3.2 基因工程的基本操作程序（第3课时）课件-2024-2025学年高二下学期生物人教版选择性必修3

第3章 基因工程 我国是棉花的生产和消费大国。棉花在种植过程中，常常会受到一些害虫的侵袭，其中以棉铃虫最为常见。棉铃虫可以使棉花产量减少三分之一，严重时，甚至能使一片棉田绝收。大量施用农药杀虫不仅会提高生产成本，还可能造成农产品和环境的污染。要是能培育出自身就能抵抗虫害的棉花新品种，这一问题就会迎刃而解，我国拥有自主知识产权的转基因抗虫棉就是在这样的背景下产生的。为什么传统的杂交育种方法培育不出抗虫棉，基因工程却可以呢？基因工程是如何进行操作的？它给我们的生产和生活带来了怎样的影响？ 第2节 基因工程的基本操作程序 （第3课时） 02 针对人类生产或生活中的某一需求，选取适当的基因工程的技术和方法，尝试设计获得某一转基因产品的方案。 尝试进行PCR的基本操作并用电泳鉴定PCR的产物。 阐明基因工程的原理和基本操作程序。 目标 01 03 学习目标 3 目的基因的筛选与获取 基因表达载体的构建 将目的基因导入受体细胞 第一步 第二步 第三步 第四步 目的基因的检测与鉴定 前提 核心 关键 保证 利用PCR 获取和扩增 启动子、 目的基因、 终止子、 标记基因 农杆菌转化法(植物)、 显微注射法(动物) 、 Ca2+处理法 (微生物); 分子检测：是否插入、转录、翻译 个体水平：是否具有抗性及抗性的程度等。 温故知新：基因工程的基本程序 4 DNA片段的扩增及电泳鉴定 一、实验原理 1、PCR体外扩增DNA的原理： ① PCR利用了DNA的热变性原理， 通过调节温度来控制DNA双链 的解聚与结合，PCR仪实质上 就是一台能够自动调控温度 的仪器。 ② PCR扩增DNA片段还利用了DNA半保留复制的原理；一次PCR一般要 经历30次循环 探究·实践 ① DNA分子具有可解离的基团，在一定的PH下，这些基团可以带上正电荷或负 电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动， 这个过程就是电泳。 ③ 凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来。 ② 在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构像等有关。 琼脂糖凝胶电泳 DNA分子电泳 DNA片段的扩增及电泳鉴定 一、实验原理 2、DNA片段电泳鉴定原理： 探究·实践 片段短，迁移速率快 片段长，迁移速率慢 在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关 ① 凝胶的浓度越大， 迁移速率越慢 ② DNA分子越大， 迁移速率越慢 ③ DNA分子构像有 环状、链状等。 怎么知道这些DNA片段的大小呢？ DNA片段电泳鉴定原理： PCR仪 微量离心管 电泳装置 微量移液器 自动控温，实现DNA的扩增 实际上是进行PCR反应的场所 用于向微量离心管转移PCR配方中的液体 包括电泳仪、电泳槽等 DNA片段的扩增及电泳鉴定 二、材料用具 1、仪器： 探究·实践 （1）无菌水、琼脂糖； （2）电泳缓冲液； （3）凝胶载样缓冲液（内含指示剂——溴酚蓝）； （4）核酸染料。 （5）PCR反应体系的配方 材料 用量 10倍浓缩的扩增缓冲液（含Mg2+） 5μL 20mmol/L的4种脱氧核苷酸的等量混合液（实为dNTP） 1μL 20μmol/L的引物Ⅰ 2.5μL 20μmol/L的引物Ⅱ 2.5μL H2O 28～33μL 1-5U/μL的Taq DNA聚合酶（即耐高温的DNA聚合酶） 1～2U 模板DNA （用量为1pg-1μg） 5～10μL DNA片段的扩增及电泳鉴定 二、材料用具 2、试剂： 探究·实践 DNA片段的扩增及电泳鉴定 循环程序 变性 复性 延伸 可根据目的片段长度适当调整延伸时间 用微量移液器按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书，在微量 离心管中依次加入各组分 ① 移液: 待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子，将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在离心管的底部（提高反应速率） ② 离心: 参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。 ③ 扩增: 三、实验步骤： 1、DNA片段的扩增 探究·实践 预变性 94℃,5min 30次 94℃,30s 55℃,30s 72℃,1min 最后一次 94℃,1min 55℃,30s 72℃,10min / / 使DNA充分变性，以利于引物更好地和模板结合。 