26届《高考特训营》生物学电子文档第十二单元　细胞工程、基因工程及生物技术的安全性与伦理问题

第十二单元　细胞工程、基因工程及生物技术的安全性与伦理问题 第44讲　植物细胞工程 课标要求 1.阐明植物组织培养是在一定条件下，将离体植物器官、组织或细胞等，培养在人工配制的培养基上，在适宜的培养条件下诱导形成愈伤组织，并重新分化，最终形成完整植株的过程 2.概述植物体细胞杂交是将不同植物体细胞在一定条件下融合成杂种细胞，继而培育成新植物体的技术 3.举例说明植物细胞工程利用快速繁殖、脱毒、次生代谢物生产、育种方式有效提高了生产效率 关键词索引 植物细胞的全能性　植物组织培养　愈伤组织　脱分化　再分化　原生质体　植物体细胞杂交　快速繁殖　作物脱毒　次生代谢物 特训点一　植物组织培养技术 1.细胞的全能性 2.植物组织培养技术 (1)定义 将　　　　　　等，培养在人工配制的培养基上，给予适宜的　　　　，诱导其最终形成　　　　的技术。  (2)流程 拓展链接 ①植物组织培养的对象：离体的植物器官、组织或细胞； ②培养条件：无菌、人工配制的培养基、相关植物激素等； ③培养结果：形成完整的植株； ④所需培养基为固体培养基，其大多由无机营养成分、有机营养成分、激素、琼脂四部分组成。 (3)实例——菊花的组织培养 知识必备答案：1.分裂和分化　产生完整生物体(有机体)或分化成其他各种细胞　本物种全部的遗传信息　细胞结构　离体　营养、激素和其他适宜外界 2.(1)离体的植物器官、组织或细胞　培养条件　完整植株　(2)离体　脱分化　植物激素　再分化　无菌 (3)无菌水　次氯酸钠　无菌水　0.5~1 cm　1/3~1/2 愈伤组织　封口膜　生芽　生根　封口膜　生长 概念诊断 1.棉花根尖细胞经诱导形成幼苗的过程能体现细胞的全能性。(　　) 答案：√ 2.植物组织培养时，外植体须用适宜浓度的乙醇和次氯酸钠的混合液消毒。(　　) 答案：× 提示：外植体的消毒步骤为流水冲洗→体积分数为70%酒精消毒30 s→无菌水清洗2~3次→次氯酸钠溶液处理30 min→无菌水清洗2~3次。 3.宜选用成熟叶片为材料制备外植体。(　　) 答案：× 提示：一般选择植物幼嫩的组织作为植物组织培养的外植体。 4.愈伤组织是外植体经脱分化和再分化后形成的薄壁组织团块。(　　) 答案：× 提示：愈伤组织是外植体经脱分化后形成的薄壁组织团块。 5.提高培养基中生长素和细胞分裂素的比值，有利于诱导生根。(　　) 答案：√ 探究点　植物组织培养技术 【情境引领】　天竺葵叶子形状与心形相似，花色丰富，具有很强的观赏价值，对治疗人体疲劳、神经衰弱等症也具有一定的疗效。下图表示利用天竺葵嫩叶进行植物组织培养的过程。 【问题生成】 (1)该植物组织培养过程中利用的外植体是什么? 提示：离体的天竺葵嫩叶。 (2)图中的A、B分别表示什么过程?其实质是什么? 提示：A表示脱分化，B表示再分化，其实质是基因的选择性表达。 (3)①和②锥形瓶需使用的培养基成分不完全相同，理由是什么? 提示：脱分化培养和再分化培养时所需的生长素和细胞分裂素的比例不同。 【真题示范】　(2024·甘肃卷)兰州百合栽培过程中易受病毒侵染，造成品质退化。某研究小组尝试通过组织培养技术获得脱毒苗，操作流程如下图。下列叙述正确的是(　　) A.①为脱分化过程，1号培养基中的愈伤组织是排列规则的薄壁组织团块 B.②为再分化过程，愈伤组织细胞分化时可能会发生基因突变或基因重组 C.3号培养基用于诱导生根，其细胞分裂素浓度与生长素浓度的比值大于1 D.百合分生区附近的病毒极少，甚至无病毒，可以作为该研究中的外植体 植物组织培养的原理 植物细胞的全能性 植物组织培养的过程 脱分化、再分化 植物组织培养的流程 离体的植物器官、组织或细胞脱分化形成愈伤组织，然后再分化生成根、芽，最终形成植物体 答案：D 解析：在脱分化过程中，1号培养基中的愈伤组织是排列不规则的薄壁组织团块，A项错误；愈伤组织细胞分化时可能会发生基因突变，但不会发生基因重组，因为基因重组发生在减数分裂过程中，B项错误；3号培养基用于诱导生根，其细胞分裂素浓度与生长素浓度的比值应该小于1，C项错误；百合分生区附近的病毒极少，甚至无病毒，因此可以作为该研究中的外植体，D项正确。 选择兰州百合的花药作为外植体进行离体培养能否直接获得兰州百合正常植株? 提示：不能，花药中含有花粉，对其离体培养可得到单倍体。 考法预测 考法　结合植物组织培养的实验流程，考查生命观念和科学探究 1.(2025·贵州黔东南开学考试)山药作为一种重要的蔬菜和药用作物，在生长过程中容易受到病毒的侵害，从而影响产量和品质。为确保山药生产的稳定性与经济效益，研究人员采用植物组织培养技术得到脱毒苗，流程如图所示。下列叙述错误的是(　　) 取样→消毒→接种外植体→培养得到愈伤组织→转接至新的培养基→脱毒苗 A.取样时可切取一定大小的山药茎尖作为外植体 B.对外植体进行湿热灭菌，可提高脱毒苗的成功率 C.培养得到愈伤组织的过程一般不需要光照 D.提高细胞分裂素/生长素的值可促进愈伤组织形成芽 答案：B 解析：茎尖分裂能力强，基本不含病菌或病毒，所以茎尖可以作为外植体培育脱毒苗，A项正确；对外植体不能灭菌，只能消毒处理，B项错误；愈伤组织是经脱分化过程获得的，脱分化过程一般不需要光照，C项正确；植物激素的比例影响愈伤组织再分化的方向，提高细胞分裂素/生长素的值可促进愈伤组织形成芽，D项正确。 2.某种极具观赏价值的菊科珍稀花卉很难获得成熟种子。某研究小组为探究该珍稀花卉原生质体的培养条件和植株再生能力，进行了相关实验，实验过程如图所示。下列叙述正确的是(　　) A.过程①需用胰蛋白酶处理，便于获得单个的原生质体 B.过程③需注意生长素与细胞分裂素用量的比值应小于1 C.愈伤组织是全能性较高、形状规则的薄壁组织团块 D.光照会影响过程②③的进行，其中过程②需光照处理 答案：B 解析：过程①表示获得原生质体的过程，需使用纤维素酶和果胶酶处理，A项错误；过程③的培养基中，生长素与细胞分裂素用量的比值应小于1，这样才有利于芽的分化，B项正确；愈伤组织是不定形(形状不规则)的薄壁组织团块，C项错误；②表示脱分化，③表示再分化，过程②一般不需要光照处理，过程③需要光照处理，D项错误。 植物组织培养注意事项 (1)植物组织培养成功的关键是避免微生物的污染，所有实验用具要严格灭菌，接种过程要进行严格的无菌操作。 (2)培养基中必须含有植物生长发育所需的全部营养物质等，其中生长素和细胞分裂素用量的比例对器官的生成起决定作用。 (3)通过根、芽的途径培养试管苗的顺序：先进行生芽培养，再进行生根培养，试管苗培养要在光照条件下进行。 (4)在愈伤组织诱导阶段，对有些植物来说，避光培养有利于细胞脱分化形成愈伤组织。当愈伤组织再分化出芽和叶时，一定要有光照，有利于叶片内叶绿素的合成。 (5)植物组织培养中所需的碳源一般为蔗糖，原因是蔗糖既可提供充足的碳源，又可维持相对适宜的渗透压。 特训点二　植物体细胞杂交技术及植物细胞工程的应用 1.植物体细胞杂交技术 (1)过程①为去除　　　　获得原生质体，用到的酶是　　　　和　　　　。  (2)过程②为　　　　的融合，人工诱导的物理法包括　　　　、离心法等，化学法包括　　　　　、高Ca2＋—高pH融合法等。  (3)过程③为融合的原生质体再生出　　　　，这是原生质体融合成功的标志。  (4)过程④为　　　　，过程⑤为　　　　。  (5)意义：在打破　　　　，实现　　　　，培育　　　　等方面展示出独特的优势。  拓展链接 有关植物体细胞杂交的三个易误点 (1)误认为植物体细胞杂交的结果只是形成杂种细胞。植物体细胞杂交的结果是最终要经过组织培养形成杂种植株。 (2)误认为植物体细胞杂交属于有性生殖。植物体细胞杂交过程中没有生殖细胞的结合，因此不属于有性生殖，应为无性生殖。 (3)误认为杂种植株的变异类型属于基因重组，基因重组发生在减数分裂过程中，而植物体细胞杂交过程属于无性生殖。杂种植株的变异类型属于染色体变异，杂种植株的染色体数通常是两亲本细胞染色体数目之和，杂种植株属于异源多倍体。 2.植物细胞工程的应用 (1)快速繁殖：优点是能够　　　　　　　　　　　　　　　　。  (2)作物脱毒：利用　　　　　　等无毒组织进行快速繁殖。  (3)作物新品种的培育 (4)细胞产物的工厂化生产：利用　　　　　　生产植物的次生代谢物，其在植物抗病、抗虫等方面发挥作用，也是许多药物、香料和色素等的重要来源。  知识必备答案：1.(1)细胞壁　纤维素酶　果胶酶　(2)原生质体　电融合法　聚乙二醇(PEG)融合法　(3)细胞壁　(4)脱分化　再分化　(5)生殖隔离　远缘杂交育种　植物新品种 2.(1)高效、快速地实现种苗的大量繁殖，保持亲本的优良性状　(2)茎尖、根尖　(3)①单倍体　②基因突变　突变率　(4)植物细胞培养 概念诊断 1.植物体细胞杂交技术利用的原理只有细胞膜的流动性。(　　) 答案：× 提示：植物体细胞杂交技术利用的原理有细胞膜的流动性和植物细胞的全能性。 2.利用物理法或化学法，可以直接将两个植物细胞进行诱导融合。(　　) 答案：× 提示：需先使用纤维素酶和果胶酶除去细胞壁后，再进行诱导融合。 3.常用灭活的病毒诱导植物原生质体融合。(　　) 答案：× 提示：灭活病毒诱导法常用于动物细胞融合。 4.以茎尖为材料通过组织培养获得的脱毒苗具有抗病毒的特点。(　　) 答案：× 提示：脱毒苗不含病毒，但不一定抗病毒。 5.突变体培育通常对植物的愈伤组织进行诱变处理，而工厂化生产的细胞产物可以来自愈伤组织细胞。(　　) 答案：√ 探究点　植物体细胞杂交技术 【情境引领】　马铃薯和番茄都属于茄科植物，有一种蜗牛喜欢啃食这两种植物的茎。下图是两种植物的体细胞杂交流程图。 【问题生成】 (1)过程①应选择哪种酶?其依据是什么? 提示：植物细胞的最外层有细胞壁，主要由纤维素和果胶组成，因此过程①应选择纤维素酶和果胶酶。 (2)植物细胞融合成功的标志是什么?这一过程与哪种细胞器有关? 提示：植物细胞融合成功的标志是杂种细胞再生出新的细胞壁，与高尔基体有关。 (3)通常情况下，马铃薯和番茄之间不能成功杂交，必须通过上述过程才能杂交，原因是什么? 提示：马铃薯和番茄属于不同物种，存在生殖隔离。 【归纳总结】 植物体细胞杂交与植物有性杂交中遗传物质的变化 设白菜细胞含2x条染色体，2个染色体组；甘蓝细胞含2y条染色体，2个染色体组。 项目 不同物种体细胞杂交 不同物种有性杂交 同一物种杂交 过程 子代染色体数目 2x＋2y x＋y 2x(白菜)或2y(甘蓝) 子代染色体组数 4 2 2 子代是几倍体 异源四倍体 异源二倍体 同源二倍体 子代是否可育 可育 不可育 可育 繁殖方式 无性繁殖 有性繁殖 有性繁殖 【真题示范】　(2024·湖北卷)植物甲抗旱、抗病性强，植物乙分蘖能力强、结实性好。科研人员通过植物体细胞杂交技术培育出兼有甲、乙优良性状的植物丙，过程如下图所示。下列叙述错误的是(　　) A.过程①中酶处理的时间有差异，原因可能是两种亲本的细胞壁结构有差异 B.过程②中常采用灭活的仙台病毒或PEG诱导原生质体融合 C.过程④和⑤的培养基中均需要添加生长素和细胞分裂素 D.可通过分析植物丙的染色体，来鉴定其是否为杂种植株 图解分析 过程解读 ① 去壁获取原生质体的过程 ②③ 人工诱导原生质体融合以及再生出新细胞壁的过程 ④ 表示脱分化形成愈伤组织 ⑤ 再分化以及个体发育形成植株丙的过程 答案：B 解析：酶解是为了去除植物细胞的细胞壁，过程①中酶处理的时间不同，说明两种亲本的细胞壁结构有差异，A项正确；过程②为原生质体的融合，常用PEG诱导原生质体融合，灭活的仙台病毒可诱导动物细胞融合，不能用于植物，B项错误；过程④(脱分化)和⑤(再分化)的培养基中均需要添加生长素和细胞分裂素，但在两个过程中添加的生长素和细胞分裂素的比例不同，C项正确；植物丙是植物甲和植物乙体细胞杂交形成的个体，应具备两者的遗传物质，因此可通过分析植物丙的染色体，来鉴定其是否为杂种植株，D项正确。 将不同种的植物体细胞进行杂交，有何现实意义? 提示：可以克服远缘杂交不亲和的障碍，培育作物新品种。 考法预测 考法　借助具体实例考查植物体细胞杂交技术及其应用，考查科学思维和社会责任 1.(2024·四川成都期末)植物细胞质中的叶绿体有相对独立的遗传体系，控制着许多优良性状。胞质杂交是植物体细胞杂交应用的一个重要方面，下图表示利用胞质杂交培育抗病植株的实验流程，下列叙述正确的是(　　) A.过程①需纤维素酶和蛋白酶处理细胞壁 B.利用聚乙二醇可诱导②和③过程的发生 C.在③④⑤过程中都会形成新的细胞壁 D.④和⑤过程通常在同一种培养基中进行 答案：C 解析：植物细胞壁的主要成分是纤维素和果胶，过程①需纤维素酶和果胶酶处理细胞壁，A项错误；过程②是植株1的叶肉细胞原生质体与植株2的叶肉细胞原生质体发生融合的过程，该过程可以利用聚乙二醇诱导，但聚乙二醇不会诱导细胞壁的再生，B项错误；过程③融合的原生质体会再生出细胞壁，过程④⑤存在有丝分裂，故在③④⑤过程中都会形成新的细胞壁，C项正确；过程④是脱分化形成愈伤组织，过程⑤是再分化形成芽和根，④和⑤过程通常不在同一种培养基中进行，D项错误。 2. (2024·山东泰安模拟预测)肉苁蓉具有较高的药用价值，自然条件下的产量较低，其次生代谢产物苯乙醇苷(PeGs)是主要活性成分。研究人员以外植体诱导出愈伤组织，进一步进行细胞悬浮培养，在不同的初始接种浓度下培养一段时间后，对悬浮培养液的PeGs进行测定，结果如下图所示。下列有关叙述正确的是(　　) A.植物细胞培养的目的主要是获得植物生长和生存所必需的次生代谢产物 B.若工厂化大量生产PeGs，细胞悬浮培养时应选择接种细胞的最适浓度为3.2 g·L-1 C.若需进一步了解细胞生成PeGs的能力，则要检测培养后培养液中的细胞密度 D.植物组织培养时，应对外植体进行灭菌处理，防止培养基及愈伤组织污染 答案：C 解析：植物细胞培养的目的主要是获得植物细胞的次生代谢产物，次生代谢产物不是植物生长所必需的，A项错误；若工厂化大量生产PeGs，细胞悬浮培养时选择接种细胞的浓度应在2.4~4.0 g·L-1之间设置梯度浓度找到最适浓度，B项错误；若需进一步了解细胞生成PeGs的能力，则要检测培养后培养液中的细胞密度，因细胞密度若过大影响其产量，C项正确；植物组织培养时，应对外植体进行消毒处理，对培养基进行灭菌处理，防止培养基及愈伤组织污染，D项错误。 植物组织培养与植物体细胞杂交的比较 一、核心概念——重落实 1.(选择性必修3 P36)植物组织培养中所需的碳源一般为蔗糖，很少用葡萄糖和果糖，原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。 提示：蔗糖既可提供充足的碳源，又可维持相对适宜的渗透压，而葡萄糖和果糖在与蔗糖提供相同数量碳源的前提下，其造成的渗透压可能过高 2.(选择性必修3 P36)“番茄—马铃薯”超级杂种植株没有如科学家所想象的那样，地上长番茄、地下结马铃薯，主要原因是　　　　　　　　　　　　　。 提示：生物基因的表达不是孤立的，它们之间是相互调控、相互影响的 3.平菇具有味道鲜美、抗杂菌污染的优势，杏鲍菇具有菌丝强壮、生长旺盛的优势。为获得同时具有二者优良性状的新菌株，研究者利用原生质体融合技术培育杂种新菌株的典型优势是　　　　　　　　　　　　　。  提示：能打破生殖隔离，实现远缘杂交育种 4.(选择性必修3 P40)单倍体植株是进行体细胞诱变和研究遗传突变的理想材料，原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。 提示：大多数单倍体植株的细胞中只含有一套染色体，染色体加倍后得到的植株的隐性性状容易显现 5.(选择性必修3 P41)若要通过植物组织培养获得脱毒紫草植株，应优先选择紫草植株的　　　　等部位作为外植体，外植体经消毒处理后，需用无菌水冲洗多次，目的是　　　　　　　　　　。外植体经愈伤组织形成紫草植株的原理是　　　　　　　　　　。  提示：茎尖(或顶端分生组织)　防止消毒剂对细胞产生毒害作用　植物细胞的全能性 二、真题体验——明考向 1.(2024·北京卷)大豆叶片细胞的细胞壁被酶解后，可获得原生质体。以下对原生质体的叙述错误的是(　　) A.制备时需用纤维素酶和果胶酶 B.膜具有选择透过性 C.可再生出细胞壁 D.失去细胞全能性 答案：D 解析：大豆叶片细胞是植物细胞，具有细胞壁，其细胞壁的主要成分是纤维素和果胶，所以制备原生质体需用纤维素酶和果胶酶进行处理，A项正确；生物膜的功能特点是具有选择透过性，所以膜具有选择透过性，B项正确；原生质体可以再生出新的细胞壁，C项正确；分离出的原生质体具有全能性，可用于植物体细胞杂交，为杂种植株的获得提供了理论基础，D项错误。 2.(2024·浙江1月选考)山药在生长过程中易受病毒侵害导致品质和产量下降。采用组织培养技术得到脱毒苗，可恢复其原有的优质高产特性，流程如图。下列操作不可行的是(　　) 外植体→愈伤组织→丛生芽→试管苗 A.选择芽尖作为外植体可减少病毒感染 B.培养基中加入抗生素可降低杂菌的污染 C.将丛生芽切割后进行继代培养可实现快速繁殖 D.提高生长素和细胞分裂素的比值可促进愈伤组织形成丛生芽 答案：D 解析：芽尖等分生组织分裂旺盛，且含病毒少，取材时常选用其作为外植体，A项不符合题意；培养基中有大量的营养物质，容易被细菌污染，加入抗生素可降低杂菌的污染，B项不符合题意；将丛生芽切割后转移到新的培养基上继续进行扩大培养称为继代培养，其又可分为第二代培养、第三代培养等，大多数植物每隔4~6周进行一次继代培养，每进行一次继代培养，培养物一般能增殖3~4倍，正因为培养物可以不断继代培养，所以离体繁殖速度比常规方法通常要快数万倍，可实现快速繁殖，C项不符合题意；提高生长素和细胞分裂素的比值可促进愈伤组织形成根而不是芽，D项符合题意。 3.(2024·江苏卷)下图表示植物原生质体制备、分离和检测的流程。下列叙述正确的是(　　) A.步骤①添加盐酸以去除细胞壁 B.步骤②吸取原生质体放入无菌水中清洗 C.原生质体密度介于图中甘露醇和蔗糖溶液密度之间 D.台盼蓝检测后应选择蓝色的原生质体继续培养 答案：C 解析：步骤①添加纤维素酶、果胶酶去除细胞壁，其原理是酶的专一性，A项错误；步骤②吸取原生质体放入等渗液中清洗，放入无菌水中会导致原生质体吸水涨破，B项错误；结合题图可知，原生质体处于甘露醇和蔗糖溶液之间，因而可推测原生质体密度介于图中甘露醇和蔗糖溶液密度之间，C项正确；台盼蓝检测后应选择无色的原生质体继续培养，染成蓝色的原生质体活性差或死亡，D项错误。 4.(2024·吉林卷)迷迭香酸具有多种药理活性。进行工厂化生产时，先诱导外植体形成愈伤组织，再进行细胞悬浮培养获得迷迭香酸，加入诱导剂茉莉酸甲酯可大幅提高产量。下列叙述错误的是(　　) A.迷迭香顶端幼嫩的茎段适合用作外植体 B.诱导愈伤组织时需加入NAA和脱落酸 C.悬浮培养时需将愈伤组织打散成单个细胞或较小的细胞团 D.茉莉酸甲酯改变了迷迭香次生代谢产物的合成速率 答案：B 解析：迷迭香顶端幼嫩的茎段适合用作外植体，因为其生长旺盛，分裂能力较强，A项正确；诱导愈伤组织时需加入生长素(IAA)和细胞分裂素，B项错误；悬浮培养时需将愈伤组织打散成单个细胞或较小的细胞团，以便更易获得营养物质和氧气，使其可以进一步分裂，C项正确；加入诱导剂茉莉酸甲酯可大幅提高产量，推测茉莉酸甲酯改变了迷迭香次生代谢产物(不是植物生长所必需的)的合成速率，D项正确。 5.(多选)(2024·山东卷)下列关于植物愈伤组织的说法，正确的是(　　) A.用果胶酶和胶原蛋白酶去除愈伤组织的细胞壁获得原生质体 B.融合的原生质体需再生出细胞壁后才能形成愈伤组织 C.体细胞杂交获得的杂种植株细胞中具有来自亲本的2个细胞核 D.通过愈伤组织再生出多个完整植株的过程属于无性繁殖 答案：BD 解析：植物细胞壁的主要成分是纤维素和果胶，故用纤维素酶和果胶酶去除细胞壁获得原生质体，A项错误；用纤维素酶和果胶酶分别处理不同的植物细胞，得到原生质体，之后诱导原生质体融合形成杂种细胞，再利用植物组织培养技术将杂种细胞培养成杂种植株，故融合的原生质体需再生出细胞壁后才能形成愈伤组织，B项正确；体细胞杂交获得的杂种植株细胞中具有来自亲本的遗传物质，只有1个细胞核，C项错误；通过愈伤组织再生出多个完整植株的过程没有生殖细胞参与，从繁殖方式看属于无性繁殖，D项正确。 A组(对点特训) 对点1　植物组织培养技术 1.(2024·辽宁沈阳三模)重瓣大岩桐(草本植物)的花大而且“重瓣”，具较高观赏价值，但无法产生种子，扦插、分根繁殖速度慢，科研人员用其叶片作为外植体，实现了种苗的快速繁殖。下列叙述正确的是(　　) A.重瓣大岩桐的成熟叶比幼嫩叶更适合作为外植体 B.将叶片诱导形成愈伤组织一般需要给予适当的光照 C.愈伤组织经过脱分化和再分化进而诱导形成试管苗 D.用叶片快速繁殖的种苗可保持“重瓣”花的特性 答案：D 解析：幼嫩叶全能性高，比成熟叶更适合作为外植体，A项错误；将叶片诱导形成愈伤组织一般需要避光处理，不能给予光照，B项错误；愈伤组织是脱分化形成的，愈伤组织经再分化可进一步诱导形成试管苗，C项错误；用叶片快速繁殖成种苗属于无性生殖，可保持“重瓣”花的特性，D项正确。 2.(2024·山东烟台三模)细胞摇摆式间歇浸没生物反应器是通过摆动架的倾斜摆动，使培养液周期性间歇浸没组培苗，实现组培苗的快速生长。下列叙述正确的是(　　) A.获得组培苗的培养基含有水、无机盐、蔗糖、琼脂和激素等多种营养物质 B.间歇摆动提高培养液溶氧量，有利于组培苗进行有氧呼吸 C.获得组培苗的步骤：外植体→脱分化形成胚状体→再分化形成试管苗 D.