2026届高三一轮复习生物：基因工程的基本操作程序之目的基因的筛选和获取课件

第3章 基因工程 第2节 基因工程的基本操作程序 —目的基因的筛选和获取（复习课） 猪是生物医学研究的重要模型。 中科奥格生物科技通过敲除介导免疫排斥的关键基因（如GGTA1、β4GalNT2、Neu5Gc），并插入人源基因（CD46、CD55、TBM），成功培育出适用于人体移植的基因编辑猪肝脏。 这项研究成果引起了各界的关注。 【大情境】 （1）从相关的已知结构和功能清晰的基因中筛选； （2）利用序列数据库筛选； （3）利用序列比对工具筛选。 （1）基因文库 （2）人工合成 （3）PCR扩增（常用） 【回忆】基因工程的基本操作程序 【小情境1】 研究人员介绍，在获得基因编辑猪肝脏的过程中，第一步就是目的基因的筛选和获取。他们采用最常用的体外PCR扩增获取了目的基因—CD46基因。 目的基因的筛选和获取—PCR技术 考向1 PCR过程： 学生活动一：完成学历案上的例1。 例1.研究人员在扩增CD46基因的PCR反应中加入了两种引物，两种引物及其与模板链的结合位置如下图1所示；图2是他们PCR的部分产物。下列有关此PCR过程的说法错误的是（　　） D A．PCR过程包括高温变性-低温复性-升温延伸三个环节 B．PCR的复性温度主要取决于引物的GC含量和长度 C．PCR第三轮复制得到8个DNA分子，其中有2个等长的，也就是有2个CD46基因 D. PCR循环4次需要的引物总数量为32个 CD46基因 目的基因的筛选和获取—PCR技术 第一轮循环 第二轮循环 第三轮循环 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 非目的基因序列 目的基因序列 引物 第一轮循环 DNA数= 2=21 引物数= 2=2*21-2 DNA数= 4=22 引物数= 6=2*22-2 第二轮循环 第三轮循环 DNA数= 8=23 引物数= 1个DNA分子，（PCR扩增）n次循环后，形成的DNA数为2n，需要引物数为2×2n-2。 2*23-2 （方法一 数学模型） 方法二 物理模型 【归纳总结1】 1.PCR的原理：__________________（高频考点）。 2.经过n次扩增循环后，DNA数为 ，需要引物数量为 。（也可构建物理模型解题） 3.第____轮循环可以得到完整的目的基因（引物结合在DNA分子内部时）（易错点）。 2n 2n+1-2或2(2n-1) DNA的半保留复制 三 目的基因的筛选和获取—PCR技术 考向1 PCR过程： 目的基因的筛选和获取—PCR技术 考向2 引物的选择和设计： 【小情境2】 研究人员介绍，为了精准扩增CD46基因，他们在PCR之前进行了引物的选择和设计。 学生活动二：完成学历案上的例2及【归纳总结2】。 例2．下面是他们两次实验的介绍，请完成相关填空： （1）第1次PCR时选择的引物位置示意图如下。请推导引物1与____链、引物2与 链 （填α或β）形成碱基互补配对关系。 β α 1.引物结合位点始终是模板链的3’端。 引物的作用： 为DNA聚合酶提供结合位点（引物的3’端）。 CD46基因 【归纳总结2】 目的基因的筛选和获取—PCR技术 考向2 引物的选择和设计： 引物摆放的位置不一定是它的结合位置，需要通过方向来判断。 （2）第2次选择了自行设计引物。研究人员设计的两组引物部分序列如下，经过电泳鉴定发现PCR失败。请写出两组引物设计不合理的原因： 第1组： ； 第2组： 。 引物Ⅰ和引物Ⅱ局部发生碱基互补配对而失效 引物Ⅰ’自身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效 5’ 5’ 5’ 5’ 3’ 3’ 3’ 3’ 2.一般PCR引物设计的要求： （2）引物长度一般为20-30bp（教材P77）： 过短（<18 bp）的引物特异性低， 过长（>30 bp）可能增加非特异性结合风险。 （1）引物要与模板链3’端碱基序列互补配对（教材P77）； （3）引物内部、引物之间的碱基不能互补。(解题所得) （否则影响与模板的结合效率） 【归纳总结2】 目的基因的筛选和获取—PCR技术 考向2 引物的选择和设计： （3）电泳结果显示，加入CD46基因扩增产物的泳道出现了非特异性条带，为了减少非特异性条带的产生，以下措施有效的是_____。 D 引物与复性温度高低的关系： 1.引物中G+C含量较高，复性时温度就较高。 2.如果复性温度太低，引物会与非目的基因片段结合，从而导致非特异性DNA片段的扩增。 A.增加模板DNA的量 B.延长热变性的时间 C.延长延伸的时间 D.提高复性的温度 目的基因的筛选和获取—PCR技术 考向2 引物的选择和设计： 1 设计增加酶切位点 目的基因的筛选和获取—PCR技术 考向3 PCR的典型应用： 【小情境3】 研究人员介绍，获得的CD46基因，需将其正确插入到质粒中才能构建表达载体。但之前设计的引物B和引物C都失败了。于是他们对引物进行了改造。 学生活动三：完成学历案上的例3及【规律总结1】。 例3．CD46基因的序列和拟插入的质粒结构图如下。请写出改造后的引物B’和C’的碱基序列，使CD46基因顺利插入该质粒当中。 （转录方向） CD46基因: 5’CATGTCCA----------------------------------CCACAACC3’ 3’GTACAGGT----------------------------------GGTGTTGG5’ 限制酶 EcoRⅠ BamHⅠ 识别序列 5’-G↓AATTC- 3’ 5’-G↓GATCC- 3’ (引物B：5’CATGTCCA3’; 引物C：5’GGTTGTGG3’) 引物B’： ； 引物C’： 。 目的基因的筛选和获取—PCR技术 考向3 PCR的典型应用： 引物B’： ； 引物C’： 。 考向3 PCR的典型应用： CD46: 5’CATGTCCA--------------------------------------------------CCACAACC3’ 3’GTACAGGT--------------------------------------------------GGTGTTGG5’ B’ C’ CATGTCCA3’ 3’GGTGTTGG (转录方向) EcoR Ⅰ BamH Ⅰ 5’ —GGATCCCATGTCCA—3’ 5’— GAATTCGGTTGTGG—3’ 5’ 5’ 引物C 引物B 1 设计增加酶切位点 目的基因的筛选和获取—PCR技术 16 【规律总结1】 添加酶切位点的引物序列（ 5’- 3’） = （5’- 3’）限制酶切序列+ 该DNA互补链序列 考向3 PCR的典型应用： 1 设计增加酶切位点 目的基因的筛选和获取—PCR技术 考向3 PCR的典型应用： 2 构建融合基因 目的基因的筛选和获取—PCR技术 【小情境4】 研究人员介绍，在研究过程中他们发现，单一的在猪细胞内插入CD46基因不足以完全解决异种移植排斥，需结合其他基因（如THBD）才能实现更优免疫耐受。于是科研小组在分别扩增得到CD46基因和THBD基因片段后，采用重叠延伸PCR技术构建了CD46—THBD融合基因。 学生活动四：完成学历案上的例4及【规律总结2】。 例4.研究人员构建融合基因的过程如图所示，请根据所学知识分析回答下列问题： (1)设计引物时，引物P1与引物P2的碱基序列 （填“能”或“不能”）互补。从引物P2和引物P3的角度分析，CD46基因的PCR过程与THBD基因的PCR过程不能在同一个反应体系中同时进行，原因是 。 不能 引物P2和引物P3之间能结合，会干扰引物和模板链的结合，影响PCR过程 考向3 PCR的典型应用： 2 构建融合基因 目的基因的筛选和获取—PCR技术 例4.研究人员构建融合基因的过程如图所示，请根据所学知识分析回答下列问题： (2)为了得到图中①②或③④的PCR产物，CD46基因与THBD基因的PCR过程至少分别需要进行_____次循环；从①②③④中，各选一条链两两结合有_____种可能；请在图中的小方框内标出能扩增出融合基因的杂交链的方向。 （3）获得CD46-THBD融合基因后，若要大量扩增该序列，可选择图中引物 继续进行PCR。 2 4 引物P1和引物P4 考向3 PCR的典型应用： 2 构建融合基因 目的基因的筛选和获取—PCR技术 【规律总结2】 1.融合基因设计引物时与一般PCR引物设计的不同点是：_____ _________________________________________________________。 2.PCR过程中互补的两条DNA单链可以互为_____、_____。 两个基因的两对引物中，需要有2种引物能碱基互补配对 模板 引物 各对当中的一种 的5’端 四种 考向3 PCR的典型应用： 2 构建融合基因 目的基因的筛选和获取—PCR技术 　 1. PCR技术广泛用于对少量DNA 样品的大量扩增过程，尤其在法医鉴定中有重要的意义。PCR 扩增过程示意图如下，请回答下列问题： 　（1）PCR技术的原理是______________。PCR反应中需要加入缓冲液、引物、模板DNA 、______________、_______________。 （2）图中步骤1代表_____，步骤2代表_____，步骤3代表延伸，这三个步骤组成一轮循环。 DNA的半保留复制 四种脱氧核苷酸 耐高温的DNA聚合酶 变性 复性 达标检测 （3）引物1和引物2的碱基序列_____（填“相同”或“不同”）。若一个 分子在中经历 轮循环，理论上需要消耗_________个引物，由引物形成子链的延伸方向是_________。 不同 引物个数=新增单链 达标检测 　 1. PCR技术广泛用于对少量DNA 样品的大量扩增过程，尤其在法医鉴定中有重要的意义。PCR 扩增过程示意图如下，请回答下列问题： （4）PCR 扩增时，复性温度的设定是成败的关键，复性温度过高会破坏______之间的碱基配对。如果 反应得不到任何扩增产物，则可以采取的改进措施有______（填序号：①升高复性温度；②降低复性温度；③重新设计引物）。 引物与模板 ②③ 达标检测 　 1. PCR技术广泛用于对少量DNA 样品的大量扩增过程，尤其在法医鉴定中有重要的意义。PCR 扩增过程示意图如下，请回答下列问题： 2. CD46是一种I型跨膜蛋白，可保护宿主细胞免受补体介导的损伤。某科研团队运用重叠延伸PCR技术在CD46基因中的特定位点引入特定突变，使该I型跨膜蛋白第47位地天冬酰胺（密码子为AAU）替换为赖氨酸（密码子为AAA），从而提高了其活性。原理见下图。 重叠延伸PCR技术∶ 一项重要的基因定点突变技术，其主要设计思路是用具有互补配对片段的引物（图中的引物2和3，突起处代表与模板链不能互补的突变位点），分别进行PCR，获得有重叠链的两种DNA片段，再在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸获得想要的目的基因。 达标检测 （1）若拟突变位点的碱基对为A-T，则需要让其突变为 才能达到目的。引物2的突变位点（突起处）应设计为 （假设引物为单链DNA）。 （2）在第一阶段获得两种具有重叠片段DNA的过程中，引物1、引物2组成的反应系统和引物3、引物4组成的反应系统中均进行一次复制，共产生 种DNA分子。该阶段必须将引物1、2和引物3、4置于不同反应系统中，这是因为 。 引物2和3中存在互补配对片段，置于同一反应系统时它们会发生结合而失去作用 T-A A 3 3. CD46是一种I型跨膜蛋白，可保护宿主细胞免受补体介导的损伤。某科研团队运用重叠延伸PCR技术在CD46基因中的特定位点引入特定突变，使该I型跨膜蛋白第47位地天冬酰胺（密码子为AAU）替换为赖氨酸（密码子为AAA），从而提高了其活性。原理见下图。 达标检测 设计增加酶切位点 构建融合基因 知识网络 PCR PCR的过程 引物的设计 PCR的应用 $