DNA片段的扩增 配制琼脂糖溶液 根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量分数为0.8%～1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀 制备凝胶 将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。待凝胶溶液完全凝固后，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜 加样 将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物 电泳 接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳 观察记录 取出凝胶置于紫外灯下观察和照相 2、DNA片段的电泳鉴定： DNA片段的扩增及电泳鉴定 三、实验步骤： 探究·实践 DNA片段的电泳鉴定： DNA片段的电泳鉴定： 05 1、为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水 等在使用前必须进行高压灭菌处理。 3、该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在-20℃ 储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。 5、在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都 必须更换。 2、在进行操作时，一定要戴好一次性手套。 4、PCR扩增不能随意加大试剂用量。 DNA片段的扩增及电泳鉴定 四、注意事项： 探究·实践 1、你是否成功扩增出DNA片段？判断的依据是什么？ 可以在紫外灯下直接观察到DNA条带的分布及粗细程度来评价扩增的结果。 如果扩增不成功，可能的原因有：漏加了PCR的反应成分，各反应成分的用量不当，PCR程序设置不当等。 如果扩增结果不止一条条带，可能的原因有：引物设计不合理，它们与非目的序列有同源性或容易形成二聚体；复性温度过低；DNA聚合酶的质量不好等。 2、你进行电泳鉴定的结果是几条条带？如果不止一条条带，请分析 产生这个结果的可能原因。 DNA片段的扩增及电泳鉴定 五、结果分析与评价 探究·实践 1.下列有关电泳的叙述，不正确的是（ ） A.电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程 B.待测样品中DNA分子的大小和构象、凝胶的浓度等都会影响DNA 在电泳中的迁移速率 C.进行电泳时，带电分子会向着与其所带电荷相同的电极移动 D.PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定 巩固训练 C 2.用PCR方法检测转基因植株是否成功导入目的基因时，得到以下电泳 图谱，其中1号为DNA标准样液(Marker)，10号为蒸馏水，PCR时加入 的模板DNA如图所示。据此作出的分析，不合理的是（ ） A.PCR产物的分子大小在250～500 bp之间 B.3号样品为不含目的基因的载体DNA C.9号样品对应植株不是所需的转基因植株 D.10号确定反应体系等对结果没有干扰 巩固训练 B 3.为优化目的基因(700 bp)的PCR条件，研究者设计不同的复性温度 进行实验，产物的琼脂糖凝胶电泳结果如下图。据图分析，下列 表述错误的是（ ） A.对照组可用无菌蒸馏水代替模板， 其他成分相同 B.电泳条带的宽度、亮度与扩增 产物大小呈正相关 C.复性温度的高低会影响PCR扩增产物的纯度 D.58 ℃是本实验中扩增该基因的最佳复性温度 巩固训练 B 4．PCR技术可用于遗传多样性的研究。下图是对两个跳虫（A和B）DNA 分析的实验过程，有关叙述错误的是（　　） A.蛋白酶可以分解组织中的蛋白质，在提取DNA时加入蛋白酶有助于释放出DNA B.Taq DNA聚合酶能够耐高温，高温下不会变性，常在PCR中用于DNA链的解旋 C.将已知长度的DNA片段装到凝胶上作参照，可用于估测样本DNA片段的大小 D.阴性对照是未加DNA模板但加入PCR扩增过程所需的混合物，以监测试剂是否污染 巩固训练 B 谢谢聆听! 同学们辛苦啦！ 22 Lavf58.29.100 Bilibili VXCode Swarm Transcoder v0.7.6 Lavf58.29.100 Bilibili VXCode Swarm Transcoder v0.7.28 Multimedia Cloud Transcode (cloud.baidu.com) Lavf58.51.100 Lavf58.51.100 $