酯键，B错误。 EcoRⅠ和BamHⅠ的识别序列不同，获取目的基因 和切割质粒时，同时选用EcoRⅠ和BamHⅠ切割， 目的基因两端形成的末端不同，切割后的质粒两端 形成的末端不同，再用DNA连接酶连接，可以防止 目的基因反向连接和质粒自身环化，C正确。导入普 通质粒和导入重组质粒的原核细胞都能在含青霉素的培养基中生长，因此能在含青霉素的培养基中生长的受体细胞不一定含有目的基因，D错误。 返回 基因工程的基本操作程序 考点二 返回 1.目的基因的筛选与获取 (1)目的基因：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。 (2)筛选合适的目的基因 ①从相关的已知__________________的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。 ②利用____________和序列比对工具等进行筛选。 必备知识 整合 结构和功能清晰 序列数据库 (3)目的基因的获取 ①人工合成目的基因。 ②利用PCR获取和扩增目的基因 氧核苷酸 耐高温 温度 脱 指数形式 琼脂糖凝胶电泳 两种引物 耐高温的DHA聚合酶 ③通过构建__________来获取目的基因。 提醒　PCR反应缓冲液中一般要添加Mg2＋，以激活DNA聚合酶。引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。 基因文库 2.基因表达载体的构建——基因工程的核心 (1)目的：使目的基因____________________________________________，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。 (2)基因表达载体的组成及作用 在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代 启动子 标记基因 (3)构建过程 3.将目的基因导入受体细胞 生物种类 植物 动物 微生物 常用方法 农杆菌转化法、________ ________ 显微注射法 ________处理法 受体细胞 体细胞或受精卵 受精卵 原核细胞 转化 过程 将目的基因插入Ti质粒的T-DNA中→农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞的染色体DNA上→表达 将含有目的基因的表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物 Ca2＋处理细胞→细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态→重组基因表达载体导入 花粉管 通道法 Ca2＋ 提醒　(1)农杆菌特点：①能在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有侵染能力。②农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T-DNA转移到被侵染的细胞中，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。 (2)农杆菌转化法中的两次拼接：第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上，第二次拼接(非人工操作)是将插入目的基因的T-DNA拼接到受体细胞的染色体DNA上；两次导入：第一次导入是将含目的基因的Ti质粒导入农杆菌，第二次导入(非人工操作)是将含目的基因的T-DNA导入受体细胞。(3)导入的目的基因，可能存在于细胞质中，也可能整合到染色体DNA上。存在于染色体DNA上的目的基因有可能通过花粉传播进入杂草或其他作物中，造成“基因污染”。 4.目的基因的检测与鉴定 1.正误判断 (1)引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。 (　　) (2)转化是指目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。 (　　) (3)抗虫基因即使成功地插入植物细胞染色体DNA上也未必能正常表达。 (　　) 考教衔接 √ √ √ 2.情境分析 根据PCR反应过程示意图分析下列问题。 (1)什么是引物？DNA复制时为什么需要引物？ 提示：引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。在DNA扩增时，DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从引物的3'端延伸DNA链，因此复制DNA时应加入两种引物。 (2)某同学设计的图示两组引物，是否合理，请分别说明理由？ 提示：不合理。引物Ⅰ和引物Ⅱ局部发生碱基互补配对而失效，引物Ⅰ'自身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效。 (3)为检测目的基因Bt基因在转基因抗虫棉细胞中是否转录，科研人员提取棉花细胞中的总RNA，经逆转录过程获得总cDNA，通过PCR技术可在总cDNA中专一性地扩增出Bt基因的cDNA，原因是什么？ 提示：引物是依据Bt抗虫蛋白基因的一段已知序列设计合成的(或引物能与Bt基因的cDNA特异性结合)。 PCR技术和DNA复制的比较 核心归纳 考向1 基因表达载体的构建过程分析 (2023·湖北卷)用氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、 四环素抗性基因(TetR)作为标记基因构建的质粒如 图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限 制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体(重组质 粒)，并转化到受体菌中。下列叙述错误的是 A.若用HindⅢ酶切，目的基因转录的产物可能不同 B.若用PvuⅠ酶切，在含Tet(四环素)培养基中的菌落，不一定含有目的基因 C.若用SphⅠ酶切，可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否 D.若用SphⅠ酶切，携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)和Tet的培养基中能形成菌落 关键能力 提升 √ 若用HindⅢ酶切，目的基因可能正向插入， 也可能反向插入，转录的产物可能不同，A 正确；若用PvuⅠ酶切，重组质粒和质粒中都 有四环素抗性基因(TetR)，因此在含Tet(四环 素)培养基中的菌落，不一定含有目的基因， B正确；DNA凝胶电泳技术可以分离不同大小的DNA片段，重组质粒的大小与质粒不同，能够鉴定重组质粒构建成功与否，C正确；SphⅠ的酶切位点位于四环素抗性基因中，若用SphⅠ酶切，会破坏四环素抗性基因，重组质粒中含氨苄青霉素抗性基因(AmpR)，因此携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)的培养基中能形成菌落，在含Tet的培养基中不能形成菌落，D错误。 考向2 目的基因的检测与鉴定实例分析 2.(2023·浙江6月选考)某研究小组利用转基因技术，将绿色荧光蛋白基因(GFP)整合到野生型小鼠Gata3基因一端，如图甲所示。实验得到能正常表达两种蛋白质的杂合子雌雄小鼠各1只，交配以期获得Gata3-GFP基因纯合子小鼠。为了鉴定交配获得的4只新生小 鼠的基因型，设计了引物1和引物2用于PCR 扩增，PCR产物电泳结果如图乙所示。下列 叙述正确的是 A.Gata3基因的启动子无法控制GFP基因表达 B.翻译时先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白 C.2号条带的小鼠是野生型，4号条带的小鼠是 Gata3-GFP基因纯合子 D.若用引物1和引物3进行PCR，能更好地区分杂合子和纯合子 √ 由图甲可知，Gata3基因与GFP基因共 用一个启动子，且由题干可知两基因 能正常表达出相关蛋白质，A错误；由 于启动子在左侧，基因在右侧，转录 基因时，先转录Gata3基因，再转录 GFP基因，由于转录和翻译的方向均 是沿mRNA的5'端→3'端，因此翻译时 先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白， B正确； 由图乙可知，大片段包含GFP基因编 码区片段，小片段不包含GFP基因编 码区片段，则2号小鼠是Gata3-GFP 基因纯合子，4号小鼠是野生型，C错 误；若用引物l和引物3进行PCR，杂 合子和Gata3-GFP基因纯合子均能扩 增出条带，仅有Gata3基因时无法扩增 出条带，不利于区分杂合子和纯合子，D错误。 