经过间歇浸没培养获得的植株需要消毒后炼苗再移栽到经灭菌处理的土壤中 答案：B 解析：琼脂是凝固剂，不提供营养，A项错误；间歇摆动提高培养液溶氧量，有利于组培苗进行有氧呼吸，有氧呼吸能为组培苗的生长发育提供能量，因此可以提高生长速度，B项正确；外植体脱分化可以形成愈伤组织，愈伤组织再分化形成胚状体，C项错误；植物组织培养是在无菌条件下进行的，经过间歇浸没培养获得的植株不需要消毒处理，D项错误。 3.(2024·山东济南模拟预测)甘草是中医使用最多的药材之一，其提取物中的黄酮具有抗衰老、抗炎等作用。下图表示利用悬浮培养生产甘草黄酮的过程。下列叙述正确的是(　　) A.可用次氯酸钠和酒精对种子进行灭菌 B.图中添加果胶酶的主要目的是获得原生质体 C.对细胞悬液进行人工诱变，其变异率常高于对器官或个体进行诱变 D.图示过程能体现植物细胞的全能性 答案：C 解析：可用次氯酸钠和酒精对种子进行消毒，A项错误；图示过程中添加果胶酶的主要目的是瓦解植物的胞间层，更快获得细胞悬液，B项错误；愈伤组织细胞分裂旺盛，更易发生突变，C项正确；题图所示过程并未将已分化的植物细胞培育成完整植株或分化成其他各种细胞，不能体现植物细胞的全能性，D项错误。 对点2　植物体细胞杂交技术及植物细胞工程的应用 4.(2024·安徽三模)青霉素发酵是高耗氧过程，为保证发酵过程中青霉素的持续高产，研究人员将含血红蛋白的透明颤菌与青霉菌进行细胞杂交，设计方案如图所示。下列叙述正确的是(　　) A.①②过程需要用纤维素酶和果胶酶去除细胞壁获得原生质体 B.③过程通常在低渗溶液中采用PEG融合法诱导原生质体融合 C.除上述方案外，通过杂交育种的方式也可以培养出该杂种菌株 D.可利用缺乏甲硫氨酸和精氨酸的基本培养基筛选出融合细胞 答案：D 解析：酶具有专一性，纤维素酶和果胶酶可去除植物细胞的细胞壁，但透明颤菌属于细菌，细胞壁的主要成分是肽聚糖，青霉菌是真菌，细胞壁的主要成分是几丁质，A项错误；③过程若在低渗溶液中会发生渗透吸水，会导致原生质体涨破，B项错误；杂交育种在自然状态下适用于真核且进行有性生殖的生物，上述杂种菌株不适用于杂交育种，C项错误；融合细胞兼有两个细胞的特点，可利用缺乏甲硫氨酸和精氨酸的基本培养基筛选出融合细胞，D项正确。 5.(2024·广西模拟预测)高山红景天植株中含有红景天苷(一种次生代谢物)等物质，具有抗衰老、抗肿瘤等作用。由于人类的过度采摘，高山红景天现仅分布于我国少部分地区，为濒危物种。为了获得次生代谢物红景天苷，研究人员尝试利用植物组织培养技术从高山红景天的愈伤组织中提取红景天苷，下列相关叙述正确的是(　　) A.红景天苷是红景天基本生命活动所必需的，但其在植物细胞中含量很少 B.诱导红景天外植体再分化形成愈伤组织时，需生长素和细胞分裂素配合使用 C.植物细胞产物的工厂化生产不占用耕地，几乎不受季节、天气等的限制 D.通过植物细胞培养获得次生代谢物的过程体现了细胞的全能性 答案：C 解析：红景天苷是红景天中含有的次生代谢物，次生代谢物一般认为不是植物基本生命活动所必需的，A项错误；在一定的激素(生长素和细胞分裂素)和营养条件下，已经分化的细胞可以通过脱分化形成愈伤组织，愈伤组织通过再分化过程形成芽、根等器官，诱导红景天外植体形成愈伤组织的过程为脱分化，B项错误；植物细胞产物的工厂化生产是指利用植物细胞培养来获得目标产物，其不占耕地，几乎不受季节、天气等的限制，C项正确；细胞的全能性是指细胞经分裂和分化后，仍具有产生完整有机体或分化成其他各种细胞的潜能，而通过植物细胞培养获得次生代谢物的过程没有体现细胞的全能性，D项错误。 6.(2024·江苏南通三模)以六倍体小麦的小孢子为材料通过组织培养可以获得大量单倍体，相关叙述错误的是(　　) A.小孢子通过组织培养形成单倍体植株体现了细胞具有全能性 B.培养基中生长素和细胞分裂素的比例影响单倍体植株的形成 C.培养基中的蔗糖能为细胞提供能量并维持渗透压的相对稳定 D.单倍体细胞中含一个染色体组，隐性性状容易显现，是研究突变的理想材料 答案：D 解析：小孢子通过组织培养形成单倍体植株的过程是由外植体发育为完整植株，可以体现细胞的全能性，A项正确；培养基中生长素和细胞分裂素的比例能够影响细胞分化方向，进而影响单倍体植株的形成，B项正确；植物组织培养过程需要加入一定的蔗糖，培养基中的蔗糖能为细胞提供能量并维持渗透压的相对稳定，C项正确；以六倍体小麦的小孢子为材料通过组织培养可以获得大量单倍体，该单倍体中含有3个染色体组，D项错误。 B组(综合特训) 7. (2024·辽宁模拟预测)以玄参茎段为外植体，在MS培养基中经诱导产生丛芽和不定根，将幼苗转移至蛭石或珍珠岩等环境中，经炼苗和壮苗后再移栽入土。下图为植物组织培养的流程图，相关判断错误的是(　　) ①外植体的选择及其消毒 → ②外植体的接种及愈伤组织诱导 → ③丛芽与不定根的诱导 → ④炼苗与移栽 A.MS培养基含植物细胞所必需的无机盐和蔗糖等营养 B.过程①可以用次氯酸钠和70%的酒精混合进行消毒 C.过程②为外植体的脱分化，与基因的选择性表达有关 D.过程③诱导形成丛芽和不定根，效果与激素比例有关 答案：B 解析：MS培养基含植物细胞所必需的无机盐和蔗糖等营养，蔗糖可以为外植体的生长提供碳源、能源，且其还能调节培养基的渗透压，A项正确；外植体的消毒，先用体积分数为70%的酒精消毒30 s后，立即用无菌水清洗2~3次，再用质量分数为5%的次氯酸钠溶液处理30 min后，再立即用无菌水清洗2~3次，B项错误；过程②为外植体的脱分化，脱分化过程与基因的选择性表达有关，C项正确；过程③诱导形成丛芽和不定根，为再分化过程，生长素/细胞分裂素的值大于1有利于根的分化，生长素/细胞分裂素的值小于1有利于芽的分化，因此再分化效果与激素比例有关，D项正确。 8.植物细胞工程在农业、医药工业等方面有着广泛的应用，并且取得了显著的社会效益和经济效益。下图表示对某植物进行的细胞工程相关操作。请据图回答有关问题： (1)快速繁殖是用于快速繁殖优良品种的植物组织培养技术，属于　　　　生殖。脱毒植物的获取一般是通过切取一定大小的茎尖进行组织培养，原因是该区域  　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。  (2)在植物细胞杂交时，若要诱导原生质体间的融合，可以采取的方法有　　　　　　　　　　(写出两种)等。该技术中植物体发生的变异类型是　　　　。来自两种植物的细胞丙、丁融合后得到的杂种植株未表现出二者所有的性状，原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。 (3)由于大多数单倍体植株的细胞中只含有一套染色体，染色体加倍后得到的植株的　　　(填“隐性”或“显性”)性状容易显现，因此单倍体植株是进行体细胞诱变育种和研究遗传突变的理想材料。  答案：(1)无性　病毒极少，甚至无病毒　(2)电融合法、离心法、聚乙二醇融合法、高Ca2＋—高pH融合法(写出两种即可)　染色体数目变异　杂种细胞具备两个物种的遗传物质，但遗传物质的表达相互干扰(基因的选择性表达)　(3)隐性 解析：(1)快速繁殖是用于快速繁殖优良品种的植物组织培养技术，由于该过程中没有有性生殖细胞的结合，因此属于无性生殖。脱毒植物的获取一般是通过切取一定大小的茎尖作为外植体进行组织培养，原因是该部位没有病毒或几乎没有病毒，可获得无毒苗。(2)在植物细胞杂交时，若要诱导原生质体间的融合，通常采用的方法有电融合法、离心法、聚乙二醇融合法、高Ca2＋—高pH融合法等。该技术中获得的植物体为多倍体，因而该过程中发生的变异类型是染色体数目变异。来自两种植物的细胞丙、丁融合后得到的杂种植株未表现出二者所有的性状，原因是杂种细胞具备两个物种的遗传物质，但遗传物质的表达相互干扰(基因的选择性表达)。(3)由于大多数单倍体植株的细胞中只含有一套染色体，染色体加倍后得到的植株往往为纯合子，同时使隐性性状得以显现，因此单倍体植株是进行体细胞诱变育种和研究遗传突变的理想材料。 9.(2024·四川眉山三模)科学家利用植物体细胞杂交技术成功获得了矮牵牛—粉蓝烟草植株。为了便于杂种细胞的筛选和鉴定，科学家利用绿色荧光和红色荧光分别标记矮牵牛原生质体和粉蓝烟草原生质体上的蛋白质，其培育过程如图。请回答下列问题： (1)植物体细胞杂交依据的生物学原理是　　　　　　　　　　　　　。人工诱导原生质体的融合可以采用　　　　和　　　　两种化学方法进行融合，植物体细胞融合完成的标志是　　　　　　　　　。  (2)在鉴定融合的原生质体时可用显微镜进行观察，当观察到融合的细胞表面　　　　　　　　　时，可判断原生质体是由矮牵牛和粉蓝烟草融合而成的。  (3)矮牵牛—粉蓝烟草植株　　　　(填“可育”或“不可育”)，原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。 答案：(1)细胞膜的流动性、植物细胞的全能性　PEG(或聚乙二醇)　高Ca2＋—高pH　杂种细胞再生出细胞壁　(2)既有红色荧光又有绿色荧光　(3)可育　矮牵牛—粉蓝烟草植株能够进行减数分裂产生正常的配子 解析：(1)植物体细胞杂交依据的生物学原理是细胞膜的流动性、植物细胞的全能性。人工诱导原生质体的融合可以采用PEG(或聚乙二醇)和高Ca2＋—高pH两种化学方法进行融合，植物体细胞融合完成的标志是杂种细胞再生出细胞壁。(2)在鉴定融合的原生质体时可用显微镜进行观察，当观察到融合的细胞表面既有红色荧光又有绿色荧光时，可判断原生质体是由矮牵牛和粉蓝烟草融合而成的。(3)矮牵牛—粉蓝烟草植株可育，原因是矮牵牛—粉蓝烟草植株能够进行减数分裂产生正常的配子。 第45讲　动物细胞工程和胚胎工程 课标要求 1.阐明动物细胞培养是从动物体获得相关组织，分散成单个细胞后，在适宜的培养条件下让细胞生长和增殖的过程。动物细胞培养是动物细胞工程的基础 2.阐明动物细胞核移植一般是将动物一个细胞的细胞核移入去核的卵母细胞中，并使重组细胞发育成新胚胎，继而发育成动物个体的过程 3.阐明动物细胞融合是指通过物理、化学或生物学等手段，使两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的过程 4.概述细胞融合技术是单克隆抗体制备的重要技术，简述干细胞在生物医学工程中有广泛的应用价值 5.简述胚胎形成经过了受精及早期发育等过程 6.简述胚胎工程包括体外受精、胚胎移植和胚胎分割等技术 关键词索引 动物细胞培养　细胞贴壁　接触抑制　胚胎干细胞　动物细胞融合技术　单克隆抗体　动物体细胞核移植技术　精子获能　早期胚胎发育　体外受精　胚胎移植　胚胎分割 特训点一　动物细胞培养 1.动物细胞培养 (1)动物细胞培养的原理是　　　　。  (2)营养条件：除糖类、氨基酸、无机盐和维生素等细胞所需的营养物质外，通常还需加入　　　　等一些天然成分。  (3)其他条件 (4)培养过程 拓展链接 辨析动物细胞培养相关的两组概念 (1)细胞贴壁与接触抑制 ①细胞贴壁：细胞悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上，称为细胞贴壁。 ②接触抑制：当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞通常会停止分裂增殖，这种现象称为接触抑制。 (2)原代培养与传代培养 ①原代培养：动物组织经处理后的初次培养称为原代培养。原代培养的细胞核型一般正常。 ②传代培养：悬浮培养的细胞直接用离心法收集；贴壁的细胞需要重新用胰蛋白酶等处理，然后分瓶继续培养，让细胞继续增殖，这样的培养过程通常被称为传代培养。 2.干细胞的类型及应用 种类 胚胎干细胞 成体干细胞 诱导多能干细胞 来源 　　　  骨髓、脐带血和外周血等 体细胞(如成纤维细胞等) 特点 能分化为成年动物体内的任何一种类型的细胞，并进一步形成机体的组织和器官甚至　　　  具有组织特异性，能分化成　　　　　　　　　　  能诱导分化成类似　　　　　　的细胞  应用 分化成心肌细胞、神经元和造血干细胞等 造血干细胞用于治疗白血病；神经干细胞用于治疗帕金森病、阿尔茨海默病等 治疗小鼠的镰状细胞贫血、阿尔茨海默病、心血管疾病等 知识必备答案：1.(1)细胞增殖　(2)血清　(3)灭菌　定期更换　36.5±0.5　7.2~7.4　维持培养液的pH　(4)胰蛋白　胶原蛋白　单个细胞　细胞悬液　原代　悬浮　贴壁　分裂受阻或停止　传代　 2.早期胚胎　个体　特定的细胞或组织　胚胎干细胞 概念诊断 1.动物细胞培养是动物细胞工程的基础，进行培养时培养基中除了需加入细胞所需的各种营养物质，还需要加入血清等天然成分。(　　) 答案：√ 2.营养供应充足时，传代培养的胚胎干细胞不会发生接触抑制。(　　) 答案：× 提示：也会发生接触抑制。 3.进行动物细胞培养时，血清应经过高温处理后加入培养基。(　　) 答案：× 提示：高温会使血清中含有的促进细胞生长和增殖所需要的营养物质失活，而使培养的动物细胞生长缓慢等。 4.培养心肌细胞时既需要氧气又需要二氧化碳。(　　) 答案：√ 5.幼龄动物的细胞比老龄动物的细胞更容易进行动物细胞培养。(　　) 答案：√ 提示：幼龄动物的细胞代谢旺盛，分裂能力强，更易培养成功。 6.胚胎干细胞的全能性最高，其应用前景优于iPS细胞。(　　) 答案：× 提示：胚胎干细胞的应用存在伦理问题，科学家普遍认为iPS细胞的应用前景优于胚胎干细胞。 探究点　动物细胞培养技术与干细胞 【情境引领】　“人造肉”即“细胞培养肉”，下图是“细胞培养肉”的生物制造流程图。 【问题生成】 (1)为什么选择肌肉干细胞进行“细胞培养肉”的生产? 提示：肌肉干细胞具有分裂和分化的能力。 (2)进行动物细胞培养时，将从动物体内取出的组织块分散成单个细胞所用的酶是什么? 提示：胰蛋白酶或胶原蛋白酶。 (3)在适宜条件下，培养瓶中的细胞一般会出现的两种现象分别是什么? 提示：细胞贴壁和接触抑制现象。 (4)对干细胞进行大规模培养时，为什么不能加入抗生素? 提示：保证“人造肉”的(食品)安全。 【归纳总结】 (1)实现无毒、无菌环境的途径：对培养液和培养用具进行灭菌处理；在无菌环境下进行操作；定期更换培养液(清除代谢物，防止细胞代谢物积累对细胞自身造成危害)。 (2)动物组织块需用机械法或胰蛋白酶、胶原蛋白酶等处理，将组织分散成单个细胞，用培养液将细胞制成细胞悬液。 (3)原代培养时，细胞分裂受阻的原因有细胞密度过大、有害代谢物积累和培养液中营养物质缺乏等，此外，贴壁细胞在生长增殖时还会出现接触抑制(当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞通常会停止分裂增殖)现象，因此需要进行传代培养。 (4)在培养iPS的培养液中加入分化诱导因子，如牛磺酸等化学物质，可以诱导iPS分化成不同的组织和器官，解决器官移植中的供体器官短缺和免疫排斥反应两大难题。 【真题示范】　(2024·吉林卷)从小鼠胚胎中分离获取胚胎成纤维细胞进行贴壁培养，在传代后的不同时间点检测细胞数目，结果如图。下列叙述正确的是(　　) A.传代培养时，培养皿需密封防止污染 B.选取①的细胞进行传代培养比②更合理 C.直接用离心法收集细胞进行传代培养 D.细胞增长进入平台期可能与细胞密度过大有关 解答本题关键是对图形的破解： 图像分析 信息解读 延迟期 细胞对新环境的适应，暂不增殖 指数增长期 细胞适应新环境后，迅速增殖，呈指数形式增长 平台期 受空间及环境资源的限制，细胞数量达到最大，不再增殖 答案：D 解析：传代培养时培养器皿容许内部气体和培养箱中的气体进行交换，A项错误；选取②的细胞进行传代培养比①更合理，②时细胞即将进入平台期，且分裂能力较强，适应性高，B项错误；对于贴壁生长的细胞进行传代培养时，先需要用胰蛋白酶等处理，使之分散为单个细胞，然后再用离心法收集，C项错误；细胞增长进入平台期可能与细胞密度过大、营养物质有限、细胞间产生接触抑制等有关，D项正确。 图中检测细胞数量时，最可能采用的方法是什么? 提示：利用血细胞计数板进行估算。 考法预测 考法　考查动物细胞培养及与植物组织培养的区别，考查科学思维 1.(2024·河南濮阳期末)下图表示正常小鼠细胞的培养过程，①~④表示相关过程。下列叙述正确的是(　　) A.过程①可以用胃蛋白酶处理，使细胞分散成单个，利于计数 B.过程②为原代培养，培养细胞1一般会发生接触抑制，停止增殖 C.培养细胞2需要贴附于基质表面生长，可直接用离心法收集 D.连续进行过程④获得的细胞与培养细胞1的遗传信息一定相同 答案：B 解析：进行动物细胞培养时，首先要对新鲜取材的动物组织进行处理，可用机械的方法，或用胰蛋白酶、胶原蛋白酶等处理一段时间，将组织分散成单个细胞，A项错误；过程②为原代培养，培养细胞1分裂生长到表面相互接触时，会发生接触抑制，细胞通常会停止分裂增殖，B项正确；培养细胞2需要重新用胰蛋白酶等处理，使之分散成单个细胞，然后用离心法收集，C项错误；④传代培养过程中连续培养的细胞可能发生基因突变，与原代培养细胞的遗传信息可能不同，D项错误。 2.(2024·浙江三模)动物细胞培养基的成分对动物细胞培养的成功至关重要，下列叙述正确的是(　　) A.为避免培养过程中病毒的侵染，应在培养基中添加抗生素 B.为提供细胞生长和增殖所需的能量，应在培养基中添加无机盐 C.为维持培养过程中pH的稳定，应在培养基中添加缓冲物质且置于CO2培养箱中 D.为维持培养细胞的悬浮生长状态，应在培养基中添加胃蛋白酶 答案：C 解析：添加抗生素是为了防止细菌污染，对病毒无效，A项错误；能量应由糖类等碳源提供，B项错误；缓冲物质和CO2浓度一起维持培养基的pH，故为维持培养过程中pH的稳定，应在培养基中添加缓冲物质且置于CO2培养箱中，C项正确；一般通过摇床振荡液体悬浮培养使培养细胞处于悬浮生长状态，D项错误。 动物细胞培养和植物组织培养的比较 特训点二　动物细胞融合技术与单克隆抗体 1.动物细胞融合技术 (1)概念：动物细胞融合技术是使　　　　动物细胞结合形成　　　　的技术。融合后形成的杂交细胞具有原来两个或多个细胞的　　　　。  (2)原理：　　　　　　　　　　　　。  (3)常用方法：　　　　、电融合法和灭活病毒诱导法等。  (4)意义：突破了有性杂交的局限，使　　　　　成为可能；为制造　　　　　　开辟了新途径。  2.单克隆抗体 (1)制备原理：(经免疫的)B 淋巴细胞能产生　　　　　；骨髓瘤细胞能够　　　　　，(经免疫的)B 淋巴细胞与其融合形成的　　　　　　既能迅速大量增殖，又能产生专一抗体。  (2)制备过程 知识必备答案：1.(1)两个或多个　一个细胞　遗传信息　(2)细胞膜的流动性　(3)PEG融合法　(4)远缘杂交　单克隆抗体 2.(1)特异性抗体　无限增殖　杂交瘤细胞　(2)骨髓瘤细胞　选择　杂交瘤细胞　体内培养 概念诊断 1.动物细胞融合与植物原生质体融合的基本原理不同。(　　) 答案：× 提示：基本原理相同，均为细胞膜的流动性。 2.灭活的病毒能促进动物细胞融合，但不能促进植物细胞的融合。(　　) 答案：√ 3.将骨髓瘤细胞和经免疫的B淋巴细胞混合，经诱导后融合的细胞即为所需的杂交瘤细胞。(　　) 答案：× 提示：诱导后融合的细胞还需筛选，才能获得所需的杂交瘤细胞。 4.运用动物细胞融合技术是为了获得杂种细胞或某种特定的细胞产物。(　　) 答案：√ 5.单克隆抗体能准确地识别抗原的细微差异，因而被广泛用作治疗药物。(　　) 答案：× 提示：单克隆抗体能准确地识别抗原的细微差异，被广泛用作诊断试剂。 探究点　单克隆抗体的制备及应用 【情境引领】　为了降低人乳腺癌治疗药物的副作用，科研人员尝试在单克隆抗体技术的基础上，构建抗体—药物偶联物(ADC)，过程如下图所示。 【问题生成】 (1)给小鼠注射的特定抗原应该取自哪里? 提示：人的乳腺癌细胞。 (2)图中需进行筛选的过程有哪些? 提示：过程②③均需要筛选，以获得能产生特定抗体的杂交瘤细胞。 (3)在上图ADC中，代表单克隆抗体的部分是什么(用字母表示)?其发挥作用的原理是什么? 提示：ADC中的a是单克隆抗体，其特异性强，能准确识别抗原的细微差异。 【归纳总结】 单克隆抗体制备流程辨析 (1)获取小鼠经免疫的B淋巴细胞的部位：脾。 (2)两次筛选的目的：第一次是在诱导融合之后，利用特定的选择培养基筛选出杂交瘤细胞。第二次是对杂交瘤细胞进行筛选，利用96孔板培养，采用专一抗体检测的方法筛选出能产生所需特定抗体的杂交瘤细胞。 (3)杂交瘤细胞的抗体检测和克隆化培养：融合后的细胞经选择培养基培养后，能存活的细胞就是杂交瘤细胞。但这些杂交瘤细胞并非都是能分泌所需抗体的细胞，通常用“有限稀释法”来选择，直至确信每个孔中增殖的细胞为单克隆细胞，该过程即为杂交瘤细胞的克隆化培养。 【真题示范】　(多选)(2024·江西卷)某病毒颗粒表面有一特征性的大分子结构蛋白S(含有多个不同的抗原决定基，每一个抗原决定基能够刺激机体产生一种抗体)。为了建立一种灵敏、高效检测S蛋白的方法，研究人员采用杂交瘤技术制备了抗-S单克隆抗体(如图)。下列说法正确的是(　　) A.利用胶原蛋白酶处理，可分散贴壁生长的骨髓瘤细胞 B.制备的单克隆抗体A和单克隆抗体B是相同的单克隆抗体 C.用于生产单克隆抗体的杂交瘤细胞可传代培养，但不能冻存 D.单克隆抗体A和单克隆抗体B都能够特异性识别S蛋白 答案：AD 解析：胶原蛋白酶可以催化细胞外的胶原蛋白分解，因此利用胶原蛋白酶处理，可分散贴壁生长的骨髓瘤细胞，A项正确；由于蛋白S含有多个不同的抗原决定基，每一个抗原决定基能够刺激机体产生一种抗体，单克隆抗体A和单克隆抗体B来自不同的杂交瘤细胞，因此制备的单克隆抗体A和单克隆抗体B不是相同的单克隆抗体，B项错误；用于生产单克隆抗体的杂交瘤细胞可传代培养，也可冷冻保存，C项错误；单克隆抗体A和单克隆抗体B都来自筛选出的杂交瘤细胞，因此都能够特异性识别S蛋白上的抗原决定基，D项正确。 