3.2基因工程的基本操作程序第二课时课件-2025-2026学年高二下学期生物人教版选择性必修3

该高中生物学课件系统梳理了基因工程的基本操作程序，从目的基因获取、载体构建到导入受体细胞及检测鉴定，层层递进，逻辑清晰。通过设问引导（如“能否直接导入目的基因”）、对比分析（如启动子与终止子功能差异）和情境任务（如设计抗虫棉载体），构建了由浅入深的学习支架，有效衔接前后知识点。 其亮点在于深度融合生命观念、科学思维与探究实践三大核心素养。例如，在PCR原理讲解中融入物质与能量观，用引物设计问题培养科学思维，借助电泳实验强化探究实践能力。特别在农杆菌转化法环节，以真实科研流程为蓝本，引导学生模拟构建重组DNA并分析连接方式，既体现学科特色又提升动手能力。学生能建立结构与功能统一的生物学认知，教师可借此优化教学设计，实现知识迁移与素养落地。

课前检测 基因工程基本操作程序主要包括哪几个步骤？ 筛选目的基因的方法？认识基因结构和功能的技术方法？ 获取目的基因的方法？ PCR的全称，概念， 原理，条件，过程？ 什么是引物？设计的依据、要求？引物的作用？ 为什么需要引物？为什么需要2种引物？ DNA聚合酶的作用？ 在PCR扩增过程中消耗62个引物，说明进行了几轮？ 思考：能不能直接将目的基因导入受体细胞，为什么？如果不能，如何避免该结果的发生呢？ 游离的DNA片段进入受体细胞，一般会直接被分解，且游离的DNA片段不能稳定遗传。 构建基因表达载体（核心工作） 导 基因表达载体的构建 构建基因表达载体的目的？ 基因表达载体和第一节学到的载体一样吗？（议） 基因表达载体的组成元件，各部分的作用？ 构建基因表达载体时Bt基因插入的位置应该在哪里？为什么？（议） 如何构建抗虫棉的基因表达载体？请文字和箭头来表示。 使用一种限制酶进行切割含Bt基因的DNA片段和质粒，再用DNA连接酶连接，可能有几种连接情况？（议） 构建基因表达载体时往往用两种限制酶分别切割目的基因的两端以及载体，请分析原因。（议） 思 ① ; ② 。 二.基因表达载体的构建 1.目的 使目的基因在受体细胞中稳定存在,并且可以遗传给下一代 使目的基因能够表达和发挥作用 ——核心步骤 2.组成 思考：要使Bt基因在受体细胞中稳定存在，并能够表达 和发挥作用，载体还需要哪些结构？ 载体≠表达载体： 相同点：二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。 区别：表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构 思考：各个元件有什么作用？ 载体=表达载体？ 目的基因：能控制表达所需要的特殊性状（必须插到启动子和终止子之间） 启动子： 位置 功能： 本质： 复制原点： DNA复制的起始位点，使目的基因复制和传递，若破坏则载体不能复制 终止子： 位置： 功能： 本质： 标记基因：用于鉴定受体细胞中是否含有目的基因。 限制酶切割位点 目的基因要插入启动子和终止子之间 因为基因表达载体需要启动子和终止子的调控，所以目的基因应插入启动子和终止子之间的部位。 二.基因表达载体的构建 ：基因的上游 RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA。 特殊序列结构的DNA片段 诱导型启动子：当诱导物存在时，可以激活或抑制目的基因的表达 基因的下游 终止转录 特殊序列结构的DNA片段 四环素抗性基因、荧光蛋白基因等 二.基因表达载体的构建 项目 启动子 终止子 起始密码子 终止密码子 本质 ______ _____ _______ _______ 位置 目的基因上游 目的基因下游 mRNA首端 mRNA尾端 功能 ________________________________________________ ____________________________ _____________________ ________________________ DNA DNA mRNA mRNA RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA 使转录在所需要的地方停下来 翻译的起始信号(编码氨基酸) 翻译的结束信号(不编码氨基酸) 启动子、终止子、起始密码子、终止密码子对比 载体 （质粒） DNA分子 （含目的基因） 限制酶处理 切开载体 出现切口 获得目的基因 DNA连接酶 重组DNA分子（重组质粒） 同一种 或能产生相同 末端的限制酶处理 1个切口， 2个黏性末端 2个切口， 4个黏性末端 二.