返回 知 识 小 结 返回 返回 真 题 体 验 返回 1.(2024·湖南卷)某同学将质粒DNA进行限制酶酶切时，发现DNA完全没有被酶切，分析可能的原因并提出解决方法。下列叙述错误的是 A.限制酶失活，更换新的限制酶 B.酶切条件不合适，调整反应条件如温度和酶的用量等 C.质粒DNA突变导致酶识别位点缺失，更换正常质粒DNA D.酶切位点被甲基化修饰，换用对DNA甲基化不敏感的限制酶 √ 限制酶失活会使DNA完全没有被酶切，此时应更换新的限制酶，A正确；酶切条件不合适可能使酶失活，无法发挥作用，但限制酶的用量过多或过少都不会出现DNA完全没有被酶切的情况，B错误；质粒DNA突变会导致限制酶识别位点缺失，进而造成限制酶无法进行切割，此时应更换为正常质粒，C正确；质粒DNA上酶切位点被甲基化修饰，会导致对DNA甲基化敏感的限制酶无法进行酶切，此时应换用对DNA甲基化不敏感的限制酶，D正确。 2.(2024·山东卷)制备荧光标记的DNA探针时，需要模板、引物、DNA聚合酶等。在只含大肠杆菌DNA聚合酶、扩增缓冲液、H2O和4种脱氧核苷酸(dCTP、dTTP、dGTP和碱基被荧光标记的dATP)的反应管①～④中，分别加入如表所示的适量单链DNA。已知形成的双链DNA区遵循碱基互补配对原则，且在本实验的温度条件下不能产生小于9个连续碱基对的双链DNA区。能得到带有荧光标记的DNA探针的反应管有 A.①② B.②③ C.①④ D.③④ √ 反应管 加入的单链DNA ①  5'-GCCGATCTTTATA-3' 3'-GACCGGCTAGAAA-5' ②  5'-AGAGCCAATTGGC-3' ③ 5'-ATTTCCCGATCCG-3' 3'-AGGGCTAGGCATA-5' ④ 5'-TTCACTGGCCAGT-3' 分析反应管①～④中分别加入的适量单链DNA可知，①中两条单链DNA分子之间具有互补的序列，但双链DNA区之外的3'端无模板，因此无法进行DNA合成，不能得到带有荧光标记的DNA探针； 反应管 加入的单链DNA ①  5'-GCCGATCTTTATA-3' 3'-GACCGGCTAGAAA-5' ②  5'-AGAGCCAATTGGC-3' ③ 5'-ATTTCCCGATCCG-3' 3'-AGGGCTAGGCATA-5' ④ 5'-TTCACTGGCCAGT-3' ②中单链DNA分子内具有自身互补的序列，由于在本实验的温度条件下不能产生小于9个连续碱基对的双链DNA区，故一条单链DNA分子不发生自身环化，但两条链可以形成双链DNA区，由于DNA合成的链中不含碱基A，不能得到带有荧光标记的DNA探针； 反应管 加入的单链DNA ①  5'-GCCGATCTTTATA-3' 3'-GACCGGCTAGAAA-5' ②  5'-AGAGCCAATTGGC-3' ③ 5'-ATTTCCCGATCCG-3' 3'-AGGGCTAGGCATA-5' ④ 5'-TTCACTGGCCAGT-3' ③中两条单链DNA分子之间具有互补的序列，且双链DNA区之外的3'端有模板和碱基T，因此进行DNA合成能得到带有荧光标记的DNA 探针； 反应管 加入的单链DNA ①  5'-GCCGATCTTTATA-3' 3'-GACCGGCTAGAAA-5' ②  5'-AGAGCCAATTGGC-3' ③ 5'-ATTTCCCGATCCG-3' 3'-AGGGCTAGGCATA-5' ④ 5'-TTCACTGGCCAGT-3' ④中单链DNA分子内具有自身互补的序列，一条单链DNA分子不发生自身环化，两条链可以形成双链DNA区，且双链DNA区之外的3'端有模板和碱基T，因此进行DNA合成能得到带有荧光标记的DNA探针。综上，能得到带有荧光标记的DNA探针的反应管有③④。 反应管 加入的单链DNA ①  5'-GCCGATCTTTATA-3' 3'-GACCGGCTAGAAA-5' ②  5'-AGAGCCAATTGGC-3' ③ 5'-ATTTCCCGATCCG-3' 3'-AGGGCTAGGCATA-5' ④ 5'-TTCACTGGCCAGT-3' 3.(2024·北京卷)学习以下材料，回答(1)～(4)题。 筛选组织特异表达的基因 筛选组织特异表达的基因，对研究细胞分化和组织、器官的形成机制非常重要。“增强子捕获”是筛选组织特异表达基因的一种有效方法。 真核生物的基本启动子 位于基因5'端附近，没有组 织特异性，本身不足以启动 基因表达。增强子位于基因 上游或下游，与基本启动子 共同组成基因表达的调控序 列。基因工程所用表达载体 中的启动子，实际上包含增强子和基本启动子。 很多增强子具有组织特异的活性，它们与特定蛋白结合后激活基本启动子，驱动相应基因在特定组织中表达(图A)。基于上述调控机理，研究者构建了由基本启动子和报告基因组成的“增强子捕获载体”(图B)，并转入受精卵。捕获载体会随机插入基因组中，如果插入位点附近存在有活性的增强子，则会激活报告基因的表达(图C)。 获得了一系列分别在不同组织中特异表达报告基因的个体后，研究者提取每个个体的基因组DNA，通过PCR扩增含有捕获载体序列的DNA片段。对PCR产物进行测序后，与相应的基因组序列比对，即可确定载体的插入位点，进而鉴定出相应的基因。 研究者利用各种遗传学手段，对筛选得到的基因进行突变、干扰或过表达，检测个体表型的改变，研究其在细胞分化和个体发育中的作用，从而揭示组织和器官形成的机理。 (1)在个体发育中，来源相同的细胞在形态、结构和功能上发生__________的过程称为细胞分化，分化是基因____________的结果。 稳定性差异 选择性表达 细胞分化是指在个体发育中，由一个或一种细胞增殖产生的后代，在形态、结构和生理功能上发生稳定性差异的过程。分化是基因选择性表达的结果。 (2)对文中“增强子”的理解，错误的是 A.增强子是含有特定碱基 序列的DNA片段 B.增强子、基本启动子和 它们调控的基因位于同一 条染色体上 C.一个增强子只能作用于 一个基本启动子 D.很多增强子在不同组织中的活性不同 √ 依据题干“增强子位于 基因上游或下游，与基 本启动子共同组成基因 表达的调控序列”可知， 增强子是含有特定碱基 序列的DNA片段，增强 子、基本启动子和它们调控的基因位于同一条染色体上，A、B正确；由图C可知，一个增强子可作用于多个基本启动子，C错误；依据题干“很多增强子具有组织特异的活性”可知，很多增强子在不同组织中的活性不同，D正确。 (3)研究者将增强子捕获技术应用于斑马鱼，观察到报告基因在某幼体的心脏中特异表达。鉴定出捕获载体的插入位点后，发现位点附近有两个基因G和H，为了确定这两个基因是否为心脏特异表达的基因，应检测_______ ________________________________________________。 其他器 官细胞中，G和H两个基因是否转录出相应的mRNA 若要确定这两个基因是否为心脏特异表达的基因，可通过PCR等技术检测其他器官细胞中G和H两个基因是否转录出相应的mRNA。 (4)真核生物编码蛋白的序列只占基因组的很少部分，因而在绝大多数表达报告基因的个体中，增强子捕获载体的插入位点位于基因外部，不会造成基因突变。研究者对图B所示载体进行了改造，期望改造后的载体随机插入基因组后，在“捕获”增强子的同时，也造成该增强子所调控的基因发生突变，以研究基因功能。请画图表示改造后的载体，并标出各部分 名称。 答案： 增强子位于基因上游或下 游，与基本启动子共同组 成基因表达的调控序列。 基因工程所用表达载体中 的启动子，实际上包含增 强子和基本启动子。增强 子捕获载体的插入位点位于基因外部，不会造成基因突变。而当增强子捕获载体的插入位点位于基因内部，会造成该增强子所调控的基因发生突变，为研究某目的基因的功能，可将图B所示载体去掉基本启动子，则该载体插入基因内部后才会发挥作用，如图： 。 4.(2024·重庆卷)大豆是重要的粮油作物，提高大豆产量是我国农业领域的重要任务。我国研究人员发现，基因S在大豆品种DN(种子较大)中的表达量高于品种TL(种子较小)，然后克隆了该基因(两品种中基因S序列无差异)及其上游的启动子序列，并开展相关研究。 (1)基因S启动子的基本组成单位是__________________________。 脱氧核糖核苷酸(脱氧核苷酸) 启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，用于启动DNA的转录，是一段DNA片段，其基本组成单位是四种脱氧核糖核苷酸。 (2)通过基因工程方法，将DN克隆的“启动子D＋基因S”序列导入无基因S的优质大豆品种YZ。