第54讲 基因工程的基本工具——2026届高中生物学一轮复习课件

第54讲 基因工程的基本工具 贺老师 大概念九 利用生物技术与工程生产对人类有用的产品 1 基因工程：是指按照人们的愿望，通过 等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物制品。 从技术操作层面看，由于基因工程是在 水平上进行设计和施工的，因此又叫： 。 体外环境 基因 分子水平 基因重组 赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物制品 定向改造生物性状；克服远缘杂交不亲和障碍 1.操作环境： 2.原理： 3.操作对象： 4.操作水平： 5.结果： 6.意义： 考点1：基因工程的概念 转基因 重组DNA技术 有性生殖中的基因重组是随机的，并且只能在同一物种间进行重组； 基因工程可以实现遗传物质在不同物种间进行重组，并且方向性强，可以定向地改变生物的性状。 DNA分子 你怎么理解基因工程？人们为什么要进行转基因？ 有性生殖中的基因重组和基因工程有什么区别？ 2 【问题1】为什么不同生物的DNA分子能拼接起来？（拼接的基础） ①DNA分子的基本组成单位相同，都是4种脱氧核苷酸； ②空间结构相同，都是规则的双螺旋结构。 ③都遵循碱基互补配对原则。 DNA立体结构 DNA平面结构 CH2 H OH H H H H 碱基 磷酸 5’ 4’ 3’ 2’ 1’ 脱氧 核糖 考点1：基因工程的概念 3 【问题2】为什么一种生物的基因可以在另一种生物细胞内表达？ （表达的基础） ①基因是控制生物性状的独立遗传单位。 相同的遗传信息在不同生物体内表达出相同的蛋白质，同一蛋白质在不同细胞中的功能相同。 ③生物界共用一套遗传密码。 DNA RNA 蛋白质 转录 翻译 复制 ②基因的表达过程相同：中心法则。 考点1：基因工程的概念 遗传信息的传递都遵循中心法则 4 考点2：重组DNA技术的基本工具 思考：获得转基因抗虫棉需要哪些分子工具? 苏云金杆菌 普通棉花(无抗虫特性) 抗虫基因 转入植物细胞 提取 怎么做？ “分子运输车” 抗虫棉： 含Bt抗虫蛋白 载体： 将体外重组DNA分子导入受体细胞 限制性内切核酸酶：准确切割DNA分子 “分子缝合针” DNA连接酶： 将DNA片段连接起来 通过转基因来转性状 5 考点2：重组DNA技术的基本工具 1 限制性内切核酸酶——”分子手术刀“ （1） 来源： 主要是原核生物，目前分离出数千种，也可人工合成 （2）作用特点： 能够识别双链DNA分子的 ，并使每一条链中特定部位的 断开。 磷酸二酯键 酶的专一性 思考1：原核生物中存在限制酶的意义是什么？ 原核生物中限制酶的作用是切割外源DNA以保证自身安全，防止外来病原物的危害。 思考2：限制酶来源于原核生物，为什么不能切割自己的DNA分子？ 通过长期的进化，细菌DNA分子中不具备这种限制酶的识别序列 限制酶的识别序列被修饰（如甲基化），使限制酶不能将其切开。 特定脱氧核苷酸序列 T C G A A G C T 6 （3） 限制酶的识别序列： 中轴线 几种限制酶识别的特定序列有何特点？ ①大多数限制酶的识别序列由 组成，也有少数限制酶的识别序列由4个、8个或其他数量的核苷酸组成。 6个核苷酸 ②都可以找到一条中心轴线； ③回文序列：从5’→3’正向读与另一条链从5’→3’反向读的碱基顺序完全一致 1.下面哪项不具有限制酶识别序列的特征（ ） A．GAATTC B．GGGGCCCC CTTAAG CCCCGGGG C．CTGCAG D．