第55讲 基因工程的应用和蛋白质工程+正反接检测、同源重组——2026届高中生物学一轮复习课件

该高中生物学高考复习课件聚焦基因工程应用、蛋白质工程等核心考点，依据高考评价体系梳理农牧业/医药卫生等应用场景、蛋白质工程操作流程等考查维度，通过真题分析明确重组质粒构建、表达载体检测等高频题型，构建系统备考框架。 课件亮点在于“真题精析+热点突破+素养培育”策略，如以2023山东真题为例解析引物选择与载体结构，结合科学思维剖析单酶切正向反向连接的PCR检测方法，通过探究实践强化无缝克隆技术应用。特设易错点警示与答题模板，助力学生掌握得分技巧，教师可据此高效规划复习，提升备考针对性。

第55讲 基因工程的应用 贺老师 大概念九 利用生物技术与工程生产对人类有用的产品 1 农牧业方面 1.转基因抗虫植物 2.转基因抗病植物 3.转基因抗除草剂植物 4.改良植物的品质 5.提高动物的生长速率 6.改善畜产品的品质 医药卫生领域 食品工业方面： 1.对微生物或动植物的细胞进行基因改造，使它们能 够生产药物。 2.利用基因工程技术，可以让哺乳动物批量生产药物， 如乳腺生物反应器。 3.用转基因动物作器官移植的供体等。 构建基因工程菌生产食品工业用酶（如凝乳酶、淀粉酶、淀粉酶、脂酶等）、氨基酸、维生素等 ：营养价值（必需氨基酸）、观赏价值（花青素代谢相关基因） ：外源生长激素基因 ：如乳糖不耐受——肠乳糖酶基因 考点一：基因工程的应用 超级小鼠 细胞因子、干扰素、抗体、疫苗和激素等 2 药用蛋白基因如人生长激素基因 提供受精卵 显微注射 胚胎移植 转基因羊 生长激素 基因表达载体含有乳腺细胞中特异表达的基因的启动子 1.实例： 乳腺生物反应器 或 乳房生物反应器 2.乳腺生物反应器的培育过程： 胚胎移植前应做DNA分析，鉴定性别，保留雌性 1 让转基因哺乳动物批量生产药物 含人生长激素 考点一：基因工程的应用 羊奶 为什么可以从羊奶中提取药用蛋白？ 按功能分：组成型启动子、诱导型启动子、组织特异性启动子。注意：启动子具有物种和组织的特异性 乳腺是一个外分泌器官，乳汁不进入体内循环，不会影响转基因动物本身的生理代谢反应。 该启动子具有物种和组织的特异性，让药用蛋白基因只在乳腺细胞中特异性表达 3 2 让转基因哺乳动物批量生产药物 1.乳腺生物反应器指的是转基因动物的乳腺吗？ 2.药用蛋白基因存在于转基因动物的哪些细胞中？为什么？ 几乎所有细胞。 不是，指的就是这个转基因动物 因为它们都是由同一个受精卵分裂、分化而来的 3.与利用细菌生产药用蛋白相比，用动物乳腺生物反应器生产药用蛋白的优势是什么？ ①动物乳腺有完整的蛋白质翻译后修饰系统，生产的蛋白质活性高，更稳定； ②产物直接经乳汁分泌，易提取。 考点一：基因工程的应用 4 膀胱生物反应器：继哺乳动物乳腺生物反应器研发成功后，膀胱生物反应器的研究也取得了一定进展。最近，科学家培养出一种转基因小鼠，其膀胱上皮细胞可以合成人的生长激素并分泌到尿液中。 1.研制膀胱生物反应器时，应如何处理目的基因？ 将目的基因与膀胱上皮细胞中 等调控元件重组在一起。 药用蛋白基因 膀胱上皮细胞中特异表达的基因的启动子等调控元件 基因表达载体 受精卵 转基因动物 药物 早期胚胎培养 早期胚胎 显微注射 胚胎移植 培育过程 尿液 2.膀胱生物反应器相比乳腺生物反应器的优点是什么？ 从尿中提取蛋白质比在乳汁中提取简便、高效。 不受性别、年龄的限制 特异表达的基因的启动子 5 在器官供体的基因组中导入 ， 以 的表达，或设法 ， 再结合 ，培育出不会引起免疫排斥反应的转基因克隆猪器官。 3 用转基因动物作为器官移植的供体 在人体所有细胞膜的表面，都有作为身份标签的一组蛋白质(主要组织相容性复合体MHC)，能被自身的免疫细胞识别。其他生物的细胞也带有各自的身份标签(相当于抗原)，当它们入侵人体后，能被免疫细胞识别出来，引起免疫排斥。 某种调节因子 抑制抗原决定基因 除去抗原决定基因 克隆技术 目的基因 基因敲除 将猪的器官移植给人为什么会引起免疫排斥？