根据题图所示信息(不考虑未标明序列)判断构建重组表达载体时，为保证目标序列的完整性，不宜使用的限制酶是______；此外，不宜同时选用酶SpeⅠ和XbaⅠ。原因是________________________ _____________________________________________________________。 EcoRⅠ 酶切后形成的片段黏性末 端相同，易自身环化；不能保证目标片段与载体定向连接(正向连接) ①根据图 示信息可 知，“启 动子D＋ 基因S” 的DNA 序列上存 在EcoRⅠ的识别序列，若使用限制酶EcoRⅠ，会使目标序列被破坏。②根据图中限制酶的识别序列可知，酶SpeⅠ和XbaⅠ切割产生的黏性末端相同，若用这两种限制酶切割，形成的DNA片段在构建基因表达载体时，容易出现自身环化，以及无法保证目的基因片段与载体片段正向连接，影响目的基因在受体细胞中的表达。 (3)为验证“启动子D＋基因S”是否连接在表达载体上，可用限制酶对重组表达载体酶切后进行电泳。电泳时，对照样品除指示分子大小的标准参照物外，还应有_________________________________________。经验证的重组表达载体需转入农杆菌，检测转入是否成功的技术是________。 酶切后的空载体片段，启动子D＋基因S片段 PCR ①DNA电泳 可以分离不 同大小的 DNA片段， 用限制酶对 重组表达载 体酶切后的产物不仅有“启动子D＋基因S”片段，还有酶切后的空载体片段，因此电泳时，对照样品除指示分子大小的标准参照物外，还应有酶切后的空载体片段和“启动子D＋基因S”片段。②在分子水平上检测目的基因是否转入成功，可通过PCR等技术检测受体细胞的DNA上是否插入目的基因或目的基因是否转录出mRNA。 (4)用检测后的农杆菌转化品种YZ所得再生植株YZ-1的种子变大。同时将从TL克隆的“启动子T＋基因S”序列成功导入YZ，所得再生植株YZ-2的种子也变大，但小于YZ-1。综合分析，大豆品种DN较TL种子大的原因是________________________________________________________________________。 品种DN的基因S上游启动子效应比TL的强，使得基因S表达量更高，种子更大 根据(4)题 目信息可 知，再生 植株YZ-1 导入的目 的基因为 取自品种DN的“启动子D＋基因S”序列，再生植株YZ-2导入的目的基因为取自品种TL的“启动子T＋基因S”序列，结合题干信息“两品种中基因S序列无差异”可推测：品种DN的基因S上游的启动子D的效应强于品种TL的启动子，启动子D使基因S表达量更高，因而种子更大。 返回 PEP 反义基因与基因工程 情境 命题48 返回 情境素材 　　丙酮酸羧化酶(PEP)是控 制油菜中蛋白质与油脂比例的 关键酶。PEP反义基因是指反 向连接在启动子之后的PEP基 因，其在转录时的模板链为 PEP基因模板链的互补链。 PEP反义基因可抑制PEP基因 的表达，从而提高油菜籽中的油脂含量。图甲为某种质粒的结构，其中neo为新霉素抗性基因，gus基因控制合成的酶能使β-葡萄糖苷酸水解为蓝色物质，图乙为PEP基因的结构。 角度一　获取信息，解答问题 (1)为方便将PEP反义基因与质粒连接，一般将限制酶的识别序列设计在引物上，在图乙中，与PEP基因上游结合的引物中应引入__________的识别序列。 命题角度 SacⅠ 角度二　原理分析，长句表达 (2)质粒上neo的作用是_________________________。将质粒和PEP反义基因连接后，再与农杆菌菌液温育一段时间，涂布到含有新霉素和β-葡萄糖苷酸的平板上。一段时间后，在平板上长出白色和蓝色两种菌落，其中符合要求的是__________，理由是____________________________________ _____________________________________________________________________________________________。 便于重组DNA分子筛选 白色菌落 PEP反义基因需连接在质粒的启动子2的后面，构建重组DNA分子时已将gus基因切除，含重组DNA分子的细胞不能合成使β-葡萄糖苷酸水解的酶 返回 (3)PEP反义基因可有效抑制PEP基因的表达，推测其原理是____________ ________________________________________________________________________。 PEP反义基因转录的RNA可与PEP基因转录的mRNA结合，从而抑制了PEP基因的表达 课 时 测 评 返回 1.(2021·湖北卷)限制性内切酶EcoRⅠ识别并切割 双链DNA，用EcoRⅠ完全酶切果蝇基因组DNA，理论上得到DNA片段的平均长度(碱基对)约为 A.6 B.250 C.4 000 D.24 000 √ 据图可知，EcoRⅠ的酶切位点有6个碱基对，由于DNA分子的碱基组成为A、T、G、C，则某一位点出现该序列的概率为1/4×1/4×1/4×1/4× 1/4×1/4＝1/4 096，即4 096≈4 000个碱基对可能出现一个限制酶EcoRⅠ的酶切位点，故理论上得到DNA片段的平均长度(碱基对)约为 4 000。C符合题意。 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 11 12 13 14 2.(2024·盐城调研)图甲、乙中的箭头表示三种限制性内切核酸酶的酶切位点，AmpR表示氨苄青霉素抗性基因，neo表示新霉素抗性基因。下列叙述错误的是 A.在构建重组质粒时，可用PstⅠ和HindⅢ切割质粒和外源DNA B.在酶切过程中，不能破坏质粒中全部的标记基因 C.若只用PstⅠ处理质粒和外源DNA分子片段，无法避免自身环化和反向 连接 D.导入重组质粒的大肠杆菌可以在含氨苄青霉素的培养基中生长 √ 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 11 12 13 14 切割目的基因时，用 BamHⅠ切割会破坏目的基 因，只用PstⅠ切割目的基 因和质粒载体，会出现目 的基因和质粒的自身环化，或目的基因和质粒的反向连接，而用PstⅠ和HindⅢ进行酶切，能确保目的基因和质粒的正向连接，并且质粒上保留新霉素抗性基因作为标记基因，A、C正确；在酶切过程中，不能破坏质粒中全部的标记基因，至少需保留其中的一个，B正确；用PstⅠ切割后，质粒上氨苄青霉素抗性基因被破坏了，导入重组质粒的大肠杆菌不可以在含氨苄青霉素的培养基中生长，D错误。 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 11 12 13 14 3.(2025·郑州模拟)图甲为培育转基因生物时选用的载体，图乙是含有目的基因的一段DNA序列，图中标注了相关限制酶的酶切位点。下列叙述错误的是 A.若通过PCR技术提取该 目的基因，应该选用引物 甲和引物丙 B.构建表达载体时应选用 BclⅠ和HindⅢ这两种限 制酶以及DNA连接酶 C.若将基因表达载体导入大肠杆菌中，需用Ca2＋处理大肠杆菌 D.只利用含四环素的培养基就可以直接筛选出成功导入表达载体的受体 细胞 √ 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 11 12 13 14 根据图乙引物引导子链 延伸的方向可知，若用 PCR技术提取该目的基 因，所用的引物组成为 图乙中引物甲和引物丙， A正确；选择的限制酶 应在目的基因两端和质粒上存在识别位点，BamHⅠ会使2种抗性基因都被破坏，同时为防止目的基因和质粒自身环化，应选BclⅠ和HindⅢ两种限制酶切割，B正确； 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 11 12 13 14 将目的基因导入大肠杆 菌细胞中，需要用Ca2＋ 处理大肠杆菌，使之成 为感受态细胞，C正确； 由于选择BclⅠ和HindⅢ 这两种限制酶，破坏了 氨苄青霉素抗性基因，但没有破坏四环素抗性基因，因此应该先用含四环素的培养基筛选出含有基因表达载体和普通质粒的大肠杆菌，再用含氨苄青霉素的培养基筛选含基因表达载体重组质粒的大肠杆菌，D错误。 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 11 12 13 14 4.为了对重金属污染的土壤进行生物修复，研究者将从杨树中克隆的重金属转运蛋白(HMA3)基因与外源高效启动子连接，导入杨树基因组中(如图)。为检测获得的转基因杨树苗中是否含有导入的HMA3基因，同时避免内源HMA3基因的干扰，在进行PCR扩增时，应选择的引物组合是 A.