3.2基因工程的基本操作程序（第三课时）课件-2024-2025学年高二下学期生物人教版选择性必修3

课前检测 1.将目的基因导入植物细胞的方法？ 2.农杆菌的特点？目的基因插入的位置？农杆菌转化法的过程、受体细胞？ 3.将目的基因导入动物细胞的方法、受体细胞？ 4.将目的基因导入微生物细胞的方法？Ca2+处理的目的？受体细胞？ 5.与大肠杆菌相比，酵母菌生产胰岛素的优势？ 6.目的基因的检测与鉴定在分子水平的检测有？方法分别是？ 7.基因工程的基本操作程序的步骤？ 8.PCR的全称、原理、条件、过程？ 9.构建基因表达载体的目的？ 10.基因表达载体的组成，各组成的作用？ 11.限制酶的选择方法？ 探究•实践：DNA片段的扩增及电泳鉴定 1.实验原理 （1）利用PCR在体外进行DNA片段扩增的原理 ①PCR利用了DNA的_________原理，通过_________来控制DNA双链的解聚与结合，PCR仪实质上就是一台能够______________的仪器，一次PCR一般要经历___次循环； 热变性 调节温度 自动调控温度 30 ②PCR扩增DNA片段还利用了_________________的原理； DNA半保留复制 基因工程的基本操作程序 （2）DNA片段电泳鉴定的原理 ①DNA分子具有_____________，在一定的___下，这些基团可以带上正电荷或负电荷，在_____的作用下，这些________会向着__________________的电极移动，这个过程就是_____； 可解离的基团 pH 电场 带电分子 电泳 与它所带电荷相反 ②PCR的产物一般通过_______________来鉴定； ③在凝胶中DNA分子的迁移速率与___________、______________和_____等有关（迁移速率与之呈负相关） ④凝胶中的DNA分子通过_____，可以在波长为_______的______下被检测出来。 琼脂糖凝胶电泳 凝胶的浓度 染色 300nm 紫外灯 DNA分子的大小 构象 基因工程的基本操作程序 2.材料用具 ①PCR仪（自动控温，实现DNA的扩增） ②微量离心管（实际上是进行PCR反应的场所） ③微量移液器（用于向微量离心管转移PCR配方中的液体） ④一次性吸液枪头（微量移液器吸取一种试剂更换一次枪头） ⑤电泳装置（包括电泳仪、电泳槽等） 基因工程的基本操作程序 10倍浓缩的扩增缓冲液（含Mg2+） 5μL 20mmol/L的4种脱氧核苷酸的等量混合液（实为dNTP） 1μL 20μmol/L的引物Ⅰ 2.5μL 20μmol/L的引物Ⅱ 2.5μL H2O 28～33μL 1-5U/μL的Taq DNA聚合酶（即耐高温的DNA聚合酶） 1～2U 模板DNA （用量为1pg-1μg） 5～10μL 总体积 50μL ⑧PCR反应体系的配方 ⑥4种脱氧核苷酸等量混合液、2种引物、TaqDNA聚合酶、模板DNA、扩增缓冲液、无菌水。 ⑦电泳缓冲液、凝胶载样缓冲液、琼脂糖和核酸染料等 基因工程的基本操作程序 3.方法步骤 基因工程的基本操作程序 ①移液： 用微量移液器按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书，在微量离心管中依次加入各组分 （1）DNA片段的扩增 ②离心： 待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子，将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在离心管的底部（提高反应速率） ③反应： 参照上表的参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。 循环程序 变性 复性 延伸 预变性 94℃，5min 30次 94℃，30s 55℃，30s 72℃，1min 最后1次 94℃，1min 55℃，30s 72℃，1min 使DNA充分变性，以利于引物更好地和模板结合。 预变性： 3.方法步骤 基因工程的基本操作程序 （2）DNA片段的电泳鉴定 ①配制琼脂糖溶液 ②制备凝胶 根据待分离DNA片段的大小，用 配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比0.8%-1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的 混匀。 核酸染料 电泳缓冲液 将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成 。 加样孔 ③填充电泳槽 电泳槽 待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入 内。将 加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜。 电泳缓冲液 3.方法步骤 基因工程的基本操作程序 ④加样 ⑤电泳、观察 （2）DNA片段的电泳鉴定 将扩增得到的PCR产物与 混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的 内。留一个加样孔加入指示分子大小的 。 凝胶载样缓冲液（内含指示剂） 加样孔 标准参照物（Marker） 接通电源，根据电泳槽 来设定电压，一般为1～5V/cm。