CTAAATC GACGTC GATTTAG D 考点2：重组DNA技术的基本工具 EcoRⅠ 5’…G-A-A-T-T-C…3’ 3’…C-T-T-A-A-G…5’ SmaⅠ 5’…C-C-C-G-G-G…3’ 3’…G-G-G-C-C-C…5’ TaqⅠ 5’……T-C-G-A……3’ 3’……A-G-C-T……5’ 读：5’→ 3’ 中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称、重复排列的，称为回文序列。 7 ①实例1——EcoRⅠ限制酶切割 *EcoRⅠ识别序列为GAATTC *EcoRⅠ切割部位为GA之间的磷酸二酯键 黏性末端 黏性末端 ②实例2——SmaⅠ限制酶切割 *SmaⅠ识别序列为CCCGGG *SmaⅠ切割部位为CG之间的磷酸二酯键 平末端 DNA两条单链的切口处，伸出几个核苷酸，刚好能互补配对，这样的切口叫黏性末端。 切口处是平整的，这样的切口叫平末端。 （4） 切割结果： 考点2：重组DNA技术的基本工具 8 、 。 A.1种 B.2种 C.3种 D.4种 D 图中的黏性末端哪些能连接在一起？ ① ② ③ ④ ①② 问题1：下列所示的黏性末端是由几种限制性内切核酸酶作用产生的（　　） ③④ 问题2：DNA片段经限制酶处理后产生的相同黏性末端，再经过DNA连接酶处理后（即①②连接到一起后），形成的新的识别序列，能否再被所用的限制酶识别？ T T A A G C T T A A C G ①②连接形成的新序列： 原来限制酶识别的序列： C G T T A A 若两个相同黏性末端是由不同限制酶切割所得，形成的新的识别序列，不能再被所用的限制酶识别。 ① ② 技巧：判断两个末端是否为同一种限制酶切割产生的方法：将其中一个末端旋转180，若与另一个完全相同，则说明这两个末端是由同一种限制酶切割产生的。 9 2 DNA连接酶——”分子缝合针“ 考点2：重组DNA技术的基本工具 想一想：把两种来源不同的DNA进行重组，应该怎样处理？ 缺口怎么办？ G C T T A A A A T T C G G C T T A A A A T T C G 注意：氢键的形成不需要酶的催化 10 种类 来源 作用 差别 E.coli DNA连接酶连接平末端时效率远低于T4 DNA连接酶 都能将双链DNA片段“缝合“起来，恢复被限制酶切开的磷酸二酯键。 均能连接平末端和粘性末端。 E.coli DNA连接酶 T4 DNA连接酶 大肠杆菌 T4噬菌体 2 DNA连接酶——”分子缝合针“ 考点2：重组DNA技术的基本工具 因为黏性末端的碱基是互补的，在连接时，黏性末端可以通过碱基互补配对，加快DNA连接酶的连接速度，而平末端则不能。 11 DNA连接酶 DNA聚合酶 相同 作用实质 化学本质 不 同 点 模板 作用对象 作用结果 用途 都能催化形成磷酸二酯键 都是蛋白质 不需要 需要DNA的一条链作模板 形成完整的重组DNA分子 形成DNA的一条链 DNA复制、基因工程 DNA复制、基因工程 在两个DNA片段间形成磷酸二酯键 将单个核苷酸连接到已有DNA片段，形成磷酸二酯键 DNA连接酶 vs DNA聚合酶 12 项目 DNA连接酶 限制酶 DNA聚合酶 解旋酶 DNA酶 作用部位 作用对象 作用结果 磷酸二酯键 将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸 磷酸二酯键 磷酸二酯键 磷酸二酯键 氢键 DNA片段 DNA 单个的脱氧 核苷酸 DNA DNA 将两个DNA片段连接成完整的DNA分子 切割双链DNA分子 将单个的脱氧核苷酸连接到DNA单链末端 将双链DNA分子局部解旋为单链 DNA连接酶、限制酶、 DNA聚合酶、解旋酶、DNA酶的比较 13 限制酶 DNA 连接酶 DNA 聚合酶 解旋酶 DNA水解酶 思考：以下酶分别代表哪种酶？ 