第42讲 基因工程、蛋白质工程及生物技术的安全性及伦理问题（专项训练）（山东专用）2026年高考生物一轮复习讲练测

第42讲 基因工程、蛋白质工程及生物技术的安全性及伦理问题 目录 01 课标达标练 【题型一】重组DNA技术的基本工具 【题型二】基因工程的基本操作程序 【题型三】PCR技术与电泳 【题型四】基因工程的应用 【题型五】蛋白质工程的原理和应用 【题型六】生物技术的安全性和伦理问题 02 能力突破练（新考法+新情景+新思维） 03 高考溯源练（含2025高考真题） 【题型一】重组DNA技术的基本工具 1.图甲、乙中的箭头表示三种限制性内切核酸酶的酶切位点，AmpR表示氨苄青霉素抗性基因，neo表示新霉素抗性基因。下列叙述错误的是(　　) A.在构建重组质粒时，可用PstⅠ和HindⅢ切割质粒和外源DNA B.在酶切过程中，不能破坏质粒中全部的标记基因 C.若只用PstⅠ处理质粒和外源DNA分子片段，无法避免自身环化和反向连接 D.导入重组质粒的大肠杆菌可以在含氨苄青霉素的培养基中生长 【答案】　D 【解析】切割目的基因时，用BamH Ⅰ切割会破坏目的基因，只用PstⅠ切割目的基因和质粒载体，会出现目的基因和质粒的自身环化，或目的基因和质粒的反向连接，而用PstⅠ和Hind Ⅲ进行酶切，能确保目的基因和质粒的正向连接，并且质粒上保留新霉素抗性基因作为标记基因，A、C正确；在酶切过程中，不能破坏质粒中全部的标记基因，至少需保留其中的一个，B正确；用Pst Ⅰ切割后，质粒上氨苄青霉素抗性基因被破坏了，导入重组质粒的大肠杆菌不可以在含氨苄青霉素的培养基中生长，D错误。 2.用DNA重组技术可以赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人类需要的生物产品。在此过程中需要使用多种工具酶，其中4种限制性内切核酸酶的切割位点如图所示。 回答下列问题： (1)常用的DNA连接酶有E.coliDNA连接酶和T4 DNA连接酶。上图中________酶切割后的DNA片段可以用E.coli DNA连接酶连接。上图中________________酶切割后的DNA片段可以用T4 DNA连接酶连接。 (2)DNA连接酶催化目的基因片段与质粒载体片段之间形成的化学键是________。 (3)DNA重组技术中所用的质粒载体具有一些特征。如质粒DNA分子上有复制原点，可以保证质粒在受体细胞中能________；质粒DNA分子上有________________，便于外源DNA插入；质粒DNA分子上有标记基因(如某种抗生素抗性基因)，利用抗生素可筛选出含质粒载体的宿主细胞，方法是________________________。 (4)表达载体含有启动子，启动子是指____________________________________ ___________________________________________________________________。 【答案】　(1)EcoR Ⅰ、Pst Ⅰ　EcoR Ⅰ、Sma Ⅰ、Pst Ⅰ、EcoR Ⅴ　(2)磷酸二酯键　(3)自我复制　限制酶切割位点　用含有该抗生素的培养基培养宿主细胞，能够存活的即为含有质粒载体的宿主细胞 (4)RNA聚合酶识别、结合和驱动转录的一段DNA序列 【解析】(1)由题图可以看出，EcoR Ⅰ、Sma Ⅰ、Pst Ⅰ、EcoR Ⅴ切割后分别形成黏性末端、平末端、黏性末端和平末端，E.coli DNA连接酶可用于连接黏性末端，T4 DNA连接酶可用于连接黏性末端和平末端。(2)DNA连接酶催化DNA链的5′端与另一DNA链的3′端生成磷酸二酯键。 (3)复制原点是在基因组上复制起始的一段序列，可以保证质粒在宿主细胞中进行自我复制。质粒上有限制酶切割位点，该位点可被限制酶切开并使外源目的基因插入其中。若质粒DNA分子上有某种抗生素抗性基因，则可以用含有该抗生素的培养基培养宿主细胞，能够存活的即为含有质粒载体的宿主细胞。 (4)启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需要的蛋白质。 3.四种限制酶的切割位点如图所示，下列叙述错误的是(　　) A.上图中EcoR Ⅰ、Pst Ⅰ两种酶切割后的DNA片段可以用E.coli DNA连接酶连接 B.图中Sma Ⅰ、EcoR V两种酶切割后的DNA片段，可以用T4 DNA连接酶连接 C.DNA连接酶催化目的基因片段与质粒载体片段连接的化学键是磷酸二酯键 D.限制酶能识别特定的核苷酸序列，具有专一性，不同的限制酶切割不能产生相同的黏性末端 【答案】　D 【解析】不同的限制酶切割也可能形成相同的黏性末端，D错误。 4.科研人员利用农杆菌转化法将抗病毒蛋白基因C导入番木瓜，培育出转基因抗病毒番木瓜，Ti质粒结构模式图如图所示。下列叙述正确的是(　　) A.农杆菌的T－DNA与番木瓜基因发生重组 B.构建重组质粒需要限制酶和DNA聚合酶 C.含重组Ti质粒的农杆菌具有四环素抗性 D.转基因抗病番木瓜不具有卡那霉素抗性 【答案】　A 【解析】构建重组质粒需要限制酶和DNA连接酶，B错误；抗病毒蛋白基因C的插入位点位于四环素抗性基因内部，插入抗病毒蛋白基因C后，重组Ti质粒的四环素抗性基因被破坏，含重组Ti质粒的农杆菌不具有四环素抗性，C错误；转基因抗病番木瓜含有卡那霉素抗性基因，故转基因抗病番木瓜具有卡那霉素抗性，D错误。 【题型二】基因工程的基本操作程序 5.科学家利用PCR技术扩增人乳头瘤病毒HPV－16L1蛋白基因，构建了含HPV－16L1蛋白基因的表达载体pBI－L1，经根瘤农杆菌介导转化，获得了转基因烟草植株。该技术利用转基因烟草作为生物反应器，生产出了纯度较高的HPV－16L1蛋白。下列说法错误的是(　　) A.构建表达载体pBI－L1时至少需要两种限制酶以防止目的基因与质粒反向连接 B.采用根瘤农杆菌介导转化时可对烟草组织进行切割，以便于农杆菌入侵植物组织 C.为促进转基因烟草丛状苗基部细胞分裂形成愈伤组织可向培养基中适当添加赤霉素 D.可以用抗原－抗体杂交法检测再生植株是否表达出相应的HPV－16L1蛋白 【答案】　C 【解析】构建表达载体pBI－L1时至少需要两种限制酶以防止质粒的自身环化和目的基因与质粒反向连接，A正确；对烟草组织进行切割，以便农杆菌细胞内的Ti质粒上的T－DNA转移到被侵染的烟草组织细胞，并将其整合到该细胞的染色体DNA上，B正确；为促进转基因烟草丛状苗基部细胞分裂形成愈伤组织可向培养基中适当添加生长素，C错误；经培养可获得新性状的再生植株，检测再生植株是否表达出相应的HPV－16L1蛋白，可以用抗原－抗体杂交法，D正确。 6.下图是利用基因工程培育抗虫植物的示意图。以下相关叙述，正确的是(　　) A.⑤只要表现出抗虫性状就表明植株发生了可遗传变异 B.③侵染植物细胞后，重组Ti质粒整合到④的染色体上 C.④的染色体上若含抗虫基因，则⑤就表现出抗虫性状 D.②的构建需要限制性内切核酸酶和DNA聚合酶参与 【答案】　A 【解析】⑤为转基因植物，只要表现出抗虫性状就说明转入的目的基因成功表达了，基因工程的原理是基因重组，属于可遗传变异，A正确；③侵染植物细胞后，重组Ti质粒上的T－DNA整合到植物细胞的染色体上，B错误；受体细胞的染色体上可能含抗虫基因，但不代表该基因就一定成功表达，因此不能确定⑤是否表现出抗虫性状，C错误；基因表达载体的构建需要限制性内切核酸酶和DNA连接酶参与，D错误。 7.下列以洋葱为实验材料进行“DNA的粗提取与鉴定实验”的叙述，正确的是(　　) A.洋葱研磨液需要用滤纸过滤，以保证提取的DNA量 B.滤液中加入冷酒精后，用玻璃棒搅拌会使DNA的提取量增加 C.向含DNA的滤液中加入2 mol/L的NaCl溶液有利于去除杂质 D.用二苯胺试剂鉴定DNA时，需沸水浴加热冷却后再观察颜色变化 【答案】　D 【解析】洋葱研磨液用两层纱布过滤，以保证提取的DNA量，A错误；DNA在冷酒精中的溶解度很低，蛋白质在冷酒精中的溶解度较高，故可以利用DNA不溶于冷酒精的原理，提纯DNA，但用玻璃棒搅拌时提取量不会增加，B错误；向含DNA的滤液中加入0.14 mol/L的NaCl溶液有利于去除杂质，C错误；在沸水浴条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色，用二苯胺试剂鉴定DNA时，需沸水浴加热冷却后再观察颜色变化，D正确。 (不定项)8.图甲、乙中标注了相关限制酶的酶切位点。下列关于培育转基因大肠杆菌的叙述正确的是(　　) A.若通过PCR获取该目的基因，应该选用引物甲和引物丙 B.图中质粒和目的基因构建表达载体，应选用Bcl Ⅰ和Hind Ⅲ剪切 C.若将基因表达载体导入受体细胞中，需选用Ca2＋转化法 D.在受体细胞中，氨苄青霉素抗性基因和目的基因可同时表达 【答案】　ABC 【解析】通过PCR获取目的基因时，两种引物分别和目的基因的两条单链结合，并沿相反的方向合成子链，故选用引物甲和引物丙，A正确；由甲图可知，选用BamHⅠ会破坏两种抗性基因，结合乙图可确定应选择BclⅠ和HindⅢ剪切，B正确；将目的基因导入大肠杆菌常采用Ca2＋转化法，C正确；构建重组质粒时目的基因插入氨苄青霉素抗性基因中，故氨苄青霉素抗性基因被破坏不能表达，D错误。 9.科研人员以浮萍为实验材料，成功建立了其稳定的遗传转化体系，并用遗传转化(转基因)技术实现了浮萍药用蛋白生物反应器的建立。建立过程使用的CRISPR/Cas9基因编辑技术可以按照人们的意愿精准剪切、改编任意靶基因的遗传信息，其原理是由一条单链向导RNA(sgRNA)引导Cas9蛋白到一个特定的基因位点进行切割，便于目的基因与载体的连接。 (1)sgRNA能引导Cas9蛋白精准确定目的基因的位置，其原理是_________________________________________________________________，Cas9蛋白的作用是________________________________________________。 (2)浮萍转化体系的建立，需使用不同种类的农杆菌对浮萍进行侵染，统计侵染3 d后浮萍愈伤组织的GUS瞬时表达率(农杆菌介导的目的基因表达数量/含有该基因总数的比率)，结果如下图1所示，浮萍遗传转化应选用________杆菌菌种，其依据是__________________________________________________。 图1 (3)在侵染过程中抑制农杆菌过度生长是转基因成败的关键，头孢霉素(Cef)和羧苄青霉素(Carb)都具有抑制农杆菌生长的作用。本实验采用检测OD值(光密度的缩写，表示被检测物吸收掉的光密度)观察抗生素对农杆菌的抑制效果，如图2所示，在侵染浮萍愈伤组织时选择________作为抑菌的抗生素，其最佳浓度选用________。 图2 (4)在转基因浮萍的培育过程中，科研人员用PCR技术特异性地快速扩增了目的基因。已知PCR引物序列如下图所示，并在每种引物的5′端设计了特定序列。 引物1：GGAAGTCTTCCCGCGGATCCATGGACTATATGTATGGA 引物2：AAACTGCAGTTAGATTCTAGAGGGAATGA 两种引物设计的依据是______________________________________________， 下划线特定序列设计的目的是_______________________________________。 【答案】　(1)单链sgRNA与目的基因之间的碱基互补配对　识别特定的核苷酸序列并在特定位置切割磷酸二酯键　(2)EHA105　农杆菌EHA105的GUS瞬时表达率(即介导的目的基因表达数量)要高于GV3101和C58C1　(3)头孢霉素或羧苄青霉素　300 mg/L　(4)目的基因两端的部分DNA序列　使扩增出的目的基因两端含有相应限制酶的识别序列和切割位点 【解析】(1)sgRNA能特异性识别特定的DNA序列，依据的原理是sgRNA与目标DNA发生碱基互补配对，从而引导Cas9蛋白催化特定部位磷酸二酯键水解，完成对特定DNA片段的剪切。 (2)根据图1分析可知：农杆菌EHA105的GUS瞬时表达率(即介导的目的基因表达数量)要高于GV3101和C58C1，所以浮萍遗传转化应选用EHA105农杆菌菌种。 (3)根据图2分析可知：头孢霉素或羧苄青霉素在浓度为300(mg·L－1)时均能完全抑制农杆菌的生长，因此在侵染浮萍愈伤组织时选择头孢霉素或羧苄青霉素作为抑菌的抗生素，其最佳浓度选用300(mg·L－1)。 (4)引物必须根据目的基因两端的部分DNA序列设计；因此下划线特定序列的设计目的是使扩增出的目的基因两端含有相应限制酶的识别序列和切割位点，便于构建重组质粒。 10.某实验利用PCR技术获取目的基因，实验结果显示除目的基因条带(引物与模板完全配对)外，还有2条非特异条带(引物和模板不完全配对)。为了减少反应中非特异条带的产生，以下措施中有效的是(　　) A.增加模板DNA的量 B.延长热变性的时间 C.延长延伸的时间 D.提高复性的温度 【答案】　D 【解析】PCR过程中，引物和模板不完全配对会形成非特异条带，增加模板DNA的量不会减少反应中非特异条带的产生，A错误；延长热变性的时间，有利于双链DNA解聚为单链，不能减少反应中非特异条带的产生，B错误；延长延伸的时间，有利于合成新的DNA链，但不能减少反应中非特异条带的产生，C错误；在一定温度范围内，选择较高的复性温度可减少引物和模板间的非特异性结合，D正确。 11.新冠疫情出现后，病毒核酸检测和疫苗接种在疫情防控中发挥了重要作用。回答下列问题： (1)新冠病毒是一种RNA病毒，检测新冠病毒RNA(核酸检测)可以采取RT—PCR法。这种方法的基本原理是先以病毒RNA为模板合成cDNA，这一过程需要的酶是________________________，再通过PCR技术扩增相应的DNA片段。根据检测结果判断被检测者是否感染新冠病毒。 (2)为了确保新冠病毒核酸检测的准确性，在设计PCR引物时必须依据新冠病毒RNA中的____________________来进行。PCR过程每次循环分为3步，其中温度最低的一步是______________。 (3)某人同时进行了新冠病毒核酸检测和抗体检测(检测体内是否有新冠病毒抗体)，若核酸检测结果为阴性而抗体检测结果为阳性，说明________________________(答出1种情况即可)；若核酸检测和抗体检测结果均为阳性，说明______________________________________________________。 (4)常见的病毒疫苗有灭活疫苗、蛋白疫苗和重组疫苗等。已知某种病毒的特异性蛋白S(具有抗原性)的编码序列(目的基因)。为了制备蛋白疫苗，可以通过基因工程技术获得大量蛋白S。基因工程的基本操作流程是________________________________________________________________。 【答案】　(1)逆转录酶(或反转录酶)　(2)特异性核苷酸序列　复性(或退火)　(3)曾感染新冠病毒，已康复　已感染新冠病毒，是患者　(4)获取目的基因→构建基因表达载体→导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定 【解析】(1)以病毒RNA为模板合成cDNA是逆转录过程，这一过程需要的酶是逆转录酶(或反转录酶)。获得cDNA后可通过PCR技术扩增相应的DNA片段。根据检测结果判断被检测者是否感染新冠病毒。 (2)为确保PCR扩增获得的是特异性序列，从而确保新冠病毒核酸检测的准确性，设计PCR引物时必须依据新冠病毒RNA中的特异性核苷酸序列来进行。PCR过程每次循环分为3步，即变性(超过90 ℃)→复性(50 ℃左右)→延伸(72 ℃左右)，其中温度最低的一步是复性(或退火)。 (3)某人同时进行了新冠病毒核酸检测和抗体检测，若核酸检测结果为阴性而抗体检测结果为阳性，说明他体内没有新冠病毒，但曾感染新冠病毒，已经康复；若核酸检测和抗体检测结果均为阳性，说明他体内已感染新冠病毒，是患者。 (4)基因工程的基本操作流程是：获取目的基因→构建基因表达载体→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定。 12.“绿水逶迤去，青山相向开。”大力发展低碳经济已成为全社会的共识。基于某些梭菌的特殊代谢能力，有研究者以某些工业废气(含CO2等一碳温室气体，多来自高污染排放企业)为原料，通过厌氧发酵生产丙酮，构建一种生产高附加值化工产品的新技术。 回答下列问题： (1)研究者针对每个需要扩增的酶基因(如图)设计一对______，利用PCR技术，在优化反应条件后扩增得到目标酶基因。 (2)研究者构建了一种表达载体pMTL80k，用于在梭菌中建立多基因组合表达库，经筛选后提高丙酮的合成量。该载体包括了启动子、终止子及抗生素抗性基因等，其中抗生素抗性基因的作用是_______________________________________，终止子的作用是_____________________________。 (3)培养过程中发现重组梭菌大量表达上述酶蛋白时，出现了生长迟缓的现象，推测其原因可能是_____________________________________________________， 此外丙酮的积累会伤害细胞，需要进一步优化菌株和工艺才能扩大应用规模。 (4)这种生产高附加值化工产品的新技术，实现了______________，体现了循环经济的特点。从“碳中和”的角度看，该技术的优势在于____________________，具有广泛的应用前景和良好的社会效益。 【答案】　(1)引物　(2)作为标记基因，筛选含有基因表达载体的受体细胞　终止转录，使转录在需要的地方停下来　(3)二氧化碳等气体用于大量合成丙酮，而不是用于重组梭菌的生长　(4)废物的资源化　不仅不排放二氧化碳，而且还可以消耗工业废气中的二氧化碳 【解析】(1)利用PCR技术扩增目标酶基因，首先需要根据目标酶基因两端的碱基序列设计一对引物，引物与模板链结合后，耐高温的DNA聚合酶才能从引物的3′端延伸子链。 (2)抗生素抗性基因是一种标记基因，其作用是将含有重组质粒的受体细胞筛选出来。终止子的作用是终止转录过程，使转录在需要的地方停下来。 (3)重组梭菌大量表达上述酶蛋白时，在这些酶蛋白的作用下，二氧化碳等气体大量用于合成丙酮，而不是用于重组梭菌的生长，所以会导致重组梭菌生长迟缓。 (4)根据题意可知，这种生产高附加值化工产品的新技术，以高污染企业排放的二氧化碳等一碳温室气体为原料，实现了废物的资源化，体现了循环经济的特点。从“碳中和”的角度看，该技术生产丙酮的过程不仅不排放二氧化碳，而且还可以消耗工业废气中的二氧化碳，有利于减缓温室效应，并实现较高的经济效益，所以具有广泛的应用前景和良好的社会效益。 13.某质粒上有Sal Ⅰ、Hind Ⅲ、BamH Ⅰ三种限制酶切割位点，同时还含有抗四环素基因和抗氨苄青霉素基因。利用此质粒获得转基因抗盐烟草的过程，如下图所示。请回答下列问题： (1)将目的基因导入植物细胞，采用最多的方法是农杆菌转化法。其中用到的质粒是________；该质粒含有一段特殊的DNA片段，称为________。该方法中农杆菌的作用是_______________________________________________________。 (2)在构建重组质粒时，和只用一种酶切割目的基因的两端及质粒相比，选用Hind Ⅲ和Sal Ⅰ两种酶的好处是____________________________________________。 (3)含有目的基因的农杆菌可根据标记基因进行筛选。若农杆菌在含有氨苄青霉素和四环素的培养基上都可以生长繁殖，农杆菌中是否已含有目的基因？________(填“是”或“否”)。为什么？_______________________________。 (4)将已经转化的农杆菌进行如下操作，筛选出符合要求的农杆菌。先把转化的农杆菌接种到A培养基中培养，长出菌落后，用无菌牙签挑取A上的单个菌落，分别接种到B(含氨苄青霉素)和C(含四环素和氨苄青霉素)两个培养基的相同位置上，一段时间后，菌落的生长状况如图所示。含目的基因的菌落位于B或C上的哪些菌落中？请在图中相应的位置上圈出来。 【答案】　(1)Ti质粒　T­DNA　感染烟草细胞，把目的基因插入到烟草细胞的染色体DNA上 (2)防止目的基因自连和质粒自连，以提高带有目的基因的重组质粒的合成效率；防止目的基因与质粒反向连接 (3)否　含有目的基因的质粒中抗四环素基因被破坏 (4) 【解析】　 如何筛选出含有目的基因的受体细胞 (1)原理：将目的基因插入含有两种抗生素抗性基因的载体时，如果插入某种抗生素抗性基因内部，则会导致该抗生素抗性基因失活。如下图，目的基因插入四环素抗性基因内部，则四环素抗性基因失活。 (2)被转化的细菌有三种：含环状目的基因的细菌、含重组质粒的细菌、含自身环化质粒的细菌。 (3)筛选方法：将混合处理后的细菌先放在含氨苄青霉素的培养基上培养，能生长的是含重组质粒的细菌和含自身环化质粒的细菌，如图1、2、3、4、5菌落，再利用无菌的绒布影印到含有四环素的培养基上，如图能生长的菌落为2、3、4，则在含四环素培养基上不生长的即为含有目的基因的菌落，如图1、5菌落。最后，可在含氨苄青霉素的培养基上挑取1、5菌落进行培养。 14.为了研究PDCD4基因对小鼠子宫内膜基质细胞凋亡的影响，进行了相关实验。 (1)取小鼠子宫时，为避免细菌污染，手术器具应进行________处理；子宫取出剪碎后，用________处理一定时间，可获得分散的子宫内膜组织细胞，再分离获得基质细胞用于培养。 (2)培养基中营养物质应有________________(填写两种)；培养箱中CO2浓度为5%，其主要作用是____________________________________________________。 (3)在含PDCD4基因的表达载体中，启动子的作用是___________________________________________。 为了证明PDCD4基因对基质细胞凋亡的作用，以含PDCD4基因的表达载体和基质细胞的混合培养为实验组，还应设立两个对照组，分别为______________________________________________。经检测，实验组中PDCD4表达水平和细胞凋亡率显著高于对照组，说明该基因对基质细胞凋亡具有________(填“抑制”或“促进”)作用。 【答案】　(1)灭菌(或消毒)　胰蛋白酶或胶原蛋白酶　(2)无机盐、葡萄糖、氨基酸、微量元素、促生长因子、血清或血浆　维持培养液的pH　(3)RNA聚合酶的识别和结合位点，驱动转录出相应的mRNA　基质细胞悬浮液和空载体与基质细胞的混合培养液　促进 【解析】(1)手术器具应灭菌或消毒处理；分散动物组织细胞用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理。 (2)动物细胞培养基中的营养物质有无机盐、葡萄糖、氨基酸、微量元素、促生长因子、血清或血浆；培养箱中浓度为5%的CO2的主要作用是维持培养液的pH。 (3)启动子的作用是被RNA聚合酶识别并结合，驱动基因转录出相应的mRNA。要证明PDCD4基因对基质细胞凋亡的作用，实验组是含有PDCD4基因的表达载体和基质细胞的混合培养液，为了能对比得出结果和排除载体本身与培养液的作用，对照组有两组，一组为等量的只含基质细胞的培养液，另一组为等量的空载体(载体上无PDCD4基因)和基质细胞的混合培养液。若实验组的细胞凋亡率高于对照组，说明PDCD4基因对基质细胞凋亡有促进作用。 