①＋③ B.①＋② C.③＋② D.③＋④ √ 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 11 12 13 14 引物①扩增的片段含有启动子 和HMA3基因，引物③扩增的 片段不含启动子，引物②扩增 的片段既含有启动子，又含有 HMA3基因序列。图示中克隆 的重金属转运蛋白(HMA3)基 因与外源高效启动子连接，导入杨树基因组中，若要检测获得的转基因杨树苗中是否含有导入的HMA3基因和高效启动子，需要检测是否含有高效启动子序列和HMA3基因序列，应选择的引物组合是①＋②，B正确。 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 11 12 13 14 5.(2025·焦作模拟)RT-PCR是将RNA逆转录(RT)成cDNA(与mRNA互补的DNA单链)和聚合酶链式反应(PCR)相结合的技术，具体过程如图所示，下列叙述正确的是 A.过程Ⅰ获得cDNA的过程与DNA复 制过程中存在的碱基配对方式相同 B.图中A、B两种引物的核苷酸序列 不同，但参与子链合成的酶均相同 C.图中子链的合成均是以四种核糖 核苷酸为原料从引物的一端开始的 D.过程Ⅱ中，若进行6轮循环，则共需要加入引物的数量为63个 √ 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 11 12 13 14 过程Ⅰ是以四种脱氧核糖核苷酸 为原料，以mRNA为模板逆转录 合成DNA的过程，催化该过程的 酶是逆转录酶，存在的碱基配对 方式是U－A、A－T、C－G、 G－C；过程Ⅱ是DNA单链复制 过程，是以四种脱氧核糖核苷酸为原料，以DNA单链为模板合成DNA单链的过程，催化该过程的酶为Taq DNA聚合酶，该过程中存在的碱基配对方式是A－T、G－C、T－A、C－G，A、B、C错误。 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 11 12 13 14 过程Ⅱ中，若进行6轮循环，最终产生的DNA单链数为26＝64条，新合成的子链数为63条，则进行6轮循环，共需要加入引物的数量为63个，D正确。 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 11 12 13 14 6.(2025·扬州模拟)土壤农杆菌侵染植物细胞时，Ti质粒上的T-DNA片段转入植物的基因组。利用农杆菌以Ti质粒作为载体进行转基因，下列相关叙述正确的是 A.目的基因应插入T-DNA片段外，以防止破坏T-DNA B.用Ca2＋处理农杆菌，以利于其侵染植物细胞 C.Ti质粒是一种环状DNA分子，没有双螺旋结构 D.可以用PCR技术检测外源DNA是否整合到植物的染色体DNA上 √ 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 11 12 13 14 在农杆菌转化法中，需要将目的基因插入到T-DNA片段上，有利于介导外源DNA整合到植物的染色体DNA上，A错误；农杆菌侵染植物细胞不需要用Ca2＋处理，B错误；Ti质粒是一种环状DNA分子，是存在于细菌细胞质中的DNA，具有双螺旋结构，C错误；采用PCR技术可以使外源DNA得以大量扩增，检测外源DNA是否整合到植物的染色体上，D正确。 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 11 12 13 14 7.(2025·秦皇岛模拟)基因工程中需使用特定的限制酶切割基因载体，以便其与目的基因连接形成基因表达载体。研究人员将相同的基因表达载体分组并进行相应酶切处理(如表所示)，其中限制酶H1和H2识别序列不同。各组基因表达载体经酶切处理后，进行琼脂糖凝胶电泳检测，实验结果如图所示。下列说法错误的是 A.该基因表达载体最有可能为环状DNA分子 B.限制酶H1与H2在该载体上都有识别和切割位点 C.限制酶H1与H2在该载体上的酶切位点最短相距0.2 kb D.限制酶作用于该载体时会直接导致氢键和磷酸二酯键的断裂 √ 分组 相应酶切处理   甲 限制酶H1 乙 限制酶H2 丙 限制酶H1＋H2 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 11 12 13 14 由图可知，当仅用一种限制酶切割载体时，仅产生一种长度的DNA片段，因此该载体最有可能为环状DNA分子，A正确；当用一种限制酶切割载体时，产生的DNA片段等长，而用两种限制酶同时切割时，产生两种长度的DNA片段，所以两种限制酶在该载体上都有酶切位点，B 正确； 分组 相应酶切处理   甲 限制酶H1 乙 限制酶H2 丙 限制酶H1＋H2 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 11 12 13 14 用两种限制酶同时切割载体时，产生0.6 kb和0.2 kb两种长度的DNA片段，所以两种限制酶的酶切位点最短相距0.2 kb，C正确；限制酶切割载体时直接破坏的是作用位点上两个脱氧核糖核苷酸之间的磷酸二酯键，D错误。 分组 相应酶切处理   甲 限制酶H1 乙 限制酶H2 丙 限制酶H1＋H2 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 11 12 13 14 8.(多选)(2024·南京师大附中调研)载体是基因工程中携带外源DNA片段(目的基因)进入受体细胞的重要运载工具，常见的载体类型主要有基因克隆载体和基因表达载体。如图是利用细菌生产人胰岛素的基本流程示意图，下列叙述错误的是 A.重组载体A、重组载体B分别是基 因表达载体和基因克隆载体 B.载体A和载体B都必须含有限制酶 切割位点、复制原点和标记基因 C.必须把目的基因插入重组载体A 的启动子和终止子之间 D.培养细菌A和细菌B的培养基在营养成分和功能上有明显差异 √ √ 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 11 12 13 14 基因克隆载体用于在受体细胞中 进行目的基因扩增的载体，重组 载体A是基因克隆载体，基因表 达载体是适合在受体细胞中表达 外源基因的载体，重组载体B是 基因表达载体，A错误；载体是 基因工程中携带外源DNA片段(目的基因)进入受体细胞的重要运载工具，载体A和载体B都必须含有限制酶切割位点、复制原点和标记基因，B正确； 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 11 12 13 14 培养细菌A的目的是扩增目的基 因，不需要获得表达产物，因此 目的基因不一定要插入重组载体 A的启动子和终止子之间，C错 误；培养细菌A的目的是扩增目 的基因，培养细菌B的目的是获 得胰岛素，因此培养两者的培养基在营养成分和功能上有明显差异，D正确。 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 11 12 13 14 9.(多选)(2023·重庆卷，改编)某小组通过PCR(假设引物长度为8个碱基，短于实际长度)获得了含有目的基因的DNA片段，并用限制酶进行酶切(如图)，再用所得片段成功构建了基因表达载体。下列叙述错误的是 A.实验所用引物，其中一个序列为 5'-TGCGCAGT-3' B.步骤①所用的酶是SpeⅠ和CfoⅠ C.用步骤①的酶对载体进行酶切， 至少获得了1个片段 D.酶切片段和载体连接时，可使用 E.coli DNA连接酶或T4 DNA连接酶 √ √ 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 11 12 13 14 根据扩增所得DNA片段可知， 实验所用的两种引物序列为 5'-TGCGCAGT-3'和 5'-AGCTAGCA-3'，A正确； 根据酶切后得到的黏性末端判 断，步骤①所用酶是NheⅠ和 CfoⅠ，B错误；步骤①用两种 酶切割载体(质粒)，质粒上至少有两个切口，至少产生2个片段，C错误；目的基因片段和质粒经酶切后产生的均为黏性末端，可用E.coli DNA连接酶或T4 DNA连接酶连接，D正确。 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 11 12 13 14 10.(多选)(2025·河北张家口模拟)为提高红豆杉细胞培养物中紫杉醇的产量，研究人员构建紫杉醇合成关键酶基因(Bapt)的超表达载体，并将其导入红豆杉细胞，具体流程如下图。下列说法正确的是 A.p1301载体上应含有 增强Bapt基因表达的 序列 B.超表达载体中应含 有潮霉素抗性基因作 为标记基因 C.