14 3 基因进入受体细胞的载体——”分子运输车“ 1、能否直接将游离的Bt蛋白基因送入棉花细胞？ ①游离的DNA片段进入受体细胞，一般会直接被分解； ②就算可以进行转录并翻译成蛋白质，游离的DNA片段也无法随着细胞分裂而进行复制，导致子代细胞中不再含有目的基因。 将 送入 ，在受体细胞内对目的基因进行 。 外源基因 在基因工程中使用的载体包括 等。 质粒、噬菌体和动植物病毒 种类 用途 不同点 质粒、噬菌体 植物病毒 动物病毒 将外源基因导入各种受体细胞 将外源基因导入植物细胞 将外源基因导入动物细胞 它们来源不同，在大小、结构、复制方式以及可以插入外源DNA片段的大小也有很大差别 动物病毒 噬菌体 1.作用： 2.种类： 受体细胞 大量复制 15 ③具有标记基因，便于筛选含有 重组DNA分子的细胞； ④对受体细胞无害。 ②在受体细胞中稳定存在并能自我复制或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制，使外源基因在受体细胞中稳定存在； ①有一个至多个限制酶切割位点， 便于插入目的基因； 3 基因进入受体细胞的载体——”分子运输车“ 质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。 最常用的载体——质粒 思考：载体上一定需要启动子和终止子存在吗？ 载体上通常需要启动子和终止子存在，这是目的基因表达的必要条件， 若基因克隆载体仅仅是携带和扩增外源DNA片段，而不涉及基因表达，那么不需要启动子和终止子。 3.运载体需具备的条件： 真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。 16 4、标记基因的筛选原理 导入 受体细胞 培养 加入氨苄青霉素 ①导入重组质粒的受体细胞存活并繁殖 ②导入普通载体的体细胞存活并繁殖 含有氨苄青霉素抗性基因载体（如质粒） 重组DNA导入受体细胞不是100%，而且导入率较低 3 基因进入受体细胞的载体——”分子运输车“ 17 4、标记基因的筛选原理 如何提高筛选的准确性？ 2、最终哪些菌落是由导入重组质粒的受体细胞繁殖而来的？ 用灭菌的绒布影印到含有四环素的培养基上（影印法） ① 菌落1和5 1、操作①是如何完成的？ (1)原理：将目的基因插入含有两种抗生素抗性基因的载体时，如果目的基因插入某种抗生素抗性基因内部，则会导致该抗生素抗性基因失活。如图，目的基因插入了四环素抗性基因内部，则四环素抗性基因失活。筛选方法：将细菌先放在含氨苄青霉素的培养基上培养，能生长的是含重组质粒的细菌和含质粒的细菌，如图中1、2、3、4、5菌落，再利，如图能生长的菌落为2、3、4，则在含四环素培养基上不生长的即含有重组质粒的菌落，如图中1、5菌落。最后，可在含氨苄青霉素的培养基上挑取1、5菌落进行培养。　　　 18 无法存活 存活；白色 存活；蓝色 如何提高筛选的准确性？ LacZ 基因表达产生的β-半乳糖甘酶能够分解 X-gal 产生蓝色物质，从而使菌落呈蓝色；否则菌落呈白色。 请分析下列3种大肠杆菌在含 X-gal 和青霉素的固体培养基上的存活情况及菌落颜色。 4、标记基因的筛选原理 3 基因进入受体细胞的载体——”分子运输车“ 当质粒上有两个标记基因时，可将目的基因插入其中一个标记基因中，也就是重组质粒上只含一个标记基因，普通质粒上含有两个标记基因。则没有导入质粒的受体细胞不具有标记基因控制的性状，导入普通质粒的受体细胞具有两个标记基因控制的性状，导入重组质粒的受体细胞只具有一个标记基因控制的性状。这样可根据标记基因控制的性状准确筛选出含有重组质粒的受体细胞。 19 1.