2025届高三生物二轮复习课件10. 生物技术与工程

主题八 生物技术与工程 一、发酵工程 1.传统发酵技术 2.无菌操作技术 P10旁栏信息：生物消毒法是指用生物或生物的代谢物去除环境中部分微生物的方法。 （1）按物理性质分类 3. 培养基的类型 固体培养基 半固体培养基 液体培养基 加入凝固剂（如琼脂） 不加凝固剂（如琼脂） 用于微生物的分离、鉴定、计数等 工业生产、大量快速培养微生物 观察微生物的运动情况 选择培养基 鉴别培养基 （2）按功能分类 允许特定微生物生长，同时抑制或阻止其他微生物生长。 用于区分和鉴定不同微生物。 （3）按成分来源分类 天然培养基 合成培养基 ：含化学成分不明确的天然物质（如含血清） ：用已知的化学物质配制 必备营养成分: 水、碳源、氮源、无机盐等。 有机碳源： （1）碳源 （2）氮源 为什么培养基需要氮源？ 氮是微生物合成蛋白质、核酸等物质必须的元素。 无机碳源： CO2、CO32-、HCO3- （自养微生物） 糖类、脂质、蛋白质、有机酸、石油等 （异养微生物） 无机氮源： NH4＋、NO3-、NH3等 有机氮源： 牛肉膏、蛋白胨、尿素、氨基酸等 4. 培养基的成分 （3）特殊需求 pH、O2和特殊营养物质（维生素、氨基酸、嘌呤、嘧啶等） ④培养厌氧微生物时，需要提供 的条件。 ①培养乳酸杆菌时，需要在培养基中添加 ； ②培养霉菌时，需要将培养基调至 ； ③培养细菌时，需要将培养基调至 ； 维生素 酸性 中性或弱碱性 无氧 6 比较 平板划线法 稀释涂布平板法 主要步骤 工具 能否计数 结果 共同点 涂布器 接种环 都能将微生物分散到固体培养基表面，以获得单细胞菌落，达到分离纯化微生物的目的，也可以于观察菌落特征 不能计数 可以计数 接种环在固体平板培养基表面连续划线（不需要额外稀释） ①梯度稀释（用无菌水稀释）； ②涂布平板法操作 5. 微生物的纯培养 由单一个体繁殖所获得的微生物群体称为纯培养物，单菌落一般就是由单个微生物繁殖形成的纯培养物。 内容 直接计数法 间接计数法 主要用具 显微镜、细菌计数板或血细胞计数板 涂布器 计数依据 细菌个数 培养基上菌落数 优点 计数方便、操作简单 计数的是活菌 计算公式 每毫升原液含菌株数＝每小格平均菌株数×400×1 0000×稀释倍数 每克样品中的菌株数:(C÷V)×M 　C:某稀释度下平板上生长的平均菌落数;V:涂布平板时所用的稀释液的体积(mL);M:稀释倍数 缺点 不能区分死菌与活菌 当两个或多个菌体连在一起时,平板上观察到的只是一个菌落 结果 比实际值偏大 比实际值偏小 6.微生物分离与计数的两个实例 每隔24h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果。目的：防止因培养时间不足而导致菌落数目遗漏。 医药工业 农牧业 动植物基因 微生物 直接改造微生物 转入 微生物 抗原基因 转入 发酵 工程 药物 药物 疫苗 各种抗生素、氨基酸、激素、免疫调节剂 ②生产微生物农药 ③生产微生物饲料 ①生产微生物肥料 利用了微生物在代谢过程中产生的有机酸、生物活性物质等来增进土壤肥力，改良土壤结构，促进植株生长。 苏云金杆菌、白僵菌（真菌）、井岗霉素（抗生素）。 通过发酵获得大量的微生物菌体，即单细胞蛋白。在青贮饲料中添加乳酸菌可以提高饲料品质、提高动物免疫。 三、在医药、农牧业的应用 其他方面 ②极端微生物的应用：嗜热菌、嗜盐菌可以用来生产洗涤剂，嗜低温菌有助于提高热敏性产品的产量。 ①利用纤维废料发酵生产酒精、乙烯等能源物质。 芽、根 植物体 再分化 遮光 光照 脱分化 愈伤组织 离体的植物器官、组织或细胞（外植体） 1. 植物组织培养 二、植物细胞工程 （1）原理： 植物细胞具有全能性 （2）表现出全能性的条件： 离体、营养物质、激素、适宜的温度和pH 诱导生芽（细胞分裂素/生长素＞1） 诱导生根（细胞分裂素/生长素＜1） （3）激素的比例影响生根、生芽： （4）再分化过程中需要照光的原因： 叶绿素的合成需要光照。 