培养骨髓瘤细胞时需满足的气体条件是什么? 提示：95%的空气＋5%的CO2气体环境。 考法预测 考法　考查单克隆抗体的制备及其应用，考查科学思维和社会责任 1.人绒毛膜促性腺激素(HCG)是一种由胎盘分泌的糖蛋白。用抗HCG单克隆抗体做成的“早早孕诊断试剂盒”对尿液进行检测，在妊娠第8天就可作出诊断。下列叙述错误的是(　　) A.胎盘是由囊胚时期出现的滋养层细胞发育而来的 B.制备该单克隆抗体以及早孕检测时，HCG均作为抗原 C.单克隆抗体能准确地识别抗原的细微差异、与特定抗原发生特异性结合、可以大量制备 D.用选择培养基筛选出的杂交瘤细胞均能产生抗HCG抗体 答案：D 解析：胚胎发育过程中，囊胚时期出现的滋养层细胞会发育成胎膜和胎盘，A项正确。制备该单克隆抗体时以HCG作为抗原，刺激机体发生免疫反应，获得能产生抗HCG抗体的B淋巴细胞；在早孕检测时利用抗原—抗体特异性结合，HCG作为抗原与抗HCG单克隆抗体特异性结合，B项正确。单克隆抗体具有能准确地识别抗原的细微差异、与特定抗原发生特异性结合、可以大量制备的特点，C项正确。筛选杂交瘤细胞时需要进行两次筛选，第一次用选择培养基筛选出杂交瘤细胞，第二次经过多孔培养板培养，再进行抗体检测，故用选择培养基筛选出的杂交瘤细胞不一定能产生抗HCG抗体，D项错误。 2. (2025·山西吕梁开学考试)下图表示生产抗β-干扰素单克隆抗体的过程。下列相关叙述错误的是(　　) A.过程①是将β-干扰素注入小鼠，再从小鼠脾脏中分离经免疫的B淋巴细胞 B.过程②中加入秋水仙素溶液可促进B淋巴细胞与骨髓瘤细胞的融合 C.过程④是对杂交瘤细胞进行克隆化培养和抗体检测并多次筛选 D.可将杂交瘤细胞在体外条件下大规模培养，从细胞培养液中能获取抗β-干扰素单克隆抗体 答案：B 解析：题图表示生产抗β-干扰素单克隆抗体的过程，因此过程①是将β-干扰素溶液注射给小鼠，激发小鼠产生特异性免疫，再从小鼠脾脏中分离经免疫的B淋巴细胞，A项正确；诱导动物细胞融合的常用方法有PEG融合法、电融合法和灭活病毒诱导法等，过程②是诱导B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，故过程②中可加入聚乙二醇溶液促进B淋巴细胞与骨髓瘤细胞的融合，秋水仙素不能诱导动物细胞融合，B项错误；过程④中，对杂交瘤细胞进行克隆化培养和抗体检测，经多次筛选，就可获得能分泌抗β-干扰素单克隆抗体的细胞，C项正确；将杂交瘤细胞在体外条件下大规模培养，杂交瘤细胞会将抗β-干扰素单克隆抗体分泌到培养液中，因此从细胞培养液中能获取抗β-干扰素单克隆抗体，D项正确。 特训点三　动物体细胞核移植和克隆动物 1.动物细胞核移植技术 2.体细胞核移植的过程 3.应用前景和存在的问题 前景 畜牧业 加速家畜遗传改良进程、促进优良畜群繁育 其他领域 保护濒危物种，了解胚胎发育及衰老过程 医药卫生 ①作为　　　　　　，生产医用蛋白  ②　　　　的细胞、组织或器官可作为异种移植的供体  ③以患者作为供体培育的人核移植　　　　经过诱导分化形成相应的细胞、组织或器官，可用于器官移植  问题 成功率　　　　；克隆动物存在　　　　问题，表现出遗传和生理缺陷；克隆动物食品的　　　　问题存在争议  知识必备答案：1.细胞核　卵母细胞　新胚胎　细胞核 胚胎 2.①细胞培养　②去核　③重构胚　④供体 3.生物反应器　转基因克隆动物　胚胎干细胞　非常低　健康　安全性 概念诊断 1.胚胎细胞核移植的成功率要高于体细胞核移植的成功率。(　　) 答案：√ 提示：胚胎细胞的分化程度低，表现全能性相对容易，进行核移植的成功率高。 2.非人灵长类动物的体细胞在去核卵母细胞中能完全恢复其分化前的状态，导致胚胎发育率高。(　　) 答案：× 提示：非人灵长类动物的体细胞在去核卵母细胞中不能完全恢复其分化前的状态，导致胚胎发育率低。 3.从牛的卵巢中采集的卵母细胞，可直接进行核移植操作。(　　) 答案：× 提示：从牛的卵巢中采集的卵母细胞，需在体外培养至MⅡ期。 4.重构胚是指人工重新构建的胚胎，具有发育成完整个体的能力。(　　) 答案：√ 5.体细胞核移植技术已成功获得多种克隆动物，该技术的成功率非常高。(　　) 答案：× 提示：目前，体细胞核移植技术的成功率还很低。 探究点　体细胞核移植技术 【情境引领】　某研究小组已从人的皮肤细胞中提取出细胞核，然后将其植入几乎被完全剔除了遗传信息的牛卵母细胞中，从而培育出人兽混合胚胎(如图所示)。该胚胎发育到第三天时已含有32个细胞，研究人员希望它能继续生长到六天，再从胚胎中取出干细胞供医学研究使用。 【问题生成】 (1)混合胚胎的基因组成有99%以上都是人类的，剩下不到1%是牛的，这1%的牛基因分布在什么部位? 提示：分布在卵母细胞质的线粒体中。 (2)核移植过程中用物理或化学方法等激活重构胚的目的是什么? 提示：使重构胚完成细胞分裂和发育进程。 (3)从早期胚胎中分离出来的细胞，称为胚胎干细胞，这类细胞在功能上具有怎样的特点? 提示：具有发育的全能性，可以分化为成年动物的任何一种组织细胞。 【归纳总结】 动物细胞培养与动物体细胞核移植 项目 动物细胞培养 动物体细胞核移植 原理 细胞增殖 动物体细胞核的全能性 过程 结果 获得细胞群 获得克隆动物 应用 生产生物制品、用于基因工程、检测有毒物质等 加速家畜遗传改良进程、促进良种繁育、保护濒危物种、生产医用蛋白、提供克隆器官组织等 考法　借助图解和实例综合考查动物的体细胞核移植技术，考查科学思维 1.(2024·黑龙江三模)下图是利用体细胞核移植来克隆高产奶牛的大致流程示意图。下列相关叙述错误的是(　　) A.体外培养至MⅡ期的卵母细胞要先经过获能处理才能用于后续操作 B.图中过程①常用显微操作法去除细胞中的纺锤体—染色体的复合物 C.图中过程③是将供体细胞整个注入去核卵母细胞中 D.图中的重构胚中含有卵母细胞的细胞质和供体细胞的细胞质 答案：A 解析：体外培养至MⅡ期的卵母细胞不需要进行获能处理就可进行后续操作，A项错误；卵母细胞去核通常是用显微操作法去除细胞中的纺锤体—染色体的复合物，B项正确；过程③构建重构胚时是将供体细胞整个注入去核卵母细胞中，因此图中的重构胚中含有卵母细胞的细胞质和供体细胞的细胞质，C、D两项正确。 2. (2024·山东淄博一模)20世纪70年代，我国科学家运用核移植技术，将鲤鱼囊胚细胞的细胞核移植到去核的鲫鱼卵中，培育出了鲤鲫移核鱼。与鲤鱼相比，鲤鲫移核鱼肌肉蛋白质含量高，生长速度快。科学家用鲤鲫移核鱼与镜鲤杂交，培育出了颖鲤。颖鲤具有明显的生长优势，在体色、体型和生长速度等方面远优于鲤鲫移核鱼。下列说法正确的是(　　) A.鲤鲫移核鱼的培育原理与颖鲤的培育原理相同 B.鲤鲫移核鱼培育过程中受体鲫鱼卵为去核的受精卵 C.颖鲤含有三种鱼的核遗传物质，因而具有生长优势 D.胚细胞的全能性高，核移植难度低于体细胞核移植 答案：D 解析：鲤鲫移核鱼的培育原理是动物细胞核有全能性，颖鲤的培育原理是基因重组，A项错误；鲤鲫移核鱼培育过程中受体鲫鱼卵为未受精的卵母细胞，而不是去核的受精卵，B项错误；科学家用鲤鲫移核鱼与镜鲤杂交，培育出了颖鲤，由于鲤鲫移核鱼的核遗传物质来自鲤鱼，故颖鲤含有两种鱼的核遗传物质，C项错误；胚细胞相对于体细胞而言，细胞分化程度低，全能性容易表达，因此胚细胞的全能性高，核移植难度低于体细胞核移植，D项正确。 特训点四　胚胎工程 1.胚胎工程 2.受精作用 (1)概念：　　　　　和 　　　　结合形成 　　　　(受精卵)的过程，包括受精前的准备阶段和受精阶段。  (2)场所：雌性动物的 　　　　内。  (3)过程： 拓展链接 ①精子获能是指精子获得受精“能力”，而不是获得能量。 ②常以观察到两个极体(多数哺乳动物的第一极体不进行减数分裂Ⅱ，不会形成两个第二极体)或者雌、雄原核作为受精的标志，而受精完成的标志是雌、雄原核融合。 ③在自然条件下，哺乳动物的受精在输卵管内完成。 ④不同哺乳动物排出的卵子成熟程度不同，有的可能是初级卵母细胞，如马、犬等；有的可能是次级卵母细胞，如猪、羊等。 3.胚胎的早期发育 拓展链接 卵裂期胚胎发育过程中物质和体积变化的规律 (1)有机物：胚胎没有和母体建立联系，不能从母体中获取有机物，而胚胎呼吸消耗一直进行，因此有机物总量减少。 (2)细胞数目和体积：胚胎总体积并不增加，但细胞数量增加，每个细胞体积减小。 (3)细胞中核DNA含量：伴随细胞分裂，细胞数量增加，总DNA含量增多，但每个细胞中核DNA含量保持相对稳定。 4.体外受精 (1)过程 (2)意义 ①提高　　　　　　　　的有效措施。  ②为　　　　提供可用的胚胎。  5.胚胎移植 拓展链接 胚胎移植的四大生理学基础 6.胚胎分割 (1)操作流程 (2)仪器设备：体视显微镜和　　　　。  (3)分割囊胚阶段的胚胎时，要注意　　　　　。  (4)意义：促进　　　　　的繁殖，产生的遗传性状　　　　的后代是进行遗传学研究的宝贵材料；在胚胎移植前，进行性别鉴定、　　　　等，对于人工控制　　　　、动物繁育健康后代具有重要意义。  知识必备答案：1.早期胚胎细胞　雌性动物　自然受精　早期胚胎发育 2.(1)精子　卵子　合子　(2)输卵管　(3)获能　MⅡ期 雌、雄原核 3.受精卵　有丝分裂　囊胚　胎膜和胎盘　胎儿的各种组织　三个胚层 4.(1)MⅡ　获能　获能的精子　适当的培养液　(2)①动物繁殖能力　②胚胎移植 5.同期发情　超数排卵　胚胎移植 6.(1)桑葚胚　囊胚　操作液　分割针　分割刀　(2)显微操作仪　(3)将内细胞团均等分割　(4)优良动物品种 相同　遗传病筛查　动物性别 概念诊断 1.雄性动物刚刚排出的精子并不具有受精能力，必须获能后才具备受精能力。(　　) 答案：√ 2.随着卵裂的进行，胚胎的体积略有减小，但有机物的总量会增加。(　　) 答案：× 提示：卵裂期的胚胎体积略有减小，有机物的总量也会减少。 3.在胚胎发育过程中，细胞的分化出现在桑葚胚阶段。(　　) 答案：× 提示：囊胚阶段开始出现细胞分化。 4.体外受精前，用性激素处理雌鼠可以获得更多的卵细胞。(　　) 答案：× 提示：应使用促性腺激素处理雌鼠。 5.胚胎移植前要对胚胎进行检查并在囊胚或原肠胚阶段移植。(　　) 答案：× 提示：检查后的胚胎应在桑葚胚或囊胚阶段移植。 6.胚胎分割过程中，可取内细胞团层细胞做DNA分析，鉴定性别。(　　) 答案：× 提示：取滋养层细胞做DNA分析。 探究点　胚胎工程及其应用 【情境引领】　和牛是当今世界公认的良种肉牛，下图表示研究人员利用胚胎工程培育优质和牛的过程。 【问题生成】 (1)通常和牛每次排出一枚卵母细胞，对供体和牛施行超数排卵的措施是什么? 提示：注射促性腺激素，使其超数排卵。 (2)在和牛的培育过程中，要使体外受精成功，精子和卵母细胞需具备怎样的条件? 提示：精子需进行获能处理，卵母细胞需培养至MⅡ期。 (3)在对囊胚进行胚胎分割时，应注意什么问题? 提示：对囊胚的内细胞团进行均等分割。 【归纳总结】 1.胚胎分割、核移植和胚胎移植的比较 项目 胚胎分割 核移植 胚胎移植 胚胎 来源 雌性动物体内受精或体外受精形成的早期胚胎、其他方式得到的胚胎 经体细 胞核移 植得到 的胚胎 雌性动物体内受精或体外受精形成的早期胚胎、其他方式得到的胚胎 生殖 类型 无性生殖 无性生殖 有性生殖或无性生殖 2.胚胎移植中的三个注意点 (1)胚胎移植过程中两次激素使用： 第一次常用孕激素对供体、受体进行同期发情处理；第二次用外源促性腺激素处理供体使其超数排卵。 (2)胚胎移植过程中有两次检查： 第一次对收集的胚胎进行检查；第二次对受体母畜是否妊娠进行检查。 (3)不同动物胚胎移植的时间不同： 小鼠、马要培养到桑葚胚或囊胚阶段；猪、绵羊在桑葚胚阶段前。几乎所有动物都不能到原肠胚阶段移植，因为此时分化程度高，移植成功率很低。 【真题示范】　(2024·甘肃卷)甘加藏羊是甘肃高寒牧区的优良品种，是季节性发情动物，每年产羔一次，每胎一羔，繁殖率较低。为促进畜牧业发展，研究人员通过体外受精、胚胎移植等胚胎工程技术提高藏羊的繁殖率，流程如下图。下列叙述错误的是(　　) A.藏羊甲需用促性腺激素处理使其卵巢卵泡发育和超数排卵 B.藏羊乙的获能精子能与刚采集到的藏羊甲的卵母细胞受精 C.受体藏羊丙需和藏羊甲进行同期发情处理 D.后代丁的遗传物质来源于藏羊甲和藏羊乙 流程图解 信息获取 超数排卵 使用促性腺激素处理 精子与卵母细胞受精 精子需获能，卵母细胞需培养至MⅡ期 胚胎移植 实质为早期胚胎空间位置的转移 答案：B 解析：促性腺激素能作用于卵巢，藏羊甲需用促性腺激素处理使其卵巢卵泡发育和超数排卵，A项正确；从卵巢中刚采集的卵母细胞需培养成熟(MⅡ期)后才可与获能的精子进行体外受精，B项错误；在胚胎移植前要对接受胚胎的受体和供体进行同期发情处理，使二者的生理状况相同，因此受体藏羊丙需和藏羊甲进行同期发情处理，C项正确；后代丁是由藏羊甲的卵母细胞和藏羊乙的精子结合形成的受精卵发育而来的，因此后代丁的遗传物质来源于藏羊甲和藏羊乙，D项正确。 进行移植的胚胎通常处于发育的何种阶段? 提示：桑葚胚或囊胚阶段。 考法预测 考法1　考查受精作用及早期胚胎的发育，考查生命观念 1.(2024·贵州毕节三模)胚胎工程的许多技术，实际上是在体外条件下，对动物自然受精和早期胚胎发育条件进行的模拟操作。以下有关哺乳动物的受精和胚胎早期发育的说法，正确的是(　　) A.自然条件下，哺乳动物的受精是在子宫里完成的 B.受精卵形成后即在输卵管内进行有丝分裂，开始发育 C.滋养层细胞将来发育成的胎盘和胎膜，属于母体组织 D.早期胚胎发育过程中，细胞数目增多，胚胎体积增大 答案：B 解析：在自然条件下，哺乳动物的受精过程在输卵管中完成，A项错误；受精卵形成后即在输卵管内开始进行有丝分裂，胚胎开始发育，B项正确；囊胚期的内细胞团将来发育成胎儿的各种组织，属于母体组织，C项错误；早期胚胎发育过程中，细胞数目增多，但胚胎总体积并不增加，甚至略微缩小，D项错误。 受精阶段的主要过程及生理反应 步骤 主要过程 生理反应 第一步 精子释放多种酶溶解卵细胞膜外的一些结构(如透明带等)，同时借助自身的运动接触卵细胞膜 透明带反应：阻止后来的精子进入透明带，是防止多精入卵受精的第一道屏障 第二步 精子入卵，尾部脱落 卵细胞膜反应：拒绝其他精子再进入卵内，是防止多精入卵受精的第二道屏障 第三步 精子核膜破裂后形成新核，卵子被激活完成减数分裂Ⅱ，排出第二极体 形成雄原核和雌原核：受精的标志 第四步 雌、雄原核充分发育后，相向移动，彼此靠近，核膜消失 形成合子(受精卵)：个体发育的起点 考法2　考查胚胎工程的基本操作及应用，考查科学思维 2.(2025·内蒙古开学考试)我国科学家利用体外受精及培养技术成功建立了小鼠(2n＝40)单倍体胚胎干细胞系，过程如图所示。下列说法正确的是(　　) A.该过程运用了体外受精、胚胎培养、胚胎移植等多种生物技术 B.图中“?”处的处理应为将精子放入ATP溶液使其获得能量 C.对早期胚胎进行分割可获得更多的单倍体胚胎干细胞 D.小鼠单倍体胚胎干细胞在进行细胞分裂时最多出现40对同源染色体 答案：C 解析：图示过程是利用体外受精及培养技术构建小鼠(2n＝40)单倍体胚胎干细胞系，该过程中运用了体外受精(精子与卵细胞结合)、胚胎培养(早期胚胎培养)，但不涉及胚胎移植技术，A项错误；图中“?”处的处理是精子获能，是指精子获得受精的能力而非获得能量，B项错误；胚胎分割是一种无性生殖技术，对早期胚胎进行分割可获得更多的单倍体胚胎干细胞，C项正确；小鼠(2n＝40)单倍体胚胎干细胞系细胞中含有20条染色体，所得的单倍体的胚胎干细胞不存在同源染色体，D项错误。 3. (2024·江西模拟预测)我国科研人员利用胚胎工程培育出两只优质纯合陶赛特羊，其具有生长发育快、耐热、适应干燥气候等特点，培育流程如下图所示。下列相关叙述错误的是(　　) A.过程①可以使用促性腺激素对母羊A进行超数排卵处理 B.过程②的实质是早期胚胎在相同生理环境条件下空间位置的转移 C.桑葚胚阶段进行胚胎分割时需要对内细胞团进行均等分割 D.陶赛特羊D的性状由A羊和B羊共同决定 答案：C 解析：过程①可用促性腺激素对陶赛特品种母羊A进行超数排卵处理，以获得更多的卵母细胞，A项正确；过程②为胚胎移植，其实质是早期胚胎在相同生理环境条件下空间位置的转移，B项正确；桑葚胚阶段还未形成内细胞团，C项错误；陶赛特羊D的性状由A羊和B羊共同决定，D项正确。 一、核心概念——重落实 1.(选择性必修3 P44)动物细胞培养中使用的是合成培养基，这是将细胞所需的营养物质按种类和所需量严格配制而成的培养基，但还需要添加血清等一些天然成分的原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。 提示：整个动物细胞培养的环境是模拟动物细胞生活的内环境，而血清中含有多种维持细胞正常代谢和生长的物质，如糖类、氨基酸、未知的促生长因子等 2.(选择性必修3 P44)动物细胞培养所需气体主要有O2和CO2，O2是细胞代谢所必需的，CO2的主要作用是　　　　　　　　。在进行细胞培养时，通常采用培养皿或松盖培养瓶，并将它们置于含有　　　　　　　　　　　　的混合气体的CO2培养箱中进行培养。  提示：维持培养液的pH　95%空气和5%CO2 3.(选择性必修3 P44)一般的动物细胞培养时需要添加一定量的抗生素，以防　　　　　　　　。  提示：培养过程中的细菌污染 4.(选择性必修3 P48)埃博拉病毒(EBOV)是一种能导致人类出血热的致死性病毒，EBOV的NP蛋白在病毒复制中具有重要作用，也是检测EBOV的重要靶蛋白。实验人员用NP蛋白免疫小鼠来制备抗EBOV单克隆抗体的过程中，用NP蛋白多次免疫小鼠的目的是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。 提示：刺激小鼠产生更多能分泌抗NP抗体的B淋巴细胞 5.(选择性必修3 P52~53)将iPS细胞注入去核卵母细胞时用灭活的仙台病毒进行了短暂处理，推测其作用是　　　　　　　　　　　　　　　。 提示：诱导体细胞与去核卵母细胞融合 6.(选择性必修3 P59)牛在自然情况下，胚胎最早可在8~16细胞阶段进入子宫，但在实践中通常对发育到囊胚阶段的胚胎进行移植的原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。  提示：提高移植后胚胎的发育率和妊娠率 二、真题体验——明考向 1.(2024·江苏卷)我国科学家利用人的体细胞制备多能干细胞，再用小分子TH34成功诱导衍生成胰岛B细胞。下列相关叙述错误的是(　　) A.基因选择性表达被诱导改变后，可使体细胞去分化成多能干细胞 B.在小分子TH34诱导下，多能干细胞发生基因突变，获得胰岛素基因 C.衍生的胰岛B细胞在葡萄糖的诱导下能表达胰岛素，才可用于移植治疗糖尿病 D.若衍生的胰岛B细胞中凋亡基因能正常表达，细胞会发生程序性死亡 答案：B 解析：体细胞可以通过特定的因子导入和培养条件，基因的调控和表达模式的改变，使得原本专一功能的体细胞去分化成为多能干细胞，A项正确；小分子药物通常通过调节现有的生物通路和基因表达来实现其功能，而胰岛素基因在人体所有细胞中都存在，但只有在胰岛B细胞中才会表达，所以多能干细胞在诱导分化的过程中不会发生基因突变获得胰岛素基因，B项错误；胰岛B细胞在较高的血糖浓度下分泌胰岛素来降低血糖，所以衍生的胰岛B细胞需在葡萄糖的诱导下成功表达胰岛素，以确保衍生的胰岛B细胞能够正常发挥功能，才可用于移植治疗糖尿病，C项正确；凋亡基因的正常表达会导致衍生的胰岛B细胞发生程序性死亡，也就是发生细胞凋亡，D项正确。 2.(2024·浙江1月选考)某动物细胞培养过程中，细胞贴壁生长至接触抑制时，需分装培养，实验操作过程如图。下列叙述错误的是(　　) A.①加消化液的目的是使细胞与瓶壁分离 B.②加培养液的目的是促进细胞增殖 C.③分装时需调整到合适的细胞密度 D.整个过程需要在无菌、无毒条件下进行 答案：B 解析：①加消化液的目的是使细胞与瓶壁分离，A项正确；②多次加培养液先洗去残留的消化酶，然后终止消化液的消化作用，并对细胞加以稀释，便于转移，B项错误；③分装时需调整到合适的细胞密度，因为若密度过大细胞之间仍存在接触抑制，C项正确；动物细胞培养需要无菌、无毒环境，因此整个过程需要在无菌、无毒条件下进行，D项正确。 3.(2024·北京卷)我国科学家体外诱导食蟹猴胚胎干细胞，形成了类似囊胚的结构(类囊胚)，为研究灵长类胚胎发育机制提供了实验体系(如图)。相关叙述错误的是(　　) A.实验证实食蟹猴胚胎干细胞具有分化潜能 B.实验过程中使用的培养基含有糖类 C.类囊胚的获得利用了核移植技术 D.可借助胚胎移植技术研究类囊胚的后续发育 答案：C 解析：体外诱导食蟹猴胚胎干细胞，形成了类似囊胚的结构(类囊胚)，证实了食蟹猴胚胎干细胞具有分化潜能，A项正确；实验过程中使用的培养基需含有糖类，糖类可为细胞培养提供能源物质，B项正确；类囊胚的获得利用了动物细胞培养技术，并没有进行核移植，C项错误；可借助胚胎移植技术将类囊胚移植到相应的雌性受体中继续发育，从而用来研究类囊胚的后续发育，D项正确。 4.(2024·湖北卷)波尔山羊享有“世界山羊之王”的美誉，具有生长速度快、肉质细嫩等优点。生产中常采用胚胎工程技术快速繁殖波尔山羊。下列叙述错误的是(　　) A.选择遗传性状优良的健康波尔母山羊进行超数排卵处理 B.胚胎移植前可采集滋养层细胞进行遗传学检测 C.