怎么从根本上消除免疫排斥现象？ (5)利用基因工程技术改造猪的器官的方法： 考点一：基因工程的应用 器官移植面临的一大难题就是 6 第55讲 蛋白质工程 贺老师 大概念九 利用生物技术与工程生产对人类有用的产品 7 基因工程的不足 将一种生物的基因转移到另一种生物体内，后者可以产生它本不能产生的 ，进而表现出新性状。 1、基因工程的实质：（教材P93） 蛋白质 2、基因工程的不足： 在原则上只能生产自然界 。 已存在的蛋白质 3、天然蛋白质的不足： 天然蛋白质的 符合特定物种生存的需要，却不一定完全符合 的需要。 结构和功能 人类生产和生活 蛋白质工程的目的： 生产符合人类生产和生活的需要的蛋白质 8 蛋白质工程 蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过改造或合成基因，来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需求。（p93） ①基础：_______________________________________________ ②途经：___________________ ③操作对象：______ ④目的：_______________________________________________________________ ⑤理论和技术： 蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系 改造或合成基因 改造现有蛋白质或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需求 基因(易错点) 借助计算机 通过X射线衍射技术 基因的定点突变技术 晶体学技术 又称第二代基因工程 获得蛋白质晶体： 分析晶体的结构： 构建蛋白质三维结构图: 碱基的替换： 由计算机建立的血红蛋白三维结构模型 利用X射线晶体衍射等，充分了解胰岛素的空间结构。 困难：蛋白质发挥功能必须依赖正确的高级结构，而蛋白质的高级结构十分复杂。 蛋白质工程是在基因工程的基础上，延伸出来的第二代基因工程，是涉及多学科的综合科技工程。 9 思考：对天然的蛋白质进行改造，为什么不是直接对蛋白质分子进行操作，而是通过对基因的操作来实现的？ 蛋白质工程 ①蛋白质的空间结构十分复杂，直接改造难度大，DNA为双螺旋结构； ②蛋白质是由基因编码的，改造了基因可以间接改造蛋白质； ③基因可以遗传，蛋白质无法遗传； 天然蛋白质合成和发挥作用的过程： 基因 表达（转录和翻译） 形成具有特定氨基酸序列的多肽链 加工成具有高级结构的蛋白质 行使生物功能 蛋白质工程是怎样的呢？ 10 预期功能 生物功能 分子设计 折叠 翻译 转录 基因 DNA 蛋白质 结构 氨基酸 序列 mRNA 从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列（基因）或合成新的基因→获得所需要的蛋白质。 蛋白质工程 蛋白质工程的基本思路： 逆中心法则，与天然蛋白质合成的过程相反 ①定点突变技术进行改造 ②人工合成等 11 思考：基因工程和蛋白质工程的操作对象都是基因，如何辨别一个操作是基因工程还是蛋白质工程？ 是否形成新的基因 蛋白质工程 是否对原有基因进行改造 是 否 是 否 蛋白质工程 基因工程 看蛋白质 看基因 是否为天然蛋白质 是 否 蛋白质工程 基因工程 蛋白质工程是在基因工程基础上延伸出来的第二代基因工程。 12 对胰岛素的改造的基本思路 氨基酸序列 新胰岛素基因 改造 降低胰岛素的聚合作用 预期功能 三维结构 推测 B28位脯氨酸替换为天冬氨酸 预期结构 转录 mRNA 折叠 行使 翻译 多肽链 有效抑制胰岛素的聚合 设计 功能 ①定点突变技术 ②人工合成 自然蛋白质的不足：天然胰岛素见效慢，是因为天然胰岛素制剂往往以二聚体或六聚体的形式存在，需要经历长时间才能解离为单体，发挥作用。 