(2023·湖北)用氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、四环素抗性基因(TetR)作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体(重组质粒)，并转化到受体菌中。下列叙述错误的是(　　) A.若用HindⅢ酶切，目的基因转录的产物可能不同 B.若用PvuⅠ酶切，在含Tet(四环素)培养基中的菌落，不一定含有目的基因 C.若用SphⅠ酶切，可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否 D.若用SphⅠ酶切，携带目的基因的受体菌在含Amp (氨苄青霉素)和Tet的培养基中能形成菌落 D 真题必刷 若用HindⅢ酶切，目的基因可能正向插入，也可能反向插入，转录的产物可能不同，A正确； 若用PvuⅠ酶切，重组质粒和质粒中都有四环素抗性基因(TetR)，B正确； DNA凝胶电泳技术可以分离不同大小的DNA片段，重组质粒的大小与质粒不同，能够鉴定重组质粒构建成功与否，C正确； SphⅠ的酶切位点位于四环素抗性基因中，若用SphⅠ酶切，会破坏四环素抗性基因(TetR)，因此在含Tet的培养基中不能形成菌落，D错误。 20 E.coli DNA连接酶 ③ 有一个至多个限制酶切割位点 质粒、噬菌体、动植物病毒 作用部位： 种类 DNA连 接酶 切开DNA分子的磷酸二酯键 主要存在于原核生物中 具有专一性（能识别双链DNA分子的特定核苷酸序列） T4 DNA连接酶 ① 对受体细胞无害 ② 能自我复制或整合到宿主DNA上。 ④ 常有特殊的标记基因 运载 工具 条件 种类： 磷酸二酯键 限制酶 作用部位： 来源： 特点： 作用结果： 产生黏性末端或平末端 重组DNA技术的基本工具 21 实验 DNA的粗提取与鉴定 贺老师 大概念九 利用生物技术与工程生产对人类有用的产品 22 DNA的粗提取与鉴定 1 实验原理 1．提取DNA的原理 2．鉴定DNA的原理 （1）DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精。 （2）DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同， 能溶于2mol/L NaCl溶液。0.14mol/LNaCl溶液溶解度最低 某种蛋白质的溶解度 在一定温度下（沸水浴），DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色，因此二苯胺试剂可以作为鉴定DNA的试剂。 实验组 空白对照组 变蓝 不变蓝 23 DNA的粗提取与鉴定 2 材料用具 1．选材 猪血（哺乳动物的成熟红细胞）无细胞核和线粒体，几乎不含DNA，不适合； 鸡血中红细胞有核DNA，且核DNA的量较多，适合。 含DNA的生物材料都可以，选取DNA含量相对较高的生物组织，成功率更大。 鸡血中加入柠檬酸钠，可防止血液凝固。 （1）选什么样的材料实验更易成功？ （2）猪血和鸡血，哪个适合用作提取DNA的材料？操作时如何防止血液凝固？ 新鲜洋葱、香蕉、菠菜、菜花和猪肝等 柠檬酸钠防止血液凝固的原理是通过与血液中的钙离子结合，形成可溶性的柠檬酸钙，从而减少血液中钙离子的浓度。钙离子在血液凝固过程中扮演着关键角色，它的减少有效地阻止了血液凝固。 24 DNA的粗提取与鉴定 2 材料用具 2．试剂 研磨液 体积分数为95%的酒精 2mol/L 的NaCl溶液 二苯胺 试剂 蒸馏水 溶解并提取DNA 溶解蛋白质等，析出DNA 溶解DNA 鉴定DNA，要现配现用 25 DNA的粗提取与鉴定 3 方法步骤 取材研磨 过 滤 DNA析出 DNA鉴定 称取30g洋葱，切碎，放入研钵中，倒入10mL研磨液，充分研磨。 