2.植物体细胞杂交技术: (1)过程①为去除_______获得原生质体，用到的酶是_________和_______。 (2)过程②为_________的融合，人工诱导的物理法包括_________、_______等，化学法包括_____________________、 等。 (3)过程③为融合的原生质体再生出_______，这是原生质体融合成功的标志。 (4)过程④为_______，过程⑤为_______。 细胞壁 纤维素酶 果胶酶 原生质体 电融合法 离心法 聚乙二醇(PEG)融合法 细胞壁 脱分化 再分化 高Ca2+—高pH融合法 此过程涉及的生殖方式为和细胞分裂方式分别是？ 无性生殖、有丝分裂 原理？ 细胞膜具有流动性、植物细胞具有全能性 打破生殖隔离，实现远缘杂交育种，培育植物新品种。 意义？ 3. 植物体细胞工程的应用 植物细胞工程的应用 植物繁殖的新途径 作物新品种的培育 细胞产物的工厂化生产 快速繁殖 作物脱毒 单倍体育种 突变体的利用 高效、快速地实现种苗的大量繁殖 保持优良品种的遗传特性 植物顶端分生区附近(如茎尖)，病毒极少 ①花药的离体培养； ②诱导染色体加倍 在植物组培过程中，由于培养细胞一直处于不断增殖的状态，因此它们容易受到培养条件和诱变因素的影响而产生突变。 次生代谢物： 不是植物基本的生命活动所必需的产物，是一类小分子有机化合物。 原理：细胞增殖 三、动物细胞工程 1. 动物细胞培养 （2）动物细胞培养需要的条件 营养条件： 无菌、无毒的环境： 温度PH和渗透压 气体环境： 除了基本营养条件外，还需要加入 。 血清 培养液、培养用具灭菌。定期更换培养液，以便清除代谢废物。 提供O2 维持培养液的pH （95%）空气: （5%）CO2： （1）动物细胞培养的原理： 细胞增殖 （3）动物细胞培养的应用 干细胞的培养： 胚胎干细胞 成体干细胞 ips细胞 （1）概念 动物细胞融合技术就是使两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的技术。 （2）原理： 细胞膜具有一定的流动性。 物理法：离心、振动、电激 化学法：聚乙二醇（PEG) 生物法：灭活病毒诱导法 与植物原生质体融合的方法相同 ——动物细胞融合特有 （3）诱导动物细胞融合的方法： 原理：病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能够与细胞膜上的糖蛋白发生作用，使细胞相互凝集，细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合。 4.意义： 突破了有性杂交方法的局限，使远缘杂交成为可能。 2. 动物细胞融合技术 传统的抗体制备 方法： 向动物体内反复注射某种抗原，使动物产生抗体，然后从动物血清中分离所需抗体。 产量低，纯度低，制备的抗体特异性差、反应不灵敏 缺点： 单克隆抗体的制备 动物细胞融合 杂交瘤细胞 动物细胞培养 单克隆抗体 骨髓瘤细胞 B淋巴细胞 杂交瘤细胞的特点：既能迅速大量增殖又能产生专一抗体 单克隆抗体能准确识别抗原的细微差异，与特定抗原发生特异性结合，并且可以大量制备。（特异性强、灵敏度高、可大量制备） 优点： 单克隆抗体 多种 细胞 细胞 体外 或体内培养 第一次筛选 骨髓瘤细胞 诱导融合 细胞 杂交瘤细胞群 提取 B淋巴细胞 思路： 目的： 第二次筛选 克隆化培养和抗体检测 用 对小鼠进行免疫 培养骨髓瘤细胞 思路： 原理： 目的： 特定的抗原 多种 杂交 杂交瘤 能分泌所需抗体的杂交瘤 用特定的选择培养基筛选 筛选出杂交瘤细胞 抗原-抗体特异性反应 筛选出能分泌所需（特异）抗体的杂交瘤细胞 生殖方式： 无性生殖 原理： 动物细胞核具有全能性 3. 动物体细胞核移植技术 从实验操作的角度和细胞发育的角度考虑，为什么要选择卵母细胞作为细胞核的“受体”？ 