六聚体 单体 13 蛋白质工程的应用 自然蛋白质的不足：小鼠单克隆抗体会使人体产生免疫反应，从而导致治疗效果大大降低。 1 医药工业方面 实例2：制备人鼠嵌合抗体 【蛋白质工程】通过改造_____，将小鼠抗体上结合抗原的区域（即可变区）“嫁接”到人的抗体（即恒定区）上，经过这样改造的抗体诱发 的强度就会降低很多。 思考：该过程能通过基因定点突变技术改造基因实现吗？ 不能；需要通过基因拼接完成。 负责识别和结合抗原 免疫反应 基因 抗体的特异识别功能没有丧失 14 高考热点 贺老师 大概念九 利用生物技术与工程生产对人类有用的产品 15 热点一：单酶切法中正向连接与反向连接 载体与目的基因正向连接 载体与目的基因反向连接 （1）将目的基因接入质粒应选用的限制酶为 。 EcoR V （2）分别画出正向连接和反向连接的重组质粒。 （3）正接和反接的转录和翻译产物有何关系？ 特征 正接 反接 转录产物 翻译产物 目的mRNA 反义RNA（与目的mRNA互补） 功能性蛋白质（如酶、受体、结构蛋白） 无功能性蛋白质 16 载体与目的基因正向连接 载体与目的基因反向连接 正向连接与反向连接的检测 方法一：利用PCR和电泳进行检测 引物选择原则： 1条引物以载体为模板，另1条引物以目的基因为模板 可选用引物a、b： 若扩增出1100bp长度的产物，则为正向连接；若无法扩增出产物则为反向连接。 可选用引物a、c： 若无法扩增出产物，则为正向连接；若可扩增出1 000 bp长度的产物，则为反向连接。 热点一：单酶切法中正向连接与反向连接 17 用Bgl Ⅱ 和HindⅠ进行双酶切，电泳后若出现1100bp条带，则为正向连接； 电泳后若出现1000bp条带，则为反向连接。 方法二：利用限制酶和电泳进行检测 限制酶选择原则： 挑选目的基因内部的一个酶切位点（避免选择正中间位置，可偏向一侧）及载体插入片段一侧的酶切位点。 热点一：单酶切法中正向连接与反向连接 选择一种新的限制酶，该酶在目的基因内部具有唯一的切割位点，而在载体多克隆位点（MCS）中，这个位点位于原始单酶切位点的某一侧。通过这种“不对称”的酶切，正向连接和反向连接的重组质粒将被切割成不同长度和数量的DNA片段，从而通过琼脂糖凝胶电泳将其区分开。 18 1．（2025.湖南）非洲猪瘟病毒是一种双链DNA病毒，可引起急性猪传染病。基因A编码该病毒的主要结构蛋白A，其在病毒侵入宿主细胞和诱导机体免疫应答过程中发挥重要作用。回答下列问题： (1)制备特定抗原 ①获取基因A，构建重组质粒（如图所示）。重组质粒的必备元件包括目的基因、限制酶切割位点、标记基因、启动子和       等；为确定基因A已连接到质粒中且插入方向正确，应选用图中的一对引物       对待测质粒进行PCR扩增，预期扩增产物的片段大小为       bp。 ②将DNA测序正确的重组质粒转入大肠杆菌构建重组菌。培养重组菌，诱导蛋白A合成。收集重组菌发酵液进行离心，发现上清液中无蛋白A，可能的原因是       （答出两点即可）。 (2)制备抗蛋白A单克隆抗体 用蛋白A对小鼠进行免疫后，将免疫小鼠B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，诱导融合的常用方法有        （答出一种即可）。选择培养时，对杂交瘤细胞进行克隆化培养和       ，多次筛选获得足够数量的能分泌所需抗体的细胞。体外培养或利用小鼠大量生产的抗蛋白A单克隆抗体，可用于非洲猪瘟的早期诊断。 真题必刷 终止子、复制原点 P1和P3 782 缺失分泌到细胞外的信号，重组菌没有将蛋白A释放到细胞外；基因A未表达；基因A丢失 聚乙二醇（PEG）融合法（或灭活病毒诱导法、电融合法） 抗体检测 （1）重组质粒的必备元件包括目的基因、限制酶切割位点、标记基因、启动子和终止子，复制原点等，终止子能终止转录过程。 