2026届高三生物一轮复习课件：基因工程

1997年，我国政府首次批准商业化种植转基因抗虫棉。到2015年，我国已育成转基因抗虫棉新品种100多个，减少农药用量40万吨，增收节支社会经济效益450亿元。苏云金杆菌伴胞晶体蛋白（Bt 抗虫蛋白），破坏鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫。你知道转基因抗虫棉抗虫的机制是什么吗？培育转基因抗虫棉一般需要哪些步骤？ 非转基因抗虫棉 课前提问 棉花细胞 表达 Bt基因 导入 与载体拼接 提取Bt基因 Bt基因 重组DNA分子 苏云金杆菌 抗虫棉 重组DNA技术的基本工具 【复习目标】1分钟 1.阐明DNA重组技术的实现需要利用限制性内切核酸酶、DNA连接酶和载体三种基本工具 2.按照实验操作步骤，进行DNA的粗提取与鉴定实验。 【考点解读】1分钟 基因工程是近年的高频考点，主要集中在限制酶的选择、基因表达载体的构建及各组分的作用、利用PCR技术获取和扩增目标DNA片段，并用电泳鉴定PCR的产物等。几乎都是情境信息题，考查学生获取和加工信息、分析和推理的能力：涉及农业、医药、卫生等，与其它技术工程常综合考查。 如2024年广东卷; 2024年湖南卷、2024年安徽； （2024·广东·高考真题）驹形杆菌可合成细菌纤维素（BC）并将其分泌到胞外组装成膜。作为一种性能优异的生物材料，BC膜应用广泛。研究者设计了酪氨酸酶（可催化酪氨酸形成黑色素）的光控表达载体，将其转入驹形杆菌后构建出一株能合成BC膜并可实现光控染色的工程菌株，为新型纺织原料的绿色制造及印染工艺升级提供了新思路（图一）。   (2)研究者利用T7 噬菌体来源的RNA聚合酶（T7RNAP）及蓝光光敏蛋白标签，构建了一种可被蓝光调控的基因表达载体（光控原理见图二a，载体的部分结构见图二b）。构建载体时，选用了通用型启动子 PBAD（被工程菌 RNA 聚合酶识别）和特异型启动子PT7（仅被T7RNAP识别）。为实现蓝光控制染色，启动子①②及③依次为        ，理由是     。 (3)光控表达载体携带大观霉素（抗生素）抗性基因。长时间培养时在培养液中加入大观霉素，其作用为                        （答两点）。 (4)根据预设的图案用蓝光照射已长出的BC菌膜并继续培养一段时间，随后将其转至染色池处理，发现只有经蓝光照射的区域被染成黑色，其原因是     。 (5)有企业希望生产其他颜色图案的BC膜。按照上述菌株的构建模式提出一个简单思路      。   1. 基因工程的概念(P67) ① 别名: 。 ② 原理: 。 ③ 操作对象: 。 ④ 操作水平: 。 ⑤ 操作环境: 生物 （体内/体外）进行 ⑥ 结果： 。 ⑦ 优点： (1) 。 (2) 等。 基因重组（广义） DNA分子水平 重组DNA技术 基因 体外 创造出符合人们需要的生物类型和生物产品 定向改造生物性状（目的性强） 克服远缘杂交不亲和的障碍 【知识梳理】一、基因工程的概念及基本工具20min 2. 基因工程的理论基础 ①不同生物的基因能够拼接的理论基础？ ② 基因能够在不同生物细胞内表达的理论基础？ （1）都遵循中心法则； （2）共用一套遗传密码。 （1）DNA是绝大多数生物的遗传物质； （2）不同生物的DNA的基本单位和结构相同； （3）均遵循碱基互补配对的原则。 【知识梳理】一、基因工程的概念及基本工具20min 5 3．重组DNA技术的基本工具 (1)限制性内切核酸酶(简称：限制酶)——分子手术刀 ①本质：蛋白质。 ②来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。 ③作用：识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。 ④结果：产生黏性末端或平末端。 选择性必修3 P71“旁栏思考”： ① 原核生物中存在限制酶的意义是什么？ 原核生物中限制酶的作用是切割外源DNA以保证自身安全，防止外来病原物的危害。 ② 限制酶来源于原核生物，为什么不能切割自己的DNA分子？ 限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物DNA分子中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰（甲基化），使限制酶不能将其切开。 