普通品质的健康杜泊母绵羊不适合作为受体 D.生产中对提供精子的波尔公山羊无须筛选 答案：D 解析：选择遗传性状优良的健康波尔母山羊作为供体，进行超数排卵处理，A项正确；胚胎移植前可采集部分滋养层细胞进行遗传学检测，B项正确；作为受体需具备健康的体质和正常繁殖能力，但山羊和绵羊是不同的物种，具有生殖隔离，不能将山羊的胚胎移植到绵羊子宫中发育，即普通品质的健康杜泊母绵羊不适合作为受体，C项正确；生产中需选择品质良好的波尔公山羊来提供精子，D项错误。 5.(多选)(2024·江苏卷)从牛卵巢采集卵母细胞进行体外成熟培养，探究高温对卵母细胞成熟的影响，结果如图所示。下列相关叙述错误的是(　　) A.选取发育状态一致的卵母细胞进行培养 B.体外培养卵母细胞时通常加入湿热灭菌后的血清 C.对采集的卵母细胞传代培养以产生大量卵细胞 D.体外培养时高温提高了卵母细胞发育的成熟率 答案：BCD 解析：选取发育状态一致的卵母细胞进行培养，这样可以排除其他因素的干扰，保证实验结果是由温度这一变量引起的，A项正确；体外培养卵母细胞时通常加入血清，但是动物血清并不能进行湿热灭菌，否则会使其中部分有效成分失活，B项错误；卵母细胞不能进行传代培养，因为卵母细胞是生殖细胞，不具有连续分裂的能力，C项错误；由图可知，高温降低了卵母细胞发育的成熟率，而不是提高，D项错误。 A组(对点特训) 对点1　动物细胞培养 1.(2024·广东广州高三月考)某研究小组对某种动物的肝肿瘤细胞(甲)和正常肝细胞(乙)进行培养，下列叙述正确的是(　　) A.制备肝细胞悬液时先用剪刀剪碎肝组织，再用胃蛋白酶处理 B.肝细胞培养过程中通常在培养液中通入5%的CO2刺激细胞呼吸 C.为了防止培养过程中杂菌的污染，可向培养液中加入适量的干扰素 D.用血细胞计数板计数的方法，可推断乙细胞比甲细胞增殖周期长 答案：D 解析：制备肝细胞悬浮液时，用机械的方法或用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理肝组织，使细胞分散开，A项错误；肝细胞培养过程中通常在培养液中通入5%的CO2维持培养液的pH，B项错误；为了防止培养过程中杂菌的污染，可向培养液中加入适量的抗生素，C项错误；肿瘤细胞没有接触抑制现象，有无限增殖的能力，即细胞分裂旺盛，细胞周期短，因此用血细胞计数板计数的方法，可推断乙细胞比甲细胞增殖周期长，D项正确。 对点2　动物细胞融合技术与单克隆抗体 2.(2024·湖北武汉模拟预测)单克隆抗体的制备过程通常涉及免疫动物、细胞融合、选择培养、单克隆抗体的大量制备等步骤。下列关于利用小鼠制备抗人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体(用于制作早早孕诊断试剂)的叙述，正确的是(　　) A.免疫动物阶段，给小鼠注射人绒毛膜促性腺激素，致使小鼠发生体液免疫 B.细胞融合阶段，可以采用的诱导融合方法与诱导原生质体融合的方法完全相同 C.选择培养阶段，淘汰掉未融合的骨髓瘤细胞和B细胞即可得到所需杂交瘤细胞 D.第二次筛选出的杂交瘤细胞只能注射到小鼠腹腔内大规模培养 答案：A 解析：利用小鼠制备抗人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体，该过程中人绒毛膜促性腺激素作为抗原，致使小鼠发生体液免疫，A项正确；动物细胞融合的方法和植物原生质体的融合方法不完全相同，动物细胞可用灭活的病毒诱导融合，而植物细胞不能，B项错误；选择培养阶段，淘汰掉的细胞还包括两个相同种类细胞融合形成的细胞，C项错误；杂交瘤细胞可在体外条件下大规模培养或注射到小鼠腹腔内增殖，从细胞培养液或小鼠腹水中就可以提取出大量的单克隆抗体，D项错误。 3.(2024·浙江绍兴模拟预测)CD47是细胞膜上的一种糖蛋白，能抑制巨噬细胞的免疫清除作用。肺癌、结肠癌等多种肿瘤细胞表面的CD47含量比正常细胞高1.6~5倍。下图为抗CD47的单克隆抗体的制备流程图，下列相关叙述错误的是(　　) A.过程①中筛选出的杂交瘤细胞都具有产生特异性抗体和无限增殖能力 B.过程②用多孔玻璃板培养和筛选杂交瘤细胞时，每个孔中尽量只接种1个细胞 C.出现阳性反应的原因是抗原与抗体发生了特异性的结合 D.注射抗CD47的单抗可以增强巨噬细胞对多种肿瘤细胞的清除作用 答案：A 解析：过程①中筛选出的杂交瘤细胞并非都具有产生特异性抗体和无限增殖能力，还需要进一步筛选，A项错误；过程②为筛选能产生特定抗体的杂交瘤细胞，具体做法是将杂交瘤细胞多倍稀释，接种在多孔的细胞玻璃板上，使每孔细胞不超过1个，通过培养让其增殖，B项正确；出现阳性反应是因为抗原(CD47)与抗体(抗CD47的单抗)发生了特异性的结合，C项正确；由于肿瘤细胞表面CD47能抑制巨噬细胞的免疫清除作用，而抗CD47的单抗可阻断其作用，所以注射抗CD47的单抗可以增强巨噬细胞对多种肿瘤细胞的清除作用，D项正确。 对点3　动物体细胞核移植和克隆动物 4.(2024·福建模拟预测)某科研人员通过将大熊猫的细胞核植入去核后的兔子卵母细胞中，克隆出一批大熊猫早期胚胎。下列有关克隆技术的叙述，正确的是(　　) A.动物体细胞核移植技术只能克隆雌性动物 B.一般用高CaCl2溶液去除卵母细胞的细胞核 C.使用灭活的病毒等方法激活重组细胞使其完成细胞分裂和发育 D.利用体细胞核移植技术可以加速家畜遗传改良进程 答案：D 解析：一般而言，生物的性别由位于细胞核内的性染色体决定，利用动物体细胞核移植技术可有选择性地繁殖某一性别的家畜，既可得到雌性动物，也可得到雄性动物，A项错误；一般通过显微操作技术去除卵母细胞的细胞核，B项错误；灭活的病毒可诱导动物细胞融合，但不能激活重组细胞使其完成细胞分裂和发育进程，C项错误；体细胞核移植技术已展示出广阔的应用前景，在畜牧生产中，利用体细胞核移植技术可以快速繁殖具有优良品质的家畜，D项正确。 对点4　胚胎工程 5.(2024·云南昆明模拟预测)胚胎工程可进一步挖掘经济动物的繁殖潜力，也为濒危动物的繁育提供技术支持。下列说法正确的是(　　) A.胚胎工程技术主要指体内受精、胚胎移植和胚胎分割等技术 B.卵母细胞与获能后的精子相遇形成受精卵，即可进行移植 C.进行牛的胚胎移植时需对供体母牛和受体母牛进行超数排卵处理 D.胚胎分割后经移植可获得同卵双胎，可以看作动物无性繁殖的方法之一 答案：D 解析：胚胎工程技术主要指体外受精、胚胎移植和胚胎分割等技术，体内受精不是胚胎工程技术，A项错误；成熟的卵母细胞与获能后的精子相遇形成受精卵，受精卵发育成桑葚胚或囊胚才能进行移植，B项错误；进行牛的胚胎移植时只需对供体母牛进行超数排卵处理，C项错误；胚胎分割后经移植可获得同卵双胎，来自同一胚胎的后代具有相同的遗传物质，胚胎分割可以看作动物无性繁殖的方法之一，D项正确。 6.(2024·四川成都高三期末)线粒体疾病严重危害患者健康。科研人员按如图所示流程进行操作，可以使患线粒体疾病的母亲生育出线粒体正常的子代。据图分析，下列叙述正确的是(　　) A.甲为M Ⅱ期产生的第二极体，其内含有的细胞质较少 B.丙为重组细胞，在精子入卵后被激活完成减数分裂Ⅱ C.丁中的B为滋养层细胞，将来发育成胎儿的各种组织 D.丁植入子宫前必须对受体进行免疫检查避免免疫排斥反应 答案：B 解析：甲细胞不含同源染色体，有姐妹染色单体，处于MⅡ期，是MⅠ期产生的(第一)极体，A项错误；丙是重组细胞，在精子入卵后被激活释放极体，完成减数分裂Ⅱ，B项正确；囊胚期的内细胞团将来发育成胎儿的各种组织，滋养层细胞将来发育成胎盘和胎膜，C项错误；胚胎移植前不需要对供体和受体进行免疫检查，因为受体子宫对移入的胚胎不会发生免疫排斥反应，D项错误。 7.(2024·浙江模拟预测)积雪草能促进肌肤再生，修复受损的胶原蛋白，是美容护肤界的万金油。现用一批遗传性状基本一致的实验鼠，研究积雪草提取液对受损皮肤的修复效果。下列叙述正确的是(　　) A.积雪草可促进受损的肌肤细胞恢复体现了全能性 B.可从不同鼠中取出体细胞进行核移植，培养获取遗传性状基本一致的实验鼠 C.通过均等分割囊胚期的内细胞团，可获得更多的遗传性状基本一致的实验鼠 D.分割获得的胚胎，需移植到经超数排卵处理的受体雌鼠的子宫中发育成熟 答案：C 解析：细胞全能性是指细胞发育为完整个体或分化为其他各种细胞的能力，积雪草能促进肌肤再生，修复受损的胶原蛋白，没有体现全能性，A项错误；培养获取遗传性状基本一致的实验鼠需要从同一小鼠体细胞中获取，B项错误；囊胚期的细胞具有全能性，通过均等分割囊胚期的内细胞团，可获得更多的遗传性状基本一致的实验鼠，C项正确；需经超数排卵处理的是供体而非受体，D项错误。 B组(综合特训) 8.(2024·广东广州二模)为研究多种血糖调节因子的作用，我国科学家开发出胰岛素抵抗模型鼠。为扩增模型鼠数量，科学家通过诱导优良模型鼠体细胞转化获得iPS细胞，继而利用iPS细胞培育出与模型鼠遗传特性相同的克隆鼠，具体步骤如图所示。请回答下列问题： (1)图中黑鼠的体细胞在诱导因子的作用下转化为iPS细胞的过程与植物组织培养中的　　　　过程类似。该过程结束后，细胞的全能性　　　　(填“提高”或“降低”)。  (2)图中灰鼠形成的受精卵，经过一次有丝分裂后可得到双细胞胚。为获得更多的双细胞胚，可对灰鼠注射　　　　激素，使其超数排卵。  (3)囊胚中的内细胞团将来可以发育成胎儿的　　　。图中的重构胚通过①　　　　技术进入代孕白鼠子宫内继续发育，X鼠的体色为　　　　。图中可以是雄鼠的有　　　　(填图中相关鼠的名称)。  (4)为确定克隆鼠的培育是否成功，须对X鼠进行　　　　　　　　的相关检测。  答案：(1)脱分化　提高　(2)促性腺　(3)各种组织　胚胎移植　黑色　黑鼠和X鼠　(4)胰岛素抵抗 解析：(1)黑鼠体细胞在诱导因子的作用下转化为iPS细胞的过程与植物组织培养中的脱分化过程类似，是组织细胞恢复分裂、分化能力的过程。iPS细胞与小鼠内细胞团一样，具有全能性，该过程结束后，细胞的全能性提高。(2)超数排卵是指应用外源促性腺激素，诱导卵巢排出比自然情况下更多的成熟卵子。(3)囊胚中的内细胞团将来可以发育成胎儿的各种组织。将重构胚移入代孕白鼠子宫内的技术为胚胎移植。克隆属于无性繁殖，iPS细胞来自黑鼠，所以X鼠的体色为黑色。图中提供胚胎的灰鼠和代孕白鼠都是雌鼠，可以是雄鼠的有黑鼠和X鼠。(4)实验最终目的为“开发出胰岛素抵抗模型鼠”，故为确定克隆鼠的培育是否成功，须对X鼠进行胰岛素抵抗的相关检测。 9.(2024·湖北一模)BBWV(蚕豆萎蔫病毒)会侵染蚕豆、辣椒等多种作物，导致作物产量和品质的下降，经筛选克隆，获得抗BBWV单克隆抗体。请回答下列有关问题： (1)经免疫的小鼠B细胞与骨髓瘤细胞融合形成　　　　细胞，获得该细胞常用的培养基从功能上划分属于　　　　　　　　培养基。  (2)科学家制备出2株抗BBWV单克隆抗体(简称单抗A、单抗B)，再分别从感染BBWV的蚕豆、辣椒等多种作物中分离出BBWV，发现同一株单抗对不同BBWV分离物的特异性表现出差异，直接原因是　　　　　　　　　　　。 (3)BBWV的外壳蛋白上有多个与抗体结合的位点。为研究单抗A、B与BBWV结合的位点是否相同，按如图所示简要流程进行实验操作。 将图中应使用的抗体填入表中①②③处(填“A”、“B”或“无关抗体”)，完善实验方案，并写出支持两株单抗与BBWV结合位点相同假说的预期结果。 未标记抗体 荧光标记抗体 实验组 ①　　　　  B 对照组1 ②　　　　  ③　　　　  对照组2 B B 预期结果：　　　　　　　　　　　　　　　　　　。 答案：(1)杂交瘤　选择　(2)不同BBWV具有不同的抗原　(3)A　无关抗体　B　实验组和对照组2的荧光强度相同，且小于对照组1的荧光强度 解析：(1)经免疫的小鼠B细胞与骨髓瘤细胞融合形成多种杂交细胞，在选择培养基上筛选出既能无限增殖又能产生抗体的杂交瘤细胞。(2)抗原和抗体特异性结合，同一株单抗对不同BBWV分离物的特异性表现出差异，直接原因是不同BBWV具有不同的抗原。(3)为检测单抗A、B与BBWV结合的位点是否相同，实验设计时要注意单一变量原则和对照原则。实验组加未标记抗体A和荧光标记抗体B，对照组1加未标记的无关抗体和荧光标记抗体B，对照组2加未标记抗体B和荧光标记抗体B。若实验组和对照组2的荧光强度相同，且小于对照组1的荧光强度，则说明单抗A、B与BBWV结合的位点相同。因为实验组和对照组2中未标记抗体A、B与BBWV结合后，标记的抗体B不能再结合了，因此对照组2和实验组应该荧光强度弱。 第46讲　基因工程的基本工具和基本操作程序 课标要求 1.阐明DNA重组技术的实现需要利用限制性内切核酸酶、DNA连接酶和载体三种基本工具 2.阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定等步骤 3.DNA的粗提取与鉴定实验 4.利用聚合酶链式反应(PCR)扩增DNA片段并完成电泳鉴定，或运用软件进行虚拟PCR实验 关键词索引 限制性内切核酸酶　DNA连接酶　载体　目的基因　PCR技术　基因表达载体　转化　抗原—抗体杂交 特训点一　基因工程的基本工具 1.基因工程的概念 别名 　　　　技术  操作环境 生物体外 操作对象 　　　  操作水平 　　　　水平  结果 创造出更符合人们需要的新的　　　　和　　　　  2.基因工程的基本工具 (1)限制性内切核酸酶——“分子手术刀” (2)DNA连接酶——“分子缝合针” (3)基因进入受体细胞的载体——“分子运输车” 拓展链接 ①DNA连接酶连接的是两个DNA片段，而DNA聚合酶是把单个的脱氧核苷酸连接到已有的DNA片段上。 ②DNA聚合酶起作用时需要以一条DNA链为模板，而DNA连接酶不需要模板。 知识必备答案：1.重组DNA　基因　DNA分子　生物类型　生物产品 2.(1)原核生物　磷酸二酯键　黏性末端　(2)磷酸二酯键　平末端　(3)质粒　限制酶切割位点 概念诊断 1.基因工程是在DNA分子水平进行设计和施工，也叫重组DNA技术。(　　) 答案：√ 2.基因工程中用到的工具酶有限制性内切核酸酶、DNA连接酶和载体。(　　) 答案：× 提示：载体不属于工具酶。 3.限制性内切核酸酶全部是从原核生物中分离纯化出来的。(　　) 答案：× 提示：限制性内切核酸酶主要是从原核生物中分离纯化出来的，少数来自真核生物，如酵母菌。 4.大多数限制酶的识别序列由8个核苷酸组成，且切割后可产生黏性末端或平末端。(　　) 答案：× 提示：大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成。 5.DNA连接酶可催化目的基因片段与质粒载体片段之间形成磷酸二酯键。(　　) 答案：√ 6.质粒是一种裸露的、结构简单，并具有自我复制能力的链状DNA分子。(　　) 答案：× 提示：质粒是一种环状DNA分子。 探究点　基因工程的基本工具 【情境引领】　重组DNA技术可以赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人类需要的生物产品。在该技术操作过程中需要使用多种工具酶，其中4种限制性内切核酸酶的切割位点如图所示。 【问题生成】 (1)DNA连接酶催化目的基因片段与质粒载体片段之间形成的化学键名称是什么? 提示：磷酸二酯键。 (2)限制酶切割DNA后产生不同种类的末端，其依据是什么? 提示：当限制酶在它的识别序列的中心轴线两侧将DNA分子的两条链分别切开时，产生的是黏性末端；当限制酶在它识别序列的中心轴线处切开时，产生的是平末端。 【归纳总结】 限制酶的选择原则 (1)不破坏目的基因原则：不选择SmaⅠ。 (2)保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则：所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择SmaⅠ。 (3)确保出现相同黏性末端原则：通常选择同一种限制酶切割含有目的基因的DNA片段和质粒，如图中PstⅠ；为避免目的基因和质粒自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割含有目的基因的DNA片段和质粒，也可选择图中PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶。 【真题示范】　(2024·湖南卷)某同学将质粒DNA进行限制酶酶切时，发现DNA完全没有被酶切，分析可能的原因并提出解决方法。下列叙述错误的是(　　) A.限制酶失活，更换新的限制酶 B.酶切条件不合适，调整反应条件如温度和酶的用量等 C.质粒DNA突变导致酶识别位点缺失，更换正常质粒DNA D.酶切位点被甲基化修饰，换用对DNA甲基化不敏感的限制酶 答案：B 解析：限制酶失活会使DNA完全不被酶切，此时应更换新的限制酶，A项正确；酶切条件不合适通常会使切割效果下降，此时应有部分DNA被酶切，且调整酶的用量没有作用，B项错误；质粒DNA突变会导致限制酶识别位点缺失，进而造成限制酶无法进行切割，此时应更换正常质粒，C项正确；质粒DNA上酶切位点被甲基化修饰，会导致对DNA甲基化敏感的限制酶无法进行酶切，此时应换用对DNA甲基化不敏感的限制酶，D项正确。 考法预测 考法　结合具体实例考查DNA相关酶的使用特点，考查科学思维 1.(2025·山西吕梁开学考试)DNA重组技术可以赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人类需要的生物产品。在此过程中需要使用多种工具酶。下列相关叙述正确的是(　　) A.所有的限制酶都具有专一性，不同限制酶切割产生的黏性末端都不同 B.限制酶和DNA连接酶分别能催化磷酸二酯键的断裂和形成 C.限制酶识别序列越短，则相应酶切位点在DNA中出现的概率越小 D.DNA连接酶可以将游离的单个脱氧核苷酸连接成双链结构 答案：B 解析：所有的限制酶都具有专一性，不同限制酶切割产生的黏性末端可能相同，A项错误；限制酶能够识别特定的DNA序列并催化磷酸二酯键的断裂，而DNA连接酶能够催化磷酸二酯键的形成，将DNA片段连接起来，B项正确；限制酶识别序列越短，则相应酶切位点在DNA中出现的概率越大，因为短序列在DNA中出现的频率较高，C项错误；DNA连接酶的功能是将DNA片段连接起来，而不是将游离的单个脱氧核苷酸连接成双链结构，D项错误。 2.(2024·安徽安庆高三月考)关于下图所示黏性末端的叙述，错误的是(　　) A.DNA连接酶可催化①与③的连接 B.①与③是由相同限制酶切割产生的 C.经酶切形成④需要消耗2分子水 D.DNA聚合酶不能作用于上述黏性末端 答案：B 解析：由于①与③的黏性末端相同，所以DNA连接酶可催化①与③的连接，A项正确；不同限制酶切割生成的黏性末端可能相同，因此①与③不一定是由相同限制酶切割产生的，B项错误；形成④需要断裂两个磷酸二酯键，因此需要消耗2分子水，C项正确；DNA聚合酶无法作用于黏性末端，它是在DNA复制时将单个脱氧核苷酸连接到子链末端，D项正确。 与DNA有关的几种酶的比较 特训点二　基因工程的基本操作程序 1.目的基因的筛选与获取 ①筛选合适的目的基因：从相关的已知　　　　　　清晰的基因中进行筛选等。  ②利用PCR获取和扩增目的基因 2.基因表达载体的构建——核心环节 拓展链接 启动子≠起始密码子，终止子≠终止密码子 ①启动子：一段有特殊序列结构的DNA片段，位于基因的上游，它是RNA聚合酶识别、结合的部位。 ②终止子：一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的下游，作用是使转录过程停止。 ③起始密码子和终止密码子位于mRNA上，分别控制蛋白质合成过程中翻译阶段的启动和终止。 3.将目的基因导入受体细胞 4.目的基因的检测与鉴定 知识必备答案： 1.①结构和功能　②DNA半保留复制　引物　耐高温的DNA聚合酶　单链　耐高温的DNA聚合酶　指数　琼脂糖凝胶电泳 2.启动子　转录　标记基因　目的基因的受体细胞 3.目的基因　子房　T-DNA　染色体DNA　受精卵　能吸收周围环境中DNA分子 4.抗原—抗体杂交　分子　个体生物学 概念诊断 1.基因工程中，目的基因一定是指编码蛋白质的基因。(　　) 答案：× 提示：目的基因主要是指编码蛋白质的基因，也可能是某些调节基因。 2.在PCR中使用的酶是解旋酶和Taq DNA聚合酶，其中后者的热稳定性较高。(　　) 答案：× 提示：PCR中利用高温解旋，不使用解旋酶。 3.Ti质粒上的T-DNA可与植物受体细胞的染色体DNA整合在一起。(　　) 答案：√ 4.为培育抗除草剂的作物新品种，导入抗除草剂基因时，可以受精卵为受体。(　　) 答案：√ 提示：为培育抗除草剂的作物新品种，导入抗除草剂基因时可以受精卵为受体，也可以体细胞为受体。 5.检测目的基因是否导入受体细胞可用PCR技术。(　　) 答案：√ 提示：检测目的基因是否导入受体细胞一般用PCR技术。 探究点　基因工程的基本操作程序 【情境引领】　近年来烟草叶绿体基因工程在提高光合效率、抗性和品质等方面取得了研究进展。下图是将拟南芥果糖1，6-二磷酸醛缩酶基因(简称“醛缩酶基因”)转入烟草叶绿体基因组的部分流程示意图。 【问题生成】 (1)图1中，利用PCR技术扩增拟南芥醛缩酶基因时，应选用引物的种类有哪些?依据是什么? 提示：引物甲和引物丙，DNA的两条链反向平行，只有使用引物甲和引物丙可扩增得到完整的拟南芥醛缩酶基因。 (2)图2中的质粒除具有上述组件外，还应具备的组件是什么? 提示：复制原点。 (3)综合图1和图2分析，构建该重组质粒时应使用的限制酶是什么? 提示：HindⅢ和BclⅠ。 【归纳总结】 基因工程操作程序中的“三、三、一” (1)目的基因的“三种获取方法” ①利用PCR技术扩增：其实质是在体外对目的基因进行大量复制。用PCR仪控制温度：变性(90 ℃以上)→复性(50 ℃左右)→延伸(72 ℃左右)； ②通过DNA合成仪用化学方法人工合成(用于核苷酸序列已知，且核苷酸数目较少的基因)； ③利用mRNA通过反转录法合成。 (2)将目的基因导入受体细胞的“三种类型” ①导入植物细胞——农杆菌转化法、花粉管通道法等； ②导入动物细胞——显微注射法(导入受精卵)； ③导入微生物细胞——Ca2＋处理法。 (3)基因工程操作的“一个核心”——基因表达载体的构建。 【真题示范】　(2024·全国甲卷)某同学采用基因工程技术在大肠杆菌中表达蛋白E。回答下列问题： (1)该同学利用PCR扩增目的基因。PCR的每次循环包括变性、复性、延伸3个阶段，其中DNA双链打开成为单链的阶段是　　　　　　，引物与模板DNA链碱基之间的化学键是　　　　。  (2)质粒载体上有限制酶a、b、c的酶切位点，限制酶的切割位点如图所示。构建重组质粒时，与用酶a单酶切相比，用酶a和酶b双酶切的优点体现在　　　　　　　　　　　　　　　　　　(答出两点即可)；使用酶c单酶切构建重组质粒时宜选用的连接酶是　　　　　　　　。  (3)将重组质粒转入大肠杆菌前，通常先将受体细胞处理成感受态，感受态细胞的特点是　　　　　　　　；若要验证转化的大肠杆菌中含有重组质粒，简要的实验思路和预期结果是　　　　　　　　　　　　　　　　。 (4)蛋白E基因中的一段DNA编码序列(与模板链互补)是GGGCCCAAGCTGAGATGA，编码从GGG开始，部分密码子见表。若第一个核苷酸G缺失，则突变后相应肽链的序列是　　　　　　　　。  氨基酸 密码子 赖氨酸 AAG 精氨酸 AGA 丝氨酸 AGC 脯氨酸 CCA CCC 亮氨酸 CUG 甘氨酸 GGC GGG 终止 UGA 分析 信息解读 (1)PCR循环 变性：高温使DNA解旋 复性：降温使引物与DNA模板链结合 延伸：在耐高温的DNA聚合酶的作用下延伸子链 (2)限制酶的 使用原则 尽量使用双酶切，使用单酶切会出现自身环化和反向连接现象 (3)导入目的基 因的方法 依据不同的受体，选择不同的导入方法 答案：(1)变性　氢键　(2)避免目的基因和质粒的反向连接、防止目的基因和质粒的自身环化　T4 DNA连接酶　(3)细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态　利用DNA分子杂交技术，将大肠杆菌的基因组DNA提取出来，在含有目的基因的DNA片段上用放射性同位素等作标记，以此作为探针，使探针与基因组DNA杂交，如果显示出杂交带，表明大肠杆菌中含有重组质粒　(4)甘氨酸—脯氨酸—丝氨酸 解析：(1)PCR的每次循环包括变性、复性、延伸3个阶段，其中DNA双链打开成为单链的阶段是变性，引物与模板DNA链碱基之间的化学键是氢键。(2)构建重组质粒时，与单一酶酶切相比，采用双酶切方法可以形成不同的黏性末端，双酶切可以避免目的基因和质粒的反向连接、防止目的基因和质粒的自身环化。酶c单酶切后形成平末端，宜用T4 DNA连接酶连接。(3)大肠杆菌细胞最常用的转化方法：首先用Ca2＋处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，这种细胞称为感受态细胞。若要验证转化的大肠杆菌中含有重组质粒，可利用DNA分子杂交技术，将大肠杆菌的基因组DNA提取出来，在含有目的基因的DNA片段上用放射性同位素等作标记，以此作为探针，使探针与基因组DNA杂交，如果显示出杂交带，表明大肠杆菌中含有重组质粒。(4)蛋白E基因中的一段DNA编码序列是GGGCCCAAGCTGAGATGA，编码链与模板链互补，模板链与mRNA互补，因此mRNA上的序列为GGGCCCAAGCUGAGAUGA，若第一个核苷酸G缺失，则mRNA上的序列变为GGCCCAAGCUGAGAUGA，肽链序列是甘氨酸—脯氨酸—丝氨酸。 PCR技术中在设计引物时，如果引物之间能配对会出现什么结果? 提示：引物之间发生碱基互补配对而失效，将无法扩增DNA分子。 考法预测 考法　借助图解和实例考查基因工程的操作程序，考查科学思维 1.(2024·全国模拟预测)干扰素是一类由单核细胞和淋巴细胞产生的细胞因子，具有广谱的抗病毒、淋巴细胞生长及分化、调节免疫等功能。下图表示利用转基因技术生产干扰素的简化流程。下列相关叙述错误的是(　　) A.过程①一般使用两种限制酶切割含有干扰素基因的DNA片段和细菌质粒 B.过程②为构建基因表达载体，需用DNA连接酶连接磷酸二酯键 C.重组质粒A上的终止子位于干扰素基因的下游，可使转录停止 D.检测干扰素基因是否转录时，应用PCR直接对产生的mRNA进行扩增和检测 答案：D 解析：图中过程①一般使用两种限制酶切割含有目的基因的DNA片段和质粒，防止目的基因和质粒自身环化，并保证两者的正确连接，A项正确；过程②为构建基因表达载体，需利用DNA连接酶将质粒和目的基因之间的磷酸二酯键连接起来，B项正确；重组质粒A上有启动子、终止子、标记基因等，其中启动子位于目的基因上游，终止子位于目的基因下游，可使转录停止，C项正确；过程③表示将目的基因导入受体细胞，检测干扰素基因是否转录，可使用PCR进行检测，即对mRNA反转录产生的cDNA进行PCR扩增，而不是直接对mRNA进行PCR扩增，D项错误。 2. (2024·湖南模拟预测)青蒿素是有效的抗疟疾药物，但野生黄花蒿中青蒿素的产量较低。为缓解青蒿素供应不足的状况，科学家将基因tms和tmr导入黄花蒿的愈伤组织，获得了黄花蒿的冠瘿组织，改造过程用到的部分结构如图所示。下列叙述错误的是(　　) A.将目的基因导入黄花蒿愈伤组织细胞常用的方法是农杆菌转化法 B.图中P位于基因的上游，作用是RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动转录 C.图中还缺少的结构是标记基因，标记基因的作用是表达出目的基因产物 D.欲检测目的基因是否导入冠瘿组织细胞的染色体DNA上，可采用PCR技术 答案： C 解析：将目的基因导入黄花蒿愈伤组织细胞常用的方法是农杆菌转化法，A项正确；图中P为启动子，位于基因的上游，作用是RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动转录，B项正确；图中还缺少的结构是标记基因，标记基因的作用是鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含目的基因的细胞筛选出来，C项错误；要检测目的基因是否导入冠瘿组织细胞的染色体DNA上，可采用PCR技术，D项正确。 (1)农杆菌特点 ①能在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有侵染能力。 ②农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T-DNA转移到被侵染的细胞中，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。 (2)农杆菌转化法中的两次拼接：第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上，第二次拼接(非人工操作)是指插入目的基因的T-DNA拼接到受体细胞的染色体DNA上。两次导入：第一次导入是将含目的基因的Ti质粒导入农杆菌，第二次导入(非人工操作)是指含目的基因的T-DNA导入受体细胞。 (3)导入的目的基因，可能存在于细胞质中，也可能整合到染色体DNA上。存在于染色体DNA上的目的基因有可能通过花粉传播进入杂草或其他作物中，造成“基因污染”。 特训点三　(探究·实践)DNA的粗提取与鉴定、DNA片段的 扩增及电泳鉴定 1.DNA的粗提取与鉴定 (1)实验原理 (2)操作流程 2.利用PCR扩增DNA片段 PCR实验的操作步骤： 3.DNA片段的电泳鉴定 (1)原理： ①电泳的原理：DNA分子具有　　　　，在一定的pH 下，这些基团可以带上　　　　　　。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷　　　　的电极移动。  ②鉴定的原理：PCR的产物一般通过　　　　　来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的　　　等有关；凝胶中的DNA分子通过　　　　，可以在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来。  (2)过程 知识必备答案：1.(1)不溶于　2 mol/L　二苯胺　(2)研磨　上清液　95%　一个方向　2 mol/L　二苯胺　5　蓝色 2.微量移液器　离心管　底部　PCR仪 3.(1)①可解离的基团　正电荷或负电荷　相反　②琼脂糖凝胶电泳　大小和构象　染色　(2)电泳　制备凝胶　凝胶载样　电泳　紫外灯 概念诊断 1.蛋白质不溶于酒精，而DNA溶于酒精。(　　) 答案：× 提示：DNA不溶于酒精，而某些蛋白质溶于酒精。 2.在常温下，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色。(　　) 答案：× 提示：在沸水浴加热的条件下，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色。 3.粗提取DNA时的过滤液沉淀过程在4 ℃冰箱中进行是为了防止DNA降解。(　　) 答案：√ 4.PCR过程中通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合利用了DNA的半保留复制原理。(　　) 答案：× 提示：PCR利用了DNA的热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。 5.利用琼脂糖凝胶电泳技术鉴定DNA时，DNA的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。(　　) 答案：√ 考法　考查DNA粗提取与鉴定实验、PCR与凝胶电泳鉴定实验，考查科学探究 1.(2024·吉林模拟预测)某兴趣小组利用洋葱进行“DNA的粗提取与鉴定”实验，实验过程中用到的材料有体积分数为95%的预冷酒精、研磨液(含表面活性剂SDS、DNA酶抑制剂EDTA、适量的NaCl)、2 mol·L-1的NaCl溶液、二苯胺试剂、蒸馏水以及其他必要实验器材。下列相关叙述错误的是(　　) A.SDS可溶解洋葱细胞的细胞膜，EDTA可减少提取过程中DNA的降解 B.将充分研磨的洋葱过滤后，在上清液中加入预冷酒精以析出DNA分子 C.将白色丝状物置于2 mol·L-1的NaCl溶液中用玻璃棒快速搅拌以去除杂质 D.DNA粗提物与二苯胺试剂经水浴加热后呈现的蓝色较深，说明提取的DNA较多 答案：C 解析：SDS具有瓦解洋葱细胞膜的作用，DNA酶抑制剂EDTA可减少提取过程中DNA的降解，A项正确；将充分研磨的洋葱过滤后，DNA溶解在上清液中，所以收集上清液加入预冷酒精，由于DNA不溶于酒精溶液，所以可以析出DNA分子，B项正确；将白色丝状物置于2 mol·L-1的NaCl溶液中，使其溶解，用玻璃棒沿着一个方向缓慢搅拌，防止DNA分子断裂，C项错误；二苯胺试剂可以鉴定DNA，根据颜色的深浅可以判断DNA的含量，所以DNA粗提物与二苯胺试剂经水浴加热后呈现的蓝色较深，说明提取的DNA较多，D项正确。 2. (2025·辽宁开学考试)甲型流感病毒(遗传物质为RNA)的抗原性及感染性与其表面的R蛋白(血凝素蛋白)密切相关，现利用基因工程的方法生产相关疫苗。图甲为构建R蛋白基因表达载体的过程图，图乙为重组质粒被相关酶切后的电泳结果图。下列相关叙述错误的是(　　) A.电泳技术可以用于人类亲子鉴定、生物间亲缘关系的鉴定 B.图甲过程中至少需要应用到逆转录酶、限制酶、DNA连接酶 C.若构建好的重组质粒长度共2 000 bp，据图乙可推测BamHⅠ在重组质粒上有4个酶切位点 D.在通过PCR技术从1个cDNA分子中特异性扩增出R蛋白基因时，为得到10个不含黏性末端等长的R蛋白基因，理论上应至少进行5次PCR循环 答案：C 解析：不同生物的DNA切割后长度不同，切割后再进行电泳，可以用于人类亲子鉴定、生物间亲缘关系的鉴定，A项正确；图甲获得重组质粒过程，至少需要应用到逆转录酶、DNA聚合酶、限制酶、DNA连接酶，B项正确；用HindⅢ将质粒2 000 bp切割后形成了200 bp、400 bp和1 400 bp 3个片段，说明HindⅢ在重组质粒上有3个酶切位点，而用HindⅢ和BamHⅠ将质粒切割后形成了200 bp、420 bp、560 bp的片段，2 000＝420×2＋560＋200×3，所以一共形成了6个片段，因此共有6个酶切位点，BamHⅠ在重组质粒上有6-3＝3个酶切位点，C项错误；通过PCR技术将cDNA分子扩增成双链DNA后，若要从中特异性扩增出完整的R蛋白基因，循环3次可获得2个不含黏性末端等长的R蛋白基因，循环4次可获得8个不含黏性末端等长的R蛋白基因，为得到10个不含黏性末端等长的R蛋白基因，理论上应至少进行5次PCR循环，D项正确。 (1)DNA的粗提取与鉴定实验中，冷却的酒精溶液(体积分数为95%)的作用有抑制核酸水解酶活性，防止DNA降解；低温有利于增加DNA分子柔韧性，减少断裂。 (2)使用鸡血做DNA的粗提取与鉴定实验时，向鸡血中加入柠檬酸钠，可防止血液凝固。 (3)DNA的粗提取与鉴定实验中，加2 mol/L的NaCl溶液的目的是溶解DNA，除掉高盐溶液中不能溶解的杂质，提纯DNA；加蒸馏水的目的是降低NaCl溶液浓度，从而降低DNA分子在NaCl溶液中的溶解度，使DNA析出，除掉溶解在低盐溶液中的杂质。 (4)DNA片段的扩增及电泳鉴定实验中，未出现扩增条带的主要原因有Taq DNA聚合酶失活、引物出现质量问题、Mg2＋浓度过低、变性时的温度低、变性时间短等。 (5)DNA片段的扩增及电泳鉴定实验中，出现非特异性扩增条带的主要原因有模板DNA出现污染、引物特异性不强或形成引物二聚体、Mg2＋浓度过高、复性时的温度过低等。 一、核心概念——重落实 1.(选择性必修3 P71)DNA聚合酶只能将　　　　　　加到已有的核苷酸片段的末端，形成磷酸二酯键。DNA连接酶是连接　　　　　　的末端，形成磷酸二酯键。  提示：单个核苷酸　两个DNA片段 2.(选择性必修3 P72)实践中常用某些病毒载体作为基因工程工具，除具备普通“质粒载体”的条件外，还应具有的条件是　　　　　　　　　　　　　。 提示：对靶细胞具有较高的转化效率，在宿主细胞中不会引起免疫排斥反应 3.(选择性必修3 P78)目前在PCR反应中使用Taq DNA聚合酶而不使用大肠杆菌DNA聚合酶的主要原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。  提示：Taq DNA聚合酶热稳定性高，而大肠杆菌DNA聚合酶在高温下会失活 4.(选择性必修3 P80)为了便于扩增的DNA片段与表达载体连接，需在引物的5'端加上限制性酶切位点，且常在两条引物上设计加入不同的限制性酶切位点，主要目的是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。 提示：使DNA片段能定向插入表达载体，减少自连 5.(选择性必修3 P81)若用家蚕作为某基因表达载体的受体细胞，在噬菌体和昆虫病毒两种载体中，不选用噬菌体作为载体，其原因是　　　　　　　　　　。 提示：噬菌体的宿主细胞是细菌，而不是家蚕 二、真题体验——明考向 1.(2024·安徽卷)下列关于“DNA粗提取与鉴定”实验的叙述，错误的是(　　) A.实验中如果将研磨液更换为蒸馏水，DNA提取的效率会降低 B.利用DNA和蛋白质在酒精中的溶解度差异，可初步分离DNA C.DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同，该原理可用于纯化DNA粗提物 D.将溶解的DNA粗提物与二苯胺试剂反应，可检测溶液中是否含有蛋白质杂质 答案：D 解析：研磨液有利于DNA的溶解，换为蒸馏水，DNA提取的效率会降低，A项正确；DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精，可分离DNA，B项正确；DNA在NaCl溶液中的溶解度随着NaCl浓度的变化而改变，因此可用不同浓度的NaCl溶液对DNA进行粗提取，C项正确；在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺试剂会被染成蓝色，二苯胺试剂用于鉴定DNA，D项错误。 2.(2024·吉林卷)关于采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物的实验，下列叙述正确的是(　　) A.琼脂糖凝胶浓度的选择需考虑待分离DNA片段的大小 B.凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示DNA分子的具体位置 C.在同一电场作用下，DNA片段越长，向负极迁移速率越快 D.琼脂糖凝胶中的DNA分子可在紫光灯下被检测出来 答案：A 解析：琼脂糖凝胶的浓度会影响DNA分子在凝胶中的迁移率和分辨率，琼脂糖凝胶的浓度通常是根据所需分离的DNA片段大小来选择的。对于较大的DNA片段，比如基因组DNA或质粒DNA，通常选择较低浓度的琼脂糖凝胶，因为它们需要更大的孔径来有效迁移；而对于较小的DNA片段，比如PCR产物或酶切片段，则需要选择较高浓度的琼脂糖凝胶，以提供更好的分辨率和分离效果，A项正确。凝胶载样缓冲液指示剂通常是一种颜色较深的染料，可以作为电泳进度的指示剂，当指示剂前沿迁移接近凝胶边缘(溴酚蓝到凝胶2/3处)时(可看蓝色条带)，则停止电泳，B项错误。DNA片段的迁移速率与其大小成反比，即DNA片段越长，迁移速率越慢，C项错误。琼脂糖凝胶中的DNA分子需染色后，才可在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来，而不是紫光灯，D项错误。 3.(2024·重庆卷)大豆是重要的粮油作物，提高大豆产量是我国农业领域的重要任务。我国研究人员发现，基因S在大豆品种DN(种子较大)中的表达量高于品种TL(种子较小)，然后克隆了该基因(两品种中基因S序列无差异)及其上游的启动子序列，并开展相关研究。 (1)基因S启动子的基本组成单位是　　　　　　　。  (2)通过基因工程方法，将DN克隆的“启动子D＋基因S”序列导入无基因S的优质大豆品种YZ。根据题图所示信息(不考虑未标明序列)判断构建重组表达载体时，为保证目标序列的完整性，不宜使用的限制酶是　　　　；此外，不宜同时选用酶SpeⅠ和XbaⅠ，原因是　　　　　　　　　　　　。  (3)为验证“启动子D＋基因S”是否连接在表达载体上，可用限制酶对重组表达载体酶切后进行电泳。电泳时，对照样品除指示分子大小的标准参照物外，还应有　　　　　　　　　　　　　。经验证的重组表达载体需转入农杆菌，检测转入是否成功的技术是　　　　　　　　　　。  (4)用检测后的农杆菌转化品种YZ所得再生植株YZ-1的种子变大。同时将从TL克隆的“启动子T＋基因S”序列成功导入YZ，所得再生植株YZ-2的种子也变大，但小于YZ-1。综合分析，大豆品种DN较TL种子大的原因是　　　　　　　　　　　　。  答案：(1)脱氧核糖核苷酸(脱氧核苷酸)　(2)EcoRⅠ　酶切后形成的片段黏性末端相同，易自我环化；不能保证目的基因片段与载体定向连接　(3)酶切后的空载体片段，“启动子D＋基因S”片段　PCR　(4)品种DN的基因S上游启动子效应比TL的强，使得基因S表达量更高，种子更大 解析：(1)启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，用于启动DNA的转录，是一段DNA片段，其基本组成单位是四种脱氧核糖核苷酸。(2)根据图示信息可知，“启动子D＋基因S”的DNA序列上存在EcoRⅠ的识别序列，若使用限制酶EcoRⅠ，会使目的基因序列被破坏。根据图中限制酶的识别序列可知，酶SpeⅠ和XbaⅠ切割产生的黏性末端相同，若用这两种限制酶切割，形成的DNA片段在构建基因表达载体时，容易出现自我环化，以及无法保证目的基因片段与载体片段定向连接，影响目的基因在受体细胞中的表达。(3)DNA电泳可以分离不同大小的DNA片段，用限制酶对重组表达载体酶切后的产物不仅有“启动子D＋基因S”片段，还有酶切后的空载体片段，因此电泳时，对照样品除指示分子大小的标准参照物外，还应有酶切后的空载体片段和“启动子D＋基因S”片段。在分子水平上检测目的基因是否转入成功，可通过PCR等技术检测受体细胞的DNA上是否插入目的基因或目的基因是否转录出mRNA。(4)根据题干信息可知，再生植株YZ-1导入的目的基因为取自品种DN的“启动子D＋基因S”序列，再生植株YZ-2导入的目的基因为取自品种TL的“启动子T＋基因S”序列，结合题干信息“两品种中基因S序列无差异”可推测：品种DN的基因S上游的启动子D的效应强于品种TL的启动子T，启动子D使基因S表达量更高，因而种子更大。 A组(对点特训) 对点1　基因工程的基本工具 1.