基因表达载体的构建 3.过程 产生相同的黏性末端或平末端，以便通过DNA连接酶连接； 思考：用同一种限制酶切割的目的是？ 切割质粒和目的基因分别产生几个黏性末端？ 思考：使用一种DNA限制酶进行切割，是否只会得到目的基因与载体结合的这一种重组DNA？ 载体 目的基因 自连 两两连接 目的基因自连 质粒自连 目的基因与目的基因连接 质粒与质粒连接 1 1’ 2 2’ 二.基因表达载体的构建 同一种限制酶切割获得的目的基因和载体混合后加DNA连接酶会出现的连接方式有： 基因的反向连接导致目的基因不能正常表达 目的基因与质粒连接 正向连接 反向连接 1 2 2’ 1’ 2 1’ 1 反向链接 二.基因表达载体的构建 思考：如何防止目的基因和载体的自身环化以及目的基因的反向连接？ 单酶切缺点: 质粒重新环化 目的基因自身环化 质粒与目的基因反向连接 基因的反向连接导致目的基因不能正常表达 选择两种产生不同黏性末端的限制酶同时对含目的基因的DNA分子和质粒切割（使得目的基因的一端与载体一端的黏性末端相同，而目的基因的另一端与载体另一端的黏性末端相同） -G -CTTAA -A -TCTAG -G -CTTAA -A -TCTAG 为了便于扩增的DNA片段与表达载体连接，需在引物的5'端加上限制酶的酶切位点，且常在两种引物设计上加入不同的酶切位点，主要目的是保证目的基因与载体的正向连接。 二.基因表达载体的构建 双酶切 图解限制酶的选择原则 (1)不破坏目的基因原则：如图甲中可选择PstⅠ，而不选择SmaⅠ。 (2)保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则：所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择SmaⅠ。 (3)确保出现相同黏性末端原则：通常选择与切割目的基因相同的限制酶切割质粒，如图中PstⅠ； 为避免目的基因和质粒自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图也可选择PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶。 二.基因表达载体的构建 将生物的所有DNA直接导入受体细胞不是更简便吗？如果这么做，效果会怎样？ 这种方法针对性差，完全靠运气，也无法确定哪些基因导入了受体细胞 由于不同转基因产品所需要的目的基因不同，受体细胞又有植物、动物、微生物之分，因此基因表达载体的构建方法不是千篇一律的,将目的基因导入受体细胞的方法也不是完全相同的。 将目的基因与载体结合，构建好基因表达载体后，下面该进行什么操作？ 基因工程第三步：将目的基因导入受体细胞 思考 是将目的基因片段导入受体细胞？ 将目的基因导入受体细胞前，必须进行基因表达载体的构建，也就是说导入受体细胞的必须是重组DNA分子，而不是直接导入目的基因 将目的基因导入受体细胞 转化的概念，实质 将目的基因导入植物细胞，动物细胞，原核生物的方法，原理 将目的基因导入动物细胞时，选用的受体细胞是什么？最终获得什么？需要利用哪些技术？ 农杆菌转化法：原理，过程（用文字和箭头构建模式图），两次拼接和两次导入分别是指什么？可以利用此方法将目的基因导入单子叶植物细胞内？ 思 常用方法 将目的基因导入 植物细胞 将目的基因导入 动物细胞 将目的基因导入 微生物细胞 农杆菌转化法 花粉管通道法 ——显微注射法 ——Ca2+处理法 我国科学家独创 三.将目的基因导入受体细胞 03 1、花粉管通道法（我国科学家独创） ②在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。 ①用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中 目的基因 目的基因 适用生物：开花植物 （一）目的基因导入植物细胞 三.将目的基因导入受体细胞 2、农杆菌转化法 （一）目的基因导入植物细胞 目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。 三.将目的基因导入受体细胞 （1）转化： 实质是基因重组。 ①农杆菌能在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有侵染能力。 （2）农杆菌的特点： ②农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T-DNA转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。 