可使用Bapt基因制成的探针检测过程⑤是否成功 D.工厂化生产紫杉醇需将改造后的红豆杉细胞培养至愈伤组织 √ √ √ 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 11 12 13 14 根据题干推测，p1301 载体上应含有增强Bapt 基因表达的序列，A正 确；超表达载体中应含 有潮霉素抗性基因作为 标记基因，在含有潮霉素的培养基上，超表达载体能够存活，从而起到筛选作用，B正确；由于红豆杉细胞中本身存在Bapt基因，无论超表达载体是否成功导入，都能与Bapt基因探针形成杂交分子，因此不能通过Bapt基因探针来检测过程⑤是否成功，C错误；工厂化生产紫杉醇属于细胞产物的获得，只需要培养到愈伤组织阶段即可，D正确。 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 11 12 13 14 11.(8分)(2023·全国乙卷)GFP是水母体内存在的能发绿色荧光的一种蛋白。科研人员以GFP基因为材料，利用基因工程技术获得了能发其他颜色荧光的蛋白。丰富了荧光蛋白的颜色种类。回答下列问题。 (1)构建突变基因文库。科研人员将GFP基因的不同突 变基因分别插入载体，并转入大肠杆菌制备出GFP基 因的突变基因文库。通常，基因文库是指__________ ______________________________________________ ______________________________________________。 将含有某种 生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因 将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 11 12 13 14 (2)构建目的基因表达载体。科研人员从构建的GFP突变基因文库中提取目的基因(均为突变基因)构建表达载体，其模式图如上所示(箭头为GFP突变基因的转录方向)。图中①为__________；②为__________，其作用是____________________________________________________________；图中氨苄青霉素抗性基因是一种标记基因，其作用是____________________ _________。 终止子 启动子 是RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动GFP突变基因转录出mRNA 将含有表达载体的细胞 筛选出来 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 11 12 13 14 从图中可以知道，转录方向是顺时针，所以①为终止子，②为启动子，启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因的转录，最终表达出相应的蛋白质。而标记基因是为了鉴别受体细胞中是否含有表达载体，从而将含有表达载体的细胞筛选出来。 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 11 12 13 14 (3)目的基因的表达。科研人员将构建好的表达载体导入大肠杆菌中进行表达，发现大肠杆菌有的发绿色荧光，有的发黄色荧光，有的不发荧光。请从密码子特点的角度分析，发绿色荧光的可能原因是__________________ ______________________________________________________________________________________(答出1点即可)。 GFP基因虽然发生了突变，但由于存在密码子的简并现象(密码子的简并)，突变基因所编码的氨基酸序列并未改变 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 11 12 13 14 基因突变，但是性状不改变的情况有多种可能，如非编码区改变，但是编码区不变导致mRNA不变，或者由于密码子的简并导致的氨基酸序列不变等等。 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 11 12 13 14 (4)新蛋白与突变基因的关联性分析。将上述发黄色荧光的大肠杆菌分离纯化后，对其所含的GFP突变基因进行测序，发现其碱基序列与GFP基因的不同，将该GFP突变基因命名为YFP基因(黄色荧光蛋白基因)。若要通过基因工程的方法探究YFP基因能否在真核细胞中表达，实验思路是______ ____________________________________________________________________________________________________。 基因插入表达载体，再将构建成功的重组表达载体导入不能发黄色荧光的真核细胞中，观察黄色荧光是否出现 将YFP 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 11 12 13 14 用基因工程将目的基因导入真核细胞，检测是否发黄色荧光即可。如以酵母菌为受体菌，以YFP为目的基因，通过基因工程技术，观察导入基因表达载体后的受体酵母菌是否可以发黄色荧光。 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 11 12 13 14 12.(8分)(2024·新课标卷)某研究小组将纤维素酶基因(N)插入某种细菌(B1)的基因组中，构建高效降解纤维素的菌株(B2)。该小组在含有N基因的质粒中插入B1基因组的M1 与M2片段；再经限制酶 切割获得含N基因的片段 甲，片段甲两端分别为 M1与M2；利用CRISPR /Cas9基因组编辑技术将 片段甲插入B1的基因组， 得到菌株B2。酶切位点(Ⅰ～Ⅳ)、引物(P1～P4)的结合位置、片段甲替换区如图所示，→表示引物5‘→3’方向。回答下列问题。 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 11 12 13 14 (1)限制酶切割的化学键是___________。为保证N基因能在菌株B2中表达，在构建片段甲时，应将M1与M2片段分别插入质粒的Ⅰ和Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ酶切位点之间，原因是______________________________________________ ____________________________。 磷酸二酯键 保证N基因启动子、N基因、N基因终止子的完整性，确保N基因能够顺利表达 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 11 12 13 14 限制酶能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。在构建片段甲时，将M1与M2片段分别插入质粒的Ⅰ和Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ酶切位点之间，可保证片段甲中的启动子位于N基因上游，终止子位于N基因下游，从而使N基因能在菌株B2中 表达。 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 11 12 13 14 (2)CRISPR/Cas9技术可以切割细菌B1基因组中与向导RNA结合的DNA。向导RNA与B1基因组DNA互补配对可以形成的碱基对有G－C和________ ______________。 C－G、 U－A、A－T 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 11 12 13 14 向导RNA为核糖核苷酸序列，含有碱基A、U、C、G；B1基因组DNA为脱氧核苷酸序列，含有碱基A、T、C、G。故向导RNA与B1基因组DNA互补配对可形成的碱基对有G－C、C－G、U－A、A－T。 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 11 12 13 14 (3)用引物P1和P2进行PCR可验证片段甲插入了细菌B1基因组，所用的模板是______________________；若用该模板与引物P3和P4进行PCR，实验结果是___________。 