下列关于基因工程所需基本工具酶的叙述，错误的是(　　) A.不同限制酶切割后产生的DNA片段可能被某种DNA连接酶连接 B.T4 DNA连接酶可以催化磷酸二酯键形成进而连接黏性末端或平末端 C.大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成，并且只在DNA其中一条链的特定部位切割 D.原核细胞内的限制酶可切割入侵的DNA分子，通常不切割细菌自身的DNA分子 答案：C 解析：不同限制酶切割后产生的DNA片段，若具有相同的末端，则可被某种DNA连接酶连接，A项正确；T4 DNA连接酶既可以连接双链DNA片段互补的黏性末端，也可以连接双链DNA片段的平末端，B项正确；限制酶能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成，并且使DNA每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂，C项错误；原核生物内的限制酶可切割入侵的DNA分子而保护自身，一般不切割自身的DNA分子，D项正确。 对点2　基因工程的基本操作程序 2.(2024·湖北一模)研究人员将外源鲫鱼Mx基因(该基因产物能抵抗粘液病毒)与质粒相连接构建基因表达载体，利用显微注射的方法将其导入草鱼体内，获得转基因抗病草鱼。下列叙述正确的是(　　) A.获得抗粘液病毒草鱼方法的原理是基因重组 B.重组载体的受体细胞一般是已分化的体细胞 C.转录Mx基因需要解旋酶和DNA连接酶 D.构建重组载体的质粒一般是天然质粒 答案：A 解析：将外源鲫鱼Mx基因与质粒相连接构建基因表达载体，再导入草鱼体内，这属于基因工程，其原理是基因重组，A项正确；重组载体的受体细胞一般是受精卵，因为受精卵具有全能性，更容易发育成完整的个体，而不是已分化的体细胞，B项错误；转录Mx基因需要RNA聚合酶，RNA聚合酶具有解旋的作用，DNA连接酶用于连接DNA片段，C项错误；构建重组载体的质粒一般不是天然质粒，而是经过人工改造的质粒，以满足基因工程的需求，D项错误。 3.(2024·安徽三模)科研人员将寒带地区海鱼中的抗冻基因转入千禧果细胞中，成功培育出抗冻千禧果。下图为培育过程中使用的Ti质粒示意图，其中Vir区的基因活化能促进T-DNA的加工和转移。下列叙述正确的是(　　) A.构建基因表达载体时，最好选择限制酶Ⅱ和Ⅲ来切割质粒 B.利用PCR扩增抗冻基因，需提前检测抗冻基因的全部碱基序列 C.Vir区的基因活化促进抗冻基因整合到千禧果细胞的染色体DNA上 D.利用含卡那霉素的培养基可筛选出成功导入抗冻基因的千禧果细胞 答案：C 解析：使用限制酶Ⅱ会破坏Vir区的基因，Vir区的基因活化能促进T-DNA的加工和转移，是T-DNA转移整合到受体细胞DNA上必不可少的，不能选限制酶Ⅱ，A项错误；使用PCR技术扩增抗冻基因，只需要知道抗冻基因两端碱基序列设计引物即可，B项错误；农杆菌侵染植物细胞后，Ti质粒上的T-DNA能转移到被侵染的细胞并整合到该细胞的染色体DNA上，所以Vir区基因活化可促进抗冻基因整合到千禧果细胞的染色体DNA上，C项正确；为筛选成功导入抗冻基因的千禧果细胞，最好在培养基中添加四环素，可以筛选出成功导入抗冻基因的千禧果细胞，D项错误。 对点3　DNA的粗提取与鉴定、DNA片段的扩增及电泳鉴定 4.(2024·河北衡水模拟)现用新鲜的加入抗凝剂的鸡血来进行DNA的粗提取和鉴定实验，其过程如图所示。下列说法错误的是(　　) A.在实验材料的选择上，鸡血细胞比菜花细胞更容易吸水涨破 B.图①和图③中均用到了搅拌，但搅拌的力度和速度均不同 C.图③利用DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精的原理粗提取 D.图④甲试管中加入的是清水和二苯胺试剂，沸水浴后不会出现颜色变化 答案：D 解析：动物细胞没有细胞壁，因此鸡血细胞相对于菜花细胞更容易吸水涨破，A项正确；图①搅拌的目的是加速吸水后的细胞破碎，因此力度和速度较大，图③搅拌的目的是使析出的DNA缠绕在玻璃棒上，搅拌时力度小、速度缓，B项正确；DNA不溶于酒精，细胞中的某些蛋白质可以溶于酒精，利用这一原理可以将蛋白质和DNA进一步分离，C项正确；图④甲试管中加入的是2 mol/L NaCl溶液和二苯胺试剂，沸水浴后不会出现颜色变化，D项错误。 5.流感病毒是一类单链RNA病毒，临床上可以通过RT-PCR技术进行病毒定量检测。其原理是先利用病毒RNA逆转录出互补DNA，再利用PCR技术扩增相应的DNA片段，根据检测结果判断被检测者是否感染。下列叙述错误的是(　　) A.PCR所用的试剂盒通常应含有解旋酶、Taq DNA聚合酶、四种脱氧核苷酸等 B.PCR所用的引物能与模板的3'端进行碱基互补配对 C.PCR过程每次循环分为3步，其中温度最低的一步是复性 D.PCR过程所需缓冲液中一般需要添加Mg2＋用于激活DNA聚合酶 答案：A 解析：RT-PCR过程需要逆转录酶和耐高温的DNA聚合酶，DNA解旋过程不需要解旋酶参与，反应过程中高温即可解旋，A项错误。PCR所用的引物能与模板的3'端进行碱基互补配对，B项正确。PCR过程每次循环分为3步：变性→复性→延伸，其中温度最低的一步是复性，C项正确。真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2＋激活，因此PCR过程所需缓冲液中一般需要添加 Mg2＋，D项正确。 B组(综合特训) 6.(2025·安徽开学考试)干扰素能干扰病毒复制，在临床上被广泛用于治疗病毒感染性疾病。传统生产干扰素的方法是从人血液中的白细胞内提取，每300 L血液只能提取1 mg干扰素，产量极低。科学家将干扰素基因转入大肠杆菌细胞中获得工程菌，再通过工程菌发酵制取干扰素，从而使产量明显提升。请据图回答下列问题： (1)用图1所示的质粒和图2所示的干扰素基因构建基因表达载体。经测序，干扰素基因的两端没有限制酶识别序列，需通过PCR技术添加。根据图3所示的相关限制酶的识别序列和切割位点，PCR时应选取的引物对及在每种引物5'端添加的序列为引物　　　　，添加序列　　　　　　；引物　　　　，添加序列　　　　　　　　。  (2)将目的基因转入不抗四环素和氨苄青霉素的大肠杆菌时，常用CaCl2溶液来处理大肠杆菌，使其处于一种　　　　　　　　　　　　，这种方法称为感受态细胞法。  (3)没有携带目的基因的质粒称为空载质粒，携带了目的基因的称为重组质粒。利用四环素筛选出的大肠杆菌中不一定含目的基因，原因是　　　　　　　　　　　　　　　。应该筛选　　　　　　　　　　　　　　的大肠杆菌，这种大肠杆菌中只转入了重组质粒。  答案：(1)甲　5'—TGATCA—3'　丁　5'—AAGCTT—3'(甲与丁位置可互换，但序列要对应)　(2)能吸收周围环境中DNA分子的生理状态　(3)只转入空载质粒的大肠杆菌也可以在含四环素的培养基上生长　在含四环素的培养基中能够生长而在含氨苄青霉素的培养基中不能生长 解析：(1)构建基因表达载体时，需要用限制酶和DNA连接酶，质粒上有四环素抗性基因和氨苄青霉素抗性基因，若用BamHⅠ酶切割，则两个抗性基因都将被破坏，故应用BclⅠ和HindⅢ两种限制酶切割，PCR扩增时引物应与模板的3'端结合，故应选择引物甲与引物丁以扩增目的基因，结合图中两种酶的酶切序列可知，PCR时应选取的引物对及在每种引物5'端添加的序列为引物甲5'—TGATCA—3'、引物丁5'—AAGCTT—3'。(2)将目的基因导入大肠杆菌(微生物细胞)时常用CaCl2溶液来处理大肠杆菌，使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，这种方法称为感受态细胞法。(3)质粒含有两种抗性基因，只转入空载质粒的大肠杆菌也可以在含四环素的培养基上生长，故利用四环素筛选出的大肠杆菌中不一定含目的基因；而重组质粒破坏了氨苄青霉素抗性基因，故在含四环素的培养基中能够生长而在含氨苄青霉素的培养基中不能生长，可利用该特点进行筛选。 7.(2025·江西赣州开学考试)将天然Ti质粒改造成含有Vir基因的辅助质粒(作用为辅助T-DNA转移)和不含有Vir基因、含有T-DNA的穿梭质粒，共同转入农杆菌，可提高转化效率。细菌和棉花对密码子偏好不同，为提高翻译效率，增强棉花抗病虫害能力，进行如下操作。回答下列问题： (1)从苏云金杆菌提取DNA时，需加入蛋白酶，其作用是　　　　　　。提取过程中加入体积分数为95%的预冷酒精，其目的是　　　　　　　　。  (2)本操作中获取目的基因的方法是　　　　　　。  (3)穿梭质粒中p35s为启动子，其作用是　　　　　　　　，驱动目的基因转录；插入两个p35s启动子，其目的可能是　　　　　　　　。  (4)根据图中穿梭质粒上的KanR和HygBR两个标记基因的位置，用　　　　(填“卡那霉素”或“潮霉素B”)初步筛选转化的棉花愈伤组织。  (5)为检测棉花植株是否导入目的基因，提取棉花植株染色体DNA作为模板，进行PCR，应选用的引物是　　　　和　　　　。  答案：(1)水解蛋白质，使得DNA与蛋白质分离　溶解(某些)蛋白质等物质，析出不溶于酒精的DNA　(2)PCR扩增和人工合成　(3)RNA聚合酶识别并结合的部位　提高(改造抗虫蛋白的)翻译效率　(4)潮霉素B　(5)F3　R2 解析：(1)从苏云金杆菌提取DNA时，需加入蛋白酶，其作用是水解蛋白质，使得DNA与蛋白质分离。提取过程中加入体积分数为95%的预冷酒精，其目的是溶解(某些)蛋白质等物质，析出不溶于酒精的DNA，该过程依据DNA不溶于酒精的原理实现。(2)基因工程的第一步是获取目的基因，结合题图可以看出，本操作中获取目的基因的方法是人工合成和PCR技术扩增。(3)穿梭质粒中p35s为启动子，启动子是RNA聚合酶识别并结合的部位，驱动目的基因转录；图中插入两个p35s启动子，其目的是保证目的基因的转录，提高(改造抗虫蛋白的)翻译效率。(4)结合基因表达载体的示意图可知，图中穿梭质粒上有KanR和HygBR两个标记基因的位置，HygBR位于T-DNA上，用HygBR基因对应的抗生素，即潮霉素B初步筛选转化的棉花愈伤组织。标记基因的作用是鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的受体细胞筛选出来。(5)为检测棉花植株是否导入目的基因，拼接重组的DNA片段是由人工合成的1~1 362基因序列和1 363~1 848基因序列组成的，引物应在目的基因的两端，因此提取棉花植株染色体DNA作为模板，进行PCR，应选用的引物是F3和R2。 1.PCR技术 (1)原理与条件 (2)PCR技术的过程 (3)PCR扩增过程中的循环图示与规律 (4)PCR中的数量关系 复制次数 1 2 3 n DNA分子数 2 4 8 2n 含其中一种引物的DNA分子数量 1 3 7 2n-1 同时含两种引物的DNA分子数量 0 2 6 2n-2 共消耗引物的DNA分子数量 2 6 14 2n＋1-2 2.PCR定点突变技术——重叠延伸PCR (1)图解 (2)四种引物 引物2和3的突起处代表与模板链不能互补的突变位点，而这两条引物有部分碱基(包括突变位点)是可以互补的。 (3)流程 ①分别利用引物1和2，引物3和4进行PCR后，得到的DNA片段可以通过引物2和3互补的碱基杂交在一起。 ②再在DNA聚合酶的作用下延伸，就能成为一条完整的DNA片段。 ③用引物1和4进行扩增得到含有突变位点的DNA片段。 ④通过测序可以检验定点突变是否成功。 【名师点睛】　①为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。 ②在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换，避免试剂的污染。 ③电泳时，DNA的相对分子量越大，迁移速率越慢；DNA的相对分子量越小，迁移速率越快。 【典型例题】　(2025·四川成都开学考试)利用PCR原理可以制备荧光标记的DNA探针。在加入了4种脱氧核苷酸(dCTP、dTTP、dGTP和碱基被荧光标记的dATP)的反应管①~④中，分别再加入如表所示的物质和单链DNA。已知形成的双链DNA区遵循碱基互补配对原则，且在本实验的温度条件下不能产生小于9个连续碱基对的双链DNA区，能得到带有荧光标记的DNA探针的反应管是(　　) 反应管 加入的物质 加入的单链DNA ① Taq DNA聚合酶、扩增缓冲液、H2O 5'—GCCGATCTTTATA—3'； 3'—GACCGGCTAGAAA—5' ② Taq DNA聚合酶、扩增缓冲液、H2O 5'—AGAGCCAATTGGC—3' ③ DNA酶、扩增缓冲液、H2O 5'—ATTTCCCGATCCG—3'； 3'—AGGGCTAGGCATA—5' ④ Taq DNA聚合酶、扩增缓冲液、H2O 5'—TTCACTGGCCAGT—3' A.① B.② C.③ D.④ 答案：D 解析：向反应管①中加入适量单链DNA，反应管①中两条单链DNA分子之间具有互补的序列，但双链DNA区之外的3'端无模板，因此无法进行DNA合成，不能得到带有荧光标记的DNA探针，A项不符合题意。向反应管②中加入适量单链DNA，反应管②中单链DNA分子内具有自身互补的序列，在本实验的温度条件下不能产生小于9个连续碱基对的双链DNA区；两条②中单链可以形成双链DNA区，由于DNA新合成的序列中不含碱基A，不能得到带有荧光标记的DNA探针，B项不符合题意。向反应管③中加入适量单链DNA，反应管③中两条单链DNA分子之间具有互补的序列，且双链DNA区之外的3'端有模板和碱基T，因此进行DNA合成能得到带有荧光标记的DNA探针，但未加入DNA聚合酶，因此不能得到带有荧光标记的DNA探针，C项不符合题意。向反应管④中加入适量单链DNA，反应管④中单链DNA分子内具有自身互补的序列，一条单链DNA分子不发生自身环化，两条链可以形成双链DNA区，且双链DNA区之外的3'端有模板和碱基T，因此进行DNA合成能得到带有荧光标记的DNA探针，D项符合题意。 1.(2025·安徽开学考试)某物质能使DNA中的G变为烷基化鸟嘌呤(mG)，mG不与C配对而与T配对。用某物质使某DNA分子中所有G成为mG后，置于PCR仪中让其在没有该物质干扰的情况下复制。下列相关叙述正确的是(　　) A.DNA分子中相邻碱基之间都有两个脱氧核糖 B.PCR过程所设计的引物对中不存在碱基C C.PCR过程需要用耐高温的DNA聚合酶提供能量 D.经复制形成的DNA所有单链中T含量均上升 答案：B 解析：DNA分子中两条链上相邻碱基通过氢键相连，一条链中相邻碱基之间通过“—脱氧核糖—磷酸—脱氧核糖—”相连，有两个脱氧核糖，A项错误；因为G烷基化为mG后只能和T配对，所以该PCR过程所用引物中不存在碱基C，B项正确；PCR中所用的耐高温的DNA聚合酶无法为反应提供能量，而是起催化作用，C项错误；DNA复制方式为半保留复制，最初的模板链中T含量不变，D项错误。 2.(2024·全国模拟预测)荧光定量PCR技术是在常规PCR的基础上，加入与模板DNA某条链互补的荧光探针(一类两端经过特殊基团修饰的单链DNA片段)，当子链延伸至探针处时DNA聚合酶会水解掉探针一端并促使荧光分子产生，使荧光监测系统接收到荧光信号，即DNA每扩增一次，就有一个荧光分子生成，原理如图所示。下列有关叙述正确的是(　　) A.1个双链DNA分子经过3轮循环一共会生成8个荧光分子 B.1个双链DNA分子经过5轮循环一共需要消耗15对引物 C.该反应循环5次，消耗引物31个 D.若某次PCR反应共产生52个等长DNA，则需加入6个荧光探针 答案：D 解析：荧光探针只能跟模板DNA的某条链互补配对，DNA分子每扩增一次，就有一个荧光分子生成，3轮循环后得到8个DNA分子，即扩增形成了7个新DNA分子，一共会生成1＋2＋4＝7个荧光分子，A项错误；1个双链DNA分子经过5轮循环一共会形成32个DNA分子，即形成64条链，其中62条链都是新合成的，一共需要消耗31对引物，B、C两项错误；若某次PCR反应共产生52个等长DNA，说明至少扩增了6次，DNA每扩增一次，就有一个荧光分子生成，就需要一个荧光探针，因此需加入6个荧光探针，D项正确。 3.(2025·湖南开学考试)利用PCR技术检测转基因植株是否成功导入目的基因时，得到以下电泳图谱。其中1号为DNA标准样液(Marker)，10号为蒸馏水，进行PCR时加入的模板DNA如图所示。以下据此作出的分析，不合理的是(　　) A.PCR产物的分子大小在250~500 bp B.9号样品对应植株不是所需的转基因植株 C.10号确定反应体系等对结果没有干扰 D.3号样品为不含目的基因的载体DNA 答案：D 解析：PCR过程中，可以通过设计特定的引物来扩增特定的DNA片段。4~9号是转基因植株DNA，理论上都应包含目的基因，结合2号野生型植株DNA和10号蒸馏水组的结果，推测PCR产物的大小应为250~500 bp，A项合理；9号PCR结果不包含250~500 bp片段，所以不是所需的转基因植株，B项合理；10号为蒸馏水，可排除反应体系等对结果的干扰，C项合理；3号PCR结果包含250~500 bp片段，应包含目的基因，D项不合理。 4.(2024·湖南永州高三期中)利用PCR技术将某小段DNA分子扩增n代，需(　　) A.测定DNA片段两端的核苷酸序列，以便设计引物对 B.2n-1对引物参与子代DNA分子的合成 C.向反应体系中加入解旋酶、DNA聚合酶等 D.保持反应体系温度恒定，确保扩增的正常进行 答案：A 解析：利用PCR技术扩增DNA时需要引物的参与，因此需要测定DNA分子两端的核苷酸序列，以便设计引物对，A项符合题意；依据题意，将某小段DNA分子扩增n代，子代DNA分子总数为2n，其中除两条最初的模板链不含引物外，其他的链均含有引物，因此需要2n-1对引物参与子代DNA分子的合成，B项不符合题意；PCR技术中双链DNA解开不需要解旋酶，且PCR扩增DNA分子是在较高温度下进行的，因此需要耐高温的DNA聚合酶，C项不符合题意；PCR扩增的过程为高温变性、低温复性、中温延伸，可见整个过程中并不需要保持恒温，D项不符合题意。 5.(2024·河北衡水模拟预测)科学家在人类的基因中发现36种病毒基因的片段，并提取相关基因片段进行扩增及电泳鉴定。下列叙述正确的是(　　) A.用PCR仪进行扩增时，扩增缓冲液中一般要添加Ca2＋ B.基因片段扩增过程中，脱氧核苷酸会依次加到引物的5'端 C.电泳时，在凝胶中基因片段的迁移速率与DNA分子的构象无关 D.将基因片段与凝胶载样缓冲液的混合液加入凝胶加样孔时，要留一个加样孔加标准参照物 答案：D 解析：用PCR仪进行扩增时，扩增缓冲液中一般要添加Mg2＋，A项错误；基因片段扩增过程中，脱氧核苷酸会依次加到引物的3'端，B项错误；电泳时，在凝胶中基因片段的迁移速率与DNA分子的大小、构象都有关，C项错误；将基因片段与凝胶载样缓冲液的混合液加入凝胶加样孔时，要留一个加样孔加指示分子大小的标准参照物，D项正确。 6.(2024·浙江宁波高三期末)图中阴影部分表示DNA片段中的某目的基因序列，现利用PCR技术对该目的基因进行扩增，其中Ⅰ~Ⅳ表示引物结合位置。下列叙述正确的是(　　) A.两种引物与模板链结合的位置分别对应图中的Ⅰ和Ⅳ B.该反应除模板、引物外，还需要原料和耐高温的DNA酶 C.初始的1个目的基因经历3轮PCR循环需要消耗16个引物 D.复性阶段若温度偏低，可能导致产物中非目的基因片段增加 答案：D 解析：引物需要与模板的3'端结合，两种引物与模板链结合的位置分别对应图中的Ⅱ和Ⅲ，A项错误；该反应除模板、引物外，还需要原料和耐高温的DNA聚合酶，而非DNA酶，B项错误；初始的1个目的基因经历3轮PCR循环得到23＝8个DNA分子，共16条链，由于模板的两条链中不含引物，共需要16-2＝14个引物，C项错误；复性目的是使两种引物通过碱基互补配对与两条DNA单链结合，故复性阶段若温度偏低，可能导致产物中非目的基因片段增加，D项正确。 7. (2024·山西朔州模拟预测)下图是目的基因结构示意图及几种限制酶的酶切位点图，下列叙述错误的是(　　) A.图中的限制酶能断开DNA每条链中特定部位的磷酸二酯键 B.目的基因的筛选与获取是基因工程的基本操作程序之一 C.用图中目的基因和质粒构建重组质粒时，不能用SmaⅠ进行切割 D.若用PCR技术扩增该基因，必须加入解旋酶和耐高温的DNA聚合酶 答案：D 解析：限制酶的作用部位是DNA每条链中特定部位的磷酸二酯键，A项正确；目的基因的筛选与获取是基因工程的基本操作程序之一，B项正确；SmaⅠ的酶切位点在编码区，会破坏目的基因，所以不能用SmaⅠ切割目的基因，C项正确；若用PCR技术扩增该基因，需要加入耐高温的DNA聚合酶，不需要加入解旋酶，D项错误。 8.(2024·湖南长沙模拟预测)猪大肠杆菌会引起仔猪发生肠炎、肠毒血症等疾病。LTB和ST1是猪源大肠杆菌肠毒素基因。研究人员通过重组PCR技术构建了LTB-ST1融合基因，其表达产物LTB-ST1融合蛋白可有效预防仔猪黄痢，该融合基因构建过程如图1所示。请回答下列问题： 图1 (1)重组PCR技术依据的生物学原理是　　　　　。  (2)PCR1和PCR2是在两个不同反应体系中进行的，两个反应体系中加入的物质中不同的是　　　　。PCR1和PCR2的目的是　　　　　　　　　　　　　　　　　　，从而有利于LTB基因和ST1基因融合。  (3)在②过程中，PCR1和PCR2产物的作用是作为　　　　　　　　　　　　。 (4)引物的作用是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。  (5)定点突变是指使基因特定位点发生碱基对的增添、缺失或者替换。重组PCR技术不仅可用于构建融合基因，还可用于基因定点突变。请结合图2，说明利用重组PCR技术进行基因内部定点突变的方法：　　　　　　　　　　　。  图2 答案：(1)DNA的半保留复制　(2)模板、引物　扩增出末端部分碱基序列互补配对的LTB和ST1单链　(3)模板、引物　(4)使耐高温的DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸　(5)根据突变位点的碱基序列设计引物b和引物c，进行重组PCR 解析：(1)PCR是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。(2)PCR1和PCR2是在两个不同反应体系中进行的，扩增的是两个不同的基因，所以加入的模板不同，引物也不同；由图可知，PCR1和PCR2的目的是扩增出末端部分碱基序列互补配对的LTB和ST1单链，以便将两个基因单链根据碱基互补配对接到一起，再以剩下的单链部分互为模板扩增出LTB-ST1融合基因。(3)PCR1和PCR2的产物是末端部分碱基序列互补配对的LTB和ST1单链，以便将两个基因连接到一起，所以PCR1和PCR2产物碱基互补序列可起到引物的作用，剩余未互补序列可作为PCR扩增的模板。(4)耐高温的DNA聚合酶不能从头开始将脱氧核苷酸聚合为核苷酸单链，只能在已有的核酸片段的3'端开始延伸，因此引物的作用是使耐高温的DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸。(5)利用重组PCR技术进行基因定点突变，可以把突变位点设计在引物上，从而加到新合成的DNA上，所以可以根据突变位点的碱基序列设计引物b和引物c，进行重组PCR。 9.(2024·山东模拟预测)我国科研人员成功从某种癌细胞中筛选出标志性蛋白质T。研究中同时发现TP、P2、P4和AD四种蛋白质在细胞癌变过程中也存在一定作用，为研究上述四种蛋白与T蛋白之间的相互作用，科研人员进行了一系列实验。请回答下列有关问题： (1)研究人员提取该种癌细胞的总mRNA，以　　　　为原料在　　　　酶的催化下获得总cDNA。  (2)通过PCR技术从总cDNA中扩增出T蛋白基因。经4轮扩增，产物中等长的T蛋白基因片段的数量是　　　　个，需要消耗引物　　　　个。为了将T蛋白基因准确连接到图1的质粒载体上，在扩增T蛋白基因时需要在引物的　　　　(填“5'”或“3'”)端添加　　　　　　　限制酶的识别序列，质粒中抗生素抗性基因的作用是　　　　　　　　　　　　　。  (3)免疫共沉淀技术是在体外研究蛋白质之间相互作用的一种技术，其原理是抗体A可与蛋白质A特异性结合，将抗体A与磁珠偶联，磁珠可以使抗体A与蛋白A沉淀下来，若蛋白B与蛋白A相互作用，那么蛋白B也会被一起沉淀下来，可以通过对沉淀物中的蛋白质进行检测最终确定蛋白质之间的相互作用关系。研究人员将T蛋白高表达的癌细胞裂解后，利用抗T蛋白的抗体偶联磁珠，对裂解液中的TP、P2、P4和AD四种蛋白质进行免疫共沉淀，结果如图2所示。该结果表明与T蛋白相互作用的蛋白质是　　　　　　　　　　。  答案：(1)脱氧核苷酸　逆(反)转录　(2)8　30　5'　XhoⅠ和HindⅢ　便于重组DNA分子的筛选　(3)TP和P4 解析：(1)研究人员提取mRNA，然后以mRNA为模板，在逆(反)转录酶的作用下合成cDNA。(2)PCR过程中第一、二轮循环合成的子链长度均不同，根据半保留复制特点可知，前两轮循环产生的四个DNA分子的两条链均不等长，第三轮循环产生的DNA分子存在等长的两条核苷酸链。由于第三轮出现两个等长的DNA，经过第四次复制产生4个等长的DNA，另外有4个DNA通过第四次复制也会分别得到一个等长的DNA，即总共8个。PCR技术的原理是DNA半保留复制，使DNA以指数形式增加，复制n次后，产生的DNA总数为2n，扩增过程中，需要引物与DNA单链结合，再进行链的延伸，所以产生的子代DNA链中都有引物，因此PCR过程中需要消耗引物-2个，复制4次，需要引物30个。引物的设计在5'，选择限制酶时应当保证目的基因插入位点在启动子和终止子之间，并保证目的基因的正确连接，应当在XhoⅠ、HindⅢ、NdeⅠ中选择两种，由于NdeⅠ在质粒上还有一个酶切位点，因此不能选择NdeⅠ，应当选择XhoⅠ和HindⅢ这两种限制酶。抗性基因为质粒上的标记基因，作用为便于重组DNA分子的筛选。(3)结合免疫共沉淀技术的原理及表中结果可知，TP和P4是与T蛋白相互作用的蛋白质。 第47讲　基因工程的应用、蛋白质工程和生物技术的安全性与伦理问题 课标要求 1.举例说明基因工程在农牧、食品及医药等行业的广泛应用改善了人类的生活品质 2.举例说明依据人类需要对原蛋白质结构进行基因改造、生产目标蛋白的过程 3.举例说出日常生活中的转基因产品，探讨转基因技术在应用过程中带来的影响 4.举例说出生殖性克隆人面临的伦理问题，分析说明我国为什么不赞成、不允许、不支持、不接受任何生殖性克隆人实验 5.举例说明历史上生物武器对人类造成了严重的威胁与危害，认同我国反对生物武器及其技术和设备的扩散 关键词索引 转基因作物　基因工程药物　乳腺生物反应器 基因工程菌　蛋白质工程　转基因产品　生殖性克隆人　设计试管婴儿　生物武器 特训点一　基因工程的应用与蛋白质工程 1.基因工程的应用 (1)农牧业方面 (2)医药卫生领域 (3)食品工业方面 2.蛋白质工程 知识必备答案：1.(1)抗虫功能的基因　抗病基因　降解或抵抗　蛋白质编码基因　花青素代谢相关的　外源生长激素　乳糖酶基因　乳汁　(2)基因改造　显微注射 抗原决定基因　克隆　免疫排斥　(3)工程菌　凝乳酶的基因　基因工程菌 2.改造　合成　新的蛋白质　功能　蛋白质结构　氨基酸序列　脱氧核苷酸序列 概念诊断 1.基因工程技术已被广泛用于改良动植物品质、提高作物和畜产品的产量等方面。(　　) 答案：√ 2.利用乳腺生物反应器生产人的血清白蛋白之前，需先将人的血清白蛋白基因导入乳腺细胞。(　　) 答案：× 提示：动物细胞作为受体细胞时，需将目的基因导入受精卵中。 3.由大肠杆菌工程菌获得人的干扰素后可直接应用。(　　) 答案：× 提示：大肠杆菌为原核细胞，无内质网和高尔基体，不能对由大肠杆菌工程菌获得的干扰素前体进行加工。 4.蛋白质工程是在分子水平上对蛋白质分子直接进行操作，可合成自然界没有的蛋白质。(　　) 答案：× 提示：蛋白质工程是在分子水平上对基因进行操作。 5.蛋白质工程是一项难度很大的工程，主要是因为人们对蛋白质复杂的高级结构没有完全认识。(　　) 答案：√ 探究点　蛋白质工程的应用 【情境引领】　水蛭是我国的传统中药材，其主要药理成分水蛭素为水蛭蛋白中重要成分之一，水蛭素具有良好的抗凝血作用。科研人员拟通过蛋白质工程改造水蛭素结构，提高其抗凝血活性。 【问题生成】 (1)图中的物质a和b分别表示什么? 提示：a表示氨基酸序列(多肽链)，b表示mRNA。 (2)在生产过程中，物质b可能不同，合成的蛋白质空间构象却相同，原因是什么? 提示：密码子的简并，即不同的密码子可能编码相同的氨基酸。 (3)改造后的水蛭素与原先的水蛭素存在的本质区别是什么? 提示：蛋白质的结构决定功能，两者功能不同的原因是氨基酸种类变化导致结构的差异，而蛋白质的结构不同，本质上是因为DNA不同。 【归纳总结】 蛋白质工程与基因工程的比较 项目 蛋白质工程 基因工程 实质 定向改造或生产人类所需蛋白质 定向改造生物的遗传特性，以获得人类所需的生物类型或生物产品(基因的异体表达) 结果 获得所需要的蛋白质 原则上只能生产自然界中已有的蛋白质 联系 蛋白质工程是在基因工程的基础上延伸出来的第二代基因工程，因为对现有蛋白质的改造或制造新的蛋白质，必须通过基因改造或基因合成实现 【真题示范】　(2024·江西卷改编)γ-氨基丁酸在医药等领域有重要的应用价值。利用L-谷氨酸脱羧酶(GadB)催化L-谷氨酸脱羧是高效生产γ-氨基丁酸的重要途径之一。研究人员采用如图方法将酿酒酵母S的L-谷氨酸脱羧酶基因(gadB)导入生产菌株E.coliA，构建了以L-谷氨酸钠为底物高效生产γ-氨基丁酸的菌株E.coliB。下列叙述正确的是(　　) A.可采用农杆菌转化法将重组质粒导入E.coliB B.E.coliB发酵生产γ-氨基丁酸时，L-谷氨酸钠的作用是供能 C.E.coliA和E.coliB都能高效降解γ-氨基丁酸 D.可通过抗原—抗体杂交技术来检测gadB基因是否在E.coliB中成功表达 解答本题关键是对图形的破解： 图像分析 信息转化 NcoⅠ和KpnⅠ双酶切 避免目的基因与质粒的反向连接及自身环化 大肠杆菌作为受体菌 基因工程菌繁殖快，产量高 答案：D 解析：农杆菌转化法是将目的基因导入植物细胞的方法，A项错误；题意显示，用L-谷氨酸脱羧酶(GadB)催化L-谷氨酸脱羧是高效生产γ-氨基丁酸的重要途径之一，E.coliB中能表达L-谷氨酸脱羧酶(GadB)，因此可用E.coliB发酵生产γ-氨基丁酸，该过程中L-谷氨酸钠的作用不是供能，B项错误；E.coliA中没有L-谷氨酸脱羧酶(GadB)，因而不能降解L-谷氨酸，而E.coliB中含有该酶的基因，因而能高效降解γ-氨基丁酸，C项错误。 在将重组质粒导入大肠杆菌前，需对其进行何种处理? 提示：需将大肠杆菌置于一定浓度的CaCl2溶液中，增强其对外源DNA的吸收能力。 考法预测 考法1　结合具体实例考查基因工程的应用，考查社会责任 1.(2024·江西南昌三模)流感病毒极易突变，故流感疫苗需根据流行毒株不断更新。为研发广谱且高效的流感疫苗，科研人员尝试将不同流感毒株共有的某种抗原蛋白片段展示在T4噬菌体衣壳表面。下列叙述错误的是(　　) A.可用灭活或减毒的流感病毒制成流感疫苗，诱导机体产生相应抗体 B.抗原呈递细胞能摄取和加工处理病毒抗原，并呈递给辅助性T细胞 C.广谱型流感疫苗是利用流感病毒容易改变的抗原蛋白诱发免疫反应 D.若使T4噬菌体表面携带抗原蛋白，需将目的基因整合到T4噬菌体基因组中 答案：C 解析：灭活或减毒的流感病毒可作为抗原，诱导机体发生特异性免疫，主要是体液免疫，产生相应抗体和记忆细胞，从而对特定传染病具有抵抗力，A项正确；抗原呈递细胞包括B细胞、树突状细胞和巨噬细胞，它们都能摄取和加工处理抗原，并且可以将抗原信息暴露在细胞表面，然后将处理后的抗原呈递给辅助性T细胞，B项正确；广谱型流感疫苗是利用流感病毒不容易改变的抗原蛋白诱发免疫反应，这样即使病毒突变，疫苗依然有用，C项错误；特定的基因表达特定的蛋白质，若使T4噬菌体表面携带抗原蛋白，T4噬菌体本身没有相关的基因，需采用基因工程手段将目的基因整合到其基因组中才能达到目的，D项正确。 2. (2024·山东济南模拟预测)W是一种具有特定功能的人体蛋白质。某研究小组拟仿照制备乳腺生物反应器的研究思路，制备一种膀胱生物反应器来获得W，基本过程如图所示。下列叙述错误的是(　　) A.步骤①是基因工程的核心步骤，需要使用的工具酶有限制性内切核酸酶、DNA连接酶和载体 B.与乳腺生物反应器相比，用膀胱生物反应器生产W所选的启动子不同 C.从上述流程可知，制备生物反应器涉及胚胎工程中的主要技术有体外受精、胚胎移植等 D.鉴定W蛋白基因是否成功表达可以检测转基因动物的尿液是否存在W蛋白 答案：A 解析：步骤①是基因表达载体的构建，是基因工程的核心步骤，需要使用的工具酶有限制性内切核酸酶和DNA连接酶，载体不是工具酶，A项错误；乳腺生物反应器是将W蛋白在乳腺中表达，应选用乳腺中特异性表达的基因的启动子，而膀胱生物反应器是将W蛋白在膀胱上皮细胞中表达，应选用膀胱上皮细胞中特异性表达的基因的启动子，B项正确；结合题图可知，制备生物反应器涉及胚胎工程中的主要技术有体外受精、早期胚胎培养、胚胎移植，C项正确；若W蛋白基因表达成功，说明膀胱生物反应器制备成功，就可以从转基因动物的尿液中检测到W蛋白，D项正确。 乳腺生物反应器与工程菌的比较 比较内容 乳腺生物反应器 工程菌 含义 让外源基因在哺乳动物乳腺细胞中特异表达，利用动物的乳腺组织生产药物蛋白 指用基因工程的方法，使外源基因得到高效表达的微生物 基因表达 合成的药物蛋白与天然蛋白相同 细菌合成的药物蛋白可能没有活性 受体细胞 动物受精卵 微生物细胞 目的基因 导入方式 显微注射法 Ca2＋处理法 生产条件 不需要严格灭菌，温度等外界条件对其影响不大 需要严格灭菌，严格控制工程菌所需的温度、pH、营养物质浓度等外界条件 药物提取 从动物乳汁中提取 从微生物细胞或其培养液中提取 考法2　考查蛋白质工程及应用，考查生命观念与科学思维 3.(2025·四川自贡开学考试)已知生物体内有一种蛋白质(P)，该蛋白质是一种转运蛋白，由305个氨基酸组成。如果将P分子中158位的丝氨酸变成亮氨酸，240位的谷氨酰胺变成苯丙氨酸而变成蛋白P1，P1不但保留P的功能，而且具有了酶的催化活性。下列叙述错误的是(　　) A.若要改变蛋白质的功能，可以考虑对蛋白质的氨基酸序列或结构进行改造 B.以P基因序列为基础，获得P1基因的途径有改造P基因或合成P1基因 C.所获基因表达时遵循中心法则，内容包括DNA的复制以及遗传信息在不同分子之间的流动 D.蛋白质工程也被称为第二代基因工程，其基本途径与基因工程的途径相同 答案：D 解析：若要改变蛋白质的功能，可以考虑对蛋白质的氨基酸序列或结构进行改造，A项正确；蛋白质工程中获得目的基因的途径有改造原有基因或合成新基因，B项正确；中心法则包括DNA复制、转录、翻译、逆转录、RNA复制等过程，即中心法则的全部内容包括DNA的复制以及遗传信息在不同分子之间的流动，C项正确；蛋白质工程的途径与基因工程的途径相反，D项错误。 特训点二　生物技术的安全性与伦理问题 1.转基因成果 项目 成果 转基因 微生物 方面 ①减少啤酒酵母双乙酰的生成，缩短啤酒的发酵周期；②构建高产、优质的基因工程菌来生产　　　　、药物  转基因 动物 方面 ①将生长激素基因、促生长激素释放激素基因等转入动物体内，培育了一批　　　　、营养品质优良的转基因家禽、家畜；②将某些抗病毒的基因导入动物体内，培育了抵抗相应病毒的动物新品种；③建立某些人类疾病的　　　　模型  转基因 植物 方面 培育出了大批具有　　　　、抗病、抗除草剂和耐储藏等新性状的作物  2.关注生殖性克隆人 (1)生殖性克隆和治疗性克隆的概念 ①生殖性克隆是指通过　　　　　产生独立生存的新个体。  ②治疗性克隆是指利用克隆技术产生特定的细胞、组织和器官，用它们来　　　　　受损的细胞、组织和器官，从而达到治疗疾病的目的。  (2)我国禁止生殖性克隆人 我国政府一再重申四不原则：　　　　　　　、不允许、不支持、不接受任何生殖性克隆人实验。我国政府主张对治疗性克隆进行有效监控和严格审查。  3.禁止生物武器 (1)生物武器种类及特点 ①生物武器包括　　　　　、病毒类和生化毒剂类等。  ②特点：　　　　　、攻击范围广。  (2)禁止生物武器：中国在任何情况下　　　　、不生产、不储存生物武器，并反对生物武器及其技术和设备的扩散。  知识必备答案：1.氨基酸　生长迅速　转基因动物　抗虫 2.(1)①克隆技术　②修复或替代　(2)不赞成 3.(1)①致病菌类　②致病能力强　(2)不发展 概念诊断 1.若转基因植物的外源基因来源于自然界，则不会存在安全性问题。(　　) 答案：× 提示：转基因植物的外源基因来源于自然界，仍会通过各种途径传播至其他生物，存在安全性问题。 2.生殖性克隆人会面临流产、死胎和畸形儿等问题，是正常现象，不违反人类传统的伦理道德。(　　) 答案：× 提示：生殖性克隆人违反了人类传统的伦理道德。 3.生殖性克隆人破坏了人类基因多样性的天然属性，不利于人类的生存和进化。(　　) 答案：√ 4.利用体外受精、体细胞核移植等技术获得的人的囊胚可以植入人或任何动物的生殖系统。(　　) 答案：× 提示：人的囊胚只能移入人的生殖系统中。 5.生物武器相对容易获得，也便于携带和施放，不会引起公众恐慌。(　　) 答案：× 提示：生物武器危害性较大，容易引起公众恐慌。 探究点　生物技术的安全性与伦理问题 【情境引领】　治疗性克隆一般是先从需要救治的病人身上提取一个细胞，将该细胞的遗传物质置于一个去除了细胞核的卵母细胞中，经培养形成一个早期胚胎，从这个早期胚胎中即可提取胚胎干细胞，胚胎干细胞经过相应的技术处理，便可发展成遗传特性与病人完全吻合的细胞、组织或器官。下图表示人类治疗性克隆的大概过程。 【问题生成】 (1)相同的胚胎干细胞，“克隆”的结果却有的是神经细胞，有的是血细胞，有的是肌肉细胞，其根本原因是什么? 提示：基因的选择性表达。 (2)由图可知，治疗性克隆所用的主要技术有哪些? 提示：细胞核移植和胚胎干细胞培养技术。 (3)治疗性克隆能解决临床上的什么问题? 提示：治疗性克隆能解决临床上供体器官不足和免疫排斥反应的问题。 【归纳总结】 比较生殖性克隆与治疗性克隆 (1)生殖性克隆：通过克隆技术产生独立生存的新个体。 (2)治疗性克隆：利用克隆技术产生特定的细胞、组织和器官，用它们来修复或替代受损的细胞、组织和器官，从而达到治疗疾病的目的。 考法　考查生物技术的安全性与伦理问题，考查社会责任 1.(2024·宁夏吴忠期末)下列关于生物技术的叙述，正确的是(　　) A.“试管婴儿”与“设计试管婴儿”都涉及的技术有体外受精、胚胎移植等 B.生物武器是用微生物、毒素、干扰素及重组致病菌等来形成杀伤力的 C.蛋白酶的改造属于蛋白质工程，自然界中的酶都可通过蛋白质工程进行改造 D.利用转基因微生物制成的生物武器可能具有超强的传染性和致病性，人们不会对其产生免疫反应 答案：A 解析：“试管婴儿”与“设计试管婴儿”都涉及的技术有体外受精、胚胎移植等，A项正确；干扰素是一种具有抗病毒、抗肿瘤等作用的糖蛋白，不是生物武器的成分，B项错误；蛋白酶的改造属于蛋白质工程，酶的化学本质大多是蛋白质，少数是RNA，蛋白质工程只能用于改造蛋白质类酶，C项错误；新型转基因微生物对人体来说是抗原，人们可以对其产生免疫反应，D项错误。 2. (2024·河北沧州二模)生物技术是一把双刃剑，造福人类的同时也带来了安全性和伦理问题，人们必须高度重视。下列叙述错误的是(　　) A.利用核移植技术获得胚胎，从中分离出ES细胞治疗白血病不涉及伦理问题 B.若有国家把研制出的新型鼠痘病毒作为生物武器，将会威胁人类安全 C.研究转基因农作物时应采取多种方法防止转基因花粉的传播 D.干细胞的研究具有广阔的应用前景，但需要监管 答案：A 解析：从人胚胎分离出ES细胞治疗白血病，会涉及胚胎的处理问题，进而产生伦理问题，A项错误；研制出的新型鼠痘病毒，若作为生物武器，杀伤力强、传播广泛、难预防，会威胁人类安全，B项正确；研究转基因农作物时应采取多种方法防止转基因花粉的传播，防止基因污染的发生，C项正确；干细胞的研究可治疗很多疾病，但也可能会向着克隆人的方向发展，带来伦理问题，因此需要严格监管，D项正确。 比较“试管婴儿”和“设计试管婴儿” (1)“试管婴儿”和“设计试管婴儿”过程如图所示 (2)“试管婴儿”和“设计试管婴儿”的异同点 项目 “试管婴儿” “设计试管婴儿” 不同点 过程 无图中d过程 多出图中d过程 技术 手段 无须进行遗传学诊断 进行遗传学诊断 应用 主要解决不孕夫妇的生育问题 主要用于白血病、贫血症等遗传疾病的预测及治疗 相同点 二者都是先通过体外受精、体外早期胚胎培养，再进行胚胎移植的。生殖方式上，二者都为有性生殖 一、核心概念——重落实 1.(选择性必修3 P89)为提高动物的生长速度，需将外源生长激素基因导入动物体内，应该选择　　　　作为受体细胞，理由是　　　　　　　　　　　。  提示：受精卵　受精卵体积较大，操作较容易，营养物质含量丰富，也能保障发育成的个体所有细胞都含有外源生长激素基因，全能性较高 2.(选择性必修3 P90)人的胰岛素基因导入大肠杆菌后不能正确表达出胰岛素，其原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。  提示：真核细胞的基因结构不同于原核细胞，其转录出的mRNA需加工后才能作为翻译的模板，细菌中不存在内质网和高尔基体等 3.(选择性必修3 P90)乳腺生物反应器是利用转基因动物的乳汁生产药用蛋白，而膀胱生物反应器是利用转基因动物的尿液生产药用蛋白，其优点是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。  提示：不受动物的性别、生长发育时期的限制，提取简单高效 4.(选择性必修3 P94)胰岛素用于治疗糖尿病，但胰岛素注射后易在皮下堆积，需较长时间才能进入血液，进入血液后又易被分解，因此治疗效果受到影响。利用蛋白质工程制备的新的速效胰岛素则不会受到影响，其产生过程中最困难的一步是　　　　　　　　　　。  提示：设计新的胰岛素分子的空间结构 5.(选择性必修3 P102)转基因生物具有某些特殊性质，它们在某地区的竞争能力较强，可能成为“入侵物种”，原因是　　　　　　　　　　　　　　。  提示：转基因生物可能会威胁生态系统中其他生物的存在，从而影响生态系统的稳定性 6.(选择性必修3 P113)我国政府规定，在任何情况下不发展、不生产、不储存生物武器，并反对生物武器及其技术和设备的扩散，理由是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。  提示：生物武器具有强大的传染性和致病力 二、真题体验——明考向 1.