拓展：农杆菌感染植物的受伤部位（受伤处的细胞会分泌大量酚类化合物，从而使农杆菌移向这些细胞） 2、农杆菌转化法 （一）目的基因导入植物细胞 三.将目的基因导入受体细胞 (3)目的基因插入位置： 转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。 （可转移的DNA） （4）具体的转化方法： ①将新鲜的从叶片上取下的圆形小片与农杆菌共培养，然后筛选转化细胞，并再生成植株； ②可以将花序直接浸没在含有农杆菌的溶液一段时间，然后培植植株并获得种子，再进行筛选、鉴定等， 2、农杆菌转化法 （一）目的基因导入植物细胞 三.将目的基因导入受体细胞 （5）过程： Ti质粒 含目的基因的DNA分子 含目的基因的重组Ti质粒 农杆菌 植物细胞 含目的基因的植物细胞 表现出新性状的植株 构建基因表达载体 转入 导入 目的基因插入染色体DNA中 植物组织培养 方法：Ca2+转化法 方法：农杆菌转化法 （受精卵或体细胞都可以） 思考：受体细胞可以是受精卵或体细胞的原因？ 植物细胞一般易表现全能性。 经过____次拼接、____次导入 ①第一次拼接：__________________________ ②第二次拼接：__________________________ _______________________________ ③第一次导入：___________________________ ④第二次导入：___________________________ 将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上 农杆菌将插入目的基因的T-DNA拼接到受体细胞染色体的DNA上（非人工操作） 两 两 将含目的基因的Ti质粒重新导入农杆菌 农杆菌含目的基因的T-DNA导入受体细胞（非人工操作） 03 （二）目的基因导入动物细胞 1、常用方法： 2、受体细胞: 显微注射法 受精卵 ①体积大，易操作。②易表现出全能性。 3、 过程： 构建基因表达载体并提纯 利用显微注射将基因表达载体注入动物的受精卵中 早期胚胎培养 胚胎移植 获得具有新性状的动物 三.将目的基因导入受体细胞 还可以选择胚胎干细胞，因为胚胎干细胞也可以发育成动物个体。 1、常用方法： Ca2+处理 目的：可使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。 2、过程： （三）目的基因导入微生物细胞 三.将目的基因导入受体细胞 Ca2+处理细胞 感受态细胞 表达载体与感受态细胞混合 感受态细胞吸收DNA分子 原核细胞（常选择大肠杆菌） 3、受体细胞： 优点：繁殖快，多为单细胞，遗传物质相对较少，易于培养。 大肠杆菌和酵母菌在基因工程中都可以作为受体细胞，但又有所不同。大肠杆菌为原核细胞，而酵母菌为真核细胞（具有多种细胞器）,所以酵母菌在用于生产需要加工和分泌的蛋白质时比大肠杆菌有优势。 实例：利用转基因大肠杆菌生产药物 注意：原核生物作为受体细胞产生的真核生物的蛋白质通常没有生物活性（无内质网和高尔基体加工），需要在体外进行再加工。 三、将目的基因导入受体细胞 思考 基因工程第四步：目的基因的检测与鉴定 按前面三个步骤进行了操作， 1.是否可以确定目的基因进入了受体细胞并能维持稳定？ 2.是否可以确定目的基因一定能够进行表达？ 3.是否可以确定得到了新的性状？ 不一定！ 检查目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性； 2.检测内容及方法: 四.目的基因的检查与鉴定 1.目的: 类型 检测内容 方法 分子水平的检测 个体生物学水平的鉴定 受体细胞的染色体DNA上是否插入了目的基因 目的基因是否转录出了mRNA PCR等技术 目的基因是否翻译成蛋白质 抗原-抗体杂交技术 个体是否具有相应性状 抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等 四.目的基因的检查与鉴定 （一）分子水平的检测 1、检测目的基因是否导入 ①通过PCR技术检测 转基因生物细胞DNA 用与目的基因相关的 引物进行PCR扩增 对扩增产物进行检测 ②DNA分子杂交技术检测 ⑴制作出相应的基因探针，并用PCR扩增； ⑵提取受体细胞全部DNA并用PCR扩增，与基因探针置于同一培养液； ⑶高温变性处理，使之全部变为单链，观察是否出现杂交DNA片段。 