15.“端稳中国碗，装满中国粮”，为了育好中国种，科研人员在杂交育种与基因工程育种等领域开展了大量的研究。二倍体作物M的品系甲有抗虫、高产等多种优良性状，但甜度不高。为了改良品系甲，增加其甜度，育种工作者做了如下实验： [实验一]遗传特性及杂交育种的研究 在种质资源库中选取乙、丙两个高甜度的品系，用三个纯合品系进行杂交实验，结果如下表。 杂交组合 F1表型 F2表型 甲×乙 不甜 1/4甜、3/4不甜 甲×丙 甜 3/4甜，1/4不甜 乙×丙 甜 13/16甜、3/16不甜 [实验二]甜度相关基因的筛选 通过对甲、乙、丙三个品系转录的mRNA分析，发现基因S与作物M的甜度相关。 [实验三]转S基因新品系的培育 提取品系乙的mRNA，通过基因重组技术，以Ti质粒为表达载体，以品系甲的叶片外植体为受体，培育出转S基因的新品系。 根据研究组的实验研究，回答下列问题： (1)假设不甜植株的基因型为AAbb和Aabb，则乙、丙杂交的F2中表现为甜的植株基因型有________种。品系乙基因型为________。若用乙×丙中F2不甜的植株进行自交，F3中甜∶不甜比例为________。 (2)下图中，能解释(1)中杂交实验结果的代谢途径有________。 (3)如图是S基因的cDNA和载体的限制性内切核酸酶(限制性核酸内切酶)酶谱。为了成功构建重组表达载体，确保目的基因插入载体中方向正确，最好选用________________酶切割S基因的cDNA和载体。 (4)用农杆菌侵染品系甲叶片外植体，其目的是_________________________。 (5)除了题中所示的杂交育种和基因工程育种外，能获得高甜度品系，同时保持甲的其他优良性状的育种方法还有________________(答出2点即可)。 【答案】　(1)①7　②aabb　③1∶5　(2)①③ (3)XbaⅠ、HindⅢ　(4)通过农杆菌的转化作用，使目的基因进入植物细胞　(5)单倍体育种、诱变育种 【解析】(1)甲为纯合不甜品系，基因型为AAbb，根据实验一结果可推得乙基因型为aabb，丙基因型为AABB，乙、丙杂交的F2基因型有3×3＝9种，由于不甜植株的基因型为AAbb和Aabb，F2中表现为甜的植株基因型有7种。若用乙×丙中F2不甜的植株进行自交，F3中不甜比例＝1/3＋2/3×3/4＝5/6，F3中甜∶不甜比例为1∶5。 (2)不甜植株的基因型为AAbb和Aabb，只有A导致不甜，当A与B同时存在时，表现为甜，故选①③。 (3)为了成功构建重组表达载体，不破坏载体关键结构和目的基因，确保目的基因插入载体中方向正确，最好选用XbaⅠ、HindⅢ酶切割S基因的cDNA和载体。(4)用农杆菌侵染品系甲叶片外植体，可以通过农杆菌的转化作用，使目的基因进入植物细胞。(5)除了题中所示的杂交育种和基因工程育种外，能获得高甜度品系，同时保持甲的其他优良性状的育种方法还有单倍体育种、诱变育种。 16.某种类型的白血病由蛋白P引发，蛋白UBC可使P被蛋白酶识别并降解，药物A可通过影响这一过程对该病起到治疗作用。为探索药物A治疗该病的机理，需构建重组载体以获得融合蛋白FLAG－P和FLAG－P△。P△是缺失特定氨基酸序列的P，FLAG是一种短肽，连接在P或P△的氨基端，使融合蛋白能与含有FLAG抗体的介质结合，但不影响P或P△的功能。 (1)为构建重组载体，需先设计引物，通过PCR特异性扩增P基因。用于扩增P基因的引物需满足的条件是________________________________________， 为使PCR产物能被限制酶切割，需在引物上添加相应的限制酶识别序列，该限制酶识别序列应添加在引物的________(填“3′端”或“5′端”)。 (2)PCR扩增得到的P基因经酶切连接插入载体后，与编码FLAG的序列形成一个融合基因，如图甲所示，其中“ATGTGCA”为P基因编码链起始序列。将该重组载体导入细胞后，融合基因转录出的mRNA序列正确，翻译出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正确，但P基因对应的氨基酸序列与P不同。据图甲分析，出现该问题的原因是_________________________________________________。 修改扩增P基因时使用的带有EcoRⅠ识别序列的引物来解决该问题，具体修改方案是______________________________________________________________。 图甲 (3)融合蛋白表达成功后，将FLAG－P、FLAG－P△、药物A和UBC按照图乙中的组合方式分成5组。各组样品混匀后分别流经含FLAG抗体的介质，分离出与介质结合的物质并用UBC抗体检测，检测结果如图丙所示。已知FLAG－P和FLAG－P△不能降解UBC，由①②③组结果的差异推测，药物A的作用是_________________________________________________________________；由②④组或③⑤组的差异推测，P△中缺失的特定序列的作用是__________________________________________________。 (4)根据以上结果推测，药物A治疗该病的机理是__________________________________________________。 【答案】　(1)能与P基因母链的一段碱基序列互补配对、短单链核酸　5′端 (2)P基因编码链的第一个碱基与EcoR Ⅰ识别序列的最后两个碱基编码一个氨基酸，导致mRNA的密码子被错位读取　在引物中的EcoRⅠ识别序列3′端添加1个碱基 (3)增强FLAG－P与UBC的结合　参与P与UBC的结合 (4)药物A通过增强P与UBC结合促进P降解 【解析】(1)引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核苷酸，因此设计扩增P基因的引物，需要两种引物分别与两条模板链3′端的碱基序列互补。DNA聚合酶延伸时，是将脱氧核苷酸加到引物的3′端，为了不破坏目的基因，该限制酶识别序列应添加在引物的5′端。 (2)融合基因转录出的mRNA序列正确，翻译出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正确，但P基因对应的氨基酸序列与P不同，说明P基因翻译时出错。由图可看出，在转录出的mRNA中，限制酶识别序列对应的最后两个碱基与P基因对应的第一个碱基构成一个密码子，导致读码框改变，翻译出的氨基酸序列改变，可通过在EcoRⅠ识别序列前后增加碱基，使其碱基数目加上FLAG的碱基数目为3的倍数，这样能保证P基因转录出的mRNA上的读码框不改变，能够正常翻译。 (3)①组仅添加UBC，处理后，用UBC抗体检测，不出现杂交带；②组添加UBC和FLAG－P，出现杂交带；③组添加UBC、药物A和FLAG－P，杂交带更加明显，说明药物A的作用是促进UBC与FLAG－P的结合。由②④组或③⑤组的差异在于②③组使用FLAG－P，出现杂交带；④⑤组使用FLAG－P△，不出现杂交带，据此推测P△中缺失的特定序列是与UBC结合的关键序列。 (4)根据(3)的分析推测，药物A促进UBC与FLAG－P的结合，从而促进蛋白P被蛋白酶识别并降解，达到治疗的目的。 17.研究发现，斑马鱼性腺体衍生因子基因(gsdf)主要在精巢中表达。为研究gsdf相关分子的调控机制模型，科研人员构建了以Gamma－crystalin启动子(使相关基因在眼部晶状体特异性表达)启动的斑马鱼gsdf基因与增强型绿色荧光蛋白基因(egfp)融合的荧光素酶报告质粒Tg(Crystal－pro－gsdf－2A－egfp，部分构建过程如图1所示)，最终成功获得表达gsdf基因的转基因斑马鱼。 图1 (1)科研人员提取斑马鱼精巢内的总RNA，经________过程获得cDNA，并以其为模板，通过PCR技术可在总cDNA中专一性的扩增出gsdf基因的cDNA，其原因是____________________________________________________________。 (2)图1中对gsdf基因、2A基因和报告质粒载体的切割共需用到________种限制酶。将酶切后的gsdf基因、2A基因定向连接到用____________双酶切的报告质粒载体中，最终通过系列操作构建出荧光素酶报告质粒Tg。 (3)图1中的2A基因表达的2A肽序列具有“自剪切”的能力，将其置于质粒上gsdf基因和egfp基因之间，可以避免这两个基因表达出一个融合蛋白。2A肽的“自剪切”原理如图2，字母G和P代表2A肽最末端的两个氨基酸。 图2 据图2推测2A肽具有“自剪切”能力的原因是_______________________。 (4)某同学认为：gsdf基因在转基因斑马鱼眼部晶状体中特异性表达，就成功建立和获得了能稳定遗传的转基因斑马鱼模型。请对该同学的观点进行评价并说明理由。___________________________________________________________。 【答案】　(1)逆转录　引物是根据gsdf基因的一段已知序列设计合成的(或引物能与gsdf基因的cDNA特异性结合)　(2)3　EcoRⅠ、NotⅠ　(3)G与P之间未形成肽键　(4)不合理。要将获得的转基因斑马鱼个体与野生型个体杂交，若后代能够表达gsdf基因，(多代杂交获得纯合子)才能说明模型成功建立。 【解析】(1)以mRNA为模板合成cDNA的过程为逆转录，利用PCR技术扩增gsdf基因的cDNA，需要根据gsdf基因的一段已知序列设计引物，这样引物能够在总cDNA中与gsdf基因的cDNA特异性结合，从而利用PCR扩增技术专一性扩增出gsdf基因的cDNA。 (2)由图1可知，对gsdf基因、2A基因和报告质粒载体的切割共需用到3种不同的限制酶。将酶切后的gsdf基因、2A基因定向连接到用EcoRⅠ、NotⅠ双酶切的报告质粒载体中，最终通过系列操作构建出荧光素酶报告质粒Tg。 (3)由题可知，将2A基因置于质粒上gsdf基因和egfp基因之间，可以转录出一条mRNA，根据题图可知，翻译出gsdf蛋白之后，在G与P之间未形成肽键，继而开始合成egfp蛋白，从而避免这两个基因表达出一个融合蛋白。由此可知G与P之间未形成肽键是2A肽具有“自剪切”能力的原因。 (4)要将获得的转基因斑马鱼个体与野生型个体杂交，若后代能够表达gsdf基因，(多代杂交获得纯合子)才能说明模型成功建立。 18.定点诱变技术是近年来生物工程研究中发展迅速的一个领域。通过定点诱变可以在体外改造目的DNA分子，进而研究基因的表达以及蛋白质的结构与功能之间的关系。经典的大引物PCR定点诱变技术成为基于PCR的定点诱变技术中应用最普遍的方法，操作过程如图甲。研究者欲改造某基因并将其导入大肠杆菌的质粒中保存，该质粒含有氨苄青霉素抗性基因、LacZ基因及一些酶切位点，结构如图乙。回答下列问题： 甲 乙 (1)利用大引物PCR进行定点诱变需要进行两轮PCR(PCR1和PCR2)，在PCR1中，至少需要________个循环才能获得相应的大引物模板。在PCR2中，要获得带有诱变点的改良基因，引物应选用大引物两条链中的________(填“①”或“②”)。 (2)为实现质粒和改良基因的高效连接，选用限制酶XmaⅠ而不选用限制酶SmaⅠ的原因是____________________________________________________________。为将改良基因构建在质粒上，还需要________等酶。 (3)在构建改良基因表达载体时，有的质粒含有改良基因，有的质粒为空白质粒，将含上述元件的溶液加入到大肠杆菌菌液中，适宜温度下培养一段时间后，再将菌液涂布在含氨苄青霉素和________的平板上。一段时间后，在培养基上出现白色和蓝色两种菌落，其中白色菌落含有重组质粒，判断的依据是 __________________________________________________________________。 【答案】　(1)2　②　(2)SmaⅠ的酶切末端为平末端，无法与改良基因上的黏性末端连接　BglⅡ、DNA连接酶　(3)β－半乳糖苷　构建改良基因重组质粒时破坏了LacZ基因，含该质粒的大肠杆菌不能分解β－半乳糖苷产生蓝色物质，菌落为白色 【解析】(1)由图可知，大引物的两条链均带有突变位点，进行第一轮循环，得到一个不含突变位点的DNA，一个有一条链含有突变位点的DNA，进行第二轮循环，即可得到三个不含突变位点的DNA和一个两条链均含突变位点的DNA，即大引物；从大引物和目的基因的结合位点分析，要获得带有诱变点的改良基因，引物应选用大引物两条链中的②链。 (2)限制酶XmaⅠ切割后产生与改良基因相同的黏性末端，限制酶SmaⅠ切出的是平末端，无法与改良基因准确连接。由酶切位点分析，除使用XmaⅠ外，还需使用BglⅡ切出另一个切口产生一个新的黏性末端与改良基因CTAG一侧进行配对。 (3)因LacZ基因编码的酶能分解β－半乳糖苷，产生蓝色物质，所以应加入β－半乳糖苷进行检测质粒上是否含有改良基因；白色菌落含有重组质粒，原因是重组质粒的LacZ基因在重组过程中被切断，不能编码相应的酶分解β－半乳糖苷。 【题型三】DNA粗提取、PCR技术与电泳 19.关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法错误的是(　　) A.过滤液沉淀过程在4 ℃冰箱中进行是为了防止DNA降解 B.离心研磨液是为了加速DNA的沉淀 C.在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色 D.粗提取的DNA中可能含有蛋白质 【答案】　B 【解析】低温时DNA酶的活性降低，过滤液沉淀过程在4 ℃冰箱中进行是为了防止DNA降解，A正确；DNA溶解在研磨液中，离心研磨液是为了使细胞碎片沉淀，B错误；在沸水浴条件下，DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色，C正确；细胞中的某些蛋白质可以溶解于酒精，可能有蛋白质不溶于酒精，在95%的冷酒精中与DNA一块儿析出，故粗提取的DNA中可能含有蛋白质，D正确。 20.DNA琼脂糖凝胶电泳的分子筛选效应是指作为支持介质的琼脂糖，具有网络结构，使大分子物质在通过时受到较大阻力，借此分离不同大小的DNA片段。下列说法错误的是(　　) A.琼脂糖凝胶电泳可用于分离、鉴定DNA分子的混合物 B.双链DNA分子片段长度越大，在琼脂糖中的移动速率越大 C.凝胶制备中加入的核酸染料能与DNA分子结合，用于分离后DNA的检测 D.凝胶中的DNA分子通过染色，可在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来 【答案】　B 【解析】琼脂糖凝胶电泳利用具有多孔网状结构的凝胶的分子筛选效应，来进行分离，可用于分离、鉴定DNA分子的混合物，A正确；凝胶中DNA分子的迁移速率与DNA分子的大小有关，双链DNA分子片段长度越大，在琼脂糖中的移动速率越小，B错误；凝胶制备中加入的核酸染料能与DNA分子结合，可以在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来，用于分离后DNA的检测，C正确；DNA分子的大小和构象等有关，凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来，D正确。 21.实时荧光RT­PCR可用于RNA病毒的核酸检测，其原理是：在PCR复性过程中探针和引物一起与模板结合，探针两侧分别带有荧光基团和抑制荧光发出的淬灭基团，新链延伸过程中，DNA聚合酶会破坏探针，导致荧光基团与淬灭基团分离而发出荧光。利用RT—PCR进行核酸检测的相关过程如图所示。下列说法错误的是(　　) A.做RT­PCR之前，需要先根据cDNA的核苷酸序列合成引物和探针 B.RNA不能作为PCR扩增的模板，故需要将样本中的RNA逆转录为DNA后再进行扩增 C.若检测结果有强烈荧光信号发出，说明被检测者没有感染病毒 D.病毒的检测还可以检测病毒表面的物质或病毒引发产生的抗体，其原理都是抗原—抗体杂交 【答案】　C 【解析】PCR扩增必须以DNA为模板，RNA不能作为PCR扩增的模板，所以需要将样本中的RNA逆转录为cDNA后再进行扩增，B正确；若检测结果有强烈荧光信号发出，说明被检测者极有可能感染了病毒，C错误。 22.为减少引物与模板之间的非特异性配对，人们在常规PCR技术的基础上进行了改良，发明了巢式PCR技术。其原理是利用两套PCR引物进行两轮PCR扩增，首先利用第一对引物(外引物)对目的基因所在DNA进行15～30个循环的扩增；第二轮扩增以第一轮扩增产物为模板，利用第二对引物(内引物或巢式引物)进行15～30个循环扩增，具体过程如图所示。下列叙述错误的是(　　) A.巢式PCR中加入的组分与常规PCR相同，但扩增产物比常规PCR特异性更强 B.两套引物需进行两次PCR，由于和两套引物都互补的靶序列较少，因此大大提高了扩增的特异性 C.内引物扩增的模板是外引物扩增后的产物，第二阶段反应能否进行，也是对第一阶段反应正确性的鉴定 D.如果第一次扩增产生了错误片段，则第二次能在错误片段上进行引物配对并扩增的概率将会增加 【答案】　D 【解析】巢式PCR中加入的组分与常规PCR相同，包括5种基本成分，依次为：引物、DNA聚合酶、dNTP(原料)、模板DNA、Mg2＋，但扩增产物比常规PCR特异性更强，A正确；巢式PCR通过两轮PCR反应，使用两套引物扩增特异性的DNA片段，第二对引物的功能是特异性的扩增位于首轮PCR产物内的一段DNA片段。第一轮扩增中，外引物用以产生扩增产物，此产物在内引物的存在下进行第二轮扩增，从而提高反应的特异性获得的产物特异性更强，B正确；内引物扩增的模板是外引物扩增后的产物，第二阶段反应能否进行，也是对第一阶段反应正确性的鉴定：如果利用外引物扩增产生了错误片段，再利用内引物扩增在错误片段上进行引物配对并扩增的概率减小，C正确，D错误。 23.PCR是以模拟体内DNA复制的方式在体外选择性地将DNA某个特殊区域进行扩增的技术。DNA扩增过程的产物有长产物片段和短产物片段两种，其形成过程如图1所示。请回答下列问题： 图1 (1)DNA复制时子链延伸的方向是________(填“5′→3′”或“3′→5′”)。由于DNA聚合酶不能直接催化两个单核苷酸之间的反应，因此DNA复制需要一段单链DNA或RNA作为________。 (2)如果扩增序列为图2所示的两段序列之间的DNA片段，请从表中列出的引物中选出一对合适的引物________。 5′→GACCTGTGGAAGC……CATACGGGATTG­3′ 3′­CTGGACACCTTCG……GTATGCCCTAAC­5′ 图2 引物Ⅰ 引物Ⅱ 甲 5′­GACCTGTGGAAGC A 5′­CATACGGGATTG 乙 5′­CTGGACACCTTCG B 5′­GTATGCCCTAAC 丙 5′­CGAAGGTGTCCAG C 5′­GTTAGGGCTTAC 丁 5′­GCTTCCACAGGTC D 5′­CAATCCCGTATG (3)下面为某同学利用PCR仪进行PCR的操作步骤，请完善相关步骤内容。 a.按配方准备好各组分。 b.用微量移液器向微量离心管中依次加入各组分：模板DNA，4种脱氧核糖核苷三磷酸、________、引物、缓冲液等。 c.________使反应液聚集在微量离心管底部。 d.将微量离心管放入PCR仪，设定好PCR仪的循环程序。 e.进行PCR反应。 (4)PCR的产物片段中，只有________才是符合要求的目标产物。 【答案】　(1)5′→3′　引物　(2)甲和D　(3)耐高温的DNA聚合酶　离心　(4)双链短产物片段 【解析】(1)DNA复制时子链延伸的方向是5′→3′。由于DNA聚合酶不能直接催化两个单核苷酸之间的反应，因此DNA复制需要一段单链DNA或RNA作为引物，当引物与模板链结合后，单个的脱氧核苷酸才能结合上来。 (2)引物与DNA的模板链的3′端能够配对，如果扩增序列为图2所示的两段序列之间的DNA片段，则根据碱基互补配对原则，最合适的引物为甲和D。 (3)PCR是在体外进行DNA复制的技术。该过程需要模板、原料、引物、耐高温的DNA聚合酶等。离心使反应液聚集在微量离心管底部。 (4)DNA是双链，PCR的产物片段中，只有双链短产物片段才是符合要求的目标产物。 24.研究发现，增强子是基因转录的调控序列，具有促进启动子表达下游基因的作用；增强子可以位于基因的5′端，也可以位于基因的3′端。人肺特异性X蛋白(LUNX)基因是某种肺癌诊断的标志物，为了研究LUNX基因的增强子是否具有增强基因表达的功能以及其发挥作用的位置是位于启动子的上游还是下游。科研人员从人类全基因组序列数据库中利用生物信息学的方法筛选并利用PCR技术扩增了3个LUNX基因增强子片段(En，表示E1～E3)，分别定向连接到pGL3载体中荧光素酶报告基因(luc＋)启动子(SV40启动子)的上游和下游，如图所示，并通过相关技术检测荧光素酶的活性从而对增强子的功能进行判断，luc＋的表达强度越强，荧光素酶的活性越高。 (1)为了扩增以上3个LUNX基因增强子片段，需要人为设计合适的引物，在上述实验中共需要设计________种引物用于PCR反应体系；为了定向连接到pGL3载体中，在引物5′端需要引入的限制性酶切位点为________种，PCR每次循环一般可以分为________________三步。 (2)以上3个LUNX基因增强子片段经回收、纯化、测序正确后，将双酶切后的PCR产物分别定向连接到用________双酶切和________双酶切的pGL3载体中，构建LUNX基因增强子分别位于报告基因上游和下游的载体，载体中的氨苄青霉素抗性基因Ampr可用来____________________，画出E1连接到pGL3载体报告基因下游的图谱。 (3)根据相关实验技术对荧光素酶的活性进行检测，结果如图3所示， 图3 根据结果得出的结论是______________________________________________。 【答案】　(1)12　4　变性、复性和延伸 (2)KpnⅠ/XhoⅠ　BamHⅠ/SalⅠ　重组DNA分子的筛选　见解析图　(3)增强子E1、E2和E3在启动子的下游都能增强基因表达，其中E1的作用最为显著，E3在启动子的上游和下游都能增强基因表达。 【解析】(1)引物是基因两端的碱基序列，3个LUNX基因，每个基因2条链，每条链的两端各需一种引物，所以扩增以上3个LUNX基因增强子片段需要设计12种引物用于PCR反应体系；目的基因与载体结合前需要用限制酶对两者进行切割，延伸是在引物的3′端延伸，为了保证目的基因的完整性，因此需在引物的5′端加上限制性酶切位点，且为了使DNA片段能定向插入表达载体，减少自连，常在两条引物上设计加入不同的限制性酶切位点，即在引物5′端需要引入的限制性酶切位点为4种，PCR每次循环一般可以分为变性、复性和延伸三步。 (2)PCR产物分别用KpnⅠ/XhoⅠ和BamHⅠ/SalⅠ双酶切，为了便于PCR产物与切割后的质粒连接，因此切割质粒也需要KpnⅠ/XhoⅠ和BamHⅠ/SalⅠ，通过题图限制酶切位点可知，KpnⅠ/XhoⅠ和BamHⅠ/SalⅠ双酶切位点符合构建基因表达载体的要求；氨苄青霉素抗性基因Ampr，可作为基因工程的标记基因，只有成功转入的由于有抗性基因而存活，从而找出那些成功转入了表达载体的细菌。