要确定基因 A 已连接到质粒中且插入方向正确，应选用引物 P1 和 P3。因为 P1 与基因 A 下游的非编码区互补配对，P3 与基因 A 上游且靠近启动子的区域互补配对，这样扩增的片段大小为200+582=782bp。 将 DNA 测序正确的重组质粒转入大肠杆菌构建重组菌，培养后上清液中无蛋白 A，可能的原因有：缺失分泌到细胞外的信号，重组菌没有将蛋白A释放到细胞外；基因A未表达；基因A丢失。 （2）①诱导动物细胞融合的常用方法有聚乙二醇（PEG）融合法、灭活病毒诱导法、电融合法等，这里答出其中一种即可，比如聚乙二醇（PEG）融合法。 ②选择培养时，对杂交瘤细胞进行克隆化培养和抗体检测，多次筛选获得足够数量的能分泌所需抗体的细胞。 19 2.（2023.山东）科研人员构建了可表达J-V5融合蛋白的重组质粒并进行了检测，该质粒的部分结构如图甲所示，其中V5编码序列表达标签短肽V5。 真题必刷   (1)与图甲中启动子结合的酶是              。除图甲中标出的结构外，作为载体，质粒还需具备的结构有           （答出2个结构即可）。 (2)构建重组质粒后，为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，需进行PCR检测，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物            。已知J基因转录的模板链位于b链，由此可知引物F1与图甲中J基因的              （填“a链”或“b链”）相应部分的序列相同。 (3)重组质粒在受体细胞内正确表达后，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表达水平，结果如图乙所示。其中，出现条带1证明细胞内表达了           ，条带2所检出的蛋白               （填“是”或“不是”）由重组质粒上的J基因表达的。 RNA聚合酶 限制酶切割位点、标记基因、复制原点等  F2和R1或F1与R2  a链 J-V5融合蛋白 不是 （1）基因表达载体的构建启动子是为了启动下游基因的“表达”，表达首先需要转录，因此RNA聚合酶识别和结合的部位才是转录的起始。作为运载体必须具备的条件：①要具有限制酶的切割位点；②要有标记基因（如抗性基因），以便于重组后重组子的筛选；③能在宿主细胞中稳定存在并复制；④是安全的，对受体细胞无害，而且要易从供体细胞分离出来，图中甲有启动子和终止子等，因此质粒还需具备的结构有限制酶的切割位点、标记基因、复制原点等。 （2）据图甲可知，引物F2与R1或F1与R2结合部位包含J基因的碱基序列，因此推测为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，进行PCR检测时，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物F2和R1或F1与R2。b是模板链，而根据图上启动子和终止子的位置可知转录方向是图上从左向右，对应的模板链方向应该是3’-5'，非模板链（也就是a链）是5'-3'；考虑到DNA复制的方向是子链的5’-3'，引物基础上延伸的方向肯定是5'-3'，所以引物结合的单链其方向是3'-5'；图中F1是前引物，在左侧，所以其配对的单链是3’-5'的b链，故其序列应该与a链相应部分的序列相同。 （3）据图乙可知，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测，均出现条带1，说明条带1是J-V5融合蛋白。抗J蛋白抗体检测出现条带2，抗V5抗体检测不出现条带2，说明条带2所检出的蛋白不是由重组质粒上的融合的J基因表达的。 20 3.GDNF是一种神经营养因子，对损伤的神经细胞具有营养和保护作用。研究人员构建了含GDNF基因的表达载体(如图1所示)，并导入到大鼠神经干细胞中，用于干细胞基因治疗的研究。