菌株B2的基因组DNA 无扩增产物 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 11 12 13 14 由题中信息“利用 CRISPR/Cas9基因组 编辑技术将片段甲插 入B1的基因组，得到 菌株B2”可知，用引 物P1和P2进行PCR验 证片段甲插入了细菌 B1基因组所用的模板为菌株B2的基因组DNA。结合题图分析可知P4是以细菌B1基因组DNA为模板设计的引物，故以菌株B2的基因组DNA为模板，以P3和P4为引物进行PCR，不能扩增出目的条带。 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 11 12 13 14 (4)与秸秆焚烧相比，利用高效降解纤维素的细菌处理秸秆的优点是______ _______________________(答出2点即可)。 废物利用，减少环境污染 实现 焚烧秸秆会污染环境，利用高效降解纤维素的细菌处理秸秆可实现废物利用，减少环境污染、高效利用秸秆资源等。 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 11 12 13 14 13.(8分)(2024·湖南卷)百合具有观赏、食用和药用等多种价值，科研人员对其进行了多种育种技术研究。回答下列问题。 (1)体细胞杂交育种。进行不同种百合体细胞杂交前，先用______________ ______去除细胞壁获得原生质体，使原生质体融合，得到杂种细胞后，继续培养，常用_____________________(填植物激素名称)诱导愈伤组织形成和分化，获得完整的杂种植株。 纤维素酶和果 胶酶 生长素和细胞分裂素 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 11 12 13 14 因植物细胞细胞壁的成分主要是纤维素和果胶，因此获得原生质体的方法是用纤维素酶和果胶酶对植物细胞进行处理。得到原生质体后使原生质体融合，形成杂种细胞，再用生长素和细胞分裂素诱导愈伤组织形成和分化，从而获得完整的杂种植株。 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 11 12 13 14 (2)单倍体育种。常用______________的方法来获得单倍体植株，鉴定百合单倍体植株的方法是______________________________________________ _____。 花药离体培养 利用显微镜观察根尖有丝分裂中期细胞中染色体的 数目 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 11 12 13 14 获得单倍体植株的常用方法是花药(花粉)离体培养；鉴定百合单倍体植株的方法是利用显微镜观察根尖有丝分裂中期细胞中染色体的数目，如果染色体数目减少一半，则获得的植株即为单倍体植株。 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 11 12 13 14 (3)基因工程育种。研究人员从野生百合中获得一个抵抗尖孢镰刀菌侵染的基因L，该基因及其上游的启动子pL和下游的终止子结构如图a。图b是一种Ti质粒的结构示意图，其中基因gus编码GUS酶，GUS酶活性可反映启动子活性。 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 11 12 13 14 ①研究病原微生物对L的启动子pL活性的影响。从图a所示结构中获取pL，首先选用_________________酶切，将其与相同限制酶酶切的Ti质粒连接，再导入烟草。随机选取3组转基因成功的烟草(P1、P2和P3)进行病原微生物胁迫，结果如图c。由此可知：三种病原微生物都能诱导pL的活性增强，其中__________的诱导作用最强。 HindⅢ、BamHⅠ 交链格孢 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 11 12 13 14 根据目的片段以及质粒上限制酶的识别位点，若要获得pL并连接到质粒上，可选用限制酶HindⅢ、BamHⅠ进行酶切，以替换Ti质粒中的启动子，从而达到根据GUS酶活性反映启动子活性的目的。根据图c的结果可知，交链格孢处理的每一组转基因烟草中的GUS酶活性都最高，可确定其诱导作用最强。 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 11 12 13 14 ②现发现栽培种百合B中也有L，但其上游的启动子与野生百合不同，且抗病性弱。若要提高该百合中L的表达量，培育具有高抗病原微生物能力的百合新品种，简要写出实验思路。________________________________ ________________________________________。 利用转基因技术将百合B中基因L的 启动子替换为野生百合中基因L的启动子pL 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 11 12 13 14 欲培育具有高抗病原微生物能力的百合新品种，可利用转基因技术将百合B中基因L的启动子替换为野生百合中基因L的启动子pL。 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 11 12 13 14 14.(10分)(2024·广东卷)驹形杆菌可合成细菌纤维素(BC)并将其分泌到胞外组装成膜。作为一种性能优异的生物材料，BC膜应用广泛。研究者设计了酪氨酸酶(可催化酪氨酸形成黑色素)的光控表达载体，将其转入驹形杆菌后构建出一株能合成BC膜并可实现光控染色的工程菌株，为新型纺织原料的绿色制造及印染工艺升级提供了新思路(图1)。 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 11 12 13 14 回答下列问题。 (1)研究者优化了培养基的__________(答两点)等营养条件，并控制环境条件，大规模培养工程菌株后可在气液界面处获得BC菌膜(菌体和BC膜的复合物)。 碳源、氮源 培养基的营养物质包括水、无机盐、碳源、氮源等，研究者培养工程菌，需要优化培养基的碳源、氮源等营养条件，并控制环境条件。 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 11 12 13 14 (2)研究者利用T7噬菌体来源的RNA聚合酶(T7RNAP)及蓝光光敏蛋白标签，构建了一种可被蓝光调控的 基因表达载体(光控原理见图2a， 载体的部分结构见图2b)。构建 载体时，选用了通用型启动子 PBAD(被工程菌RNA聚合酶识 别)和特异型启动子PT7(仅被 T7RNAP识别)。为实现蓝光控 制染色，启动子①②及③依次为 ___________________，理由是_____________________________________ _____________________________。 PT7、PBAD和PBAD 基因2和3正常表达出无活性的T7RNAP， 被蓝光激活后再启动基因1表达 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 11 12 13 14 题图2a分析可知，蓝光照射下， T7RNAP N端-nMag与T7RNAP C 端结合，导致无活性的T7RNAP 变成有活性的T7RNAP，结合图 1，蓝光处理后，RNA聚合酶 (T7RNAP)识别启动子①使基因1 转录获得相应的mRNA，再以其 为模板通过翻译过程获得酪氨酸 酶，酪氨酸酶从而催化染色液中酪氨酸形成黑色素，可见基因2和3正常表达出无活性的T7RNAP，被蓝光激活后再启动基因1表达，综合上述分析可知，为实现蓝光控制染色，启动子①②及③依次为PT7、PBAD和PBAD。 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 11 12 13 14 (3)光控表达载体携带大观霉素(抗生素)抗性基因。长时间培养时在培养液中加入大观霉素，其作用为________________________________________ ___________(答两点)。 选择含有重组质粒的驹形杆菌，杀死其他杂菌 避免污染 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 11 12 13 14 将携带大观霉素抗性基因的光 控表达载体导入驹形杆菌，会 获得未成功导入的菌株和成功 导入的工程菌株，长时间培养 时也可能感染其他杂菌，在培 养液中加入大观霉素可以筛选 出工程菌株，同时也能抑制 其他杂菌的生长，提高工程菌 的生产效率。 