从实验操作的角度：卵母细胞体积大，易操作； 从细胞发育的角度：卵母细胞细胞质营养丰富； 其细胞质中含有激发细胞核全能性表达的物质。 去核的方法和实质是什么？ 方法：显微操作法。 实质：染色体-纺锤体复合物。 其他方法：还可以采取梯度离心、紫外线短时间照射、化学物质处理。 激活重构胚的方法 用物理或化学方法（如电刺激、Ca2+载体、乙醇、蛋白酶合成抑制剂等）激活重构胚使其完成细胞分裂和发育进程。 （一）受精 1.概念：指精子和卵子结合形成合子（受精卵）的过程。 2.场所：自然条件下，在哺乳动物的输卵管完成。 准备阶段 受精阶段 3.过程 精子获能 卵子的准备 ①在雌性动物的生殖道内获能 ②在人工配制的获能液（肝素、Ca2+载体） ①卵子要在输卵管中进一步成熟，达到减Ⅱ中期时才具备与精子受精的能力。 排卵：卵子从卵泡中排出。 不同动物排出的卵子成熟度不同： 有的可能是初级卵母细胞（如马、犬），有的可能是次级卵母细胞（如猪、羊）。 四、胚胎工程 精子触及卵细胞膜的瞬间，发生透明带反应 精子入卵后，发生卵细胞膜反应 形成雌原核和雄原核 形成合子（受精卵） 防止多精子入卵的第一道屏障 防止多精子入卵的第二道屏障 获能后的精子穿越卵子外的结构（如透明带） 受精的过程 精子获能 卵子准备 准备阶段 受精阶段 受精 早期胚胎发育的过程 胚胎移植技术 什么是同期发情处理？目的是什么？ 如何进行超数排卵？目的是什么？ 用激素人为地控制并调整一群母畜发情周期的进程，使之在预定时间内集中发情。 使供体、受体处于相同生理环境。 用外源促性腺激素诱发卵巢排出比自然情况下更多的成熟卵子，后续就可以收集多个胚胎。 胚胎移植的意义 充分发挥雌性优良个体的繁殖潜力； 缩短供体繁殖周期；增加供体的后代数。 地位 胚胎移植是胚胎工程的最终阶段。 实质 胚胎移植的实质是：早期胚胎在相同生理环境下空间位置的转移。 1. 概念：采用机械方法将早期胚胎分割成2等份、4等份或8等份等，经移植获得同卵双胎或多胎的技术。 胚胎分割技术 2.理论基础：早期胚胎细胞具有很强的分裂能力，并保持着细胞全能性。 4.产生后代的特点: 后代具有相同的遗传物质，因此胚胎分割可以看做动物无性繁殖或克隆的方法之一。 3.胚胎选择：桑葚胚 或 囊胚 （若分割囊胚，要注意将内细胞团均等分割） 1.下列关于传统发酵技术的叙述正确的是______。 ①(2021·江苏卷)以乙醇为底物进行果醋发酵时，发酵液产生的气泡量明显少于果酒发酵时。 ②(2022·湖北卷)葡萄糖转化为乙醇所需的酶既存在于细胞质基质，也存在于线粒体。 ③(2021·湖北卷)酸奶制作过程中，后期低温处理可产生大量乳酸杆菌。 ④(2021·山东卷)葡萄酒的颜色是葡萄皮中的色素进入发酵液形成的。 ①④ 2.下列关于微生物培养和筛选的叙述，不正确的有________。　 ①(2021·山东卷)为探究发臭水体中甲、乙菌是否产生硫化氢及两种菌的运动能力，用穿刺接种的方法分别将两种菌接种在含有硫酸亚铁铵的培养基上进行培养，为不影响菌的运动需选用液体培养基。 ②(2022·辽宁卷)为避免航天器在执行载人航天任务时出现微生物污染风险，需要对航天器及洁净的组装车间进行环境微生物检测，采用平板划线法等分离培养微生物，观察菌落特征。 ③(2021·江苏卷)涂布用的菌浓度应控制在30～300个/mL。 ①②③ 3.下列有关细胞工程和胚胎工程的叙述正确的有______。 ①(2021·江苏卷)植物组织培养过程中，用同一植株体细胞离体培养获得的再生苗不会出现变异。 ②(2019·江苏卷)杂交瘤细胞制备过程中，可用灭活的仙台病毒诱导细胞融合。 ③(2021·浙江1月选考)动物细胞培养过程中用盐酸溶解细胞间物质使细胞分离。 ④(2020·江苏卷)胚胎干细胞和诱导出的各种细胞都需在CO2 培 养 箱 中 进 行 培养。 ⑤(2020·江苏卷)为获得更多的囊胚，采用激素注射促进雄鼠产生更多的精子。 ⑥(2018·江苏卷)胚胎移植时需使用免疫抑制剂以避免代孕牛对植入胚胎的排斥反应。 ②④ 4.语言组织与表达训练： (1)(2020·全国卷Ⅲ)制作果酒需要________，这一过程中也需要O2，O2的作用是________________________________。 (2)(2022·河北卷)培养过程中抽样检测活菌数量时，应采用______________ (填“稀释涂布平板法”或“显微镜直接计数法”)，其原因是 __________ ________________________________________________________________ _________________________________。 (3)(2023·海南卷)从外植体转变成愈伤组织的过程属于________；从愈伤组织到幼苗的培养过程需要的激素有生长素和____________，该过程还需要光照，其作用是___________________________________________________________。 酵母菌 促进有氧呼吸，使酵母菌大量繁殖 稀释涂布平板法 用稀释涂布平板法在培养基上看到的每一个菌落都来自一个活细胞，而显微镜直接计数法不能直接区分死菌和活菌 脱分化 细胞分裂素 诱导叶绿素的形成；满足叶绿体利用光能制造有机物的需要 (4)(2022·全国甲卷)在体外受精前要对精子进行获能处理，其原因是______ ____________________________________________________________。 刚排出的精子必须在雌性生殖道内发生相应生理变化后才能获得受精能力 返回 五、基因工程 1.基因工程的基本工具 （1）限制酶主要是从 提取的。 （2）限制酶的种类 ①产生 末端 ①产生 末端 （3）不同限制酶切割产生的粘性末端 相同。 （4）区分DNA连接酶和DNA聚合酶 原核生物 黏性 平 可能 标记基因便于重组DNA分子的筛选 在相应抗生素中生存下来的受体细胞不一定是含有目的基因的细胞 导入了目的基因及载体 导入了载体（空质粒） 与载体拼接 目的基因（抗虫基因） 重组DNA分子 1.目的基因的筛选与获取 2.基因表达载体的构建 3.将目的基因导入受体细胞 4.目的基因的检测与鉴定 导入受体细胞 重组DNA分子 抗虫棉 2.基因工程的操作程序 （核心步骤） （1）目的基因的获取 ①PCR技术全称: ②原理: ③操作环境: ④目的: ⑤优点: 聚合酶链式反应 DNA半保留复制 体外(PCR扩增仪/PCR仪) 对目的基因的核苷酸序列进行大量复制 可以在短时间内大量扩增目的基因 ⑥PCR技术需要的条件 1. 模板 两条母链 2. 原料 4种游离的脱氧核苷酸 3. 酶 耐高温的DNA聚合酶 4. 缓冲液 一般需要添加Mg2+ 5. 引物 需要人为设计并添加2种引物 关于PCR技术中的引物 ①为什么需要添加引物？ ②什么是引物？ ③引物应该和母链的5’还是3’结合？ DNA聚合酶不能从头合成DNA，只能在已有片段的3’端添加游离的脱氧核苷酸 引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。用于PCR的引物长度通常为20-30个核苷酸。 （引物既可以是一段DNA单链也可以是一段RNA单链，在PCR技术中用的是一段DNA单链） 引物只能结合到母链的3’端，子链的延伸方向只能是5’→3’。 ④为什么需要同时加入2种引物? 因为模板是母链的两条链,而两条链的3’端序列不一样。 ⑤设计引物有哪些注意事项？ 引物Ⅰ和引物Ⅱ局部发生碱基互补配对而失效。 引物Ⅰ′自身内部部分碱基发生互补配对(形成了发卡结构)而失效. 例题:设计引物是PCR技术关键步骤之一。某同学设计的两组引物(只标注了部分碱基序列)都不合理(如下图)，请分别说明理由。 一对引物之间不能有2个及以上的连续碱基互补配对的序列。 一个引物不能自身内部互补配对。