E1连接到pGL3载体报告基因下游的图谱为 (3)分析实验结果可知，与对照组相比，增强子E1、E2和E3在启动子的下游都能增强基因表达，其中E1的作用最为显著，E3在启动子的上游和下游都能增强基因表达。 25.新冠肺炎疫情发生后，全球多地已成功分离出新型冠状病毒毒株，为研发新型冠状病毒核酸检测试剂盒等奠定了基础。实时荧光定量PCR在诊断新型冠状病毒感染中发挥着关键作用，其具体的过程为：从样品中提取RNA→反转录成DNA→PCR扩增→荧光检测。请回答下列问题： (1)新型冠状病毒在不同动物体内翻译出基本相同的多肽链，这是因为___________________________________________________________________。 (2)核酸检测样本多采集于咽、鼻，这些部位存在多种微生物，提取物中核酸种类可能有多种，但通过PCR技术可专一地对新型冠状病毒的核酸序列进行扩增，原因是_______________________________________________________________。 (3)用新型冠状病毒核酸检测试剂盒进行检测时，若送检样本中存在新型冠状病毒，则以新型冠状病毒RNA为模板， 在________酶的作用下合成cDNA，合成cDNA过程中的碱基配对方式为________________________。检测时应设置一空白对照组，若该组别也探测到荧光，则说明_____________________________________。 (4)新型冠状病毒的遗传物质为RNA，RNA易变异，世界多地已经检测出多种变异毒株，这可能导致的危害有：______________________________________(写出两个)。 【答案】　(1)几乎所有的生物体都共用一套密码子　(2)引物是根据新型冠状病毒的核酸的一段已知序列设计合成的(或引物能与新型冠状病毒核酸的cDNA特异性结合)　(3)逆转录　A—T、U—A、C—G、G—C　检测过程存在污染，检测结果不可靠(合理即可) (4)变异毒株无法被检测到、病毒的传染性增强、病毒的致病性增强、已经接种的疫苗失效(合理即可) 【解析】(1)几乎所有的生物体都共用一套密码子，故在不同的宿主细胞中，该病毒可翻译出基本相同的多肽链。 (2)进行PCR扩增时，需要加入设计好的一对引物。若引物是根据新型冠状病毒RNA的一段已知序列设计合成的，就能够实现专一地扩增新型冠状病毒的核酸序列。 (3)若送检样本中存在新型冠状病毒，则以病毒RNA为模板，在逆转录酶的作用下合成cDNA。合成cDNA过程中的碱基配对方式为A—T、U—A、C—G。若空白对照组探测到荧光，则说明检测过程存在污染，检测结果不可靠。 (4)新型冠状病毒的遗传物质是RNA，RNA变异可能使病毒的性状改变，导致变异毒株无法被检测到、病毒的传染性增强、病毒的致病性增强、已经接种的疫苗失效等。 【题型四】基因工程的应用 26.利用转基因山羊乳腺生物反应器生产丁酰胆碱酯酶，可治疗有机磷中毒。下列叙述错误的是(　　) A.应该用山羊乳腺中特异表达的基因的启动子构建基因表达载体 B.通过体细胞克隆可将丁酰胆碱酯酶基因传递给子代 C.通过显微注射技术将基因表达载体导入山羊乳腺细胞 D.山羊乳腺细胞可将肽链加工成具有一定空间结构的丁酰胆碱酯酶 【答案】　C 【解析】要得到转基因山羊乳腺生物反应器，在构建基因表达载体时需要乳腺中特异表达的基因的启动子，使目的基因只在乳腺细胞中表达，A正确；通过显微注射技术将基因表达载体导入山羊受精卵，C错误；山羊乳腺细胞含有内质网和高尔基体，可将肽链加工成具有一定空间结构的丁酰胆碱酯酶，D正确。 (不定项)27.植物生物反应器主要以整株植物、植物组织或植物悬浮细胞为加工场所，生产药物蛋白。叶绿体遗传转化体系是近年发展起来的一种新的植物生物反应器。叶绿体转化是以同源重组原理将外源目的基因整合到目标叶绿体基因组中的一种方式，是一种高表达、安全性极高的遗传转化方法。下列相关叙述正确的是(　　) A.植物生物反应器涉及的现代生物学技术是基因工程和植物细胞工程 B.构建的基因表达载体中含有叶绿体特异启动子，使得目的基因只能在叶绿体中表达 C.植物叶绿体表达体系可以防止转基因作物的目的基因通过花粉在自然界中扩散 D.把目的基因导入叶绿体DNA中，将来产生的配子一定含有此目的基因 【答案】　ABC 【解析】植物生物反应器首先需要用基因工程技术将目的基因导入植物细胞，其次需要采用植物细胞工程技术将转基因植物细胞培育成转基因植株或转基因植物组织或转基因植物悬浮细胞，因此涉及基因工程和细胞工程技术，A正确；要使目的基因只能在叶绿体中表达，则构建的基因表达载体中要含有叶绿体特异性启动子，B正确；由于受精卵中的细胞质几乎全部来自卵细胞，因此植物叶绿体表达体系可以防止转基因作物的目的基因通过花粉在自然界中扩散，C正确；把目的基因导入叶绿体DNA中，叶绿体DNA存在于细胞质中，在配子产生过程中并不遵循遗传定律，所以将来产生的配子中不一定含有此目的基因，D错误。 28.运用现代生物技术的育种方法，将抗菜青虫的Bt基因转入优质油菜中，培育出转基因抗虫油菜品种，该品种在生长过程中能产生抗虫蛋白，对菜青虫有显著抗性，能提高油菜产量，减少农药使用量，保护农业生态环境。根据以上信息，分析下列叙述正确的是(　　) A.Bt基因的本质是蛋白质 B.Bt基因中有菜青虫的遗传物质 C.转基因抗虫油菜能产生抗虫蛋白是由于其具有Bt基因 D.转基因抗虫油菜产生的抗虫蛋白是无机物 【答案】　C 【解析】Bt基因的本质是有遗传效应的DNA片段，A错误；Bt基因不是来源于菜青虫，不含菜青虫的遗传物质，B错误；基因控制生物的性状，将抗菜青虫的Bt基因转移到油菜中，培育出转基因抗虫油菜，该品种能产生抗虫蛋白，对菜青虫有显著抗性，表明转基因抗虫油菜能产生抗虫蛋白是由于其具有Bt基因，C正确；转基因抗虫油菜产生的抗虫蛋白是一种蛋白质，属于有机物，D错误。 29.几丁质是许多真菌细胞壁的重要成分，几丁质酶可催化其水解。将几丁质酶基因转入菊花体内，可增强其抗真菌病的能力。下列有关叙述错误的是(　　) A.将几丁质酶基因插入Ti质粒的T­DNA上构建表达载体 B.可通过显微注射法将农杆菌导入菊花受体细胞 C.可用PCR等技术检测目的基因是否成功导入 D.可用真菌接种实验检测转基因菊花对真菌的抗性程度 【答案】　B 【解析】Ti质粒的T­DNA可以转移到受体细胞中，并且整合到受体细胞染色体的DNA上，根据这一特点，构建表达载体时，应该将目的基因即几丁质酶基因插入到Ti质粒的T－DNA上，A正确；可通过农杆菌转化法将农杆菌导入菊花受体细胞，显微注射法是用于将目的基因导入动物细胞的方法，B错误；根据题干信息“几丁质酶基因转入菊花体内，可增强其抗真菌病的能力”，故可用真菌接种实验检测转基因菊花对真菌的抗性程度，D正确。 30.青蒿素是有效的抗疟药物，但野生黄花蒿青蒿素产量低，为缓解青蒿素供应不足的状况，科学家将tms基因和tmr基因导入黄花蒿的愈伤组织从而获得了黄花蒿的冠瘿组织，实验过程用到的部分结构如下图。请据图回答问题： (1)在构建重组Ti质粒的过程中常使用两种能产生不同黏性末端的限制性内切核酸酶对目的基因和Ti质粒分别进行切割，这样做的好处有_________________。 (2)将目的基因导入黄花蒿愈伤组织前，先将目的基因导入农杆菌，农杆菌的作用是_______________________________________________________________。 (3)为了准确鉴别受体细胞中是否含有目的基因并将含有目的基因的细胞筛选出来，所选的Ti质粒至少应包含________种抗生素抗性基因，以便筛选和鉴别。 (4)与愈伤组织相比，冠瘿组织的生长速度更快，原因可能是__________________________________________________________________。 (5)艾弗里等人的肺炎链球菌转化实验为证明DNA是遗传物质做出了重要贡献，也可以说是基因工程的先导，如果他们的工作为基因工程理论的建立提供了启示，那么，这一启示是___________________________________________________。 【答案】　(1)可以避免目的基因和Ti质粒的自身连接成环和反向连接(可使目的基因定向插入Ti质粒)　(2)农杆菌可感染植物并将目的基因转移到受体细胞中　(3)2　(4)tms基因和tmr基因编码产物控制合成了生长素和细胞分裂素，促进了冠瘿组织的生长　(5)DNA可以在同种生物不同个体之间转移 【解析】(1)在构建重组Ti质粒的过程中常使用两种能产生不同黏性末端的限制性内切核酸酶对目的基因和Ti质粒分别进行切割，可以避免目的基因和Ti质粒的自身连接成环和反向连接(可使目的基因定向插入Ti质粒)。 (2)将目的基因导入植物细胞时，常用农杆菌转化法，是因为农杆菌可感染植物并将目的基因转移到受体细胞中。 (3)图中插入了2个目的基因，为了准确鉴别受体细胞中是否含有目的基因，并将含有目的基因的细胞筛选出来，所选的Ti质粒至少应包含2种抗生素抗性基因，以便筛选和鉴别。 (4)据Ti质粒图示可知，Ti质粒中的tms基因和tmr基因编码产物控制合成了生长素和细胞分裂素，促进了冠瘿组织的生长，因此与愈伤组织相比，冠瘿组织的生长速度更快。 (5)肺炎链球菌转化实验中，S型菌的DNA进入R型菌中并能表达，说明DNA可以在同种生物不同个体之间转移，为基因工程理论的建立提供了启示。 31.乳腺炎和口蹄疫分别是由细菌和病毒引起的危害奶牛养殖业的两种严重疾病。研究者利用生物技术培育出转牛乳铁蛋白肽(抗细菌)和干扰素(抗病毒)基因的双转基因奶牛品种。下图1为基因表达载体，图2为培育流程。请据图回答问题： (1)构建基因表达载体时需要用到的工具酶是___________________________________。 (2)基因表达过程包括________，图1中一般能同时表达的基因是_________________________________。 新霉素抗性基因的作用是______________________________________________。 (3)图2中研究者可利用____________________________技术筛选出干扰素基因成功表达的胚胎进行移植。 (4)若利用PCR技术增加目的基因的数量，由图3可知，A、B、C、D四种单链DNA片段中应选取________作为引物(DNA复制子链的延伸方向5′→3′)。若上图所示基因复制2次，则共需要这两种引物各________个；PCR程序中“适温延伸”中的适温是________酶的最适温度。 【答案】　(1)限制酶和DNA连接酶　(2)转录和翻译　干扰素基因和新霉素抗性基因　便于筛选出含有目的基因的细胞　(3)抗原—抗体杂交　(4)B和C　3　耐高温的DNA聚合 【解析】(1)构建基因表达载体时需要用到的工具酶是限制酶和DNA连接酶。 (2)基因表达过程包括转录和翻译，据图可知，干扰素基因和新霉素抗性基因均位于相同的启动子和终止子之间，可同时转录。新霉素抗性基因的作用是便于筛选出含有目的基因的细胞。 (3)干扰素基因可在牛全身细胞表达，因此筛选胚胎时可利用抗原—抗体杂交技术筛选出干扰素基因成功表达的胚胎。 (4)若利用PCR技术增加目的基因的数量，由图3可知，DNA复制只能从5′到3′，因此构建前利用PCR技术扩增干扰素基因时，A、B、C、D四种单链DNA片段中应选取B和C作为引物。若题图所示基因复制2次，则共需要这两种引物各3个；PCR程序中“适温延伸”中的适温是耐高温的DNA聚合酶的最适温度。 32.乙肝病毒表面有T1蛋白和T2蛋白，免疫接种实验表明这两种蛋白质都可引起实验动物的免疫反应。科研人员用农杆菌转化法培育出转基因番茄，用于生产可口服的乙肝病毒疫苗，为预防乙肝开辟了一条新途径。回答下列问题： (1)T1蛋白和T2蛋白进入实验动物的肠道后，会被实验动物小肠黏膜上的一种M细胞当作________处理，进而引发一系列的免疫反应，最终产生相应的________，使实验动物获得了对乙肝病毒的免疫能力。 (2)构建基因表达载体是基因工程的核心，其目的是_____________________。构建表达载体时，需要选择果实特异性启动子，其目的是__________________________________________。 (3)用转基因番茄生产可口服的乙肝病毒疫苗(含T1蛋白)，若要检测目的基因是否翻译出T1蛋白，可用的检测物质是________________(填“T1蛋白的基因”或“T1蛋白的抗体”)，该检测方法称为_______________________________________。 (4)获得转基因番茄植株后，已确定该植株所结番茄中含有T2蛋白，此后还要对T2蛋白的功能进行个体水平的鉴定，方法是____________________________。 【答案】　(1)抗原　抗体和记忆细胞　(2)使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用　使目的基因在番茄果实细胞中特异性表达　(3)T1蛋白的抗体　抗原—抗体杂交　(4)用转基因番茄植株生产的T2蛋白对实验动物进行免疫接种实验(或用转基因番茄植株的果实对实验动物进行口服免疫) 【解析】(1)T1蛋白和T2蛋白是乙肝病毒表面的蛋白质，进入实验动物的肠道后，会被当作抗原处理，进而引发一系列的免疫反应，最终产生相应的记忆细胞和抗体。 (2)构建基因表达载体的目的是使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。要想使目的基因在番茄果实细胞中特异性表达，在构建表达载体时，需要选择果实特异性启动子。 (3)用转基因番茄生产可口服的乙肝病毒疫苗(含T1蛋白)，若要检测目的基因是否翻译出T1蛋白，可用T1蛋白的抗体进行抗原—抗体杂交。 (4)乙肝病毒表面有T1蛋白和T2蛋白，免疫接种实验表明这两种蛋白质都可引起实验动物的免疫反应。在已确定该转基因番茄植株所结番茄中含有T2蛋白的前提下，进行个体水平的鉴定方法是用转基因番茄植株生产的T2蛋白对实验动物进行免疫接种实验(或用转基因番茄植株的果实对实验动物进行口服免疫)。 【题型五】蛋白质工程的原理和应用 33.纤维素酶广泛应用于医药、食品发酵、造纸、废水处理等领域。研究人员利用蛋白质工程将细菌纤维素酶的相应氨基酸替换后，纤维素酶热稳定性得到了提高。下列有关该技术的说法，正确的是(　　) A.改造后的纤维素酶的较高热稳定性不可遗传 B.对纤维素酶的改造需要以基因工程为基础 C.改造纤维素酶无需构建基因表达载体 D.对纤维素酶的改造是通过直接改造mRNA实现的 【答案】　B 【解析】由于蛋白质工程是进行了基因改造，所以改造后的纤维素酶的较高热稳定性是可遗传的，A错误；对纤维素酶的改造需要以基因工程为基础，B正确；改造纤维素酶同样需构建基因表达载体，C错误；对纤维素酶的改造是通过改造控制合成纤维素酶的基因来实现的，D错误。 34.下图表示蛋白质工程的操作过程，相关说法不正确的是(　　) A.a、b过程分别是转录、翻译 B.蛋白质工程中对蛋白质分子结构的了解是非常关键的工作 C.蛋白质工程是完全摆脱基因工程技术的一项全新的生物工程技术 D.蛋白质工程中可能构建出一种全新的基因 【答案】　C 【解析】a过程是以DNA的一条链为模板合成mRNA的转录过程，b过程是以mRNA为模板合成具有一定氨基酸顺序的多肽链的翻译过程，A正确；蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过基因改造或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活需求，因此蛋白质工程中对蛋白质分子结构的了解是非常关键的工作，B正确；蛋白质工程是在基因工程的基础上，延伸出来的第二代基因工程，C错误；蛋白质工程中，可能根据已经明确的蛋白质的结构构建出一种全新的基因，D正确。 35.水蛭是我国的传统中药材，主要药理成分水蛭素为水蛭蛋白中重要成分之一，具有良好的抗凝血作用。拟通过蛋白质工程改造水蛭素结构，提高其抗凝血活性。回答下列问题： (1)蛋白质工程流程如图所示，物质a是________________，物质b是__________。在生产过程中，物质b可能不同，合成的蛋白质空间构象却相同，原因是_______________________________________。 (2)蛋白质工程是基因工程的延伸，基因工程中获取目的基因的常用方法有________________________、________________________________和利用PCR技术扩增。PCR技术遵循的基本原理是__________________。 (3)将提取的水蛭蛋白经甲、乙两种蛋白酶水解后，分析水解产物中的肽含量及其抗凝血活性，结果如图所示。推测两种处理后酶解产物的抗凝血活性差异主要与肽的________(填“种类”或“含量”)有关，导致其活性不同的原因是__________________________________________________。 (4)若要比较蛋白质工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素的抗凝血活性差异，简要写出实验设计思路。 ___________________________________________________________________。 【答案】　(1)氨基酸序列多肽链　mRNA　密码子的简并　(2)从基因文库中获取目的基因　通过DNA合成仪用化学方法人工合成　DNA半保留复制　(3)种类　提取的水蛭蛋白的酶解时间和处理的酶的种类不同，导致水蛭蛋白水解产物的空间结构不同 (4)取3支试管，分别加入等量的蛋白质工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素；用注射器取同一种动物(如家兔)血液，立即将等量的血液加入1、2、3号三支试管中，放在适宜条件下静置一段时间，统计三支试管中血液凝固时间 【解析】(1)根据蛋白质工程的基本流程，a是氨基酸序列多肽链，b是mRNA。在生产过程中，mRNA可能不同，合成的蛋白质空间构象却相同，原因是密码子具有简并的特性，即一种氨基酸可能有几个对应的密码子，使不同mRNA翻译出来的氨基酸序列相同。 (2)蛋白质工程是基因工程的延伸，基因工程中获取目的基因的常用方法有从基因文库中获取、通过DNA合成仪进行人工合成和利用PCR技术扩增。PCR技术是体外扩增DNA的技术，遵循的基本原理是DNA半保留复制。 (3)分析曲线图可知，酶甲、酶乙处理，水解产物中的肽含量都随着酶解时间的延长而逐渐升高，且两种酶作用下差别不大；经酶甲处理后，随着酶解时间的延长，抗凝血活性先升高而后保持相对稳定；经酶乙处理后，随着酶解时间的延长，抗凝血活性先上升而后有所下降，且酶甲处理后的产物的抗凝血活性最终高于酶乙处理后的酶解产物的抗凝血活性。据此推测两种酶处理后水解产物的抗凝血活性差异主要与肽的种类有关，导致其活性不同的原因是对水蛭蛋白进行酶解时的酶的种类不同，导致水蛭蛋白水解产物的空间结构不同。 (4)若要比较蛋白质工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素的抗凝血活性差异，可以以三种物质作为自变量，分别检测它们的抗凝血活性，故实验设计思路为：取3支试管，分别加入等量的蛋白质工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素；取同一种动物(如家兔)血液，立即将等量的血液加入1、2、3号三支试管中，放在适宜条件下静置一段时间，观察统计三支试管中血液凝固时间。 36.以我国科学家为主的科研团队将OSNL(即4个基因Oct4/Sox2/Nanog/Lin28A的缩写)导入黑羽鸡胚成纤维细胞(CEFs)，诱导其重编程为诱导多能干细胞(iPS)，再诱导iPS分化为诱导原始生殖细胞(iPGCs)，然后将iPGCs注射到孵化2.5天的白羽鸡胚血管中，最终获得具有黑羽鸡遗传特性的后代，实验流程如图。回答下列问题。 (1)CEFs是从孵化9天的黑羽鸡胚中分离获得的，为了获得单细胞悬液，鸡胚组织剪碎后需用________处理。动物细胞培养通常需要在合成培养基中添加________等天然成分，以满足细胞对某些细胞因子的需求。 (2)体外获取OSNL的方法有________________(答出1种即可)。若要在CEFs中表达外源基因的蛋白，需构建基因表达载体，载体中除含有目的基因和标记基因外，还须有启动子和________等。启动子是________识别和结合的部位，有了它才能驱动__________________________________。 (3)iPS细胞和iPGCs细胞的形态、结构和功能不同的根本原因是____________________________________________________________________。 (4)诱导iPS细胞的技术与体细胞核移植技术的主要区别是__________________________________________________________________。 (5)该实验流程中用到的生物技术有__________________________________(答出2点即可)。 【答案】　(1)胰蛋白酶或胶原蛋白酶　血清　(2)基因文库法、PCR技术、人工合成法(任答1种)　终止子　RNA聚合酶　目的基因转录出mRNA，最终表达出所需要的蛋白质　(3)基因的选择性表达 (4)诱导iPS细胞的技术是将已分化的细胞诱导为类似胚胎干细胞的一种细胞(iPS)，再诱导iPS分化为诱导原始生殖细胞(iPGCs)的技术；体细胞核移植技术是将动物一个体细胞的细胞核移入去核的卵母细胞中，使这个重新组合的细胞发育成新胚胎，继而发育成动物个体的技术　(5)基因工程、动物细胞培养 【解析】(1)动物细胞培养时，动物组织剪碎后需要用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理一段时间，以便获得单个细胞。使用合成培养基培养动物细胞时，通常需要添加血清等天然成分，以满足细胞对某些细胞因子的需求。 (2)体外获取目的基因的方法有多种，如基因文库法、PCR技术、人工合成法。基因表达载体的组成包括目的基因、标记基因、启动子、终止子等结构，启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了启动子才能驱动目的基因转录出mRNA，最终获得所需要的蛋白质。 (3)iPGCs细胞是由iPS细胞增殖、分化而来的，两者在形态、结构和功能方面不同的根本原因是基因的选择性表达。 (4)诱导iPS细胞的技术与体细胞核移植技术存在明显的区别，主要表现在诱导iPS细胞的技术是将已分化的细胞诱导为类似胚胎干细胞的一种细胞(iPS)，再诱导iPS分化为诱导原始生殖细胞(iPGCs)的技术；而体细胞核移植技术是将动物一个体细胞的细胞核移入去核的卵母细胞中，使这个重新组合的细胞发育成新胚胎，继而发育成动物个体的技术。 (5)分析题意可知，该实验流程中用到的生物技术有基因工程、动物细胞培养技术。 37.中国是传统的水稻种植大国，有一半以上人口以稻米为主食。在培育水稻优良品种的过程中，发现某野生型水稻叶片绿色由基因C控制。回答下列问题： (1)突变型1叶片为黄色，由基因C突变为C1所致，基因C1纯合幼苗期致死。突变型1连续自交3代，F3成年植株中黄色叶植株占________。 (2)测序结果表明，突变基因C1转录产物编码序列第727位碱基改变，由5′－GAGAG－3′ 变为5′－GACAG－3′，导致第______位氨基酸突变为__________，从基因控制性状的角度解释突变体叶片变黄的机理_____________________________________________。(部分密码子及对应氨基酸：GAG谷氨酸；AGA精氨酸；GAC天冬氨酸；ACA苏氨酸；CAG谷氨酰胺) (3)由C突变为C1产生了一个限制酶酶切位点。从突变型1叶片细胞中获取控制叶片颜色的基因片段，用限制酶处理后进行电泳(电泳条带表示特定长度的DNA片段)，其结果为图中____(填“Ⅰ”“Ⅱ”或“Ⅲ”)。 (4)突变型2叶片为黄色，由基因C的另一突变基因C2所致。用突变型2与突变型1杂交，子代中黄色叶植株与绿色叶植株各占50%。能否确定C2是显性突变还是隐性突变？______(填“能”或“否”)，用文字说明理由_______________________________________________________________。 【答案】　(1)2/9　(2)243　谷氨酰胺　基因突变影响与色素形成有关酶的合成，导致叶片变黄　(3)Ⅲ　(4)能　若C2是隐性突变，则突变型2为纯合子，则子代CC2表现为绿色，C1C2表现为黄色，子代中黄色叶植株与绿色叶植株各占50%。若突变型2为显性突变，突变型2(C2C)与突变型1(CC1)杂交，子代表现型及比例应为黄∶绿＝3∶1，与题意不符 【解析】(1)突变型1叶片为黄色，由基因C突变为C1所致，基因C1纯合幼苗期致死，说明突变型1应为杂合子，C1对C为显性，突变型1自交1代，子一代中基因型为1/3CC、2/3C1C，F2中3/5CC、2/5C1C，F3成年植株中黄色叶植株占2/9。 (2)突变基因C1转录产物编码序列第727位碱基改变，由5＇－GAGAG－3＇变为5＇－GACAG－3＇，突变位点前对应氨基酸数为726/3＝242，则会导致第243位氨基酸由谷氨酸突变为谷氨酰胺。叶片变黄是叶绿体中色素含量变化的结果，而色素不是蛋白质，从基因控制性状的角度推测，基因突变影响与色素形成有关酶的合成，导致叶片变黄。 (3)突变型1应为杂合子(C1C)，由C突变为C1产生了一个限制酶酶切位点。Ⅰ应为C酶切、电泳结果， Ⅱ应为C1酶切、电泳结果，从突变型1叶片细胞中获取控制叶片颜色的基因片段，用限制酶处理后进行电泳，其结果为图中Ⅲ。 (4)用突变型2(C2_)与突变型1(C1C)杂交，子代中黄色叶植株与绿色叶植株各占50%。若C2是隐性突变，则突变型2为纯合子，则子代CC2表现为绿色，C1C2表现为黄色，子代中黄色叶植株与绿色叶植株各占50%。若突变型2为显性突变，突变型2(C2C)与突变型1(C1C)杂交，子代表现型及比例应为黄∶绿＝3∶1，与题意不符。故C2是隐性突变。 38.目前科学家们通过蛋白质工程制造出了蓝色荧光蛋白、黄色荧光蛋白等。采用蛋白质工程技术制造出蓝色荧光蛋白的过程的正确顺序是(　　) ①推测蓝色荧光蛋白的氨基酸序列和确定相对应的脱氧核苷酸序列　②根据预期的蓝色荧光蛋白的功能设计其结构　③合成蓝色荧光蛋白基因　④表达出蓝色荧光蛋白 A.①②③④ B.②①③④ C.②③①④ D.④②①③ 【答案】　B 【解析】参照蛋白质工程的基本途径，采用蛋白质工程技术制造出蓝色荧光蛋白的过程的正确顺序是②根据预期的蓝色荧光蛋白的功能设计其结构→①推测蓝色荧光蛋白的氨基酸序列和确定相对应的脱氧核苷酸序列→③合成蓝色荧光蛋白基因→④表达出蓝色荧光蛋白。 39.T4溶菌酶在高温时易失去活性。研究人员对编码T4溶菌酶的基因进行改造，使T4溶菌酶第3位的异亮氨酸变为半胱氨酸，该半胱氨酸与第97位的半胱氨酸之间形成一个二硫键，提高了酶的耐热性。下列相关叙述正确的是(　　) A.T4溶菌酶耐热性提高的原因是组成该酶的氨基酸种类和数量发生了改变 B.T4溶菌酶的改造属于蛋白质工程，自然界中的酶都可通过蛋白质工程进行改造 C.蛋白质工程与中心法则的流动方向一致，即DNA→mRNA→蛋白质 D.若高温使蛋白质分子的空间结构发生改变，蛋白质的功能也会受到影响 【答案】　D 【解析】由题意可知，T4溶菌酶耐热性提高的原因是组成该酶的氨基酸种类均发生了改变，但组成该酶的氨基酸数量未变，A错误；T4溶菌酶的改造属于蛋白质工程，酶大多是蛋白质，少数是RNA，蛋白质工程只能用于改造蛋白质类酶，B错误；蛋白质工程与中心法则的流动方向相反，C错误；若高温使蛋白质分子的空间结构发生改变，蛋白质的功能也会受到影响，D正确。 40.錾字石村因甜柿出名而获“中国甜柿之乡”。甜柿鲜果肉中含有可溶性糖、微量元素、维生素和β－胡萝卜素等多种成分，营养价值高，深受消费者的喜爱。甜柿的自然脱涩与乙醛代谢关键酶基因(PDC)密切相关，推测涩味程度可能与PDC基因的表达情况有关。已知启动子区域存在着许多调控蛋白的结合位点，RNA聚合酶和调控蛋白共同影响基因的表达水平。AD基因表达出的AD蛋白与启动子足够靠近时，能够激活后续基因转录，据此可利用与AD蛋白形成的融合蛋白来筛选待测蛋白。为筛选PDC基因的调控蛋白，科研人员进行了下列实验。回答下列问题。 注：金担子素是一种抗真菌药物 甲 (1)PDC基因的启动子序列未知，为获得大量该基因启动子所在片段，可利用限制酶将基因组DNA进行酶切，然后在________的作用下将已知序列信息的接头片段连接在PDC基因的上游，根据接头片段和PDC基因编码序列设计引物进行PCR，引物的作用是____________________________，目前在PCR反应中使用Taq酶而不使用大肠杆菌DNA聚合酶的主要原因是_________________________________________________________________。 (2)利用质粒A构建含有PDC基因启动子片段的重组质粒并导入代谢缺陷型酵母菌，用不含________的培养基可筛选出成功转化的酵母菌Y1H；将从甜柿中提取的RNA逆转录形成的各种cDNA与质粒G连接后导入酵母菌，此时应选择质粒G中的位点________(填序号1～5)作为cDNA的插入位点，最终获得携带不同cDNA片段的酵母菌群Y187。重组酵母Y1H与Y187能够进行接合生殖，形成的接合子含有两种酵母菌质粒上的所有基因。若接合子能在含有金担子素的培养基中生存，则推测待测蛋白是PDC基因的调控蛋白，请结合图丙简述作出该推测的理由____________________________________________。 (3)筛选出PDC基因的调控蛋白后，为满足生产上的需要对其进行改良，这种技术属于________工程，该工程的起点是____________。 【答案】　(1)DNA连接酶　与模板链结合，提供DNA延伸起始位点　大肠杆菌DNA聚合酶不耐高温，在高温下会失活　(2)尿嘧啶　2　接合子中待测蛋白与AD蛋白形成了融合蛋白，若待测蛋白是PDC基因的调控蛋白，就能与PDC基因启动子结合，AD蛋白也能靠近PDC基因启动子并激活金担子素基因的表达，使酵母菌表现出金担子素抗性　(3)蛋白质　预期蛋白质的功能 【解析】(1)该操作为目的基因和运载体的酶切和连接，限制酶切割后需要在DNA连接酶的作用下连接，即在DNA连接酶的作用下将已知序列信息的接头片段连接在PDC基因的上游。引物是人工合成的两段寡核苷酸序列，其作用是与模板链结合，提供DNA延伸起始位点。大肠杆菌DNA聚合酶不耐高温，在高温下会失活，而PCR反应体系中加入的聚合酶需耐高温，Taq酶是耐高温的DNA聚合酶，故在PCR反应中使用Taq酶而不使用大肠杆菌DNA聚合酶。 (2)由质粒A的图谱可知，带有选择功能的基因片段有尿嘧啶合成基因、金担子素抗性基因两种，但是金担子素抗性基因无法启动，所以选择尿嘧啶合成基因作为选择依据，则用不含尿嘧啶的培养基可筛选出成功转化的酵母菌Y1H。科研人员从甜柿中提取RNA，将逆转录形成的各种cDNA与质粒G连接后导入酵母菌，cDNA片段需要插入启动子之后，且不能破坏其他蛋白质基因的表达，因此选择2作为cDNA的插入位点。依据题干和图丙，重组酵母Y187与Y1H接合子应同时含有质粒A、质粒G，则接合子有质粒A为含有PDC基因、金担子素抗性基因的质粒；质粒G为可正常表达AD蛋白、待测蛋白的质粒，接合子中待测蛋白与AD蛋白形成了融合蛋白，若待测蛋白是PDC基因的调控蛋白，就能与PDC基因启动子结合，则AD蛋白携带的待测蛋白靠近PDC基因启动子，激活PDC基因的转录，并激活金担子素抗性基因的表达，使酵母菌表现出金担子素抗性，能在含有金担子素的培养基中生存。 (3)筛选出PDC基因的调控蛋白后，为满足生产上的需要对其进行改良，即对蛋白质进行改造，这种技术属于蛋白质工程。蛋白质工程的设计流程为：预期蛋白质的功能→设计预期的蛋白质的结构→推测应有的氨基酸序列→找出相对应的脱氧核苷酸序列(基因)，所以蛋白质工程的起点是预期蛋白质的功能。 【题型六】生物技术的安全性和伦理问题 41.关于现代生物工程技术应用安全性的评价，下列叙述正确的是(　　) A.由于存在生殖隔离，大量种植转基因抗除草剂农作物不存在安全性问题 B.中国政府不反对治疗性克隆，可以有限制地进行生殖性克隆研究 C.《禁止生物武器公约》规定在任何情况下都不发展、不生产生物武器，但可储存少量的生物武器用于研究 D.转基因的受体细胞通常限制在遗传上有特定缺陷的生物上 【答案】　D 【解析】转基因抗除草剂农作物可能通过花粉传播到杂草中，存在安全性问题，A错误；中国政府的态度是禁止生殖性克隆人，坚持四不原则(不赞成、不允许、不支持、不接受任何生殖性克隆人实验)，不反对治疗性克隆，B错误。 42.下列关于治疗性克隆和生殖性克隆的说法，错误的是(　　) A.使用病人自己的细胞产生胰岛细胞以治疗糖尿病属于治疗性克隆 B.将一个克隆的胚胎植入一个女性子宫发育成婴儿的过程属于生殖性克隆 C.治疗性克隆属于无性生殖，生殖性克隆属于有性生殖 D.治疗性克隆和生殖性克隆技术均需要用到动物细胞培养技术和核移植 【答案】　C 【解析】使用病人自己的干细胞，在一定的条件下，通过离体培养和诱导分化形成胰岛细胞以治疗糖尿病，属于治疗性克隆，A正确；生殖性克隆是以产生新个体为目的进行的克隆，即用生殖技术将一个克隆的胚胎植入一个女性子宫中发育成婴儿的过程，B正确；克隆属于无性生殖，C错误。 1．融合PCR技术采用具有互补末端的引物，形成具有重叠链的PCR产物，通过PCR产物重叠链的延伸，从而将不同来源的任意DNA片段连接起来（如图）。下列说法错误的是（    ） A．基因甲至少经3个循环才能获得含引物P2的双链等长DNA B．不能为提高扩增效率把四种引物同时加入一个扩增体系 C．图中融合PCR第一步的两条链重叠部位可互相作为另一条链的引物 D．经融合PCR获得64个融合基因至少消耗63个引物P4 【答案】D 【解析】我们根据PCR扩增后的产物类型分类可知，构成DNA的两条链的长度不同，将PCR技术中的DNA分成三种（第一种是：两条链都是最短的（即等长的DNA）；第二种是：最长的+中长的；第三种是：中长的+最短的；那么要求等长的DNA的数量，我们就用n轮后产生的所有DNA的数量减掉第二种和第三种情况的DNA的数量即可，而第二中和第三种都含有中长的链，所有我们只要找到中长链的数量即可。在第一次复制完成后，中长的有2个，在第二次复制完成后，中长的有2+2个，在第三次复制完成后，中长链有2+2+2个，那么，n次复制完成后共有2+2+2+2+2+2+2+2+2............=2n，既为n个2相加，也就是经过n次复制后，不符合要求的（就是两条链不等长的DNA）共有2n个，而总的DNA为2n，所有经过n轮循环后，等长的DNA为2n-2n＞0，即n≥3，所以基因甲至少经3个循环才能获得含引物P2的双链等长DNA，A正确；在融合PCR 技术里，甲基因扩增依赖引物 P1、P2，乙基因扩增依赖引物 P3、P4。不同基因扩增所需引物特异性结合各自模板链，且反应条件（如引物与模板的适配性等 ）有差异，若放同一反应体系，引物间易相互干扰（P2和P3存在互补序列），无法精准、高效完成甲、乙基因各自扩增，所以不能为提高扩增效率把四种引物同时加入一个扩增体系，B正确；结合图示可知，融合PCR的第一步两条链重叠部位即互补配对，可互为另一条链的引物，C正确；若融合PCR获得了64个融合基因，引物数目和新合成的子链数目相同，即该过程消耗了64×2-2=126个引物，该过程消耗了126÷2=63个引物P4，但在融合PCR的第一步前还进行了一次利用引物P4扩增DNA链的过程，所以该过程共消耗了引物63+1=64个，D错误。 2.下列有关“DNA粗提取与鉴定”、“DNA片段的扩增及电泳鉴定”实验的叙述，错误的是（　　） A．设置一组加二苯胺但是不加DNA的对照组用来排除二苯胺受热变蓝的可能 B．提取到的白色丝状物直接与一定浓度的二苯胺溶液混合，沸水浴5min后变蓝 C．电泳实验中待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时停止电泳 D．琼脂糖凝胶中加入核酸染料，便于在300nm的紫外灯下检测扩增产物 【答案】B 【解析】设置对照组的目的是为了排除二苯胺试剂本身或其他实验条件可能产生的颜色变化，从而确保实验结果的特异性，A正确；将丝状物溶于2moL的5mL的NaCl溶液中，然后向试管中加入4mL的二苯胺试剂，沸水浴加热5min，试管冷却后溶液呈现 蓝色，B错误；电泳缓冲液加入电泳槽，待指示剂前沿迁移至凝胶边缘时停止电泳，C正确；在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化，稍冷却后加入适量核酸染料混匀，便于在300nm的紫外灯下检测扩增产物，D正确。 3．毕赤酵母是一种能直接利用甲醇的微生物，其含有的醇氧化酶基因(AOX1)强效启动子在甲醇存在时被激活，可以驱动外源基因的高效表达。人体蛋白MT1-MMP定位在细胞膜上，并在多种肿瘤中被高表达出，MT1-MMP能促进肿瘤转移。为进一步研究肿瘤转移机制，科研人员将MT1-MMP基因转化至毕赤酵母，先将转基因个体进行低密度发酵，然后再进行高密度发酵，最终获得目标蛋白。下列相关说法正确的是（    ） A．转基因毕赤酵母和大肠杆菌作为发酵菌种都具有发酵周期短的优点 B．目标蛋白的产量受发酵培养基成分、甲醇、温度、pH的影响 C．可将MT1-MMP基因插入AOX1中以便通过甲醇调控基因表达 D．甲醇的作用是作为碳源和氮源以及诱导目标蛋白的表达 【答案】B 【解析】大肠杆菌是原核生物，无法对合成的目标蛋白进行加工，不能作为该实验的目标菌种，A错误；发酵培养基的成分可以提供微生物生长和代谢所需的营养物质，甲醇可以激活醇氧化酶基因强效启动子从而影响目标蛋白的表达，温度和pH会影响微生物细胞内酶的活性，进而影响微生物的代谢，所以发酵培养基成分、甲醇、温度、pH均会影响目标蛋白的产量，B正确；将MT1-MMP基因插入AOX1中会破坏醇氧化酶基因AOX1的结构，应该将MT1-MMP基因插入含有AOX1强效启动子的载体上，这样在甲醇存在时，AOX1启动子被激活，从而驱动MT1-MMP基因高效表达，C错误；甲醇含有的是C、H、O元素，不含氮元素，因此甲醇无法作为氮源，D错误。 4．CRISPR/Cas9系统包含向导RNA（gRNA）和核酸酶Cas9，可以对哺乳动物细胞进行基因组编辑。编辑时，Cas9蛋白在gRNA的引导下，结合基因组的特定位点并进行切割。科研人员利用图中gRNA和Cas9共表达质粒，对体外培养的小鼠细胞中A基因的表达进行调控。下列说法错误的是（　　）    A．可以依据A基因的部分序列设计共表达质粒中的编码gRNA序列 B．编码gRNA的序列需要整合到受体细胞基因组DNA上才能发挥作用 C．导入该质粒后使用含潮霉素的液体培养基筛选受体细胞 D．用抗原—抗体杂交技术检测结果为部分细胞A蛋白表达量降低 【答案】B 【解析】由图知，gRNA序列中插入了A基因片段，故可以依据A基因的部分序列设计共表达质粒中的编码gRNA序列，A正确；编码gRNA的序列不需要整合到受体细胞基因组DNA上就能发挥作用，其作用的对象是受体细胞DNA中的特定基因，B错误；重组质粒中标记基因为潮霉素抗性基因，所以导入该质粒后使用含潮霉素的液体培养基筛选受体细胞，能存活的即为导入了质粒的，C正确；检测蛋白质的表达用抗原—抗体杂交技术，部分细胞A基因切除后A蛋白表达量降低，D正确。 5．单亲二体(UPD)是指体细胞中某对同源染色体来自同一亲本，其它染色体组成正常的个体，其染色体组成是2n。微卫星DNA(STR)的核心序列为2-6个碱基，重复次数和分布个数因染色体而异，可以随染色体稳定地遗传给下一代。可使用STR检测技术对UPD进行诊断：先在各条染色体上找到STR区域，在STR区域的两侧设计PCR引物，每对引物当中有一条是带荧光标记的，在同一体系中进行PCR得到带有不同荧光标记的扩增产物，经电泳后被检测到，然后进行比对、确认。下列说法错误的是（    ） A．同一体系中进行PCR使用的引物的复性温度应大致相同 B．用含有核酸染料的载样缓冲液来鉴定扩增得到的PCR产物 C．UPD现象可能会导致隐性遗传病以显性方式传递 D．检测过程需要分析多个STR位点以确定是否为UPD 【答案】B 【解析】PCR中复性指引物通过碱基互补配对与模板链结合，同一体系中进行PCR使用的引物的复性温度应大致相同，A正确；扩增得到的PCR产物通过电泳鉴定，核酸染料加在稍冷却的琼脂糖溶液中，制成琼脂糖凝胶平板，将来对扩增的DNA染色，含有指示剂的凝胶载样缓冲液与扩增得到的PCR产物混合，加到加样孔，电泳时指示剂的移动可以判断DNA分子的移动情况，B错误；UPD个体的某对同源染色体来自同一亲本，可能会导致UPD个体的某种隐性致病基因都来自同一个亲本，从而表现出病症，故UPD现象可能会导致隐性遗传病以显性方式传递，C正确；微卫星DNA(STR)的核心序列为2-6个碱基，碱基序列短，DNA存在重复，重复次数和分布个数因染色体而异，故检测过程需要分析多个STR位点以确定是否为UPD，D正确。 6．为能快速找到特定抗原的高亲和力抗体，研究者构建抗体文库。从免疫后动物的特定细胞中提取总mRNA，反转录成cDNA，经PCR扩增后，构建重组载体，再把重组载体转化到宿主细胞，形成含不同抗体基因的细胞集合，即抗体文库。下列说法错误的是（　　） A．“特定细胞”是B淋巴细胞 B．反转录出的cDNA全部是抗体基因 C．基因需要定向插入启动子和终止子中间才能表达 D．抗体分布在宿主细胞表面有利于进行抗体筛选 【答案】B 【解析】抗体是由浆细胞（效应B细胞）产生的，而浆细胞是由B淋巴细胞分化而来，从免疫后动物中提取能产生抗体相关mRNA的“特定细胞”是B淋巴细胞，A正确；从B淋巴细胞中提取的总mRNA包含了该细胞内多种基因转录形成的mRNA，反转录出的cDNA不全部是抗体基因，还有其他基因对应的cDNA，B错误；启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录，终止子终止转录，基因需要定向插入启动子和终止子中间才能正常表达，C正确；如果抗体分布在宿主细胞表面，就可以利用抗原 - 抗体特异性结合的原理，方便地进行抗体筛选，D正确。 7．DNA因构象不同在电泳时的迁移速率有所差异。超螺旋DNA以超螺旋形式存在，分子体积小；线性DNA分子伸展，在凝胶中移动时受到的摩擦力较大；开环DNA是由环状DNA双链中的一条链发生断裂形成，分子更松散。下列说法正确的是（　　） A．电泳时需要留一个加样孔加入标准参照物 B．电泳时电泳指示剂加在凝胶中，核酸染料与PCR产物混合加入加样孔 C．电泳后的凝胶置于紫外灯下，看到的DNA条带呈蓝色 D．三种构象的DNA在不同浓度的凝胶中迁移速率一定不同 【答案】A 【解析】电泳时需要留一个加样孔加入标准参照物，A正确；配制琼脂糖凝胶时，待凝胶融化稍冷却后，加入适量的核酸染料混合；电泳时，将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内，B错误；电泳后的凝胶置于紫外灯下，看到的DNA条带呈桔红色，C错误；DNA的迁移速率与凝胶浓度、DNA分子大小和构象有关，三种构象的DNA在不同浓度的凝胶中迁移速率可能相同，D错误。 8.微生物底盘细胞是指经过基因工程改造、用于高效表达目标蛋白的宿主细胞系统。利用合成生物学相关技术对底盘细胞进行遗传及代谢途径改造，可以构建出较为理想的细胞工厂，具体流程见图。研究者已用毕赤酵母作为底盘细胞来生产次生代谢产物萜类物质。下列说法错误的是（　　）      A．毕赤酵母生产的萜类物质是酵母生长所必需的物质 B．某基因失活后菌株无法存活可以确定该基因是必需基因 C．去除野生菌株的非必需基因降低底盘细胞的复杂性，保证目的基因的高效表达 D．选择大肠杆菌做底盘细胞直接合成的胰岛素通常不具备生物活性 【答案】A 【解析】毕赤酵母生产的萜类物质是次生代谢物，不是酵母生长所必需的物质，A错误；某基因失活后菌株无法存活可以确定该基因是必需基因，B正确；去除野生菌株的非必需基因降低底盘细胞的复杂性，保证目的基因的高效表达，避免了非必需基因对目的基因表达的干扰，C正确；大肠杆菌为原核生物，没有内质网和高尔基体等细胞器，不能对胰岛素进行修饰加工，所以以大肠杆菌做底盘细胞直接合成的胰岛素通常不具备生物活性，D正确。 9.农杆菌感知到植物分泌的酚类化合物后，会开启其侵染过程，胞内蛋白V2识别并切割T-DNA的边界序列，切割后的T-DNA的一条链与V2形成复合物经通道复合体进入植物细胞。植物细胞被农杆菌侵染后会合成磷酸化的蛋白(VIP1-P)激活抗病相关基因的表达。同时，农杆菌的VF蛋白通过通道复合体进入植物细胞使VIP1-P去磷酸化且去除T-DNA上的V2为T-DNA的整合做准备。下列说法正确的是（    ） A．V2识别切割T-DNA并与其形成复合物的过程主要由线粒体供能 B．VF降低了植物的抗菌能力并促进了T-DNA与染色体DNA的整合 C．T-DNA与VF借助细胞膜上的蛋白质通过胞吞进入细胞 D．农杆菌侵染进入植物细胞的过程未涉及氢键、磷酸二酯键的断裂与形成 【答案】B 【解析】农杆菌是原核生物，无线粒体，V2识别切割T-DNA并与其形成复合物的过程不是由线粒体供能，A错误；植物细胞被农杆菌侵染后合成的VIP1 - P能激活抗病相关基因表达，而VF蛋白使VIP1 - P去磷酸化，降低了植物的抗菌能力；同时VF蛋白去除T-DNA上的V2为T-DNA的整合做准备，促进了T-DNA与染色体DNA的整合，B正确；由题干可知，T-DNA的一条链与V2形成复合物以及VF蛋白是经通道复合体进入植物细胞，不是通过胞吞，C错误；胞内蛋白V2识别并切割T - DNA的边界序列，涉及磷酸二酯键的断裂，D错误。 10.PCR和琼脂糖凝胶电泳是基因工程中常用的两种技术，下列对其中所用试剂和操作的说法正确的是（　　） A．PCR所用微量离心管、微量移液器、枪头都要进行高压蒸汽灭菌 B．PCR扩增前，应根据待扩增DNA片段的长度设置合适的延伸温度 C．需将扩增得到的PCR产物与内含核酸染料的缓冲液混合后进行加样 D．DNA分子较大时，可适当降低凝胶浓度来提高DNA分子的迁移速率 【答案】D 【解析】微量移液器不需要进行高压蒸汽灭菌，微量离心管、枪头都要进行高压蒸汽灭菌，A错误；利用PCR技术进行扩增时，退火温度的设定是成败的关键，退火温度过高会使引物无法与模板的碱基配对，所以退火温度的设定与引物有关；延伸时间的设定与扩增片段的长度有关，B错误；将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内，C错误；DNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与DNA分子量对数成反比，分子越大则所受阻力越大，也越难于在凝胶孔隙中蠕行，因而迁移得越慢。