待 前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳。取出凝胶置于 观察和照相。 阳极至阴极之间的距离 紫外灯下 指示剂 注意: ①为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。 ②该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在-20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。 ③在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。 ⑤在进行操作时，一定要戴好一次性手套。 ⑥PCR扩增不能随意加大试剂用量。 基因工程的基本操作程序 3.方法步骤 可以在紫外灯下直接观察到DNA条带（根据条带的分布及粗细程度来评价扩增的结果） 一条条带 1.你是否成功扩增出DNA片段？判断的依据是什么？ 2.本实验进行电泳鉴定的结果应该是几条条带？ 3.如图所示，该片段大小约为 。 750bp 0次 12次 12次 30次 30次 Marker 基因工程的基本操作程序 4.结果分析与评价 漏加了PCR反应成分，耐高温的DNA聚合酶失活，PCR程序设置不合理等 ①引物设计不合理，它们与非目的序列有同源性； ②复性温度过低； ③模板DNA污染。 4.如果未出现条带，可能原因是什么？ 5.如果出现不止一条条带，可能原因是什么？ 基因工程的基本操作程序 4.结果分析与评价 小结：基因工程 一、概念检测 练习与应用 1. 研究人员将一种海鱼的抗冻蛋白基因afp加整合到土壤农杆菌的Ti质粒上，然后用它侵染番茄细胞，获得了抗冻的番茄品种。判断下列相关表述是否正确。 （1）afp基因是培育抗冻番茄用到的目的基因 （ ） （2） 构建含有afp基因的Ti质粒需要限制酶、DNA连接酶和核酸酶（ ） （3） 只要检测出番茄细胞中含有afp基因，就代表抗冻番茄培育成功。 （ ） × × √ 15 2. 利用PCR既可以快速扩增特定基因，也可以检测基因的表达。下列有关PCR的叙述错误的是 （ ） A. PCR用的DNA聚合酶是一种耐高温酶 B. 变性过程中双链DNA的解开不需要解旋酶 C. 复性过程中引物与模板链的结合遵循碱基互补配对原则 D. 延伸过程中需要DNA聚合酶、ATP和 4种核糖核苷酸 一、概念检测 练习与应用 D 16 二、拓展应用 1. 研究人员在研究转基因烟草中外源卡那霉素抗性基因的遗传稳定性时，发现44株转基因烟草中有4株该基因的遗传不符合孟德尔遗传规律，在它们的自交后代中出现了较多的没有卡那霉素抗性的植株。请查找相关资料，尝试对这个问题作出解释。 外源基因插入基因组中可能为单位点插入，或者同一染色体多位点插入，或者不同染色体多位点插入。大多数情况下，插入的位点难以做到定点插入；插入的拷贝数也是随机的。因此，外源基因在转基因植物中的遗传是很复杂的。例如，科研人员在对转GUS基因(β-葡糖醛酸糖苷酶基因)的烟草进行基因表达分析时，发现部分转基因植株的染色体DNA中整合了多个拷贝的基因，从而导致GUS基因失活。除此之外，外源基因丢失、基因重排等也都可能影响外源基因的稳定性。 17 1. （1）应选择用相同的限制酶或切割能产生相同末端的限制酶切割质粒和含有目的基因的DNA片段，并且注意限制酶的切割位点不能位于目的基因的内部，以防破坏目的基因，限制酶也不能破坏质粒的启动子、终止子、标记基因、复制原点等结构。 (2)加入DNA连接酶。 (3 )该质粒便于进行双重筛选。标记基因AmpR基因可用于检测质粒是否导入了大肠杆菌，一般只有导入了质粒的大肠杆菌才能在添加了青霉素的培养基上生长。而由于LacZ基因的效应，这些生长的菌落可能出现两种颜色：含有空质粒（没有连接目的基因的质粒）的大肠杆菌菌落呈蓝色；含有重组质粒的大肠杆菌菌落呈白色。 (4)含有重组质粒的大肠杆菌菌落呈白色。因为目的基因的插入破坏了LacZ基因的结构，使其不能正常表达，形成β-半乳糖苷酶，底物X-gal也就不会被分解。 复习与提高答案 2.(1)逆转录病毒是载体，能将外源基因Oct3/4、Sox2、c-Myc和KIf4送入小鼠成纤维细胞。 (2)可以设置对照组。将转入外源基因和没有转人外源基因的细胞分别培养在相同的培养基中，并确保其他培养条件相同。如果只有转入外源基因的细胞转化成了iPS细胞，就可以证明iPS细胞的产生不是由于培养基的作用。(3)可以依次去掉1个基因，将其他3个基因转入小鼠成纤维细胞中，然后通过与转入4个基因的小鼠成纤维细胞的诱导情况进行比较，来推测缺失的那个基因对诱导iPS细胞的影响，进而判断每个基因作用的相对大小。（其他合理答案均可） (4)不会引起免疫排斥反应，因为在诱导转化的过程中细胞的遗传物质没有发生变化，理论上产生的还是“自体”细胞。iPS细胞拥有分化为各种细胞的潜能，因此存在分化成肿瘤细胞的风险。 复习与提高答案 3.（1）从亲缘关系的远近来看，固氮相关基因可能更容易在水稻根系微生物中稳定存在和表达，进而使其具有固氮的能力。（其他合理答案均可）(2)此题不要求有唯一的答案，学生可从便捷性、安全性、经济性等角度进行分析，言之成理即可。例如，从便捷性角度认为能固氮的水稻新品种更值得推广；或从转基因安全性角度认为能固氮的水稻根系微生物更值得推广等。 复习与提高答案 Lavf58.51.100 $