请回答： (1)在分离和培养大鼠神经干细胞的过程中，使用胰蛋白酶的目的是_________________。 使细胞分散开 (2)构建含GDNF基因的表达载体时，需选择图1中的________限制酶进行酶切。 XhoⅠ 真题必刷 21 (3)经酶切后的载体和GDNF基因进行连接，连接产物经筛选得到的载体主要有3种：单个载体自连、GDNF基因与载体正向连接、GDNF基因与载体反向连接(如图1所示)。为鉴定这3种连接方式，选择HpaⅠ酶和BamHⅠ酶对筛选得到的载体进行双酶切，并对酶切后的DNA片段进行电泳分析，结果如图2所示。图中第________泳道显示所鉴定的载体是正向连接的。 ② 3.GDNF是一种神经营养因子，对损伤的神经细胞具有营养和保护作用。研究人员构建了含GDNF基因的表达载体(如图1所示)，并导入到大鼠神经干细胞中，用于干细胞基因治疗的研究。请回答： 22 热点二：同源重组和无缝克隆技术 23 热点二：同源重组和无缝克隆技术 1.磷脂酸（PA）是调节植物生长发育和逆境响应的重要信使物质。为了解植物细胞中PA的动态变化，研究人员用无缝克隆技术将高度专一的PA结合蛋白（PABD）基因与绿色荧光蛋白（GFP）基因融合，构建有效监测细胞PA变化的荧光探针，并测定拟南芥细胞内PA含量。无缝克隆技术连接DNA片段的机理和构建荧光探针表达载体过程如图所示，请回答下列问题。 (1)无缝克隆时，T5核酸外切酶沿    的方向水解DNA，其目的是形成    。T5核酸外切酶催化的最适温度为37℃，而过程①选择的温度为50℃，目的是降低酶活性，    。 (2)过程②两个片段退火后存在“缺口”的原因是    ，过程③所需的酶有    。 (3)与传统的酶切再连法相比无缝克隆技术构建重组质粒的优点有_______。 A．不受限制酶切位点的限制 B．不会引入多余碱基 C．操作时间短，成功率高 D．有利于多个小片段（小于50bp）连接 5'→3' 黏性末端 防止过度水解DNA 过程①形成的黏性末端长度不同 DNA 聚合酶和DNA连接酶 ABC 24 (4)PCR扩增PABD基因时需依据    设计引物R1。 据图分析扩增目的片段的引物F1和R2对应于下表中的    。 (5)利用农杆菌花序侵染法转化拟南芥，将获得的种子（T1）进行表面消毒，均匀铺在含有    的MS培养基上进行筛选和鉴定。T1代自交获得的T2代幼苗的抗性表现和比例为    ，说明T1为单位点插入的转基因株系。通过观测转基因拟南芥根尖细胞中     ，了解PA的动态变化。 1 5'-TCCGGACTCAGATCTCGAGC-3' 2 5'-AGCTATAGTTCTAGATCTAGATTAACTAGTCTTAGTGGCGTC-3' 3 5'-TATCGATGGCGCCAGCTGAGGATGGTGAGCAAGGGCGA-3' 4 5'-GCTCGAGATCTGAGTCCGGACTTGTACAGCTCGTCCA-3' PABD基因一端的核苷酸序列和载体一端的核苷酸序列 1、4 草胺膦 抗草胺膦：不抗草胺膦= 3：1 绿色荧光点的分布 （1）由图可知，无缝克隆时，过程①中T5核酸外切酶沿5'→3'的方向水解DNA，以形成黏性末端。温度能影响酶活性，T5核酸外切酶催化的最适温度为37℃，而过程①选择的温度为50℃，目的是降低酶活性，其目的是降低酶活性，防止过度水解DNA。 （2）过程②在退火的过程中，两个片段的黏性末端可根据互补序列进行配对结合，但由于过程①形成的黏性末端长度不同，因此在过程②退火后存在“缺口”。过程③缺口处DNA链的补齐，可以看作DNA分子的复制过程，所需的酶有DNA 聚合酶（DNA聚合酶将脱氧单核苷酸加到子链3′-OH末端）和DNA连接酶（将两个DNA片段进行连接）。 （3）传统的酶切再连法需要用特定的限制酶将目的基因和质粒先进行切割，再用DNA连接酶对目的基因和质粒进行连接，在该过程会形成多个小片段，操作复杂，而无缝克隆技术构建重组质粒是不受限制酶切位点的限制；不会引入多余碱基；操作时间短，成功率高，但不利于多个小片段（小于50bp）连接，ABC正确。 