大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成 XbaⅠ SpeⅠ XhoⅠ 写出下列限制酶切割形成的末端序列 Sau3AⅠ XbaⅠ: 5’-T3’ 3’-AGATC5’ or 5’CTAGA-3’ 3’T-5’ SpeⅠ: 5’-A3’ 3’-TGATC5’ or 5’CTAGT-3’ 3’A-5’ XhoⅠ 5’-C3’ 3’-GAGCT5’ or 5’TCGAG-3’ 3’C-5’ Sau3AⅠ: 5’GATC-3’or 5’GATC-3 5’- 3’- -3’ -5’ 【思考】同种限制酶切割产生的黏性末端是否相同？ 不同限制酶切割产生的黏性末端是否一定不同？ 相同 可能会相同 (2)DNA连接酶——“分子缝合针” ① 作用：将限制酶切割下来的DNA片段拼接成新DNA分子。 ② 类型 常用类型 E·coli DNA连接酶 T4 DNA连接酶 来源 ___________ T4噬菌体 功能 只“缝合”___________ “缝合”_______________ 结果 恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的_______________ 大肠杆菌 黏性末端 磷酸二酯键 黏性末端和平末端 2．重组DNA技术的基本工具 A G T C A T T C G A T A 名称 作用部位 作用结果 限制酶 DNA连接酶 DNA聚合酶 DNA(水解)酶 解旋酶 磷酸二酯键 碱基对之间的氢键 将DNA切成两个片段 磷酸二酯键 将两个DNA片段连接为一个DNA分子 磷酸二酯键 将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端 磷酸二酯键 将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸 将双链DNA分子局部解旋为单链 载体 质粒（常用载体），噬菌体、动植物病毒等 ①能在受体细胞中复制并稳定保存 ②具有1个或多个限制酶位切点 ③具有特殊的标记基因，便于重组DNA分子的筛选 ④对受体细胞无害 携带外源DNA片断进入受体细胞，并在受体细胞内对目的基因进行复制和表达 种类 特点 作用 质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。天然质粒需进行人工改造，才能用于基因工程。 2．重组DNA技术的基本工具 (3)载体——分子运输车 1.几种限制酶的识别序列及其切割位点(箭头表示相关酶的切割位点)如表所示。限制酶切后产生的几种末端如图所示。根据题表和题图判断下列说法正确的是( C ) A．BamHⅠ切割的是氢键，AluⅠ切割的是磷酸二酯键B．Sau3AⅠ和BamHⅠ切割产生的片段能够相连，但连接后的片段两者都不能再切割C．②④⑤对应的识别序列均能被Sau3AⅠ识别并切割D．T4 DNA连接酶既能连接①③，也能连接②⑤，但后者连接效率低 【考题讲练一】4分钟 【知识梳理二】 DNA的粗提取 7min 1．DNA的粗提取与鉴定 (1)基本原理 ①提取原理：DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面存在差异，可以利用这些差异，选用适当的物理或化学方法对它们进行提取。 例如，DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精； DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，它能溶于2 mol·L－1的NaCl溶液。 ②鉴定原理：在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色。 (2)方法步骤 研磨 上清液 95% 一个方向 2mol/L 二苯胺 5min 蓝色 1.(2023年广东卷第11题)“DNA粗提取与鉴定”实验的基本过程是:裂解→分离→沉淀→鉴定.下列叙述错误的是(　D　) A．裂解:使细胞破裂释放出DNA等物质 B．分离:可去除混合物中的多糖、蛋白质等 C．沉淀:可反复多次以提高DNA的纯度 D．鉴定:加入二苯胺试剂后即呈现蓝色 【考题讲练二】2分钟 【课堂小结】1min 一、基因工程的概念及基本工具 1、概念： 2、理论基础 3、基本工具 二、 DNA的粗提取与鉴定 （1）限制酶 （2）DNA连接酶 （3）基因进入受体细胞的载体 2.