（形成发卡结构） 引物长度不能过短（过短特异性降低），也不能过长。 （三）PCR技术的过程 基本过程：变性→复性→延伸 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 1.变性：当温度超过 时，双链DNA在热作用下，氢键断裂，解聚为单链。 90℃ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 2.复性：当温度降低至 时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链结合。 50℃ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3.延伸：当温度上升至 时，4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。 72℃ 注意：引物只能结合在母链3’端，引导子链从5’→3’延伸 思考：利用PCR技术扩增目的基因，在第几轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的目的基因片段？比例是多少？ 在第3轮开始出现两条链等长的目的基因片段；占比为1/4（2/8）。 问1：1个模板DNA分子经过n轮PCR，可以扩增出 个DNA片段，即以_____形式扩增。　　　 问2：1个模板DNA分子经过n轮PCR，则共需消耗多少个引物？ PCR技术扩增目的基因时至少要经过几次循环才能从中分离两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段？ 34 项目 PCR技术 体内DNA复制 相 同 点 场所 解旋方式 酶 引物 特点 ATP 温度条件 目的 细胞外（主要在PCR仪内） 细胞内（主要在细胞核内） 耐高温的DNA聚合酶 解旋酶催化解旋 DNA在高温下变性解旋 解旋酶、DNA聚合酶 一般是单链DNA分子 一小段RNA 边解旋边复制 不需要 需要 在较高温度下进行 细胞内温和的条件 复制出大量目的基因 复制出完整的DNA分子 比较：体内DNA复制与PCR技术 完全解旋再复制 教材P79旁栏思考：PCR技术可以扩增mRNA吗？ mRNA不可以直接扩增，需要将它逆转录成cDNA再进行扩增。 RT-PCR技术： mRNA RNA-DNA杂交链 DNA双链 大量DNA双链 逆转录 PCR （1）使目的基因在受体细胞中稳定存在，且可以遗传给下一代； （2）使目的基因能够在受体细胞中表达和发挥作用。 构建基因表达载体的目的 基因表达载体的组成 ①启动子： (2)基因表达载体的构建 是一段特殊序列的DNA片段，位于基因的上游,是RNA聚合酶结合位点，驱动基因的转录。 可以人工构建诱导型启动子，当诱导物存在时激活或抑制目的基因的表达（如光诱导、热诱导启动子等）。 ②终止子： 位于基因的下游，终止转录。 ④标记基因： 便于重组DNA分子的筛选。 ⑤复制原点： ⑥目的基因 使得表达载体能够自我复制（DNA聚合酶结合位点）。 第三步：将目的基因导入受体细胞 构建好的载体需要通过一定的方式才能进入受体细胞 受体细胞 将目的基因导入 植物细胞(体细胞或受精卵） 将目的基因导入 动物细胞（受精卵） 将目的基因导入 微生物细胞 农杆菌转化法（常用） 花粉管通道法 ——显微注射法 ——Ca2+处理法 （感受态细胞法） T-DNA 目的基因 构建表达载体 含目的基因的重组Ti质粒 转入农杆菌 含重组Ti质粒的农杆菌 导入植物细胞 表现出新性状的植物 植物细胞 将目的基因插入染色体DNA中 植物组织培养 农杆菌转化法 转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。 第四步：目的基因的检测与鉴定 分子水平的鉴定 个体水平的鉴定 六、蛋白质工程 DNA的粗提取与鉴定 DNA片段的电泳鉴定 √ 考向探究·强化能力 1.