故选ABC。 （4）用于PCR扩增的引物是根据一段已知目的基因（PABD基因）的核苷酸序列来设计的，由图可知，PABD基因（目的基因）需要用载体进行连接，因此PCR扩增PABD基因时需依据PABD基因一端的核苷酸序列和载体一端的核苷酸序列引物R1。由重组DNA图可知，GFP基因和PABD基因进行连接，PCR扩增GFP基因时需根据GFP基因一端的核苷酸序列和PABD基因一端的核苷酸序列引物R2，而设计引物F1仅需根据PABD基因一端的核苷酸序列，因此引物F1的碱基序列比引物R2的碱基序列短，因此扩增目的片段的引物F1对应于下表中的1。PCR扩增GFP基因时需根据GFP基因一端的核苷酸序列和PABD基因一端的核苷酸序列引物R2，即引物R2的一部分能与引物F1进行碱基互补配对，综上所述，R2对应于下表中的4。 （5）由图可知，bar（草胺膦抗性基因）为标记基因，位于T-DNA上，农杆菌中的Ti质粒上的T-DNA可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA上，因此利用农杆菌花序侵染法转化拟南芥，将获得的种子（T1）进行表面消毒，均匀铺在含有草胺膦的MS培养基上进行筛选和鉴定。若T1为单位点插入的转基因株系，假设抗性基因用A表示，非抗性为a，则T1的基因型为Aa，T1代自交获得的T2代幼苗的基因型及比例为A_:aa= 3：1，因此抗草胺膦：不抗草胺膦= 3：1。 （6）由题意“将高度专一的PA结合蛋白（PABD）基因与绿色荧光蛋白（GFP）基因融合，构建有效监测细胞PA变化的荧光探针，并测定拟南芥细胞内PA含量”可知，通过观测转基因拟南芥根尖细胞中绿色荧光点的分布，了解PA的动态变化。 25 热点二：同源重组和无缝克隆技术 2.(2024·新课标卷，35 大本p331)某研究小组将纤维素酶基因(N)插入某种细菌(B1)的基因组中，构建高效降解纤维素的菌株(B2)。该小组在含有N基因的质粒中插入B1基因组的M1与M2片段；再经限制酶切割获得含N基因的片段甲，片段甲两端分别为M1与M2；利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术将片段甲插入B1的基因组，得到菌株B2。酶切位点(Ⅰ～Ⅳ)、引物(P1～P4)的结合位置、片段甲替换区如下图所示，→表示引物5′→3′方向。回答下列问题。 (1)限制酶切割的化学键是____________。为保证N基因能在菌株B2中表达，在构建片段甲时，应将M1与M2片段分别插入质粒的Ⅰ和Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ酶切位点之间，原因是___________________________________________________________ ___________________________________________________________________。 磷酸二酯键 保证N基因启动子、N基因、N基因终止子的完整性，确保N基因能够顺利表达 26 热点二：同源重组和无缝克隆技术 (2)CRISPR/Cas9技术可以切割细菌B1基因组中与向导RNA结合的DNA。向导RNA与B1基因组DNA互补配对可以形成的碱基对有G—C和____________________。 (3)用引物P1和P2进行PCR可验证片段甲插入了细菌B1基因组，所用的模板是________________________；若用该模板与引物P3和P4进行PCR，实验结果是______________________。 C—G、U—A、A—T 菌株B2的基因组DNA 无PCR产物 27 例1：纤维素是自然界中分布最广、含量最丰富的一种多糖，水解纤维素的酶系包括内切酶(EG)、外切酶(CBH)和B－葡萄糖苷酶(BGL)。