(2024·浙江1月选考)关于生物技术的安全与伦理问题在我国相关法规明令禁止的是(　　) A.试管动物的培育 B.转基因食品的生产 C.治疗性克隆的研究 D.生物武器的发展和生产 答案：D 解析：试管动物的培育属于胚胎工程，没有禁止，A项不符合题意；我国目前不反对转基因食品的生产，B项不符合题意；中国政府禁止生殖性克隆，不反对治疗性克隆，C项不符合题意；生物武器致病能力强、攻击范围广，世界范围内应全面禁止生物武器，D项符合题意。 2.(2023·浙江1月选考)以哺乳动物为研究对象的生物技术已获得了长足的进步。对生物技术应用于人类，在安全与伦理方面有不同的观点，下列叙述正确的是(　　) A.试管婴儿技术应全面禁止 B.治疗性克隆不需要监控和审查 C.生殖性克隆不存在伦理道德方面的风险 D.我国不赞成、不允许、不支持、不接受任何生殖性克隆人实验 答案：D 解析：我国支持和发展试管婴儿等辅助生殖技术，A项错误；我国政府同样重视治疗性克隆所涉及的伦理问题，主张对治疗性克隆进行有效监控和严格审查，B项错误；生殖性克隆人冲击了现有的一些有关婚姻、家庭和两性关系的伦理道德观念，C项错误；我国政府一再重申四不原则：不赞成、不允许、不支持、不接受任何生殖性克隆人实验，D项正确。 3.(2022·辽宁卷)抗虫和耐除草剂玉米双抗12-5是我国自主研发的转基因品种。为给监管转基因生物安全提供依据，采用PCR方法进行目的基因监测，反应程序如图所示。下列叙述正确的是(　　) A.预变性过程可促进模板DNA边解旋边复制 B.后延伸过程可使目的基因的扩增更加充分 C.延伸过程无须引物参与即可完成半保留复制 D.转基因品种经检测含有目的基因后即可上市 答案：B 解析：预变性是使模板DNA充分变性，A项错误；后延伸是为了让引物延伸完全并让单链产物完全退火形成双链结构，可使目的基因的扩增更加充分，B项正确；延伸过程需引物参与，C项错误；转基因品种不只需要检测是否含有目的基因，还要检测是否表达，还有安全性问题，D项错误。 4.(2024·河北卷)新城疫病毒可引起家禽急性败血性传染病，我国科学家将该病毒相关基因改造为r2HN，使其在水稻胚乳特异表达，制备获得r2HN疫苗，并对其免疫效果进行了检测。回答下列问题： (1)实验所用载体的部分结构及其限制酶识别位点如图1所示。其中GtP为启动子，若使r2HN仅在水稻胚乳表达，GtP应为　　　　　　　　启动子。Nos为终止子，其作用为　　　　　　　　　。r2HN基因内部不含载体的限制酶识别位点。因此，可选择限制酶　　　　和　　　　对r2HN基因与载体进行酶切，用于表达载体的构建。  (2)利用　　　　　　　　的方法将r2HN基因导入水稻愈伤组织。为检测r2HN表达情况，可通过PCR技术检测　　　　　　　，通过　　　　　　　　技术检测是否翻译出r2HN蛋白。  (3)获得转基因植株后，通常选择单一位点插入目的基因的植株进行研究。此类植株自交一代后，r2HN纯合子植株的占比为　　　　。选择纯合子进行后续研究的原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。  (4)制备r2HN疫苗后，为研究其免疫效果，对实验组鸡进行接种，对照组注射疫苗溶剂。检测两组鸡体内抗新城疫病毒抗体水平和特异应答的细胞(细胞毒性T细胞)水平，结果如图2所示。据此分析，获得的r2HN疫苗能够成功激活鸡的　　　　免疫和　　　　免疫。  (5)利用水稻作为生物反应器生产r2HN疫苗的优点是　　　　　　　　(答出两点即可)。  答案：(1)在胚乳中特异性表达的　终止转录　HindⅢ　EcoRⅠ　(2)农杆菌转化　r2HN mRNA　抗原—抗体杂交　(3)1/4　纯合子自交后代不发生性状分离　(4)体液　细胞　(5)不受性别的限制、可大量种植、成本低、安全性高等 解析：(1)利用水稻细胞培育能表达r2HN的水稻胚乳细胞生物反应器，在胚乳中特异性表达的启动子在水稻胚乳细胞中更容易被RNA聚合酶识别和结合而驱动转录。Nos为终止子，终止子可以终止转录。r2HN基因内部不含载体的限制酶识别位点。KpnⅠ破坏了启动子序列而不能选用，SacⅠ位于终止子序列之外而不能选用，为了将目的基因插入载体的启动子和终止子之间，则需要用限制酶HindⅢ和EcoRⅠ对r2HN基因与载体进行酶切，用于表达载体的构建。(2)获得水稻愈伤组织后，通过农杆菌的侵染，目的基因进入水稻细胞并完成转化。为检测r2HN表达情况，可通过PCR技术检测转录的r2HN mRNA，可从转基因水稻中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原—抗体杂交检测是否翻译出r2HN蛋白。(3)获得转基因植株后，通常选择单一位点插入目的基因的植株进行研究。单一位点插入目的基因的植株，则相当于杂合子，杂合子自交，后代含有r2HN基因的纯合子为1/4。由于纯合子自交后代不发生性状分离，具有遗传的稳定性，所以选择纯合子进行后续研究。(4)据图可知，实验组的抗体水平和CD8＋T细胞水平都比对照组高，说明通过体液免疫产生了抗体，通过细胞免疫产生了细胞毒性T细胞，即r2HN疫苗能够成功激活鸡的体液免疫和细胞免疫。(5)利用水稻作为生物反应器生产r2HN疫苗具有不受性别的限制、可大量种植、成本低、安全性高等优点。 5.(2024·山东卷)研究发现基因L能够通过脱落酸信号途径调控大豆的逆境响应。利用基因工程技术编辑基因L，可培育耐盐碱大豆品系。在载体上的限制酶BsaⅠ切点处插入大豆基因L的向导DNA序列，将载体导入大豆细胞后，其转录产物可引导核酸酶特异性结合基因组上的目标序列并发挥作用。载体信息、目标基因L部分序列及相关结果等如图所示。 (1)用PCR技术从大豆基因组DNA中扩增目标基因L时，所用的引物越短，引物特异性越　　　　　(填“高”或“低”)。限制酶在切开DNA双链时，形成的单链突出末端为黏性末端，若用BsaⅠ酶切大豆基因组DNA，理论上可产生的黏性末端最多有　　　　种。载体信息如图甲所示，经BsaⅠ酶切后，载体上保留的黏性末端序列应为5'—　　　　—3'和5'—　　　　—3'。  (2)重组载体通过农杆菌导入大豆细胞，使用抗生素　　　　筛选到具有该抗生素抗性的植株①~④。为了鉴定基因编辑是否成功，以上述抗性植株的DNA为模板，通过PCR扩增目标基因L，部分序列信息及可选用的酶切位点如图乙所示，PCR产物完全酶切后的电泳结果如图丙所示。据图可判断选用的限制酶是　　　　，其中纯合的突变植株是　　　　(填序号)。  (3)实验中获得1株基因L成功突变的纯合植株，该植株具有抗生素抗性，检测发现其体细胞中只有1条染色体有T-DNA插入。用抗生素筛选这个植株的自交子代，其中突变位点纯合且对抗生素敏感的植株所占比例为　　　　，筛选出的敏感植株可用于后续的品种选育。  答案：(1)低　256　GTTT　CAAT　(2)卡那霉素　SacⅠ　④　(3)1/4 解析：(1)引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，用于PCR的引物长度通常为20~30个核苷酸。由此可知，在利用PCR技术从大豆基因组DNA中扩增目的基因时，所用的引物越短，则引物的特异性就越低。根据题意可知，限制酶在切开DNA双链时，形成的单链突出末端为黏性末端，若用BsaⅠ酶切大豆基因组DNA，图中给出的只是载体信息，大豆基因组无法从图中看出。只能根据理论来推测，BsaⅠ切割产生的黏性末端是NNNN，四个碱基最多可能有256种排列顺序，故答案应为256。根据图甲所示的载体信息，经BsaⅠ酶切后，载体上保留的黏性末端序列应为5'—GTTT—3'和5'—CAAT—3'。(2)根据图示信息可知，重组载体通过农杆菌导入大豆细胞当中的片段包含了卡那霉素抗性基因，因此可以通过使用卡那霉素筛选到具有该抗生素抗性的植株。根据图甲可知，目标基因L的目标序列跟突变序列之间的差异只有在SacⅠ酶切位点上存在差异，BamHⅠ和EcoRⅠ这两个酶切位点完全相同，根据图丙、题意及所展示的电泳结果可知，要以上述抗性植株的DNA为模板，通过PCR扩增目标基因L，并对PCR产物完全酶切后进行电泳从而判断植株含有的是目标序列还是突变序列，因此只能选用限制酶SacⅠ，限制酶SacⅠ在突变序列存在酶切位点，但是在目标序列没有，因此经过该酶酶切后突变序列的电泳条带会出现两条，目标序列是一条带，根据图丙结果可知，只有④为纯合突变的植株。(3)根据题意可知，在实验当中获得了一株基因L成功突变的纯合植株，已知该植株具有抗生素抗性，经过检测发现其体细胞中只有一条染色体有T-DNA插入。根据题图可知，抗生素抗性基因在T-DNA片段上，因此如果用抗生素来筛选该植株进行自交，可知其配子中含有抗生素抗性基因的比例为1/2，不含T-DNA(对抗生素敏感)的配子比例为1/2，因此突变位点纯合且对抗生素敏感的植株所占比例应该为(1/2)×(1/2)＝1/4，突变位点纯合且具有抗生素抗性的植株所占比例应该为3/4，筛选出的敏感植株可用于后续的品种选育。 A组(对点特训) 对点1　基因工程的应用 1.(2024·湖北一模)人乳铁蛋白(hLF)是乳汁中一种重要的非血红素铁结合糖蛋白，具有抑菌、抗肿瘤等多种生理功能，被认为是一种极具开发潜力的食品添加剂。某科研团队将人乳铁蛋白(hLF)基因转入山羊体内，从山羊的乳汁中获得hLF，可以解决天然乳铁蛋白资源短缺的问题。下列有关叙述错误的是(　　) A.可用PCR直接扩增乳铁蛋白的基因转录产物 B.重组载体中人乳铁蛋白基因的启动子是乳腺蛋白基因启动子 C.将目的基因导入山羊受精卵中一般应用的技术是显微注射法 D.检测人乳铁蛋白基因是否成功翻译常采用抗原—抗体杂交技术 答案：A 解析：不可以用PCR直接扩增mRNA，需将mRNA逆(反)转录成cDNA再进行扩增，A项错误；为保证在供体山羊的乳汁中提取到人乳铁蛋白，需要将人乳铁蛋白基因与山羊乳腺蛋白基因的启动子等调控元件重组在一起，B项正确；一般用显微注射法将目的基因导入山羊受精卵中，C项正确；为检测人乳铁蛋白基因是否成功翻译出蛋白质，检测方法是从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原—抗体杂交，若出现相应现象，则表明目的基因已翻译形成蛋白质，D项正确。 2.(2024·湖北武汉二模)水中E物质污染会导致鱼类雌性化异常。将绿色荧光蛋白(GFP)基因、Ga14蛋白基因等转入斑马鱼，可用于监测水体E物质，下图中ERE和UAS是两种诱导型启动子，分别被E物质—受体复合物和Ga14蛋白特异性激活，启动下游基因表达。下列叙述错误的是(　　) A.根据题意可知，斑马鱼的某些细胞存在E物质的受体 B.用ERE直接驱动GFP基因表达可提高监测的灵敏度 C.用于监测E物质污染的转基因斑马鱼最好是不育的 D.被E物质污染的河水中该转基因斑马鱼会显绿色 答案：B 解析：将绿色荧光蛋白(GFP)基因、Ga14蛋白基因等转入斑马鱼，可用于监测水体E物质，推测斑马鱼的某些细胞存在E物质的受体，A项正确；结合题图，ERE诱导Ga14基因转录，其翻译产物Ga14蛋白与UAS结合驱动GFP基因表达，可提高监测的灵敏度，这是一个间接驱动而非直接驱动的过程，B项错误；用于监测E物质污染的转基因斑马鱼最好是不育的，避免因有性生殖带来的基因污染，C项正确；E物质能与受体结合形成E物质—受体复合物，最终促进GFP蛋白的合成，D项正确。 3.(2024·江苏盐城模拟)常见的启动子可分为三类：组成型启动子，驱动基因在所有细胞、组织和器官中持续表达；组织特异型启动子，调控基因只在某些特定的部位中表达；诱导型启动子，通常在光、盐等信号作用下，调节目的基因的转录水平。下列相关叙述错误的是(　　) A.细胞分化与组织特异型启动子的调控和组成型启动子均有关 B.乳腺生物反应器的构建需要将目的基因连接在诱导型启动子的下游 C.真核生物细胞中，一般一个启动子只能启动一个基因的转录 D.强启动子可使基因高水平表达，启动子的强弱与RNA聚合酶的亲和性有关 答案：B 解析：根据题干信息“组成型启动子，驱动基因在所有细胞、组织和器官中持续表达”，所以细胞分化与组成型启动子有关；组织特异型启动子，调控基因只在某些特定的部位中表达，所以细胞分化与组织特异型启动子的调控也有关，A项正确。组织特异型启动子，调控基因只在某些特定的部位中表达，而乳腺生物反应器需要将目的基因连接在组织特异型启动子的下游，导入细胞中，保证基因在乳腺细胞中表达，B项错误。一般情况下，真核生物细胞中，一个启动子只能启动一个基因的转录，C项正确。强启动子可使基因高水平表达，启动子的强弱与RNA聚合酶的亲和性有关，从而启动基因的转录，D项正确。 对点2　蛋白质工程 4.(2024·河南洛阳期末)苏云金芽孢杆菌中的杀虫晶体蛋白Cry存在杀虫谱窄、毒力有限等问题，制约了其在农业生产中的进一步应用。科学家通过定点突变，将Cry蛋白第168位的组氨酸替换为精氨酸后，Cry蛋白对烟草天蛾的毒性提高了3倍；将Cry蛋白第282位、第283位的丙氨酸和亮氨酸分别替换成甘氨酸和丝氨酸后，Cry蛋白对舞毒蛾的毒性提高了7倍。下列相关叙述错误的是(　　) A.对Cry蛋白的改造是通过改造编码Cry蛋白的基因来实现的 B.与基因工程相比，蛋白质工程的实现也需要构建基因表达载体 C.蛋白质工程难度较大，主要是蛋白质发挥功能所依赖的高级结构十分复杂 D.如果将第168、282、283位的氨基酸全部替换，Cry蛋白对舞毒蛾的毒性将增加21倍 答案：D 解析：蛋白质的改造需要从根本上改造基因，因此对Cry蛋白的改造是通过改造编码Cry蛋白的基因来实现的，A项正确；需要将改造的基因导入受体细胞并表达相关产物，就需要构建基因表达载体，因此与基因工程相比，蛋白质工程的实现也需要构建基因表达载体，B项正确；蛋白质工程难度较大，主要是蛋白质发挥功能所依赖的高级结构十分复杂，C项正确；如果将第168、282、283位的氨基酸全部替换，Cry蛋白可能会失去原有的功能，D项错误。 5.(2024·福建龙岩期末)T4溶菌酶耐热性差，若将该酶的第3位氨基酸进行改造，将第3位异亮氨酸变为半胱氨酸(如图所示)，并使第3位氨基酸和第97位氨基酸之间形成1个二硫键，可以大大提高其耐热性。下列叙述错误的是(　　) A.根据设计的T4溶菌酶的氨基酸序列可推测出多种脱氧核苷酸序列 B.T4溶菌酶耐热性提高的原因是其氨基酸的种类和数量均发生改变 C.改造T4溶菌酶可利用基因定点突变技术，对相关基因进行改造 D.改造后的T4溶菌酶需要进行功能鉴定才能应用于生产实践 答案：B 解析：由于一种氨基酸可能对应多种密码子，因此根据设计的T4溶菌酶的氨基酸序列可能推测出多种脱氧核苷酸序列，A项正确；根据题意可知，经改造后T4溶菌酶的第3位异亮氨酸变为半胱氨酸，即T4溶菌酶耐热性提高的原因是组成该酶的氨基酸种类和排列顺序发生了改变，且在第3位氨基酸和第97位氨基酸之间形成了1个二硫键，而氨基酸的数量没变，B项错误；根据题意，改造T4溶菌酶可以从合成蛋白质的基因进行改造，因此可利用基因定点突变技术，对相关基因进行改造，C项正确；该实例将蛋白质进行了改造，属于蛋白质工程的范畴，T4溶菌酶的化学本质为蛋白质，可利用抗原—抗体特异性结合的特点对该酶进行检测，D项正确。 对点3　生物技术的安全性与伦理问题 6.(2024·浙江模拟预测)转基因产品的安全性一直是人们关注的焦点。下列哪项是对待转基因技术的理性态度(　　) A.转基因农作物对于解决粮食、能源等问题起了积极作用，同时也存在一定风险 B.转基因技术是按照人们的意愿对生物进行的设计，不存在负面影响 C.大量引入国外转基因作物与本地近缘作物品种杂交 D.转基因技术如果被恐怖分子利用将可能导致人类灭绝，应停止转基因研究 答案：A 解析：转基因农作物对于解决粮食、能源等问题起了积极作用，同时也存在一定风险，A项符合题意；转基因技术存在一定的负面影响，B项不符合题意；大量引入国外转基因作物与本地近缘作物品种杂交，容易造成基因污染，是不理性的表现，C项不符合题意；转基因技术有其优点和缺点，应趋利避害，而不是停止转基因研究，D项不符合题意。 B组(综合特训) 7.(2024·河南模拟)草甘膦是一种广谱、非选择性的系统性除草剂，其通过抑制植物中EPSPS酶的活性，使植物细胞内某些氨基酸不能合成，从而达到除草的目的。为提高小麦对草甘膦的耐受性，科学家将细菌的EPSPS基因转入小麦叶绿体中，得到抗草甘膦转基因小麦。下列相关叙述错误的是(　　) A.将EPSPS基因导入小麦的叶绿体可避免基因污染 B.可将EPSPS基因导入小麦体细胞或受精卵中 C.可通过喷洒草甘膦来检验转基因小麦是否培育成功 D.转基因小麦中EPSPS酶参与合成的氨基酸数量下降 答案：D 解析：将目的基因整合到受体细胞的叶绿体基因组中能防止基因污染，因为叶绿体基因组不会进入花粉，A项正确；将目的基因导入植物细胞时，受体细胞既可以是体细胞，也可以是受精卵，B项正确；转基因小麦如果培育成功，则会产生EPSPS酶，能抵抗草甘膦，因此可以通过喷洒草甘膦来检验转基因小麦是否培育成功，C项正确；转基因小麦中导入了EPSPS基因，细胞内EPSPS酶数量增加，促进了相关氨基酸的合成，D项错误。 8.(2024·河北沧州三模)人体内的t-PA蛋白能高效降解血栓，是心梗和脑血栓的急救药。然而，为心梗患者注射大剂量的t-PA蛋白会诱发颅内出血。研究证实，将t-PA第84位的半胱氨酸换成丝氨酸，能显著降低出血副作用。据此，先对天然的t-PA基因进行序列改造，然后再采取传统的基因工程方法表达该突变基因，可制造出性能优异的t-PA突变蛋白。下图是通过重叠延伸PCR技术获取t-PA改良基因和利用质粒pCLY11构建含t-PA改良基因的重组质粒示意图(图中重叠延伸PCR过程中引物a、b用来扩增突变位点的上游DNA序列，引物c、d用来扩增突变位点的下游DNA序列)。请回答下列问题： (1)科学家将t-PA第84位的半胱氨酸换成丝氨酸，生产出性能优良的t-PA突变蛋白的生物技术手段属于　　　　　　　　范畴。该工程的基础是　　　　　　　　。  (2)获得性能优良的t-PA突变蛋白的正确顺序是　　　　　　　　(选择正确编号并排序)。  ①t-PA蛋白功能分析和结构设计　②借助定点突变改造t-PA基因序列　③检验t-PA蛋白的结构和功能　④设计t-PA蛋白氨基酸序列和基因序列　⑤利用工程菌发酵合成t-PA蛋白 (3)已知t-PA蛋白第84位是半胱氨酸，相应的基因模板链(图中t-PA基因的上链)上的碱基序列是ACA，丝氨酸的密码子是UCU。重叠延伸PCR示意图中的黑点便是突变部位的碱基，引物b中该突变位点的碱基是　　　　，引物c中该突变位点的碱基是　　　　。  (4)据图可知，PCR3时需要的引物是　　　　，引物的作用是　　　　　　　　　　　　　　　。若扩增图中序列时引物选择正确，PCR操作过程没有问题，但对产物进行电泳时，发现除目标序列外还有很多非特异性条带，请分析出现此情况的原因：　　　　　　　　　　　。 (5)若获得的t-PA改良基因如图所示，那么质粒pCLY11需用限制酶　　　　切开，才能与t-PA改良基因高效连接。  答案：(1)蛋白质工程　基因工程　(2)①④②⑤③　(3)G(鸟嘌呤)　C(胞嘧啶)　(4)引物a和引物d　使DNA聚合酶从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸　退火(复性)温度过低、引物特异性不高　(5)XmaⅠ、BglⅡ 解析：(1)由题干信息可知，上述生产改良t-PA蛋白的技术是先对天然的t-PA基因进行序列改造，然后在大肠杆菌中表达改造后的基因，可得到性能优异的改良t-PA蛋白，因此属于蛋白质工程。该工程的基础是基因工程。(2)蛋白质工程的一般过程是根据新蛋白质预期功能设计相关蛋白质结构→设计对应的氨基酸序列→合成可产生新蛋白质的相关脱氧核苷酸序列→利用基因工程技术合成新的蛋白质。获得性能优良的t-PA突变蛋白的正确顺序是①t-PA蛋白功能分析和结构设计→④设计t-PA蛋白氨基酸序列和基因序列→②借助定点突变改造t-PA基因序列→⑤利用工程菌发酵合成t-PA蛋白→③检验t-PA蛋白的结构和功能。(3)已知t-PA蛋白第84位是半胱氨酸，相应的基因模板链(图中t-PA基因的上链)上的碱基序列是ACA，则半胱氨酸的密码子为UGU，而丝氨酸的密码子是UCU，由此可知，若要将t-PA蛋白第84位的半胱氨酸换成丝氨酸，则t-PA基因上链第84位发生碱基替换为ACA→AGA，图中显示引物b与t-PA基因的下链互补，故其中相应部位的碱基与上链相同，即该部位的碱基是G，引物c与t-PA基因的上链互补，故其中相应部位的碱基与下链相同，即该部位的碱基是C。(4)由于DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能从3'端延伸DNA链，因此PCR中需要加入合适的引物来完成子链的延伸，引物需要与模板的3'端结合，故据图可知，重叠延伸时，需要的引物是引物a和引物d。DNA聚合酶不能从头合成DNA，只能从引物的3'端开始延伸DNA链，因此引物的作用是使DNA聚合酶从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸。出现非目的序列产物的原因：引物设计太短(或引物特异性不高，即与非目的序列有同源性)、两引物之间碱基互补配对(形成引物二聚体)、复性温度过低、Mg2＋浓度过高、DNA模板出现污染等。(5)根据图中目的基因两端的黏性末端以及各种限制酶的切割位点可知，在构建重组质粒时，选用限制酶XmaⅠ和BglⅡ切割质粒，才能与目的基因t-PA改良基因高效连接。 学科网（北京）股份有限公司 $