当DNA分子较大时，可适当降低凝胶浓度来提高DNA分子的迁移速率，D正确。 11.染色体上的端粒DNA由短的串联重复序列组成，同种生物的该序列相同。少数缺乏端粒酶活性的肿瘤细胞可通过端粒延长替代机制（ALT）维持端粒长度。ALT机制如下：第一条染色体端粒的末端①链结合到第二条染色体端粒的末端②链上并延伸；随后①链脱离，在RNA引物和DNA聚合酶的作用下，新延长的①链被转化成双链形式。这个过程可被重复数十次，使得序列信息从一个端粒传递到另一端粒上。下列说法错误的是（    ） A．①链的延伸过程以②链作为模板，该过程不需要合成引物 B．DNA聚合酶只能从核酸片段3′端延伸，这导致端粒DNA5′端比3′端短 C．进行ALT的肿瘤细胞中端粒酶基因甲基化程度可能较高 D．非同源染色体间通过ALT机制实现了基因重组，增加了遗传的多样性 【答案】D 【解析】根据题意，第一条染色体端粒的末端①链结合到第二条染色体端粒的末端②链上并延伸，这个延伸过程以②链为模板，并且文中提到随后在RNA引物和DNA聚合酶的作用下，新延长的①链被转化成双链形式，说明延伸过程不需要引物，A正确；DNA聚合酶只能使子链从已有的核酸片段3'端延伸，这会导致端粒DNA在复制过程中5'端比3'端短，B正确；端粒酶活性缺乏的肿瘤细胞可通过ALT机制维持端粒长度，端粒酶基因甲基化程度高会抑制端粒酶活性，所以进行ALT的肿瘤细胞中端粒酶基因甲基化程度可能较高，C正确；非同源染色体间通过ALT机制能增加遗传的多样性，但并没有实现非同源染色体间基因的重新组合，而是染色体结构变异，D错误。 12.双向启动子可同时结合两个RNA聚合酶来驱动下游基因的表达，研究人员构建了如图所示的表达载体，以检测双向启动子作用效果。下列分析正确的是（    ）    A．表达载体中GUS基因和LUC基因转录时使用同一条DNA单链为模板 B．为连入GUS基因，需用Sal I和Sph I酶切已整合了双向启动子及LUC基因的质粒 C．在培养基中添加壮观霉素可筛选出成功导入表达载体的受体细胞 D．通过观察是否出现荧光和蓝色物质可检测双向启动子的作用效果 【答案】D 【解析】转录是从子链（mRNA）5'→3'方向进行的，由图可知，双向启动子位于GUS基因和LUC基因之间，所以GUS基因和LUC基因转录时的模板链不是DNA分子的同一条链，A错误；如果用SphI 酶切已整合了双向启动子及LUC基因的质粒时就会破坏LUC基因，B错误；T-DNA中含有潮霉素抗性基因，而不包含壮观霉素抗性基因，因此可以通过在培养基中添加潮霉素来筛选成功导入表达载体的受体细胞，C错误；双向启动子如果正常表达，就会合成荧光素酶和β-葡萄糖苷酶，催化底物分别产生荧光或生成蓝色物质，从而确定双向启动子的作用，D正确。 13.采用焦磷酸光化测序法进行DNA测序的原理是：将待测DNA链固定到一个磁珠上，将磁珠包被在单个油水混合小滴（乳滴）中，在该乳滴里进行独立的DNA复制，四种脱氧核苷三磷酸依照T、A、C、G的顺序一个一个进入该乳滴，如果发生碱基配对，就会释放一个焦磷酸（PPi），PPi经过一系列酶促反应后发出荧光。下列说法错误的是（    ）    A．脱氧核苷三磷酸通过磷酸二酯键把脱氧核苷酸接到多核苷酸链的3'-OH末端 B．PPi经过一系列的酶促反应后，释放出的能量一部分可转化为光能 C．当胞嘧啶脱氧核苷三磷酸进入后能发出荧光，说明此位置模板链上为G D．若将四种脱氧核苷三磷酸同时加入反应体系中，可大大提高DNA测序的效率 【答案】D 【解析】在DNA合成过程中，脱氧核苷三磷酸确实是通过磷酸二酯键把脱氧核苷酸接到多核苷酸链的3'-OH末端，A正确； PPi经过一系列的酶促反应后，释放出的能量一部分可转化为光能，从而发出荧光，B正确；根据碱基互补配对原则，胞嘧啶（C）与鸟嘌呤（G）配对，当胞嘧啶脱氧核苷三磷酸进入后能发出荧光，说明此位置模板链上为G，C正确；若将四种脱氧核苷三磷酸同时加入反应体系中，就无法根据碱基配对产生荧光的情况来确定模板链上的碱基顺序，不能提高DNA测序的效率，D错误。 14.已知紫外线（UV）可诱导DNA单链上相邻的T之间相互结合形成嘧啶二聚体，阻碍碱基正常配对而导致复制错误引起突变，DNA修复机制对维持遗传稳定性至关重要。研究人员发现某细菌中存在两种如图所示修复机制：①光复活修复：光复活酶（PRE）在可见光下直接切割二聚体，恢复原结构；②暗修复：无需光照，通过切除损伤单链并重新合成。下列说法正确的是（    ）    A．PRE可将嘧啶二聚体的磷酸二酯键断开 B．暗修复过程中还需消耗原料、能量和引物 C．PRE基因发生碱基替换后，在光照下PRE的修复功能可能正常 D．UV诱导DNA形成嘧啶二聚体引起的变异不可遗传 【答案】C 【解析】由图可知，PRE（光复活酶）切割的是相邻T碱基之间形成的环状共价键，并非磷酸二酯键，A错误；无需光照，通过切除损伤单链并重新合成，即暗修复切除损伤片段后，DNA聚合酶可直接利用缺口处原有的3′OH末端延伸合成新链，不需要引物，B错误；由于密码子具有简并性，基因的碱基替换未改变氨基酸得排列顺序，酶活性不变，则在光照条件下PRE的修复功能仍可能维持正常，C正确；若嘧啶二聚体未被修复而导致DNA碱基序列永久改变，则该突变在细胞分裂过程中是可以遗传的，D错误。 （不定项）15.某研究小组构建了能表达ACTA1-GFP融合蛋白的重组质粒，该重组质粒的部分结构如下图所示。下列叙述错误的是（    ）    注：F1和F2表示上游引物，R1和R2表示下游引物 A．RNA聚合酶与启动子结合，调控ACTA1基因和GFP基因的表达 B．仅用F2和R1一对引物无法确定ACTA1基因插入方向是否正确 C．ACTA1基因转录的模板链是a链，引物F1与a链的部分序列相同 D．若用引物F2和R2进行PCR，能更好地区分ACTA1-GFP基因纯合子和杂合子 【答案】BC 【解析】据图可知，ACTA1基因和GFP基因位于启动子和终止子之间，故RNA聚合酶与启动子结合，调控ACTA1基因和GFP基因的表达，A正确；据图可知，引物F2与R1结合部位包含ACTA1基因的碱基序列，因此推测为了确定ACTA1基因连接到质粒中且插入方向正确，进行PCR检测时，若仅用一对引物，应选择图中的引物F2和R1，B错误；ACTA1基因转录的模板链是a链，引物F1与b链均可以和a链互补配对，引物F1与a链的部分序列互补，C错误；若用引物F2和R2进行PCR，可根据电泳条带数目能更好地区分ACTA1-GFP基因纯合子和杂合子，D正确。 16.荧光素酶（Luc蛋白）由550个氨基酸组成，分为N端和C端2个功能片段，即NLuc蛋白 （2-416氨基酸） 和CLuc蛋白 （398—550氨基酸），两部分不能自动重组并发挥作用；将目标蛋白OsBIK1蛋白和OsXLG2蛋白分别与NLuc蛋白和CLuc蛋白融合，若2个目标蛋白相互作用，则NLuc蛋白和CLuc蛋白能成功组装为荧光素酶并分解荧光素发出荧光。科研人员构建了可表达OsBIK1-HA-NLuc融合蛋白的表达载体1和可表达CLuc-OsXLG2融合蛋白的表达载体2并进行了检测，如图1所示，图中HA为标签蛋白（用于目的蛋白的检测、示踪等）的编码序列。 (1)构建重组质粒1时，需要把OsBIK1基因的对应终止密码子的3个碱基去除，原因是 ；图中HA编码序列插入OsBIK1基因编码链的 （填“5'端”或“3'端”），编码链为转录时所用模板链的互补链。 (2)如果用抗Luc蛋白抗体分别检测表达载体1和2融合蛋白表达情况，结果如图2，可优先选用抗 蛋白抗体进一步区分条带1为 融合蛋白。 (3)为了满足应用常需要在载体中构建诱导型启动子，当诱导物存在时可以激活或抑制目的基因的表达。双向启动子可同时结合两个RNA聚合酶来驱动下游基因的表达，研究人员已经构建了下图所示的基因表达载体，以检测双向启动子作用效果。试分析：为连入GUS基因，需用 酶切已整合了双向启动子及LUC基因的质粒，若观察到 则可确认双向启动子起作用。 【答案】(1)保证OsBIK1基因编码的蛋白和NLuc基因片段编码的蛋白形成融合蛋白 3' (2)HA OsBIK1-HA-NLuc (3)AgeⅠ和SalⅠ 蓝色物质且有荧光 【解析】（1）终止密码子可控制翻译的结束，如果保留OsBIK1基因的对应终止密码子，则在翻译完OsBIK1基因对应的mRNA序列后就会终止翻译，不能形成OsBIK1基因编码的蛋白和NLuc基因片段编码的蛋白构成的融合蛋白，故保证OsBIK1基因编码的蛋白和NLuc基因片段编码的蛋白形成融合蛋白，需要把OsBIK1基因的对应终止密码子的3个碱基去除；已知编码链为转录时所用模板链的互补链，编码链和模板链反向螺旋在一起，而转录时RNA聚合酶是从DNA模板链的3'端向5'端移动，因此图中HA编码序列插入到OsBIK1基因编码链的3'端，才能使转录时OsBIK1-HA两个基因同时转录。 （2）HA为标签蛋白（用于目的蛋白的检测、示踪等）的编码序列，插入HA序列后会有HA标签蛋白产生，用于目的蛋白的检测、示踪等，故优先选用抗HA蛋白抗体，根据图2可知，用抗Luc蛋白抗体分别检测表达载体1和2融合蛋白表达情况，会出现条带1和条带2，图2中最后一幅图出现的是条带1，且已知图中HA为标签蛋白的编码序列，可用于目的蛋白的检测、示踪等，因此可优先选用抗HA蛋白抗体进一步区分条带1为OsBIK1-HA-NLuc融合蛋白。 （3）观察可知，要连入GUS基因，需要在不破坏其他关键基因（如LUC基因）的前提下进行酶切。分析质粒上的酶切位点，发现GUS基因的两侧含有AgeⅠ、SphⅠ和SalⅠ酶切位点，而如果用SphⅠ酶切已整合了双向启动子及LUC基因的质粒时就会破坏LUC基因，所以应该用AgeⅠ和SalⅠ酶切已整合了双向启动子及LUC基因的质粒，才能在合适的位置连入GUS基因，双向启动子如果正常表达，就会合成荧光素酶和β-葡萄糖苷酶，那么就会既观察到蓝色物质，又观察到荧光，从而确定双向启动子的作用。 1．（2025·山东·高考真题）种子休眠是抵御穗发芽的一种机制。通过对Ti质粒的改造，利用农杆菌转化法将Ti质粒上的T-DNA随机整合到小麦基因组中，筛选到2个种子休眠相关基因的插入失活纯合突变体。与野生型相比，突变体种子的萌发率降低。小麦基因组序列信息已知。 (1)Ti质粒上与其在农杆菌中的复制能力相关的结构为 。选用图甲中的SmaI对抗除草剂基因X进行完全酶切，再选择SmaI和 对Ti质粒进行完全酶切，将产生的黏性末端补平，补平时使用的酶是 。利用DNA连接酶将酶切后的包含抗除草剂基因X的片段与酶切并补平的Ti质粒进行连接，构建重组载体，转化大肠杆菌；经卡那霉素筛选并提取质粒后再选用限制酶 进行完全酶切并电泳检测，若电泳结果呈现一长一短2条带，较短的条带长度近似为 bp，则一定为正向重组质粒。 (2)为证明这两个突变体是由于T-DNA插入到小麦基因组中同一基因导致的，提取基因组DNA，经酶切后产生含有T-DNA的基因组片段（图乙）。在此酶切过程中，限于后续PCR难以扩增大片段DNA，最好使用识别序列为 （填“4”“6”或“8”）个碱基对的限制酶，且T-DNA中应不含该酶的酶切位点。需首先将图乙的片段 ，才能利用引物P1和P2成功扩增未知序列。PCR扩增出未知序列后，进行了一系列操作，其中可以判断出2条片段的未知序列是否属于同一个基因的操作为 （填“琼脂糖凝胶电泳”或“测序和序列比对”）。 (3)通过农杆菌转化法将构建的含有野生型基因的表达载体转入突变植株，如果检测到野生型基因， （填“能”或“不能”）确定该植株的表型为野生型。 【答案】(1)复制原点 XbaI DNA聚合酶 SmaI和SpeI 550bp (2)4 环化 测序和序列比对 (3)不能 【解析】（1）DNA复制的起点是复制原点，因此Ti质粒上与其在农杆菌中的复制能力相关的结构为复制原点。根据SmaI限制酶识别序列可知，酶切形成的是平末端，若质粒仅用SmaI酶切，抗除草剂基因和质粒可以正向接入也可以反向接入，且无法区分，为了确定是否是正向重组质粒，因此在构建重组质粒时需要用到另一种限制酶，抗除草剂因需要插入到启动子和终止子之间，因此不能选择BamHI，因为该限制酶会破坏终止子，因此可选择XbaI和SmaI进行酶切，XbaI酶切会形成黏性末端，需要用DNA聚合酶聚合脱氧核糖核苷酸单体将产生的黏性末端补平（可使重组质粒最小，同时PstI酶切后产生的黏性末端无法用DNA聚合酶抹平，因为DNA聚合酶只能从3'延伸子链）。利用DNA连接酶将酶切后的包含抗除草剂基因X的片段与酶切并补平的Ti质粒进行连接，构建重组载体，转化大肠杆菌。重组的T-DNA片段上含有一个SmaI酶切位点和一个SpeI酶切位点，可以选择用SmaI和SpeI进行酶切，转录的方向是从模板的3'→5'，和质粒对应的方向相同，经过两种酶的酶切后并电泳呈现一长一短2条带，较短的条带长度近似为550bp，若反向接，较短的条带长度近似为200bp。 （2）由于后续PCR难以扩增大片段DNA，所以最好选择识别序列为4个碱基的限制酶，原因是识别序列越短，酶切位点越多，切割产生的片段可能越小，更有利于后续的PCR扩增。由于引物是根据已知序列设计的，但此时需要扩增未知序列，因此可以将图乙的片段环化，这样就可以利用现有引物扩增出未知序列。为了确定未知序列是否是同一基因，需要准确比对其上的碱基序列，因此对同一个基因的操作为测序和序列比对。 （3）突变植株成功导入野生型基因，但野生型基因未必可以正常表达，因此不能确定该植株的表型为野生型。 2．（2024·山东·高考真题）研究发现基因L能够通过脱落酸信号途径调控大豆的逆境响应。利用基因工程技术编辑基因L，可培育耐盐碱大豆品系。在载体上的限制酶BsaI切点处插入大豆基因L的向导DNA序列，将载体导入大豆细胞后，其转录产物可引导核酸酶特异性结合基因组上的目标序列并发挥作用。载体信息、目标基因L部分序列及相关结果等如图所示。 (1)用PCR技术从大豆基因组DNA中扩增目标基因L时，所用的引物越短，引物特异性越 （填“高”或“低”）。限制酶在切开DNA双链时，形成的单链突出末端为黏性末端，若用BsaI酶切大豆基因组DNA，理论上可产生的黏性末端最多有 种。载体信息如图甲所示，经BsaI酶切后，载体上保留的黏性末端序列应为5'- -3'和5'- -3'。 (2)重组载体通过农杆菌导入大豆细胞，使用抗生素 筛选到具有该抗生素抗性的植株①～④。为了鉴定基因编辑是否成功，以上述抗性植株的DNA为模板，通过PCR扩增目标基因L，部分序列信息及可选用的酶切位点如图乙所示，PCR产物完全酶切后的电泳结果如图丙所示。据图可判断选用的限制酶是 ，其中纯合的突变植株是 （填序号）。 (3)实验中获得1株基因L成功突变的纯合植株，该植株具有抗生素抗性，检测发现其体细胞中只有1条染色体有T-DNA插入。用抗生素筛选这个植株的自交子代，其中突变位点纯合且对抗生素敏感的植株所占比例为 ，筛选出的敏感植株可用于后续的品种选育。 【答案】(1)低 256 5'-CAAT-3' 5'-GTTT-3' (2)卡那霉素 Sac Ⅰ ④ (3)1/4 【解析】（1）引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，用于PCR的引物长度通常为20~30个核苷酸。由此可知，在利用PCR技术从大豆基因组DNA中扩增目的基因时，所用的引物越短，则引物的特异性就越低。根据题意可知，限制酶在切开DNA双链时，形成的单链突出末端为黏性末端，若用BsaI酶切大豆基因组DNA，图中给出的只是载体信息，大豆基因组无法从图中看出。只能根据理论来推测，BsaI切割产生的黏性末端是NNNN，四个碱基最多可能有256种排列顺序，故答案应为 256。根据图甲所示的载体信息，经BsaI酶切后，载体上保留的黏性末端序列应为5'-CAAT-3'、5'-GTTT-3'。 （2）根据图示信息可知，重组载体通过农杆菌导入大豆细胞当中的片段包含了卡那霉素抗性基因，因此可以通过使用卡那霉素筛选到具有该抗生素抗性的植株。根据图甲可知，目标基因L的目标序列跟突变序列之间的差异只有在Sac Ⅰ酶切位点上存在差异，BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ这两个酶切位点完全相同，根据图丙及题意可知，所展示的电泳结果可知，要以上述抗性植株的DNA为模板，通过PCR扩增目标基因L，并对PCR产物完全酶切后进行电泳从而判断植株含有的是目标序列还是突变序列，因此只能选用限制酶Sac Ⅰ，限制酶Sac Ⅰ在突变序列存在酶切位点，但是目标序列没有，因此经过该酶酶切后突变序列的电泳条带会出现两条，目标序列是一条带，根据图丙结果可知，只有④为纯和突变的植株。 （3）根据题意可知，在实验当中获得了一株基因l成功突变的纯合之中，已知该植株具有抗生素抗性，经过检测发现其体细胞中只有一条染色体含有T-DNA插入。根据图示可知，抗生素抗性基因在T-DNA片段上，因此如果用抗生素来筛选该植株进行自交，可知其配子中含有抗生素抗性基因的比例为1/2，不含T-DNA（对抗生素敏感）的配子比例为1/2，因此突变位点纯合且对抗生素敏感的植株所占比例应该为1/2×1/2=1/4，纯突变位点纯合且具有抗生素抗性的植株所占比例应该为3/4，可以筛选出的敏感植株可用于后续的品种选育。 3．（2023·山东·高考真题）科研人员构建了可表达J-V5融合蛋白的重组质粒并进行了检测，该质粒的部分结构如图甲所示，其中V5编码序列表达标签短肽V5。    (1)与图甲中启动子结合的酶是 。除图甲中标出的结构外，作为载体，质粒还需具备的结构有 （答出2个结构即可）。 (2)构建重组质粒后，为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，需进行PCR检测，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物 。已知J基因转录的模板链位于b链，由此可知引物F1与图甲中J基因的 （填“a链”或“b链”）相应部分的序列相同。 (3)重组质粒在受体细胞内正确表达后，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表达水平，结果如图乙所示。其中，出现条带1证明细胞内表达了 ，条带2所检出的蛋白 （填“是”或“不是”）由重组质粒上的J基因表达的。 【答案】(1)RNA聚合酶 限制酶切割位点、标记基因、复制原点等 (2)F2和R1或F1与R2 a链 (3) J-V5融合蛋白 不是 【解析】（1）基因表达载体的构建启动子是为了启动下游基因的“表达”，表达首先需要转录，因此RNA聚合酶识别和结合的部位才是转录的起始。作为运载体必须具备的条件：①要具有限制酶的切割位点；②要有标记基因（如抗性基因），以便于重组后重组子的筛选；③能在宿主细胞中稳定存在并复制；④是安全的，对受体细胞无害，而且要易从供体细胞分离出来，图中甲有启动子和终止子等，因此质粒还需具备的结构有限制酶的切割位点、标记基因、复制原点等。 （2）据图甲可知，引物F2与R1或F1与R2结合部位包含J基因的碱基序列，因此推测为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，进行PCR检测时，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物F2和R1或F1与R2。b是模板链，而根据图上启动子和终止子的位置可知转录方向是图上从左向右，对应的模板链方向应该是3’-5'，非模板链（也就是a链）是5'-3'；考虑到DNA复制的方向是子链的5’-3'，引物基础上延伸的方向肯定是5'-3'，所以引物结合的单链其方向是3'-5'；图中F1是前引物，在左侧，所以其配对的单链是3’-5'的b链，故其序列应该与a链相应部分的序列相同。 （3）据图乙可知，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测，均出现条带1，说明条带1是J-V5融合蛋白。抗J蛋白抗体检测出现条带2，抗V5抗体检测不出现条带2，说明条带2所检出的蛋白不是由重组质粒上的融合的J基因表达的。 4．（2022·山东·高考真题）某种类型的白血病由蛋白P引发，蛋白UBC可使P被蛋白酶识别并降解，药物A可通过影响这一过程对该病起到治疗作用。为探索药物A治疗该病的机理，需构建重组载体以获得融合蛋白FLAG-P和FLAG-P△。P△是缺失特定氨基酸序列的P，FLAG是一种短肽，连接在P或P△的氨基端，使融合蛋白能与含有FLAG抗体的介质结合，但不影响P或P△的功能。 (1)为构建重组载体，需先设计引物，通过PCR特异性扩增P基因。用于扩增P基因的引物需满足的条件是 、为使PCR产物能被限制酶切割，需在引物上添加相应的限制酶识别序列，该限制酶识别序列应添加在引物的 （填“3'端”或“5'端”）。 (2)PCR扩增得到的P基因经酶切连接插入载体后，与编码FLAG的序列形成一个融合基因，如图甲所示，其中“ATGTGCA”为P基因编码链起始序列。将该重组载体导入细胞后，融合基因转录出的mRNA序列正确，翻译出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正确，但P基因对应的氨基酸序列与P不同。据图甲分析，出现该问题的原因是 。修改扩增P基因时使用的带有EcoRⅠ识别序列的引物来解决该问题，具体修改方案是 。 (3)融合蛋白表达成功后，将FLAG-P、FLAG-P△、药物A和UBC按照图乙中的组合方式分成5组。各组样品混匀后分别流经含FLAG抗体的介质，分离出与介质结合的物质并用UBC抗体检测，检测结果如图丙所示。已知FLAG-P和FLAG-P△不能降解UBC，由①②③组结果的差异推测，药物A的作用是 ；由②④组或③⑤组的差异推测，P△中缺失的特定序列的作用是 。 (4)根据以上结果推测，药物A治疗该病的机理是 。 【答案】(1)能与P基因母链的一段碱基序列互补配对、短单链核酸 5'端 (2)P基因编码链的第一个碱基与EcoRⅠ识别序列的最后两个碱基编码一个氨基酸，导致mRNA的密码子被错位读取。 在引物中的EcoRⅠ识别序列3'端添加1个碱基 (3)增强FLAG-P与UBC的结合 参与P与UBC的结合 (4)药物A通过增强P与UBC结合促进P降解。 【解析】（1）引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核苷酸，因此设计扩增P基因的引物，需要两种引物分别与两条模板链3'端的碱基序列互补。DNA聚合酶延伸时，是将脱氧核苷酸加到引物的3'端，为了不破坏目的基因，该限制酶识别序列应添加在引物的5'端。 （2）融合基因转录出的mRNA序列正确，翻译出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正确，但P基因对应的氨基酸序列与P不同，说明P基因翻译时出错。由图可看出，在转录出的mRNA中，限制酶识别序列对应的最后两个碱基与P基因对应的第一个碱基构成一个密码子，导致读码框改变，翻译出的氨基酸序列改变，可通过在EcoRⅠ识别序列3'端添加1个碱基，使其碱基数目加上FLAG的碱基数目为3的倍数，这样能保证P基因转录出的mRNA上的读码框不改变，能够正常翻译。 （3）①组仅添加UBC，处理后，用UBC抗体检测，不出现杂交带；②组添加UBC和FLAG-P，出现杂交带；③组添加UBC、药物A和FLAG-P，杂交带更加明显，说明药物A的作用是促进UBC与FLAG-P的结合。由②④组或③⑤组的差异在于②③组使用FLAG-P，出现杂交带；④⑤组使用FLAG-P△，不出现杂交带，据此推测P△中缺失的特定序列是与UBC结合的关键序列。 （4）根据（3）的分析推测，药物A促进UBC与FLAG-P的结合，从而促进蛋白P被蛋白酶识别并降解，达到治疗的目的。 5．