已知酿酒酵母菌不能吸收纤维素，科研人员利用基因工程技术依次将EG基因、CBH基因和BGL基因分多步导入酿酒酵母菌，获取可以直接利用纤维素发酵的酿酒酵母工程菌。 热点二：同源重组和无缝克隆技术 (1)构建基因表达载体是基因工程的核心步骤，科研人员采用以下两种方法构建含有EG基因的表达载体。 ①双酶切法：如图甲标注了载体、EG基因的限制酶切点、EG基因插入部位及两端的部分序列，已知酿酒酵母菌不能合成尿嘧啶，图中的标记基因为尿嘧啶合成基因。结合图中信息分析，在扩增EG基因时应在引物的____ (填“5′”或“3′”)端添加__________________限制酶的识别序列，设计的引物序列为______________________ ___________________。(从5′端书写，写出前12个碱基序列) 5′ BamH Ⅰ、Sac Ⅰ GGATCCGAATCG、 GAGCTCAGCCTA 28 热点二：同源重组和无缝克隆技术 (1)构建基因表达载体是基因工程的核心步骤，科研人员采用以下两种方法构建含有EG基因的表达载体。 ②同源重组法：将目的基因两端带有与线性化质粒两端 的DNA序列，在相关酶的作用下即可实现质粒上的同源重组(如图乙所示)。与双酶切法相比，同源重组法构建基因表达载体的突出优点是______________________________________ _____________________。 在相关酶的作用下可以实现载体上任一点与目的基因的重组 同源 29 1．（2023·天津·高考真题）构建可利用纤维素产乙醇的转基因酿酒酵母菌株是解决能源危机的手段之一，为此设计表达载体，思路如下。 (1)外源基因的选择    纤维素常见生物降解途径如下。 酿酒酵母通常无法吸收纤维素、寡糖和纤维二糖，应向酿酒酵母转入上图中三种酶的基因，并使其表达产物在细胞         (内/外)发挥作用。 (2)外源基因的插入方法 同源重组是碱基序列基本相同的DNA区段通过配对、链断裂和再连接而产生片段交换的过程。通过同源重组将外源基因插入染色体的特定位点可获得遗传稳定的工程菌株，如甲图所示。 酿酒酵母基因组有多个AB短序列。为通过同源重组将外源基因插入AB之间，在设计表达载体时，可采用PCR技术在外源基因两端分别引入A和B，获得乙图所示长片段。PCR时应选用的一对引物为          (从P1~P6中选)。 外 P1和P6 30 (3)标记基因的选择：URA3是尿嘧啶合成关键酶基因，常被用作标记基因。另外，URA3编码的蛋白可将外源5-氟乳清酸转化为有毒物质，导致细胞死亡。 ①为得到成功插入酶I基因的菌株1，需将酶I基因同URA3一起插入URA3缺陷型酿酒酵母基因组AB之间，并利用            的培养基筛选存活菌株。 ②在后续插入酶Ⅱ基因时，为继续利用URA3作为筛选标记，需切除菌株1的URA3。为此设计表达载体时，还应向URA3两端引入酿酒酵母基因组中不存在的同源区段C和C´,并以下图方式       排列才能通过同源重组达到上述目的。 此后，需要将菌株1在           的培养基上培养，存活菌株即为URA3被成功切除的菌株1´。 (4)表达载体的构建： 综上，为将三种酶基因依次插入酿酒酵母基因组中，在构建表达载体时，A、B、C、C´、URA3和酶基因应采用下图     的排布方式。 不含尿嘧啶 2 含有5-氟乳清酸和尿嘧啶 4 一是需要将UR43标记基因与目的基因（酶基因）一起 插入酿酒酵母基因组AB之间，所以A、B应置于标记基因与目的基因最 外侧；二是需要利用C、C片段切除URA3 标记基因，同时不能影响酶基因，所以C、 C应紧邻URA3两侧。同时满足上述条件 的只有图4。 31 EV录屏5.4.2软件录制 Lavf58.33.100 本视频由湖南一唯信息科技开发的EV录屏软件录制, www.ieway.cn $