(2024·湖北武汉二模)由于某目的基因酶切后的末端为平末端，载体E只有产生黏性末端的酶切位点，需借助中间载体P将目的基因接入载体E。据图分析，下列叙述正确的是 A.通过PCR扩增获取目的基因是基因工程的核心工作 B.为了便于该目的基因接入载体E，可用限制酶EcoRⅤ或SmaⅠ切割载体P C.载体P只能作为中间载体，是因为其没有表达该目的基因的启动子与终止子 D.若受体细胞表现出抗性基因的相应性状，表明重组载体成功导入受体细胞 √ 2.(2023·福建莆田统考二模)乙肝病毒表面主蛋白是由 H基因控制合成。下图是将H基因导入某酵母菌生产 乙肝疫苗的过程。5'A和3'TT分别是该酵母菌中某基 因的启动子和终止子，此启动子还能使外源基因在酵 母菌中高效表达，3'A是该基因下游的序列。科学家 将改造过的P质粒与H基因连接形成重组质粒，再在 重组质粒特定部位酶切，形成的重组DNA片段可以整合到酵母菌染色体上，最终实现H基因的表达。下列叙述错误的是 A.构建重组质粒时，可在H基因两侧分别接上SnaBⅠ和AvrⅡ的酶切位点 B.步骤1中，将重组质粒先导入大肠杆菌的目的是复制出大量重组质粒 C.步骤3中，用Bgl Ⅱ对重组质粒进行酶切可以获得图示的重组DNA片段 D.用含有氨苄青霉素的培养基可以筛选出含有H基因的酵母菌 3.(2024·山东泰安模拟)与普通玉米相比，甜玉米细胞中可溶性糖向淀粉的转化较慢导致可溶性糖含量高，汁多质脆。为提高甜玉米的商品价值，科研人员培育出了超量表达G蛋白转基因甜玉米新品种。在超量表达G基因载体的构建中，所用DNA片段和Ti质粒的酶切位点如图1、2所示。 (1)强启动子能被______________识别并结合，驱动基因持续转录。在培育转基因甜玉米中T－DNA的作用是 _____________________________________________________。 为使DNA片段能定向插入T－DNA中，可用PCR技术在DNA片段的两端添加限制酶识别序列，M、N端添加的序列所对应的限制酶分别是_______________。处理好的DNA片段与Ti质粒的重组过程共需要_____种酶。 RNA聚合酶 将强启动子和G基因转移到甜玉米细胞，并整合到甜玉米细胞的染色体DNA上 NotⅠ和SacⅠ 　3 (2)外植体经脱分化形成的愈伤组织放入农杆菌液浸泡后，进行植物组织培养时培养基中需加入__________进行筛选，获得玉米株系a1、a2、a3、a4。通过对四个株系的G蛋白表达量进行测定，发现a4株系的表达量与野生型相近，原因可能是____________________________________________ ________。 潮霉素 a4株系玉米中可能没有导入目的基因或目的基因 　 未表达 ①为验证上述假说，分别在受精卵发育后3天的胚细胞中从实验组和对照组提取_______，逆转录形成cDNA。若假说1成立，使用图示引物2和引物4进行PCR后电泳的结果为____________________________________(目的条带的有无)。 总RNA　 实验组有目的条带、对照组无目的条带 (3)下图示为淀粉合成酶基因片段，其转录后形成的前体RNA需通过剪接(切去内含子对应序列)和加工后方能用于翻译。科研人员希望通过降低淀粉合成酶基因的表达，进一步提高甜玉米中可溶性糖的含量，将吗啉反义寡核苷酸(RNA剪接抑制剂)导入玉米受精卵中，发现其基因表达受阻。科研人员对其作用机制提出两种假说。 假说1：导致RNA前体上内含子1的对应序列不能被剪切； 假说2：导致RNA前体上内含子1和外显子2的对应序列同时被剪切。 ②若要证明假说2，需选择图示引物__________进行PCR。 3和4 ③若某次实验电泳结果发现：实验组和对照组都没有任何条带，从PCR操作过程角度解释可能的原因是_____________________________(至少写出两点)。 退火温度太高、引物自连或互连 $