一段带有检测标记（荧光或同位素标记），顺序已知的，与目的基因能互补的核酸序列。 15N 15N 变性 变性 探针（PCR扩增） 转基因生物的DNA 杂交DNA分子 出现杂交带 原理？ 。 碱基互补配对 四.目的基因的检查与鉴定 2、检测目的基因是否转录 提取转基因生物mRNA 逆转录 产生DNA 对扩增产物进行检测 用与目的基因相关的 引物进行PCR扩增 ①通过PCR等技术检测 （一）分子水平的检测 ②分子杂交技术检测 变性 探针 15N 15N 转基因生物 的mRNA 原理？ 。 碱基互补配对 3、检测目的基因是否翻译 从转基因生物中 提取蛋白质 用相应抗体进行 抗原-抗体杂交检测 —通过抗原-抗体杂交检测 如果出现杂交带，说明目的基因已经翻译。 检测目的基因是否表现出相应的性状 四.目的基因的检查与鉴定 （二）个体水平的检测 个体生物学水平的鉴定具体方法举例 转基因生物 鉴定方法 成功标志 抗虫植物 抗病毒（菌）植物 抗盐植物 抗除草剂植物 获取目的基因产物的转基因生物 饲喂害虫（抗虫接种实验） 害虫死亡 病毒（菌）接种实验 未染病 盐水浇灌 正常生长 喷洒除草剂 正常生长 提取细胞产物与天然产品进行功能活性比较 功能、活性正常 探究•实践：DNA片段的扩增及电泳鉴定 1.实验原理 （1）利用PCR在体外进行DNA片段扩增的原理 ①PCR利用了DNA的_________原理，通过_________来控制DNA双链的解聚与结合，PCR仪实质上就是一台能够______________的仪器，一次PCR一般要经历___次循环； 热变性 调节温度 自动调控温度 30 ②PCR扩增DNA片段还利用了_________________的原理； DNA半保留复制 基因工程的基本操作程序 （2）DNA片段电泳鉴定的原理 ①DNA分子具有_____________，在一定的___下，这些基团可以带上正电荷或负电荷，在_____的作用下，这些________会向着__________________的电极移动，这个过程就是_____； 可解离的基团 pH 电场 带电分子 电泳 与它所带电荷相反 ②PCR的产物一般通过_______________来鉴定； ③在凝胶中DNA分子的迁移速率与___________、______________和_____等有关（迁移速率与之呈负相关） ④凝胶中的DNA分子通过_____，可以在波长为_______的______下被检测出来。 琼脂糖凝胶电泳 凝胶的浓度 染色 300nm 紫外灯 DNA分子的大小 构象 基因工程的基本操作程序 2.材料用具 ①PCR仪（自动控温，实现DNA的扩增） ②微量离心管（实际上是进行PCR反应的场所） ③微量移液器（用于向微量离心管转移PCR配方中的液体） ④一次性吸液枪头（微量移液器吸取一种试剂更换一次枪头） ⑤电泳装置（包括电泳仪、电泳槽等） 基因工程的基本操作程序 10倍浓缩的扩增缓冲液（含Mg2+） 5μL 20mmol/L的4种脱氧核苷酸的等量混合液（实为dNTP） 1μL 20μmol/L的引物Ⅰ 2.5μL 20μmol/L的引物Ⅱ 2.5μL H2O 28～33μL 1-5U/μL的Taq DNA聚合酶（即耐高温的DNA聚合酶） 1～2U 模板DNA （用量为1pg-1μg） 5～10μL 总体积 50μL ⑧PCR反应体系的配方 ⑥4种脱氧核苷酸等量混合液、2种引物、TaqDNA聚合酶、模板DNA、扩增缓冲液、无菌水。 ⑦电泳缓冲液、凝胶载样缓冲液、琼脂糖和核酸染料等 基因工程的基本操作程序 3.方法步骤 基因工程的基本操作程序 ①移液： 用微量移液器按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书，在微量离心管中依次加入各组分 （1）DNA片段的扩增 ②离心： 待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子，将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在离心管的底部（提高反应速率） ③反应： 参照上表的参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。 循环程序 变性 复性 延伸 预变性 94℃，5min 30次 94℃，30s 55℃，30s 72℃，1min 最后1次 94℃，1min 55℃，30s 72℃，1min 使DNA充分变性，以利于引物更好地和模板结合。 预变性： Multimedia Cloud Transcode (cloud.baidu.com) $