（2021·山东·高考真题）人类γ基因启动子上游的调控序列中含有 BCL11A 蛋白结合位点，该位点结合 BCL11A 蛋白后，γ基因的表达被抑制。通过改变该结合位点的序列，解除对γ基因表达的抑制，可对某种地中海贫血症进行基因治疗。科研人员扩增了γ基因上游不同长度的片段，将这些片段分别插入表达载体中进行转化和荧光检测，以确定 BCL11A 蛋白结合位点的具体位置。相关信息如图所示。 （1）为将扩增后的产物定向插入载体指导荧光蛋白基因表达，需在引物末端添加限制酶识别序列。据图可知，在 F1～F7末端添加的序列所对应的限制酶是 ，在 R 末端添加的序列所对应的限制酶是 。本实验中，从产物扩增到载体构建完成的整个过程共需要 种酶。 （2）将构建的载体导入除去 BCL11A 基因的受体细胞，成功转化后，含 F1～F6与 R 扩增产物的载体表达荧光蛋白，受体细胞有荧光，含 F7与 R 扩增产物的受体细胞无荧光。含 F7 与 R 扩增产物的受体细胞无荧光的原因是 。 （3）向培养液中添加适量的雌激素，含 F1～F4与 R 扩增产物的受体细胞不再有荧光，而含 F5～F6与 R 扩增产物的受体细胞仍有荧光。若γ基因上游调控序列上与引物序列所对应的位置不含有 BCL11A 蛋白的结合位点序列，据此结果可推测，BCL11A 蛋白结合位点位于 ，理由是 。 【答案】（1）SalI EcoRI 6 （2）F7与R扩增产物不含完整的启动子，荧光蛋白基因不表达 引物 F4 与 F5 在调控序列上所对应序列之间的区段上 （3）根据有无荧光情况判断，F1～F4 与 R 扩增产物上均有结合位点，因此结合位点位于 F4 所对应调控序列的下游（右侧）；F5～F6 与 R 扩增产物上均无结合位点，可知结合位点位于 F5 所对应调控序列的上游（左侧） 所以结合位点位于引物 F4 与 F5 在调控序列上所对应序列之间的区段上 【解析】（1）据题意可知，需要将扩增后的产物定向插入并指导荧光蛋白基因的表达，则含有启动子的扩增后的产物读取方向与荧光蛋白基因的读取方向一致，故扩增后的产物中的R端与荧光蛋白基因中限制酶Mun Ⅰ 识别序列端结合，才能保证扩增后的产物定向插入并指导荧光蛋白基因的表达。要做到定向插入，需要引物末端两端添加限制酶的识别序列，且被限制酶识别并切割后，两端的黏性末端不能相同。而扩增后的产物中可能含有Mun Ⅰ 和 Xho Ⅰ 的识别位点，故在引物末端添加限制酶的识别序列不能被限制酶Mun Ⅰ 和Xho Ⅰ 所识别，故应该选用添加限制酶EcoR Ⅰ 和限制酶Sal Ⅰ 识别序列，据图中对限制酶的注释可知，限制酶Mun Ⅰ 识别并切割后的黏性末端与限制酶EcoR Ⅰ 识别并切割后的黏性末端相同，故 R 末端添加的序列所对应的限制酶是EcoR Ⅰ ，在 F1～F7 末端添加的序列所对应的限制酶是Sal Ⅰ ；荧光蛋白基因中含有限制酶EcoR Ⅰ 的识别位点，故对载体使用限制酶Mun Ⅰ 和Xho Ⅰ 切割。综上所述，对载体使用限制酶Mun Ⅰ 和Xho Ⅰ 切割，对扩增后的产物用限制酶EcoR Ⅰ 和限制酶Sal Ⅰ 识别序列，然后在DNA连接酶的催化作用下，连接形成重组载体；产物扩增中需要使用Taq酶催化，合成更多的产物，故从产物扩增到载体构建完成的整个过程共需要6种酶，分别是Taq酶、限制酶EcoR Ⅰ 、限制酶Sal Ⅰ、限制酶Mun Ⅰ 、限制酶Xho Ⅰ 、DNA连接酶； （2）受体细胞中已经除去 BCL11A 基因，故扩增产物中的 BCL11A 蛋白结合位点，不会抑制荧光蛋白基因的表达；基因的表达需要RNA聚合酶与启动子结合，才能完成荧光蛋白基因的转录过程；含 F1～F6与 R 扩增产物的载体表达荧光蛋白，受体细胞有荧光，含 F7 与 R 扩增产物的受体细胞无荧光，则可能是F7与R扩增产物不含完整的启动子，荧光蛋白基因不表达； （3）向培养液中添加适量的雌激素，此时重组载体上的BCL11A基因表达，产生 BCL11A 蛋白， BCL11A 蛋白与BCL11A 蛋白结合位点结合后，导致荧光蛋白基因被抑制；含 F1～F4 与 R 扩增产物的受体细胞不再有荧光，则说明BCL11A 蛋白结合位点结合后在引物F4与引物R之间的序列上；含 F5～F6 与 R 扩增产物的受体细胞仍有荧光，则说明BCL11A 蛋白结合位点结合后在引物F5的上游序列，故据此结果可推测，BCL11A 蛋白结合位点位于引物 F4 与 F5 在调控序列上所对应序列之间的区段上。 6．（2024·山东·高考真题）关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法正确的是（　　） A．整个提取过程中可以不使用离心机 B．研磨液在4℃冰箱中放置几分钟后，应充分摇匀再倒入烧杯中 C．鉴定过程中DNA双螺旋结构不发生改变 D．仅设置一个对照组不能排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰 【答案】A 【解析】在DNA的粗提取与鉴定实验中，可将获得的研磨液用纱布过滤后，在4℃的冰箱中放置几分钟，再取上清液，也可以直接将研磨液用离心机进行离心后取上清液，A正确；研磨液在4℃冰箱中放置几分钟后，DNA在上清液中，应取上清液倒入烧杯中，B错误；鉴定过程中用沸水浴加热，DNA双螺旋结构会发生改变，C错误；加入二苯胺试剂后沸水浴处理的时间要在5分钟以上，且要等到冷却后再观察结果，这样才可以观察到较为明显的显色反应，仅设置一个对照组可以排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰，D错误。 7．（2022·山东·高考真题）关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法错误的是（    ） A．过滤液沉淀过程在4℃冰箱中进行是为了防止DNA降解 B．离心研磨液是为了加速DNA的沉淀 C．在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色 D．粗提取的DNA中可能含有蛋白质 【答案】B 【解析】低温时DNA酶的活性较低，过滤液沉淀过程在4℃冰箱中进行是为了防止DNA降解，A正确；离心研磨液是为了使细胞碎片沉淀，B错误；在沸水浴条件下，DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色，C正确；细胞中的某些蛋白质可以溶解于酒精，可能有蛋白质不溶于酒精，在95%的冷酒精中与DNA一块儿析出，故粗提取的DNA中可能含有蛋白质，D正确。 8．（2021·山东·高考真题）粗提取 DNA 时，向鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水并搅拌，过滤后所得滤液进行下列处理后再进行过滤，在得到的滤液中加入特定试剂后容易提取出 DNA相对含量较高的白色丝状物的处理方式是（    ） A．加入适量的木瓜蛋白酶 B．37～40℃的水浴箱中保温 10～15 分钟 C．加入与滤液体积相等的、体积分数为 95%的冷却的酒精 D．加入 NaCl 调节浓度至 2mol/L→过滤→调节滤液中 NaCl 浓度至 0．14mol/L 【答案】A 【解析】木瓜蛋白酶可以水解DNA中的蛋白质类杂质，由于酶具有专一性，不能水解DNA，过滤后在得到的滤液中加入特定试剂后容易提取出 DNA相对含量较高的白色丝状物，A正确；37～40℃的水浴箱中保温 10～15 分钟不能去除滤液中的杂质，应该放在60~75℃的水浴箱中保温 10～15 分钟，使蛋白质变性析出，B错误；向鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水并搅拌，过滤后在得到的滤液中加入与滤液体积相等的、体积分数为 95%的冷却的酒精，此时DNA析出，不会进入滤液中，C错误；加入 NaCl 调节浓度至 2mol/L→过滤→调节滤液中 NaCl 浓度至 0．14mol/L，DNA在0．14mol/L的NaCl溶液中溶解度小，DNA析出，不会进入滤液中，D错误。 学科网（北京）股份有限公司1 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 $ 第42讲 基因工程、蛋白质工程及生物技术的安全性及伦理问题 目录 01 课标达标练 【题型一】重组DNA技术的基本工具 【题型二】基因工程的基本操作程序 【题型三】PCR技术与电泳 【题型四】基因工程的应用 【题型五】蛋白质工程的原理和应用 【题型六】生物技术的安全性和伦理问题 02 能力突破练（新考法+新情景+新思维） 03 高考溯源练（含2025高考真题） 【题型一】重组DNA技术的基本工具 1.图甲、乙中的箭头表示三种限制性内切核酸酶的酶切位点，AmpR表示氨苄青霉素抗性基因，neo表示新霉素抗性基因。下列叙述错误的是(　　) A.在构建重组质粒时，可用PstⅠ和HindⅢ切割质粒和外源DNA B.在酶切过程中，不能破坏质粒中全部的标记基因 C.若只用PstⅠ处理质粒和外源DNA分子片段，无法避免自身环化和反向连接 D.导入重组质粒的大肠杆菌可以在含氨苄青霉素的培养基中生长 2.用DNA重组技术可以赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人类需要的生物产品。在此过程中需要使用多种工具酶，其中4种限制性内切核酸酶的切割位点如图所示。 回答下列问题： (1)常用的DNA连接酶有E.coliDNA连接酶和T4 DNA连接酶。上图中________酶切割后的DNA片段可以用E.coli DNA连接酶连接。上图中________________酶切割后的DNA片段可以用T4 DNA连接酶连接。 (2)DNA连接酶催化目的基因片段与质粒载体片段之间形成的化学键是________。 (3)DNA重组技术中所用的质粒载体具有一些特征。如质粒DNA分子上有复制原点，可以保证质粒在受体细胞中能________；质粒DNA分子上有________________，便于外源DNA插入；质粒DNA分子上有标记基因(如某种抗生素抗性基因)，利用抗生素可筛选出含质粒载体的宿主细胞，方法是________________________。 (4)表达载体含有启动子，启动子是指____________________________________ ___________________________________________________________________。 3.四种限制酶的切割位点如图所示，下列叙述错误的是(　　) A.上图中EcoR Ⅰ、Pst Ⅰ两种酶切割后的DNA片段可以用E.coli DNA连接酶连接 B.图中Sma Ⅰ、EcoR V两种酶切割后的DNA片段，可以用T4 DNA连接酶连接 C.DNA连接酶催化目的基因片段与质粒载体片段连接的化学键是磷酸二酯键 D.限制酶能识别特定的核苷酸序列，具有专一性，不同的限制酶切割不能产生相同的黏性末端 4.科研人员利用农杆菌转化法将抗病毒蛋白基因C导入番木瓜，培育出转基因抗病毒番木瓜，Ti质粒结构模式图如图所示。下列叙述正确的是(　　) A.农杆菌的T－DNA与番木瓜基因发生重组 B.构建重组质粒需要限制酶和DNA聚合酶 C.含重组Ti质粒的农杆菌具有四环素抗性 D.转基因抗病番木瓜不具有卡那霉素抗性 【题型二】基因工程的基本操作程序 5.科学家利用PCR技术扩增人乳头瘤病毒HPV－16L1蛋白基因，构建了含HPV－16L1蛋白基因的表达载体pBI－L1，经根瘤农杆菌介导转化，获得了转基因烟草植株。该技术利用转基因烟草作为生物反应器，生产出了纯度较高的HPV－16L1蛋白。下列说法错误的是(　　) A.构建表达载体pBI－L1时至少需要两种限制酶以防止目的基因与质粒反向连接 B.采用根瘤农杆菌介导转化时可对烟草组织进行切割，以便于农杆菌入侵植物组织 C.为促进转基因烟草丛状苗基部细胞分裂形成愈伤组织可向培养基中适当添加赤霉素 D.可以用抗原－抗体杂交法检测再生植株是否表达出相应的HPV－16L1蛋白 6.下图是利用基因工程培育抗虫植物的示意图。以下相关叙述，正确的是(　　) A.⑤只要表现出抗虫性状就表明植株发生了可遗传变异 B.③侵染植物细胞后，重组Ti质粒整合到④的染色体上 C.④的染色体上若含抗虫基因，则⑤就表现出抗虫性状 D.②的构建需要限制性内切核酸酶和DNA聚合酶参与 7.下列以洋葱为实验材料进行“DNA的粗提取与鉴定实验”的叙述，正确的是(　　) A.洋葱研磨液需要用滤纸过滤，以保证提取的DNA量 B.滤液中加入冷酒精后，用玻璃棒搅拌会使DNA的提取量增加 C.向含DNA的滤液中加入2 mol/L的NaCl溶液有利于去除杂质 D.用二苯胺试剂鉴定DNA时，需沸水浴加热冷却后再观察颜色变化 (不定项)8.图甲、乙中标注了相关限制酶的酶切位点。下列关于培育转基因大肠杆菌的叙述正确的是(　　) A.若通过PCR获取该目的基因，应该选用引物甲和引物丙 B.图中质粒和目的基因构建表达载体，应选用Bcl Ⅰ和Hind Ⅲ剪切 C.若将基因表达载体导入受体细胞中，需选用Ca2＋转化法 D.在受体细胞中，氨苄青霉素抗性基因和目的基因可同时表达 9.科研人员以浮萍为实验材料，成功建立了其稳定的遗传转化体系，并用遗传转化(转基因)技术实现了浮萍药用蛋白生物反应器的建立。建立过程使用的CRISPR/Cas9基因编辑技术可以按照人们的意愿精准剪切、改编任意靶基因的遗传信息，其原理是由一条单链向导RNA(sgRNA)引导Cas9蛋白到一个特定的基因位点进行切割，便于目的基因与载体的连接。 (1)sgRNA能引导Cas9蛋白精准确定目的基因的位置，其原理是_________________________________________________________________，Cas9蛋白的作用是________________________________________________。 (2)浮萍转化体系的建立，需使用不同种类的农杆菌对浮萍进行侵染，统计侵染3 d后浮萍愈伤组织的GUS瞬时表达率(农杆菌介导的目的基因表达数量/含有该基因总数的比率)，结果如下图1所示，浮萍遗传转化应选用________杆菌菌种，其依据是__________________________________________________。 图1 (3)在侵染过程中抑制农杆菌过度生长是转基因成败的关键，头孢霉素(Cef)和羧苄青霉素(Carb)都具有抑制农杆菌生长的作用。本实验采用检测OD值(光密度的缩写，表示被检测物吸收掉的光密度)观察抗生素对农杆菌的抑制效果，如图2所示，在侵染浮萍愈伤组织时选择________作为抑菌的抗生素，其最佳浓度选用________。 图2 (4)在转基因浮萍的培育过程中，科研人员用PCR技术特异性地快速扩增了目的基因。已知PCR引物序列如下图所示，并在每种引物的5′端设计了特定序列。 引物1：GGAAGTCTTCCCGCGGATCCATGGACTATATGTATGGA 引物2：AAACTGCAGTTAGATTCTAGAGGGAATGA 两种引物设计的依据是______________________________________________， 下划线特定序列设计的目的是_______________________________________。 10.某实验利用PCR技术获取目的基因，实验结果显示除目的基因条带(引物与模板完全配对)外，还有2条非特异条带(引物和模板不完全配对)。为了减少反应中非特异条带的产生，以下措施中有效的是(　　) A.增加模板DNA的量 B.延长热变性的时间 C.延长延伸的时间 D.提高复性的温度 11.新冠疫情出现后，病毒核酸检测和疫苗接种在疫情防控中发挥了重要作用。回答下列问题： (1)新冠病毒是一种RNA病毒，检测新冠病毒RNA(核酸检测)可以采取RT—PCR法。这种方法的基本原理是先以病毒RNA为模板合成cDNA，这一过程需要的酶是________________________，再通过PCR技术扩增相应的DNA片段。根据检测结果判断被检测者是否感染新冠病毒。 (2)为了确保新冠病毒核酸检测的准确性，在设计PCR引物时必须依据新冠病毒RNA中的____________________来进行。PCR过程每次循环分为3步，其中温度最低的一步是______________。 (3)某人同时进行了新冠病毒核酸检测和抗体检测(检测体内是否有新冠病毒抗体)，若核酸检测结果为阴性而抗体检测结果为阳性，说明________________________(答出1种情况即可)；若核酸检测和抗体检测结果均为阳性，说明______________________________________________________。 (4)常见的病毒疫苗有灭活疫苗、蛋白疫苗和重组疫苗等。已知某种病毒的特异性蛋白S(具有抗原性)的编码序列(目的基因)。为了制备蛋白疫苗，可以通过基因工程技术获得大量蛋白S。基因工程的基本操作流程是________________________________________________________________。 12.“绿水逶迤去，青山相向开。”大力发展低碳经济已成为全社会的共识。基于某些梭菌的特殊代谢能力，有研究者以某些工业废气(含CO2等一碳温室气体，多来自高污染排放企业)为原料，通过厌氧发酵生产丙酮，构建一种生产高附加值化工产品的新技术。 回答下列问题： (1)研究者针对每个需要扩增的酶基因(如图)设计一对______，利用PCR技术，在优化反应条件后扩增得到目标酶基因。 (2)研究者构建了一种表达载体pMTL80k，用于在梭菌中建立多基因组合表达库，经筛选后提高丙酮的合成量。该载体包括了启动子、终止子及抗生素抗性基因等，其中抗生素抗性基因的作用是_______________________________________，终止子的作用是_____________________________。 (3)培养过程中发现重组梭菌大量表达上述酶蛋白时，出现了生长迟缓的现象，推测其原因可能是_____________________________________________________， 此外丙酮的积累会伤害细胞，需要进一步优化菌株和工艺才能扩大应用规模。 (4)这种生产高附加值化工产品的新技术，实现了______________，体现了循环经济的特点。从“碳中和”的角度看，该技术的优势在于____________________，具有广泛的应用前景和良好的社会效益。 13.某质粒上有Sal Ⅰ、Hind Ⅲ、BamH Ⅰ三种限制酶切割位点，同时还含有抗四环素基因和抗氨苄青霉素基因。利用此质粒获得转基因抗盐烟草的过程，如下图所示。请回答下列问题： (1)将目的基因导入植物细胞，采用最多的方法是农杆菌转化法。其中用到的质粒是________；该质粒含有一段特殊的DNA片段，称为________。该方法中农杆菌的作用是_______________________________________________________。 (2)在构建重组质粒时，和只用一种酶切割目的基因的两端及质粒相比，选用Hind Ⅲ和Sal Ⅰ两种酶的好处是____________________________________________。 (3)含有目的基因的农杆菌可根据标记基因进行筛选。若农杆菌在含有氨苄青霉素和四环素的培养基上都可以生长繁殖，农杆菌中是否已含有目的基因？________(填“是”或“否”)。为什么？_______________________________。 (4)将已经转化的农杆菌进行如下操作，筛选出符合要求的农杆菌。先把转化的农杆菌接种到A培养基中培养，长出菌落后，用无菌牙签挑取A上的单个菌落，分别接种到B(含氨苄青霉素)和C(含四环素和氨苄青霉素)两个培养基的相同位置上，一段时间后，菌落的生长状况如图所示。含目的基因的菌落位于B或C上的哪些菌落中？请在图中相应的位置上圈出来。 14.为了研究PDCD4基因对小鼠子宫内膜基质细胞凋亡的影响，进行了相关实验。 (1)取小鼠子宫时，为避免细菌污染，手术器具应进行________处理；子宫取出剪碎后，用________处理一定时间，可获得分散的子宫内膜组织细胞，再分离获得基质细胞用于培养。 (2)培养基中营养物质应有________________(填写两种)；培养箱中CO2浓度为5%，其主要作用是____________________________________________________。 (3)在含PDCD4基因的表达载体中，启动子的作用是___________________________________________。 为了证明PDCD4基因对基质细胞凋亡的作用，以含PDCD4基因的表达载体和基质细胞的混合培养为实验组，还应设立两个对照组，分别为______________________________________________。经检测，实验组中PDCD4表达水平和细胞凋亡率显著高于对照组，说明该基因对基质细胞凋亡具有________(填“抑制”或“促进”)作用。 15.“端稳中国碗，装满中国粮”，为了育好中国种，科研人员在杂交育种与基因工程育种等领域开展了大量的研究。二倍体作物M的品系甲有抗虫、高产等多种优良性状，但甜度不高。为了改良品系甲，增加其甜度，育种工作者做了如下实验： [实验一]遗传特性及杂交育种的研究 在种质资源库中选取乙、丙两个高甜度的品系，用三个纯合品系进行杂交实验，结果如下表。 杂交组合 F1表型 F2表型 甲×乙 不甜 1/4甜、3/4不甜 甲×丙 甜 3/4甜，1/4不甜 乙×丙 甜 13/16甜、3/16不甜 [实验二]甜度相关基因的筛选 通过对甲、乙、丙三个品系转录的mRNA分析，发现基因S与作物M的甜度相关。 [实验三]转S基因新品系的培育 提取品系乙的mRNA，通过基因重组技术，以Ti质粒为表达载体，以品系甲的叶片外植体为受体，培育出转S基因的新品系。 根据研究组的实验研究，回答下列问题： (1)假设不甜植株的基因型为AAbb和Aabb，则乙、丙杂交的F2中表现为甜的植株基因型有________种。品系乙基因型为________。若用乙×丙中F2不甜的植株进行自交，F3中甜∶不甜比例为________。 (2)下图中，能解释(1)中杂交实验结果的代谢途径有________。 (3)如图是S基因的cDNA和载体的限制性内切核酸酶(限制性核酸内切酶)酶谱。为了成功构建重组表达载体，确保目的基因插入载体中方向正确，最好选用________________酶切割S基因的cDNA和载体。 (4)用农杆菌侵染品系甲叶片外植体，其目的是_________________________。 (5)除了题中所示的杂交育种和基因工程育种外，能获得高甜度品系，同时保持甲的其他优良性状的育种方法还有________________(答出2点即可)。 16.某种类型的白血病由蛋白P引发，蛋白UBC可使P被蛋白酶识别并降解，药物A可通过影响这一过程对该病起到治疗作用。为探索药物A治疗该病的机理，需构建重组载体以获得融合蛋白FLAG－P和FLAG－P△。P△是缺失特定氨基酸序列的P，FLAG是一种短肽，连接在P或P△的氨基端，使融合蛋白能与含有FLAG抗体的介质结合，但不影响P或P△的功能。 (1)为构建重组载体，需先设计引物，通过PCR特异性扩增P基因。用于扩增P基因的引物需满足的条件是________________________________________， 为使PCR产物能被限制酶切割，需在引物上添加相应的限制酶识别序列，该限制酶识别序列应添加在引物的________(填“3′端”或“5′端”)。 (2)PCR扩增得到的P基因经酶切连接插入载体后，与编码FLAG的序列形成一个融合基因，如图甲所示，其中“ATGTGCA”为P基因编码链起始序列。将该重组载体导入细胞后，融合基因转录出的mRNA序列正确，翻译出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正确，但P基因对应的氨基酸序列与P不同。据图甲分析，出现该问题的原因是_________________________________________________。 修改扩增P基因时使用的带有EcoRⅠ识别序列的引物来解决该问题，具体修改方案是______________________________________________________________。 图甲 (3)融合蛋白表达成功后，将FLAG－P、FLAG－P△、药物A和UBC按照图乙中的组合方式分成5组。各组样品混匀后分别流经含FLAG抗体的介质，分离出与介质结合的物质并用UBC抗体检测，检测结果如图丙所示。已知FLAG－P和FLAG－P△不能降解UBC，由①②③组结果的差异推测，药物A的作用是_________________________________________________________________；由②④组或③⑤组的差异推测，P△中缺失的特定序列的作用是__________________________________________________。 (4)根据以上结果推测，药物A治疗该病的机理是__________________________________________________。 17.研究发现，斑马鱼性腺体衍生因子基因(gsdf)主要在精巢中表达。为研究gsdf相关分子的调控机制模型，科研人员构建了以Gamma－crystalin启动子(使相关基因在眼部晶状体特异性表达)启动的斑马鱼gsdf基因与增强型绿色荧光蛋白基因(egfp)融合的荧光素酶报告质粒Tg(Crystal－pro－gsdf－2A－egfp，部分构建过程如图1所示)，最终成功获得表达gsdf基因的转基因斑马鱼。 图1 (1)科研人员提取斑马鱼精巢内的总RNA，经________过程获得cDNA，并以其为模板，通过PCR技术可在总cDNA中专一性的扩增出gsdf基因的cDNA，其原因是____________________________________________________________。 (2)图1中对gsdf基因、2A基因和报告质粒载体的切割共需用到________种限制酶。将酶切后的gsdf基因、2A基因定向连接到用____________双酶切的报告质粒载体中，最终通过系列操作构建出荧光素酶报告质粒Tg。 (3)图1中的2A基因表达的2A肽序列具有“自剪切”的能力，将其置于质粒上gsdf基因和egfp基因之间，可以避免这两个基因表达出一个融合蛋白。2A肽的“自剪切”原理如图2，字母G和P代表2A肽最末端的两个氨基酸。 图2 据图2推测2A肽具有“自剪切”能力的原因是_______________________。 (4)某同学认为：gsdf基因在转基因斑马鱼眼部晶状体中特异性表达，就成功建立和获得了能稳定遗传的转基因斑马鱼模型。请对该同学的观点进行评价并说明理由。___________________________________________________________。 18.定点诱变技术是近年来生物工程研究中发展迅速的一个领域。通过定点诱变可以在体外改造目的DNA分子，进而研究基因的表达以及蛋白质的结构与功能之间的关系。经典的大引物PCR定点诱变技术成为基于PCR的定点诱变技术中应用最普遍的方法，操作过程如图甲。研究者欲改造某基因并将其导入大肠杆菌的质粒中保存，该质粒含有氨苄青霉素抗性基因、LacZ基因及一些酶切位点，结构如图乙。回答下列问题： 甲 乙 (1)利用大引物PCR进行定点诱变需要进行两轮PCR(PCR1和PCR2)，在PCR1中，至少需要________个循环才能获得相应的大引物模板。在PCR2中，要获得带有诱变点的改良基因，引物应选用大引物两条链中的________(填“①”或“②”)。 (2)为实现质粒和改良基因的高效连接，选用限制酶XmaⅠ而不选用限制酶SmaⅠ的原因是____________________________________________________________。为将改良基因构建在质粒上，还需要________等酶。 (3)在构建改良基因表达载体时，有的质粒含有改良基因，有的质粒为空白质粒，将含上述元件的溶液加入到大肠杆菌菌液中，适宜温度下培养一段时间后，再将菌液涂布在含氨苄青霉素和________的平板上。一段时间后，在培养基上出现白色和蓝色两种菌落，其中白色菌落含有重组质粒，判断的依据是 __________________________________________________________________。 【题型三】DNA粗提取、PCR技术与电泳 19.关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法错误的是(　　) A.过滤液沉淀过程在4 ℃冰箱中进行是为了防止DNA降解 B.离心研磨液是为了加速DNA的沉淀 C.在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色 D.粗提取的DNA中可能含有蛋白质 20.DNA琼脂糖凝胶电泳的分子筛选效应是指作为支持介质的琼脂糖，具有网络结构，使大分子物质在通过时受到较大阻力，借此分离不同大小的DNA片段。下列说法错误的是(　　) A.琼脂糖凝胶电泳可用于分离、鉴定DNA分子的混合物 B.双链DNA分子片段长度越大，在琼脂糖中的移动速率越大 C.凝胶制备中加入的核酸染料能与DNA分子结合，用于分离后DNA的检测 D.凝胶中的DNA分子通过染色，可在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来 21.实时荧光RT­PCR可用于RNA病毒的核酸检测，其原理是：在PCR复性过程中探针和引物一起与模板结合，探针两侧分别带有荧光基团和抑制荧光发出的淬灭基团，新链延伸过程中，DNA聚合酶会破坏探针，导致荧光基团与淬灭基团分离而发出荧光。利用RT—PCR进行核酸检测的相关过程如图所示。下列说法错误的是(　　) A.做RT­PCR之前，需要先根据cDNA的核苷酸序列合成引物和探针 B.RNA不能作为PCR扩增的模板，故需要将样本中的RNA逆转录为DNA后再进行扩增 C.若检测结果有强烈荧光信号发出，说明被检测者没有感染病毒 D.病毒的检测还可以检测病毒表面的物质或病毒引发产生的抗体，其原理都是抗原—抗体杂交 22.为减少引物与模板之间的非特异性配对，人们在常规PCR技术的基础上进行了改良，发明了巢式PCR技术。其原理是利用两套PCR引物进行两轮PCR扩增，首先利用第一对引物(外引物)对目的基因所在DNA进行15～30个循环的扩增；第二轮扩增以第一轮扩增产物为模板，利用第二对引物(内引物或巢式引物)进行15～30个循环扩增，具体过程如图所示。下列叙述错误的是(　　) A.巢式PCR中加入的组分与常规PCR相同，但扩增产物比常规PCR特异性更强 B.两套引物需进行两次PCR，由于和两套引物都互补的靶序列较少，因此大大提高了扩增的特异性 C.内引物扩增的模板是外引物扩增后的产物，第二阶段反应能否进行，也是对第一阶段反应正确性的鉴定 D.如果第一次扩增产生了错误片段，则第二次能在错误片段上进行引物配对并扩增的概率将会增加 23.PCR是以模拟体内DNA复制的方式在体外选择性地将DNA某个特殊区域进行扩增的技术。DNA扩增过程的产物有长产物片段和短产物片段两种，其形成过程如图1所示。请回答下列问题： 图1 (1)DNA复制时子链延伸的方向是________(填“5′→3′”或“3′→5′”)。由于DNA聚合酶不能直接催化两个单核苷酸之间的反应，因此DNA复制需要一段单链DNA或RNA作为________。 (2)如果扩增序列为图2所示的两段序列之间的DNA片段，请从表中列出的引物中选出一对合适的引物________。 5′→GACCTGTGGAAGC……CATACGGGATTG­3′ 3′­CTGGACACCTTCG……GTATGCCCTAAC­5′ 图2 引物Ⅰ 引物Ⅱ 甲 5′­GACCTGTGGAAGC A 5′­CATACGGGATTG 乙 5′­CTGGACACCTTCG B 5′­GTATGCCCTAAC 丙 5′­CGAAGGTGTCCAG C 5′­GTTAGGGCTTAC 丁 5′­GCTTCCACAGGTC D 5′­CAATCCCGTATG (3)下面为某同学利用PCR仪进行PCR的操作步骤，请完善相关步骤内容。 a.按配方准备好各组分。 b.用微量移液器向微量离心管中依次加入各组分：模板DNA，4种脱氧核糖核苷三磷酸、________、引物、缓冲液等。 c.________使反应液聚集在微量离心管底部。 d.将微量离心管放入PCR仪，设定好PCR仪的循环程序。 e.进行PCR反应。 (4)PCR的产物片段中，只有________才是符合要求的目标产物。 24.研究发现，增强子是基因转录的调控序列，具有促进启动子表达下游基因的作用；增强子可以位于基因的5′端，也可以位于基因的3′端。人肺特异性X蛋白(LUNX)基因是某种肺癌诊断的标志物，为了研究LUNX基因的增强子是否具有增强基因表达的功能以及其发挥作用的位置是位于启动子的上游还是下游。科研人员从人类全基因组序列数据库中利用生物信息学的方法筛选并利用PCR技术扩增了3个LUNX基因增强子片段(En，表示E1～E3)，分别定向连接到pGL3载体中荧光素酶报告基因(luc＋)启动子(SV40启动子)的上游和下游，如图所示，并通过相关技术检测荧光素酶的活性从而对增强子的功能进行判断，luc＋的表达强度越强，荧光素酶的活性越高。 (1)为了扩增以上3个LUNX基因增强子片段，需要人为设计合适的引物，在上述实验中共需要设计________种引物用于PCR反应体系；为了定向连接到pGL3载体中，在引物5′端需要引入的限制性酶切位点为________种，PCR每次循环一般可以分为________________三步。 (2)以上3个LUNX基因增强子片段经回收、纯化、测序正确后，将双酶切后的PCR产物分别定向连接到用________双酶切和________双酶切的pGL3载体中，构建LUNX基因增强子分别位于报告基因上游和下游的载体，载体中的氨苄青霉素抗性基因Ampr可用来____________________，画出E1连接到pGL3载体报告基因下游的图谱。 (3)根据相关实验技术对荧光素酶的活性进行检测，结果如图3所示， 图3 根据结果得出的结论是______________________________________________。 25.新冠肺炎疫情发生后，全球多地已成功分离出新型冠状病毒毒株，为研发新型冠状病毒核酸检测试剂盒等奠定了基础。实时荧光定量PCR在诊断新型冠状病毒感染中发挥着关键作用，其具体的过程为：从样品中提取RNA→反转录成DNA→PCR扩增→荧光检测。请回答下列问题： (1)新型冠状病毒在不同动物体内翻译出基本相同的多肽链，这是因为___________________________________________________________________。 (2)核酸检测样本多采集于咽、鼻，这些部位存在多种微生物，提取物中核酸种类可能有多种，但通过PCR技术可专一地对新型冠状病毒的核酸序列进行扩增，原因是_______________________________________________________________。 (3)用新型冠状病毒核酸检测试剂盒进行检测时，若送检样本中存在新型冠状病毒，则以新型冠状病毒RNA为模板， 在________酶的作用下合成cDNA，合成cDNA过程中的碱基配对方式为________________________。检测时应设置一空白对照组，若该组别也探测到荧光，则说明_____________________________________。 (4)新型冠状病毒的遗传物质为RNA，RNA易变异，世界多地已经检测出多种变异毒株，这可能导致的危害有：______________________________________(写出两个)。 【题型四】基因工程的应用 26.利用转基因山羊乳腺生物反应器生产丁酰胆碱酯酶，可治疗有机磷中毒。下列叙述错误的是(　　) A.应该用山羊乳腺中特异表达的基因的启动子构建基因表达载体 B.通过体细胞克隆可将丁酰胆碱酯酶基因传递给子代 C.通过显微注射技术将基因表达载体导入山羊乳腺细胞 D.山羊乳腺细胞可将肽链加工成具有一定空间结构的丁酰胆碱酯酶 (不定项)27.植物生物反应器主要以整株植物、植物组织或植物悬浮细胞为加工场所，生产药物蛋白。叶绿体遗传转化体系是近年发展起来的一种新的植物生物反应器。叶绿体转化是以同源重组原理将外源目的基因整合到目标叶绿体基因组中的一种方式，是一种高表达、安全性极高的遗传转化方法。下列相关叙述正确的是(　　) A.植物生物反应器涉及的现代生物学技术是基因工程和植物细胞工程 B.构建的基因表达载体中含有叶绿体特异启动子，使得目的基因只能在叶绿体中表达 C.植物叶绿体表达体系可以防止转基因作物的目的基因通过花粉在自然界中扩散 D.把目的基因导入叶绿体DNA中，将来产生的配子一定含有此目的基因 28.运用现代生物技术的育种方法，将抗菜青虫的Bt基因转入优质油菜中，培育出转基因抗虫油菜品种，该品种在生长过程中能产生抗虫蛋白，对菜青虫有显著抗性，能提高油菜产量，减少农药使用量，保护农业生态环境。根据以上信息，分析下列叙述正确的是(　　) A.Bt基因的本质是蛋白质 B.Bt基因中有菜青虫的遗传物质 C.转基因抗虫油菜能产生抗虫蛋白是由于其具有Bt基因 D.转基因抗虫油菜产生的抗虫蛋白是无机物 29.几丁质是许多真菌细胞壁的重要成分，几丁质酶可催化其水解。将几丁质酶基因转入菊花体内，可增强其抗真菌病的能力。下列有关叙述错误的是(　　) A.将几丁质酶基因插入Ti质粒的T­DNA上构建表达载体 B.可通过显微注射法将农杆菌导入菊花受体细胞 C.可用PCR等技术检测目的基因是否成功导入 D.可用真菌接种实验检测转基因菊花对真菌的抗性程度 30.青蒿素是有效的抗疟药物，但野生黄花蒿青蒿素产量低，为缓解青蒿素供应不足的状况，科学家将tms基因和tmr基因导入黄花蒿的愈伤组织从而获得了黄花蒿的冠瘿组织，实验过程用到的部分结构如下图。请据图回答问题： (1)在构建重组Ti质粒的过程中常使用两种能产生不同黏性末端的限制性内切核酸酶对目的基因和Ti质粒分别进行切割，这样做的好处有_________________。 (2)将目的基因导入黄花蒿愈伤组织前，先将目的基因导入农杆菌，农杆菌的作用是_______________________________________________________________。 (3)为了准确鉴别受体细胞中是否含有目的基因并将含有目的基因的细胞筛选出来，所选的Ti质粒至少应包含________种抗生素抗性基因，以便筛选和鉴别。 (4)与愈伤组织相比，冠瘿组织的生长速度更快，原因可能是__________________________________________________________________。 (5)艾弗里等人的肺炎链球菌转化实验为证明DNA是遗传物质做出了重要贡献，也可以说是基因工程的先导，如果他们的工作为基因工程理论的建立提供了启示，那么，这一启示是___________________________________________________。 31.乳腺炎和口蹄疫分别是由细菌和病毒引起的危害奶牛养殖业的两种严重疾病。研究者利用生物技术培育出转牛乳铁蛋白肽(抗细菌)和干扰素(抗病毒)基因的双转基因奶牛品种。下图1为基因表达载体，图2为培育流程。请据图回答问题： (1)构建基因表达载体时需要用到的工具酶是___________________________________。 (2)基因表达过程包括________，图1中一般能同时表达的基因是_________________________________。 新霉素抗性基因的作用是______________________________________________。 (3)图2中研究者可利用____________________________技术筛选出干扰素基因成功表达的胚胎进行移植。 (4)若利用PCR技术增加目的基因的数量，由图3可知，A、B、C、D四种单链DNA片段中应选取________作为引物(DNA复制子链的延伸方向5′→3′)。若上图所示基因复制2次，则共需要这两种引物各________个；PCR程序中“适温延伸”中的适温是________酶的最适温度。 32.乙肝病毒表面有T1蛋白和T2蛋白，免疫接种实验表明这两种蛋白质都可引起实验动物的免疫反应。科研人员用农杆菌转化法培育出转基因番茄，用于生产可口服的乙肝病毒疫苗，为预防乙肝开辟了一条新途径。回答下列问题： (1)T1蛋白和T2蛋白进入实验动物的肠道后，会被实验动物小肠黏膜上的一种M细胞当作________处理，进而引发一系列的免疫反应，最终产生相应的________，使实验动物获得了对乙肝病毒的免疫能力。 (2)构建基因表达载体是基因工程的核心，其目的是_____________________。构建表达载体时，需要选择果实特异性启动子，其目的是__________________________________________。 (3)用转基因番茄生产可口服的乙肝病毒疫苗(含T1蛋白)，若要检测目的基因是否翻译出T1蛋白，可用的检测物质是________________(填“T1蛋白的基因”或“T1蛋白的抗体”)，该检测方法称为_______________________________________。 (4)获得转基因番茄植株后，已确定该植株所结番茄中含有T2蛋白，此后还要对T2蛋白的功能进行个体水平的鉴定，方法是____________________________。 【题型五】蛋白质工程的原理和应用 33.纤维素酶广泛应用于医药、食品发酵、造纸、废水处理等领域。研究人员利用蛋白质工程将细菌纤维素酶的相应氨基酸替换后，纤维素酶热稳定性得到了提高。下列有关该技术的说法，正确的是(　　) A.改造后的纤维素酶的较高热稳定性不可遗传 B.对纤维素酶的改造需要以基因工程为基础 C.改造纤维素酶无需构建基因表达载体 D.对纤维素酶的改造是通过直接改造mRNA实现的 34.下图表示蛋白质工程的操作过程，相关说法不正确的是(　　) A.a、b过程分别是转录、翻译 B.蛋白质工程中对蛋白质分子结构的了解是非常关键的工作 C.蛋白质工程是完全摆脱基因工程技术的一项全新的生物工程技术 D.蛋白质工程中可能构建出一种全新的基因 35.水蛭是我国的传统中药材，主要药理成分水蛭素为水蛭蛋白中重要成分之一，具有良好的抗凝血作用。拟通过蛋白质工程改造水蛭素结构，提高其抗凝血活性。回答下列问题： (1)蛋白质工程流程如图所示，物质a是________________，物质b是__________。在生产过程中，物质b可能不同，合成的蛋白质空间构象却相同，原因是_______________________________________。 (2)蛋白质工程是基因工程的延伸，基因工程中获取目的基因的常用方法有________________________、________________________________和利用PCR技术扩增。PCR技术遵循的基本原理是__________________。 (3)将提取的水蛭蛋白经甲、乙两种蛋白酶水解后，分析水解产物中的肽含量及其抗凝血活性，结果如图所示。推测两种处理后酶解产物的抗凝血活性差异主要与肽的________(填“种类”或“含量”)有关，导致其活性不同的原因是__________________________________________________。 (4)若要比较蛋白质工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素的抗凝血活性差异，简要写出实验设计思路。 ___________________________________________________________________。 36.以我国科学家为主的科研团队将OSNL(即4个基因Oct4/Sox2/Nanog/Lin28A的缩写)导入黑羽鸡胚成纤维细胞(CEFs)，诱导其重编程为诱导多能干细胞(iPS)，再诱导iPS分化为诱导原始生殖细胞(iPGCs)，然后将iPGCs注射到孵化2.5天的白羽鸡胚血管中，最终获得具有黑羽鸡遗传特性的后代，实验流程如图。回答下列问题。 (1)CEFs是从孵化9天的黑羽鸡胚中分离获得的，为了获得单细胞悬液，鸡胚组织剪碎后需用________处理。动物细胞培养通常需要在合成培养基中添加________等天然成分，以满足细胞对某些细胞因子的需求。 (2)体外获取OSNL的方法有________________(答出1种即可)。若要在CEFs中表达外源基因的蛋白，需构建基因表达载体，载体中除含有目的基因和标记基因外，还须有启动子和________等。启动子是________识别和结合的部位，有了它才能驱动__________________________________。 (3)iPS细胞和iPGCs细胞的形态、结构和功能不同的根本原因是____________________________________________________________________。 (4)诱导iPS细胞的技术与体细胞核移植技术的主要区别是__________________________________________________________________。 (5)该实验流程中用到的生物技术有__________________________________(答出2点即可)。 37.中国是传统的水稻种植大国，有一半以上人口以稻米为主食。在培育水稻优良品种的过程中，发现某野生型水稻叶片绿色由基因C控制。回答下列问题： (1)突变型1叶片为黄色，由基因C突变为C1所致，基因C1纯合幼苗期致死。突变型1连续自交3代，F3成年植株中黄色叶植株占________。 (2)测序结果表明，突变基因C1转录产物编码序列第727位碱基改变，由5′－GAGAG－3′ 变为5′－GACAG－3′，导致第______位氨基酸突变为__________，从基因控制性状的角度解释突变体叶片变黄的机理_____________________________________________。(部分密码子及对应氨基酸：GAG谷氨酸；AGA精氨酸；GAC天冬氨酸；ACA苏氨酸；CAG谷氨酰胺) (3)由C突变为C1产生了一个限制酶酶切位点。从突变型1叶片细胞中获取控制叶片颜色的基因片段，用限制酶处理后进行电泳(电泳条带表示特定长度的DNA片段)，其结果为图中____(填“Ⅰ”“Ⅱ”或“Ⅲ”)。 (4)突变型2叶片为黄色，由基因C的另一突变基因C2所致。用突变型2与突变型1杂交，子代中黄色叶植株与绿色叶植株各占50%。能否确定C2是显性突变还是隐性突变？______(填“能”或“否”)，用文字说明理由_______________________________________________________________。 