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 11 12 13 14 (4)根据预设的图案用蓝光照射已长出的BC菌膜并继续培养一段时间，随后将其转至染色池处理，发现只有经蓝光照射的区域被染成黑色，其原因是__________________________________________________。 该处细胞中T7RNAP激活，酪氨酸酶表达并合成黑色素 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 11 12 13 14 由小问2分析可知，细胞中 T7RNAP激活，酪氨酸酶表 达并合成黑色素，故用蓝光 照射已长出的BC菌膜并继续 培养一段时间，随后将其转至 染色池处理，发现只有经蓝光 照射的区域被染成黑色。 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 11 12 13 14 (5)有企业希望生产其他颜色图案的BC膜。按照上述菌株的构建模式提出一个简单思路：__________________________________________________ ________________________________________。 将酪氨酸酶替换成催化其他色素合成的酶(或将酪氨酸酶替换成不同颜色蛋白)，催化产生不同的色素 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 11 12 13 14 由小问2分析可知，题干信息 的设计思路最终BC膜被染成 黑色，希望生产其他颜色图 案的BC膜，则需要将酪氨酸 酶替换成催化其他色素合成 的酶(或将酪氨酸酶替换成不 同颜色蛋白)，催化产生不同 的色素。 返回 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 11 12 13 14 规范 答题7 “四步法”把控基因工程操作程序题 返回 (2024·山东卷)研究发现基因L能够通过脱落酸信号途径调控大豆的逆境响应。利用基因工程技术编辑基因L，可培育耐盐碱大豆品系。在载体上的限制酶BsaⅠ切点处插入大豆基因L的向导DNA序列，将载体导入大豆细胞后，其转录产物可引导核酸酶特异性结合基因组上的目标序列并发挥作用。载体信息、目标基因L部分序列及相关结果等如图所示。 真题演示 (1)用PCR技术从大豆基因组DNA中扩增目标基因L时，所用的引物越短，引物特异性越____(填“高”或“低”)。限制酶在切开DNA双链时，形成的单链突出末端为黏性末端，若用BsaⅠ酶切大豆基因组DNA，理论上可产生的黏性末端最多有_____种。载体信息如图甲所示，经BsaⅠ酶切后，载体上保留的黏性末端序列应为5'-________-3'和5'-________-3'。 低 256 GTTT CAAT (2)重组载体通过农杆菌导入大豆细胞，使用抗生素__________筛选到具有该抗生素抗性的植株①～④。为了鉴定基因编辑是否成功，以上述抗性植株的DNA为模板，通过PCR扩增目标基因L，部分序列信息及可选用的酶切位点如图乙所示，PCR产物完全酶切后的电泳结果如图丙所示。据图可判断选用的限制酶是________，其中纯合的突变植株是_______(填序号)。 卡那霉素 SacⅠ ④ (3)实验中获得1株基因L成功突变的纯合植株，该植株具有抗生素抗性，检测发现其体细胞中只有1条染色体有T-DNA插入。用抗生素筛选这个植株的自交子代，其中突变位点纯合且对抗生素敏感的植株所占比例为______，筛选出的敏感植株可用于后续的品种选育。 1/4 信息审读 关键信息 信息加工 引物特异性 筛选到具有该抗生素抗性的植株 其体细胞中只有1条染色体有T-DNA插入。用抗生素筛选这个植株的自交子代 引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。用于PCR的引物长度通常为20～30个核苷酸，所用的引物越短，则引物的特异性就越低 基因表达载体中标记基因可用于目的基因的筛选，根据图示信息可知，(2)重组载体通过农杆菌导入大豆细胞当中的片段包含了卡那霉素抗性基因，因此可以通过使用卡那霉素筛选到具有该抗生素抗性的植株 (3)经过检测发现其体细胞中只有一条染色体含有T-DNA插入。根据图示可知，抗生素抗性基因在T-DNA片段上，因此如果用抗生素来筛选，该植株进行自交，可知其配子中含有抗生素抗性基因的比例为1/2，不含T-DNA(对抗生素敏感)的配子比例为1/2，因此突变位点纯合且对抗生素敏感的植株所占比例应该为1/2×1/2＝1/4，可以筛选出敏感植株用于后续的品种选育 思维路径 规范作答 (1)低　256　GTTT　CAAT (2)卡那霉素　SacⅠ　④ (3)1/4 方法归纳　“四步法”把控基因工程基本操作程序题 (1)(三辨－分辨限制酶的种类、识别序列和切割位点。在切割目的基因和载体时，一般用不同的限制酶切割。 (2)三找－找出标记基因、目的基因及其插入位点。一般来说，质粒中至少有一个标记基因，如抗生素抗性基因。明确目的基因的插入位点是在标记基因内部还是在标记基因之外。 (3)一析－分析目的基因插入质粒后是否破坏了标记基因。如果质粒中有一个标记基因，则插入目的基因后不能破坏标记基因；如果质粒中有两个标记基因，则需看标记基因中是否有插入位点，如果某一标记基因中有插入位点，则目的基因插入质粒后该标记基因被破坏。 (4)一定－确定判断目的基因是否导入受体细胞的方法。一般用含有某种抗生素的培养基培养受体菌，如果有两种抗生素抗性基因，还需判断用哪一种抗生素来检测。 返回 1.(2024·山东济南三模)基因SLC能控制合成5-羟色胺转运体(5-HTT蛋白)。机体缺氧可以诱导神经细胞PC12 凋亡和5-HTT蛋白表达量升高。为 探究5-HTT蛋白表达的变化对缺氧 神经细胞的影响，科研人员构建了 带有基因shSLC(其结构如图1所示) 和绿色荧光蛋白基因GFP的重组质 粒(如图2所示)并进行了相关检测。 shSLC通过转录得到的shRNA(如图 3所示)可用于干扰基因SLC翻译过 程，而使其沉默。 跟踪演练 (1)将图1中人工合成的大量A链和B链与缓冲液共同放入PCR仪中，经______和______过程可得到shSLC。 变性 复性 PCR的过程包括变性、复性和 延伸，因此将图1中人工合成的 大量A链和B链与缓冲液共同放 入PCR仪中，A链和B链可作为 模板链进行DNA复制，经变性 和复性过程可得到shSLC。 (2)shSLC可以和经AgeⅠ和EcoRⅠ双酶切的载体相连的原因是_____________________ ______________________________________。对构建成功的载体鉴定时，最好使用_______(填“AgeⅠ”“EcoRⅠ”或 “KpnⅠ”)完成酶切，然后通过凝胶电 泳将酶切后产生的不同长度DNA片段分 离出来，从而完成鉴定过程。若用A链 做引物F1，B链做引物R1，其位置如上 图所示。另有引物F2和引物R2，鉴定构 建成功的载体，一般利用__________(填“F1和R2”或“F2和R2”)进行PCR并对扩增目的产物进行测序验证，使用所选引物 的原因是__________________________ ___________________________________。 双酶切后产生了与shSLC相同的黏性末端 载体被AgeⅠ和EcoRⅠ AgeⅠ F2和R2 因为使用F1进行PCR易形成 发卡结构，可能导致不会出现目标产物 识图分析可知，载体经AgeⅠ和 EcoRⅠ双酶切后产生了与shSLC 相同的黏性末端，因此shSLC可 以和经AgeⅠ和EcoRⅠ双酶切的 载体相连。对构建成功的载体鉴 定时，最好使用AgeⅠ完成酶切， 酶切后可以产生带有基因shSLC 和绿色荧光蛋白基因的片段，然 后通过凝胶电泳将酶切后产生的不同长度DNA片段分离出来，分离得到带有基因shSLC和绿色荧光蛋白基因的片段从而完成鉴定过程。 根据图示和题意可知，一般利 用F2和R2进行PCR并对扩增目 的产物进行测序验证，如果使 用A链做引物F1，A链中含有发 卡结构区，因此F1进行PCR易 形成发卡结构，可能导致不会出 现目标产物。 (3)表达载体转染PC12细胞后，可通过荧光显微镜下观察细胞___________ ___的表达进行鉴定；据图4分析转染shSLC组中5-HTT蛋白表达量____。 绿色荧光蛋 降低 白 根据图示和题意可知， 表达载体中含有绿色 荧光蛋白基因GFP作 为标记基因，因此表 达载体转染PC12细胞 后，可通过荧光显微 镜下观察细胞绿色荧 光蛋白的表达进行鉴 定；据图4分析可知，与对照组相比，转染shSLC组中5-HTT蛋白表达量降低。 (4)检测发现对照组正常情况下细胞凋亡率6.30％，缺氧24 h后细胞凋亡率14.24％；转染shSLC组正常情况下细胞凋亡率6.38％，缺氧24 h细胞凋亡率9.10％。据此可得出的结论是_____________________________________ ___________________________________________________。 正常条件下沉默SLC基因对细胞凋亡无影 响，缺氧后沉默SLC基因的PC12细胞凋亡比例明显下降 根据题意，对照组正 常情况下细胞凋亡率 6.30％，缺氧24 h后 细胞凋亡率14.24％； 转染shSLC组正常情 况下细胞凋亡率 6.38％，缺氧24 h细 胞凋亡率9.10％。据 此可知，与对照组相比，正常条件下沉默SLC基因对细胞凋亡无影响，缺氧后沉默SLC基因的PC12细胞凋亡比例明显下降。 2.(2024·济宁三模)PCR技术的实用性和极强的生命力使其成为生物科学研究的一种重要方法，极大地推动了分子生物学以及生物技术产业的发展。下面是两个具体实验中的PCR技术应用，请根据资料回答下列问题。 (1)重叠延伸PCR技术是一种通过寡聚核苷酸链之间重叠的部分互相搭桥、互为模板，通过多次PCR扩增，从而获 得目的基因的方法。利用该技术可以实 现基因的定点诱变。它在需要诱变的位 置合成两个带有变异基因碱基的互补引 物，然后分别与引物a和引物d做PCR， 这样得到的两个PCR引物产物都带有变 异基因，并且彼此重叠，再将重叠部位 进行重组PCR就能得到诱变PCR产物， 如图所示： ①PCR扩增DNA的过程中，引物a、b、c、d中，PCR1应选择图1中引物__________，大量扩增突变产物AD则应选择引物__________。 ①a和b a和d PCR扩增DNA的过程中，新合成的两 条单链延伸方向相反，根据图中引物 的方向可知，PCR1应选择引物a和b， 得到产物AB。PCR2应选择引物c和d， 得到产物CD。突变产物AD扩增选择 的引物是a和d。重叠延伸时，可以分 别以AB上链和CD下链为引物进行延 伸，所以不需要引物。 ②重叠延伸PCR通过______________________实现定点突变。PCR1和PCR2需要分别进行的原因是_____________________________________。 在引物b和c上引入突变 引物b和引物c可以互补配对，导致引物失效 重叠延伸PCR通过在引物b和c上引入 突变实现定点突变，引物b和c分别和 第一代DNA的两条单链的对应碱基互 补，则其上的碱基应互补配对。由于 引物b和引物c可以互补配对，导致引 物失效，所以PCR1和PCR2需要分别 进行。 ③若正常基因可被限制酶DpnⅠ识别并切割，特定位点突变后的基因不能被DpnⅠ识别，请设计实验思路鉴定上 述过程获得的突变产物AD是否为突变 基因：___________________________ _________________________________ _________________________________ _________________________________ _________________________________ _______。 用限制酶DpnⅠ分别处理正常基因和上述过程获得的突变产物AD，然后进行电泳；若上述过程获得的突变产物AD的电泳条带只有一条且大于正常基因的电泳条带，则为突变基因 据题意可知，正常基因可被限制酶 DpnⅠ识别并切割，特定位点突变后 的基因不能被DpnⅠ识别，因此要鉴 定获得的突变产物AD是否为突变基 因，实验设计思路为：用限制酶DpnⅠ 分别处理正常基因和上述过程获得的 突变产物AD，然后进行电泳；若上 述过程获得的突变产物AD的电泳条 带只有一条且大于正常基因的电泳条 带，则为突变基因。 (2)反向PCR可用于扩增未知序列，其原理如下图所示。下图链状DNA分子内侧是已知序列，外侧为未知序列。 ①不直接在图2中DNA分子的两端设计引物并进行扩增，原因是_________ _________________________。 序列未知，无法设计引物 DNA两端 利用PCR技术扩增目的基因的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列作为引物，由于该DNA分子两端的脱氧核苷酸序列未知，故无法设计引物，所以不能直接在图1中DNA分子的两端设计引物并进行 扩增。 ②图3中环状DNA进行PCR的过程中，沿引物A延伸子链的延伸方向是_______(填“顺时针”或“逆时针”)，PCR产物_____(填“含有”或“不含”)EcoRⅠ的酶切位点。 逆时针 含有 据图中未知序列的 位置可知，图3中环 状DNA进行PCR的 过程中，沿引物A 逆时针延伸子链， 沿引物a顺时针延 伸子链，才能扩增 到未知序列，由于碱基互补配对，环化后的DNA分子含有EcoRⅠ的切割位点，则PCR产物含有EcoRⅠ的酶切位点。 3.(2023·北京昌平二模)研究者利用基因组编辑技术，将Bcl-2(抗凋亡)基因定点敲入FUT8(岩藻糖转移酶)基因，从而改造中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。 (1)Cas9蛋白和sgRNA是基因组编辑工具(图1)，为筛选进行高效编辑的sgRNA，需根据________基因相应序列，设计并合成多个sgRNA链。分别构建sgRNA/Cas9表达质粒，并通过__________法导入CHO细胞。 FUT8 显微注射 据图可知，需要进行基因编辑，需构建含sgRNA基因和Cas基因的重组DNA分子(重组质粒，基因表达载体)，并导入受体细胞。需根据FUT8基因相应序列，设计并合成多个sgRNA链，并通过显微注射法导入CHO细胞。 (2)Cas9蛋白与靶序列结合并将DNA双链切断，随后细胞会通过DNA损伤修复机制，将断裂处两端的序列连接起来，但在缺口处会发生碱基错配。T酶能特异性识别并切割错配的双链DNA，通过T酶的酶切实验检测sgRNA在CHO细胞内编辑效率。对图2电泳结果分析，__________组实现sgRNA的高效编辑。 2、3、4 对图2电泳结果分析，2、3、4组电泳片段最多，由于T酶能特异性识别并切割错配的双链DNA，通过T酶的酶切实验检测sgRNA在CHO细胞内编辑效率，可知2、3、4组实现sgRNA的高效编辑。 (3)将含目的基因表达框和sgRNA/Cas9表达质粒(1∶1)共转染CHO细胞，实现同步敲入敲除基因，具体过程如图3。 ①目的基因表达框中含基因表达所需的元件，元件顺序依次为：同源序列Ⅰ－________________－同源序列Ⅱ， ___元件导致FUT8基因靶点后序列没 有成功转录。(填选项) a.T2A(连接子) b.启动子 c.转录终止信号 d.Bcl-2基因 e.FUT8基因 f.绿色荧光蛋白基因 b－d－a－f－c c 目的基因表达框中含基因表达所需的元件，元件顺序依次为：同源序列Ⅰ－b－d－a－f－c－同源序列Ⅱ，c元件导致FUT8基因靶点后序列没有成功转录。 ②选取具有__________特征的细胞，进一步提取基因组DNA，并对图3中片段__________进行PCR，筛选出在FUT8靶基因处成功整合目的基因表达框的单克隆细胞。若PCR扩增产物的电泳结果出现__________________ ______________，表明筛选出的单克隆细胞为成功定点整合的纯合细胞。 绿色荧光 1、2、3 长度约4 768 bp的(明 亮)单一条带 选取具有绿色荧光特征的细胞，进 一步提取基因组DNA，对图3中片段 目的基因1、2、3进行PCR，筛选出 在FUT8靶基因处成功整合目的基因 表达框的单克隆细胞。若PCR扩增 产物的电泳结果出现长度约 4 768 bp的(明亮)单一条带，表明筛 选出的单克隆细胞为成功定点整合 的纯合细胞。 (4)CHO细胞是基因工程中生产抗体的常用受体细胞，FUT8负责将岩藻糖转移至表达抗体上，而岩藻糖的存在会极大地降低抗体的作用。请分析利用改造后的CHO细胞株进行抗体生产的优势：______ ________________________________________________________________________________________________________________________________。 改造后的CHO细胞株具有Bcl-2基因不易发生细胞凋亡，利于进行抗体的大规模生产；同时其生产的抗体无岩藻糖修饰，利于发挥抗体的作用 利用改造后的CHO细胞株进行抗体 生产的优势是：改造后的CHO细胞 株具有Bcl-2基因不易发生细胞凋亡， 利于进行抗体的大规模生产；同时 其生产的抗体无岩藻糖修饰，利于 发挥抗体的作用。 返回 谢 谢 观 看 基因工程的基本工具和操作程序 $