破碎细胞，使核物质容易溶解在研磨液中 防止研磨时产生的热量影响DNA的提取量 (1)研磨的目的： (2)研磨时间不宜太长： 研磨液成分 作用 SDS(洗涤剂) EDTA Tris-HCl缓冲液 使蛋白质变性 抑制DNA酶 维持pH稳定 SDS（十二烷基硫酸钠）：溶解细胞膜和核膜，释放DNA；同时使蛋白质变性，便于后续分离。 EDTA（乙二胺四乙酸）：螯合金属离子（如Mg²⁺、Ca²⁺），抑制核酸酶活性，防止DNA被酶解。 Tris-HCl：维持溶液的pH稳定，通常调节至7.5-8.0。DNA对pH变化敏感，稳定的pH环境可防止DNA降解。 26 DNA的粗提取与鉴定 3 方法步骤 取材研磨 过 滤 DNA析出 DNA鉴定 方法一：在漏斗中垫上 过滤研磨液，4℃冰箱中静置后取 ； 方法二：将研磨液倒入塑料离心管中离心，取 。 纱布 上清液 上清液 问题1：过滤的纱布能用滤纸代替吗？ 不可以，因为DNA会被吸附到滤纸上而大量损失。 问题2：上清液中除DNA之外，可能含有哪些杂质？ 可能含有核蛋白、多糖等杂质 4℃冰箱：降低DNA 酶的活性，防止DNA被降解 由于玻璃表面带电荷，DNA易被吸附于玻璃表面，故实验中应尽量不使用或少使用玻璃器皿，且玻璃棒不能直插烧杯底部。 27 DNA的粗提取与鉴定 3 方法步骤 DNA析出 DNA鉴定 取材研磨 过 滤 问题1：此步骤的目的是？ 使蛋白质等溶解在酒精中，DNA不溶于酒精而析出。 问题2：酒精预冷的作用？ ①可抑制核酸水解酶的活性，进而抑制DNA降解； ②抑制分子运动，使DNA易形成沉淀析出； ③低温有利于增加DNA分子的柔韧性，减少其断裂。 问题3：为什么搅拌时应轻缓、并沿一个方向目的？ 减少DNA断裂，以便获得较完整的DNA分子 在上清液中加入体积相等的 溶液,静置2~3min，溶液中出现的 就是粗提取的DNA 。 预冷的酒精 白色丝状物 28 实验组 对照组 沸水浴加热 DNA的粗提取与鉴定 3 方法步骤 DNA析出 DNA鉴定 取材研磨 过 滤 加入2mol/L氯化钠溶液 不加入丝状物 加入4ml二苯胺试剂 加入2mol/L氯化钠溶液 加入丝状物 加入4ml二苯胺试剂 将丝状物或沉淀物溶于 溶液中，加 入 试剂，混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min。 二苯胺 2mol/L的NaCl 29 DNA的粗提取与鉴定 4 进一步探究 如何利用NaCl溶液进一步提纯DNA？ 提示：DNA能溶于2mol/L NaCl溶液，在0.14mol/LNaCl溶液溶解度最低 操作1：得到的DNA粗提取物（丝状物或沉淀）加入2mol/L的NaCl溶液溶解，过滤，取滤液（DNA提取液）。 目的： 溶解DNA，除掉高盐溶液中不能溶解的杂质，提纯DNA液。 操作2：上述得到的DNA提取液，缓缓加入蒸馏水，调节NaCl溶液的浓度为0.14mol/L，玻璃棒搅拌，析出DNA。 目的： 降低NaCl溶液浓度，从而降低DNA分子在NaCl溶液中的溶解度，使DNA析出，除掉溶解在低盐溶液中的杂质。 通过反复溶解与析出DNA，就能够除去 的多种杂质。 与DNA溶解度不同 30 1.如果选用鸡血细胞进行实验，如何快速破碎细胞？ 将鸡血细胞置于蒸馏水中，待细胞涨破后，收集滤液。 利用蛋白酶分解杂质蛋白，不分解DNA，有利于DNA与蛋白质分开。 2.有时会在DNA滤液中添加嫩肉粉（木瓜蛋白酶），这样有什么好处？ 拓展探究： 以血液（如鸡血细胞）为实验材料时，每100 mL血液中需要加入3g柠檬酸钠，防止血液凝固。 31 $