38.目前科学家们通过蛋白质工程制造出了蓝色荧光蛋白、黄色荧光蛋白等。采用蛋白质工程技术制造出蓝色荧光蛋白的过程的正确顺序是(　　) ①推测蓝色荧光蛋白的氨基酸序列和确定相对应的脱氧核苷酸序列　②根据预期的蓝色荧光蛋白的功能设计其结构　③合成蓝色荧光蛋白基因　④表达出蓝色荧光蛋白 A.①②③④ B.②①③④ C.②③①④ D.④②①③ 39.T4溶菌酶在高温时易失去活性。研究人员对编码T4溶菌酶的基因进行改造，使T4溶菌酶第3位的异亮氨酸变为半胱氨酸，该半胱氨酸与第97位的半胱氨酸之间形成一个二硫键，提高了酶的耐热性。下列相关叙述正确的是(　　) A.T4溶菌酶耐热性提高的原因是组成该酶的氨基酸种类和数量发生了改变 B.T4溶菌酶的改造属于蛋白质工程，自然界中的酶都可通过蛋白质工程进行改造 C.蛋白质工程与中心法则的流动方向一致，即DNA→mRNA→蛋白质 D.若高温使蛋白质分子的空间结构发生改变，蛋白质的功能也会受到影响 40.錾字石村因甜柿出名而获“中国甜柿之乡”。甜柿鲜果肉中含有可溶性糖、微量元素、维生素和β－胡萝卜素等多种成分，营养价值高，深受消费者的喜爱。甜柿的自然脱涩与乙醛代谢关键酶基因(PDC)密切相关，推测涩味程度可能与PDC基因的表达情况有关。已知启动子区域存在着许多调控蛋白的结合位点，RNA聚合酶和调控蛋白共同影响基因的表达水平。AD基因表达出的AD蛋白与启动子足够靠近时，能够激活后续基因转录，据此可利用与AD蛋白形成的融合蛋白来筛选待测蛋白。为筛选PDC基因的调控蛋白，科研人员进行了下列实验。回答下列问题。 注：金担子素是一种抗真菌药物 甲 (1)PDC基因的启动子序列未知，为获得大量该基因启动子所在片段，可利用限制酶将基因组DNA进行酶切，然后在________的作用下将已知序列信息的接头片段连接在PDC基因的上游，根据接头片段和PDC基因编码序列设计引物进行PCR，引物的作用是____________________________，目前在PCR反应中使用Taq酶而不使用大肠杆菌DNA聚合酶的主要原因是_________________________________________________________________。 (2)利用质粒A构建含有PDC基因启动子片段的重组质粒并导入代谢缺陷型酵母菌，用不含________的培养基可筛选出成功转化的酵母菌Y1H；将从甜柿中提取的RNA逆转录形成的各种cDNA与质粒G连接后导入酵母菌，此时应选择质粒G中的位点________(填序号1～5)作为cDNA的插入位点，最终获得携带不同cDNA片段的酵母菌群Y187。重组酵母Y1H与Y187能够进行接合生殖，形成的接合子含有两种酵母菌质粒上的所有基因。若接合子能在含有金担子素的培养基中生存，则推测待测蛋白是PDC基因的调控蛋白，请结合图丙简述作出该推测的理由____________________________________________。 (3)筛选出PDC基因的调控蛋白后，为满足生产上的需要对其进行改良，这种技术属于________工程，该工程的起点是____________。 【题型六】生物技术的安全性和伦理问题 41.关于现代生物工程技术应用安全性的评价，下列叙述正确的是(　　) A.由于存在生殖隔离，大量种植转基因抗除草剂农作物不存在安全性问题 B.中国政府不反对治疗性克隆，可以有限制地进行生殖性克隆研究 C.《禁止生物武器公约》规定在任何情况下都不发展、不生产生物武器，但可储存少量的生物武器用于研究 D.转基因的受体细胞通常限制在遗传上有特定缺陷的生物上 42.下列关于治疗性克隆和生殖性克隆的说法，错误的是(　　) A.使用病人自己的细胞产生胰岛细胞以治疗糖尿病属于治疗性克隆 B.将一个克隆的胚胎植入一个女性子宫发育成婴儿的过程属于生殖性克隆 C.治疗性克隆属于无性生殖，生殖性克隆属于有性生殖 D.治疗性克隆和生殖性克隆技术均需要用到动物细胞培养技术和核移植 1．融合PCR技术采用具有互补末端的引物，形成具有重叠链的PCR产物，通过PCR产物重叠链的延伸，从而将不同来源的任意DNA片段连接起来（如图）。下列说法错误的是（    ） A．基因甲至少经3个循环才能获得含引物P2的双链等长DNA B．不能为提高扩增效率把四种引物同时加入一个扩增体系 C．图中融合PCR第一步的两条链重叠部位可互相作为另一条链的引物 D．经融合PCR获得64个融合基因至少消耗63个引物P4 2.下列有关“DNA粗提取与鉴定”、“DNA片段的扩增及电泳鉴定”实验的叙述，错误的是（　　） A．设置一组加二苯胺但是不加DNA的对照组用来排除二苯胺受热变蓝的可能 B．提取到的白色丝状物直接与一定浓度的二苯胺溶液混合，沸水浴5min后变蓝 C．电泳实验中待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时停止电泳 D．琼脂糖凝胶中加入核酸染料，便于在300nm的紫外灯下检测扩增产物 3．毕赤酵母是一种能直接利用甲醇的微生物，其含有的醇氧化酶基因(AOX1)强效启动子在甲醇存在时被激活，可以驱动外源基因的高效表达。人体蛋白MT1-MMP定位在细胞膜上，并在多种肿瘤中被高表达出，MT1-MMP能促进肿瘤转移。为进一步研究肿瘤转移机制，科研人员将MT1-MMP基因转化至毕赤酵母，先将转基因个体进行低密度发酵，然后再进行高密度发酵，最终获得目标蛋白。下列相关说法正确的是（    ） A．转基因毕赤酵母和大肠杆菌作为发酵菌种都具有发酵周期短的优点 B．目标蛋白的产量受发酵培养基成分、甲醇、温度、pH的影响 C．可将MT1-MMP基因插入AOX1中以便通过甲醇调控基因表达 D．甲醇的作用是作为碳源和氮源以及诱导目标蛋白的表达 4．CRISPR/Cas9系统包含向导RNA（gRNA）和核酸酶Cas9，可以对哺乳动物细胞进行基因组编辑。编辑时，Cas9蛋白在gRNA的引导下，结合基因组的特定位点并进行切割。科研人员利用图中gRNA和Cas9共表达质粒，对体外培养的小鼠细胞中A基因的表达进行调控。下列说法错误的是（　　）    A．可以依据A基因的部分序列设计共表达质粒中的编码gRNA序列 B．编码gRNA的序列需要整合到受体细胞基因组DNA上才能发挥作用 C．导入该质粒后使用含潮霉素的液体培养基筛选受体细胞 D．用抗原—抗体杂交技术检测结果为部分细胞A蛋白表达量降低 5．单亲二体(UPD)是指体细胞中某对同源染色体来自同一亲本，其它染色体组成正常的个体，其染色体组成是2n。微卫星DNA(STR)的核心序列为2-6个碱基，重复次数和分布个数因染色体而异，可以随染色体稳定地遗传给下一代。可使用STR检测技术对UPD进行诊断：先在各条染色体上找到STR区域，在STR区域的两侧设计PCR引物，每对引物当中有一条是带荧光标记的，在同一体系中进行PCR得到带有不同荧光标记的扩增产物，经电泳后被检测到，然后进行比对、确认。下列说法错误的是（    ） A．同一体系中进行PCR使用的引物的复性温度应大致相同 B．用含有核酸染料的载样缓冲液来鉴定扩增得到的PCR产物 C．UPD现象可能会导致隐性遗传病以显性方式传递 D．检测过程需要分析多个STR位点以确定是否为UPD 6．为能快速找到特定抗原的高亲和力抗体，研究者构建抗体文库。从免疫后动物的特定细胞中提取总mRNA，反转录成cDNA，经PCR扩增后，构建重组载体，再把重组载体转化到宿主细胞，形成含不同抗体基因的细胞集合，即抗体文库。下列说法错误的是（　　） A．“特定细胞”是B淋巴细胞 B．反转录出的cDNA全部是抗体基因 C．基因需要定向插入启动子和终止子中间才能表达 D．抗体分布在宿主细胞表面有利于进行抗体筛选 7．DNA因构象不同在电泳时的迁移速率有所差异。超螺旋DNA以超螺旋形式存在，分子体积小；线性DNA分子伸展，在凝胶中移动时受到的摩擦力较大；开环DNA是由环状DNA双链中的一条链发生断裂形成，分子更松散。下列说法正确的是（　　） A．电泳时需要留一个加样孔加入标准参照物 B．电泳时电泳指示剂加在凝胶中，核酸染料与PCR产物混合加入加样孔 C．电泳后的凝胶置于紫外灯下，看到的DNA条带呈蓝色 D．三种构象的DNA在不同浓度的凝胶中迁移速率一定不同 8.微生物底盘细胞是指经过基因工程改造、用于高效表达目标蛋白的宿主细胞系统。利用合成生物学相关技术对底盘细胞进行遗传及代谢途径改造，可以构建出较为理想的细胞工厂，具体流程见图。研究者已用毕赤酵母作为底盘细胞来生产次生代谢产物萜类物质。下列说法错误的是（　　）      A．毕赤酵母生产的萜类物质是酵母生长所必需的物质 B．某基因失活后菌株无法存活可以确定该基因是必需基因 C．去除野生菌株的非必需基因降低底盘细胞的复杂性，保证目的基因的高效表达 D．选择大肠杆菌做底盘细胞直接合成的胰岛素通常不具备生物活性 9.农杆菌感知到植物分泌的酚类化合物后，会开启其侵染过程，胞内蛋白V2识别并切割T-DNA的边界序列，切割后的T-DNA的一条链与V2形成复合物经通道复合体进入植物细胞。植物细胞被农杆菌侵染后会合成磷酸化的蛋白(VIP1-P)激活抗病相关基因的表达。同时，农杆菌的VF蛋白通过通道复合体进入植物细胞使VIP1-P去磷酸化且去除T-DNA上的V2为T-DNA的整合做准备。下列说法正确的是（    ） A．V2识别切割T-DNA并与其形成复合物的过程主要由线粒体供能 B．VF降低了植物的抗菌能力并促进了T-DNA与染色体DNA的整合 C．T-DNA与VF借助细胞膜上的蛋白质通过胞吞进入细胞 D．农杆菌侵染进入植物细胞的过程未涉及氢键、磷酸二酯键的断裂与形成 【答案】B 10.PCR和琼脂糖凝胶电泳是基因工程中常用的两种技术，下列对其中所用试剂和操作的说法正确的是（　　） A．PCR所用微量离心管、微量移液器、枪头都要进行高压蒸汽灭菌 B．PCR扩增前，应根据待扩增DNA片段的长度设置合适的延伸温度 C．需将扩增得到的PCR产物与内含核酸染料的缓冲液混合后进行加样 D．DNA分子较大时，可适当降低凝胶浓度来提高DNA分子的迁移速率 11.染色体上的端粒DNA由短的串联重复序列组成，同种生物的该序列相同。少数缺乏端粒酶活性的肿瘤细胞可通过端粒延长替代机制（ALT）维持端粒长度。ALT机制如下：第一条染色体端粒的末端①链结合到第二条染色体端粒的末端②链上并延伸；随后①链脱离，在RNA引物和DNA聚合酶的作用下，新延长的①链被转化成双链形式。这个过程可被重复数十次，使得序列信息从一个端粒传递到另一端粒上。下列说法错误的是（    ） A．①链的延伸过程以②链作为模板，该过程不需要合成引物 B．DNA聚合酶只能从核酸片段3′端延伸，这导致端粒DNA5′端比3′端短 C．进行ALT的肿瘤细胞中端粒酶基因甲基化程度可能较高 D．非同源染色体间通过ALT机制实现了基因重组，增加了遗传的多样性 12.双向启动子可同时结合两个RNA聚合酶来驱动下游基因的表达，研究人员构建了如图所示的表达载体，以检测双向启动子作用效果。下列分析正确的是（    ）    A．表达载体中GUS基因和LUC基因转录时使用同一条DNA单链为模板 B．为连入GUS基因，需用Sal I和Sph I酶切已整合了双向启动子及LUC基因的质粒 C．在培养基中添加壮观霉素可筛选出成功导入表达载体的受体细胞 D．通过观察是否出现荧光和蓝色物质可检测双向启动子的作用效果 13.采用焦磷酸光化测序法进行DNA测序的原理是：将待测DNA链固定到一个磁珠上，将磁珠包被在单个油水混合小滴（乳滴）中，在该乳滴里进行独立的DNA复制，四种脱氧核苷三磷酸依照T、A、C、G的顺序一个一个进入该乳滴，如果发生碱基配对，就会释放一个焦磷酸（PPi），PPi经过一系列酶促反应后发出荧光。下列说法错误的是（    ）    A．脱氧核苷三磷酸通过磷酸二酯键把脱氧核苷酸接到多核苷酸链的3'-OH末端 B．PPi经过一系列的酶促反应后，释放出的能量一部分可转化为光能 C．当胞嘧啶脱氧核苷三磷酸进入后能发出荧光，说明此位置模板链上为G D．若将四种脱氧核苷三磷酸同时加入反应体系中，可大大提高DNA测序的效率 14.已知紫外线（UV）可诱导DNA单链上相邻的T之间相互结合形成嘧啶二聚体，阻碍碱基正常配对而导致复制错误引起突变，DNA修复机制对维持遗传稳定性至关重要。研究人员发现某细菌中存在两种如图所示修复机制：①光复活修复：光复活酶（PRE）在可见光下直接切割二聚体，恢复原结构；②暗修复：无需光照，通过切除损伤单链并重新合成。下列说法正确的是（    ）    A．PRE可将嘧啶二聚体的磷酸二酯键断开 B．暗修复过程中还需消耗原料、能量和引物 C．PRE基因发生碱基替换后，在光照下PRE的修复功能可能正常 D．UV诱导DNA形成嘧啶二聚体引起的变异不可遗传 （不定项）15.某研究小组构建了能表达ACTA1-GFP融合蛋白的重组质粒，该重组质粒的部分结构如下图所示。下列叙述错误的是（    ）    注：F1和F2表示上游引物，R1和R2表示下游引物 A．RNA聚合酶与启动子结合，调控ACTA1基因和GFP基因的表达 B．仅用F2和R1一对引物无法确定ACTA1基因插入方向是否正确 C．ACTA1基因转录的模板链是a链，引物F1与a链的部分序列相同 D．若用引物F2和R2进行PCR，能更好地区分ACTA1-GFP基因纯合子和杂合子 16.荧光素酶（Luc蛋白）由550个氨基酸组成，分为N端和C端2个功能片段，即NLuc蛋白 （2-416氨基酸） 和CLuc蛋白 （398—550氨基酸），两部分不能自动重组并发挥作用；将目标蛋白OsBIK1蛋白和OsXLG2蛋白分别与NLuc蛋白和CLuc蛋白融合，若2个目标蛋白相互作用，则NLuc蛋白和CLuc蛋白能成功组装为荧光素酶并分解荧光素发出荧光。科研人员构建了可表达OsBIK1-HA-NLuc融合蛋白的表达载体1和可表达CLuc-OsXLG2融合蛋白的表达载体2并进行了检测，如图1所示，图中HA为标签蛋白（用于目的蛋白的检测、示踪等）的编码序列。 (1)构建重组质粒1时，需要把OsBIK1基因的对应终止密码子的3个碱基去除，原因是 ；图中HA编码序列插入OsBIK1基因编码链的 （填“5'端”或“3'端”），编码链为转录时所用模板链的互补链。 (2)如果用抗Luc蛋白抗体分别检测表达载体1和2融合蛋白表达情况，结果如图2，可优先选用抗 蛋白抗体进一步区分条带1为 融合蛋白。 (3)为了满足应用常需要在载体中构建诱导型启动子，当诱导物存在时可以激活或抑制目的基因的表达。双向启动子可同时结合两个RNA聚合酶来驱动下游基因的表达，研究人员已经构建了下图所示的基因表达载体，以检测双向启动子作用效果。试分析：为连入GUS基因，需用 酶切已整合了双向启动子及LUC基因的质粒，若观察到 则可确认双向启动子起作用。 1．（2025·山东·高考真题）种子休眠是抵御穗发芽的一种机制。通过对Ti质粒的改造，利用农杆菌转化法将Ti质粒上的T-DNA随机整合到小麦基因组中，筛选到2个种子休眠相关基因的插入失活纯合突变体。与野生型相比，突变体种子的萌发率降低。小麦基因组序列信息已知。 (1)Ti质粒上与其在农杆菌中的复制能力相关的结构为 。选用图甲中的SmaI对抗除草剂基因X进行完全酶切，再选择SmaI和 对Ti质粒进行完全酶切，将产生的黏性末端补平，补平时使用的酶是 。利用DNA连接酶将酶切后的包含抗除草剂基因X的片段与酶切并补平的Ti质粒进行连接，构建重组载体，转化大肠杆菌；经卡那霉素筛选并提取质粒后再选用限制酶 进行完全酶切并电泳检测，若电泳结果呈现一长一短2条带，较短的条带长度近似为 bp，则一定为正向重组质粒。 (2)为证明这两个突变体是由于T-DNA插入到小麦基因组中同一基因导致的，提取基因组DNA，经酶切后产生含有T-DNA的基因组片段（图乙）。在此酶切过程中，限于后续PCR难以扩增大片段DNA，最好使用识别序列为 （填“4”“6”或“8”）个碱基对的限制酶，且T-DNA中应不含该酶的酶切位点。需首先将图乙的片段 ，才能利用引物P1和P2成功扩增未知序列。PCR扩增出未知序列后，进行了一系列操作，其中可以判断出2条片段的未知序列是否属于同一个基因的操作为 （填“琼脂糖凝胶电泳”或“测序和序列比对”）。 (3)通过农杆菌转化法将构建的含有野生型基因的表达载体转入突变植株，如果检测到野生型基因， （填“能”或“不能”）确定该植株的表型为野生型。 2．（2024·山东·高考真题）研究发现基因L能够通过脱落酸信号途径调控大豆的逆境响应。利用基因工程技术编辑基因L，可培育耐盐碱大豆品系。在载体上的限制酶BsaI切点处插入大豆基因L的向导DNA序列，将载体导入大豆细胞后，其转录产物可引导核酸酶特异性结合基因组上的目标序列并发挥作用。载体信息、目标基因L部分序列及相关结果等如图所示。 (1)用PCR技术从大豆基因组DNA中扩增目标基因L时，所用的引物越短，引物特异性越 （填“高”或“低”）。限制酶在切开DNA双链时，形成的单链突出末端为黏性末端，若用BsaI酶切大豆基因组DNA，理论上可产生的黏性末端最多有 种。载体信息如图甲所示，经BsaI酶切后，载体上保留的黏性末端序列应为5'- -3'和5'- -3'。 (2)重组载体通过农杆菌导入大豆细胞，使用抗生素 筛选到具有该抗生素抗性的植株①～④。为了鉴定基因编辑是否成功，以上述抗性植株的DNA为模板，通过PCR扩增目标基因L，部分序列信息及可选用的酶切位点如图乙所示，PCR产物完全酶切后的电泳结果如图丙所示。据图可判断选用的限制酶是 ，其中纯合的突变植株是 （填序号）。 (3)实验中获得1株基因L成功突变的纯合植株，该植株具有抗生素抗性，检测发现其体细胞中只有1条染色体有T-DNA插入。用抗生素筛选这个植株的自交子代，其中突变位点纯合且对抗生素敏感的植株所占比例为 ，筛选出的敏感植株可用于后续的品种选育。 3．（2023·山东·高考真题）科研人员构建了可表达J-V5融合蛋白的重组质粒并进行了检测，该质粒的部分结构如图甲所示，其中V5编码序列表达标签短肽V5。    (1)与图甲中启动子结合的酶是 。除图甲中标出的结构外，作为载体，质粒还需具备的结构有 （答出2个结构即可）。 (2)构建重组质粒后，为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，需进行PCR检测，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物 。已知J基因转录的模板链位于b链，由此可知引物F1与图甲中J基因的 （填“a链”或“b链”）相应部分的序列相同。 (3)重组质粒在受体细胞内正确表达后，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表达水平，结果如图乙所示。其中，出现条带1证明细胞内表达了 ，条带2所检出的蛋白 （填“是”或“不是”）由重组质粒上的J基因表达的。 4．（2022·山东·高考真题）某种类型的白血病由蛋白P引发，蛋白UBC可使P被蛋白酶识别并降解，药物A可通过影响这一过程对该病起到治疗作用。为探索药物A治疗该病的机理，需构建重组载体以获得融合蛋白FLAG-P和FLAG-P△。P△是缺失特定氨基酸序列的P，FLAG是一种短肽，连接在P或P△的氨基端，使融合蛋白能与含有FLAG抗体的介质结合，但不影响P或P△的功能。 (1)为构建重组载体，需先设计引物，通过PCR特异性扩增P基因。用于扩增P基因的引物需满足的条件是 、为使PCR产物能被限制酶切割，需在引物上添加相应的限制酶识别序列，该限制酶识别序列应添加在引物的 （填“3'端”或“5'端”）。 (2)PCR扩增得到的P基因经酶切连接插入载体后，与编码FLAG的序列形成一个融合基因，如图甲所示，其中“ATGTGCA”为P基因编码链起始序列。将该重组载体导入细胞后，融合基因转录出的mRNA序列正确，翻译出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正确，但P基因对应的氨基酸序列与P不同。据图甲分析，出现该问题的原因是 。修改扩增P基因时使用的带有EcoRⅠ识别序列的引物来解决该问题，具体修改方案是 。 (3)融合蛋白表达成功后，将FLAG-P、FLAG-P△、药物A和UBC按照图乙中的组合方式分成5组。各组样品混匀后分别流经含FLAG抗体的介质，分离出与介质结合的物质并用UBC抗体检测，检测结果如图丙所示。已知FLAG-P和FLAG-P△不能降解UBC，由①②③组结果的差异推测，药物A的作用是 ；由②④组或③⑤组的差异推测，P△中缺失的特定序列的作用是 。 (4)根据以上结果推测，药物A治疗该病的机理是 。 5．（2021·山东·高考真题）人类γ基因启动子上游的调控序列中含有 BCL11A 蛋白结合位点，该位点结合 BCL11A 蛋白后，γ基因的表达被抑制。通过改变该结合位点的序列，解除对γ基因表达的抑制，可对某种地中海贫血症进行基因治疗。科研人员扩增了γ基因上游不同长度的片段，将这些片段分别插入表达载体中进行转化和荧光检测，以确定 BCL11A 蛋白结合位点的具体位置。相关信息如图所示。 （1）为将扩增后的产物定向插入载体指导荧光蛋白基因表达，需在引物末端添加限制酶识别序列。据图可知，在 F1～F7末端添加的序列所对应的限制酶是 ，在 R 末端添加的序列所对应的限制酶是 。本实验中，从产物扩增到载体构建完成的整个过程共需要 种酶。 （2）将构建的载体导入除去 BCL11A 基因的受体细胞，成功转化后，含 F1～F6与 R 扩增产物的载体表达荧光蛋白，受体细胞有荧光，含 F7与 R 扩增产物的受体细胞无荧光。含 F7 与 R 扩增产物的受体细胞无荧光的原因是 。 （3）向培养液中添加适量的雌激素，含 F1～F4与 R 扩增产物的受体细胞不再有荧光，而含 F5～F6与 R 扩增产物的受体细胞仍有荧光。若γ基因上游调控序列上与引物序列所对应的位置不含有 BCL11A 蛋白的结合位点序列，据此结果可推测，BCL11A 蛋白结合位点位于 ，理由是 。 6．（2024·山东·高考真题）关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法正确的是（　　） A．整个提取过程中可以不使用离心机 B．研磨液在4℃冰箱中放置几分钟后，应充分摇匀再倒入烧杯中 C．鉴定过程中DNA双螺旋结构不发生改变 D．仅设置一个对照组不能排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰 7．（2022·山东·高考真题）关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法错误的是（    ） A．过滤液沉淀过程在4℃冰箱中进行是为了防止DNA降解 B．离心研磨液是为了加速DNA的沉淀 C．在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色 D．粗提取的DNA中可能含有蛋白质 8．（2021·山东·高考真题）粗提取 DNA 时，向鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水并搅拌，过滤后所得滤液进行下列处理后再进行过滤，在得到的滤液中加入特定试剂后容易提取出 DNA相对含量较高的白色丝状物的处理方式是（    ） A．加入适量的木瓜蛋白酶 B．37～40℃的水浴箱中保温 10～15 分钟 C．加入与滤液体积相等的、体积分数为 95%的冷却的酒精 D．加入 NaCl 调节浓度至 2mol/L→过滤→调节滤液中 NaCl 浓度至 0．14mol/L 学科网（北京）股份有限公司1 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 $