（2024·安徽·高考真题）下列关于“DNA 粗提取与鉴定”实验的叙述，错误的是（ D   ） A．实验中如果将研磨液更换为蒸馏水，DNA提取的效率会降低 B．利用DNA和蛋白质在酒精中的溶解度差异，可初步分离DNA C．DNA在不同浓度NaC1溶液中溶解度不同，该原理可用于纯化DNA粗提物 D．将溶解的DNA粗提物与二苯胺试剂反应，可检测溶液中是否含有蛋白质杂质 1.（2024·湖南）某同学将质粒DNA进行限制酶酶切时，发现DNA完全没有被酶切，分析可能的原因并提出解决方法。下列叙述错误的是（　B　） A．限制酶失活，更换新的限制酶 B．酶切条件不合适，调整反应条件如温度和酶的用量等 C．质粒DNA突变导致酶识别位点缺失，更换正常质粒DNA D．酶切位点被甲基化修饰，换用对DNA甲基化不敏感的限制酶 【当堂训练】10min 3.节选（2024·江西）聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）是一种聚酯塑料，会造成环境污染。磷脂酶可催化PET降解。为获得高产磷脂酶的微生物，研究人员试验了2种方法。回答下列问题： (2)方法2采用      技术定向改造现有微生物，以获得高产磷脂酶的微生物。除了编码磷脂酶的基因外，该技术还需要      、      、      等“分子工具”。 (2)     基因工程（或转基因）     限制酶     DNA连接酶     载体（或质粒） 4.[2023湖北卷-T22] 构建重组质粒需要使用DNA连接酶。下列属于DNA连接酶底物的是_________。 ④ 一、基因工程的概念及基本工具 1、概念： 2、理论基础 3、基本工具 二、 DNA的粗提取与鉴定 （1）限制酶 （2）DNA连接酶 （3）基因进入受体细胞的载体 【板书设计】 【作业布置】完成金版知识梳理 【课前提问】2min 1.载体的特点？ 第3章 第2节 基因工程的基本操作程序 选择性必修3　生物技术与工程 第1课时 课件类型：A 【复习目标】1分钟 【考点解读】1分钟 1.阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定等步骤。 2.利用聚合酶链式反应(PCR)扩增DNA片段并完成电泳鉴定。 基因工程是近年的高频考点，主要集中在限制酶的选择、基因表达载体的构建及各组分的作用、利用PCR技术获取和扩增目标DNA片段，并用电泳鉴定PCR的产物等。几乎都是情境信息题，考查学生获取和加工信息、分析和推理的能力：涉及农业、医药、卫生等，与其它技术工程常综合考查。 如2024年广东卷; 2024年吉林卷、2023年天津；2021年广东卷T22、全国乙卷T38、山东卷T25、天津卷T16等。 1. 目的基因的筛选与获取 基因文库 mRNA反转录 DNA合成仪 【知识梳理一】 基因工程的操作25min 21 ②条件 模板：亲代DNA分子两条单链 原料：4种游离的脱氧核苷酸（三磷酸脱氧腺苷dNTP） 酶：Taq酶(耐高温的DNA聚合酶) 2种引物：一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸 Mg2+ ：激活DNA聚合酶 ①原理： DNA的双链复制半保留复制、碱基互补配对原则 (2)PCR技术 —— 聚合酶链式反应 引物(一对，短单链核酸)高频考点归纳： 1.作用：使耐高温DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸 2.PCR扩增前提：需知目的基因两端的碱基序列来设计引物 3.延伸时需要加入两种引物，原因是 DNA是反向平行的双链，DNA聚合酶只能从引物3′端延伸DNA链， 用两种引物才能确保DNA两条链同时被扩增 4.引物能与模板链的3’端进行碱基互补配对 5.引物5’端可以修饰，如：为目的基因添加酶切位点限制酶切位点,保证目的基因能与载体相连接 6.引物的基本要求： 引物自身不能环化 两种引物之间不能互补配对 引物长度不宜过短，防止引物随机结合 3’ 5’ 3’ 5’ 引物1 5’ 3’ 引物2 5’ 3’ (3)利用PCR获取和扩增目的基因 ③扩增过程： 过程 说明 图解 变性 温度超过90 ℃，双链DNA解聚为单链 复性 温度下降到50 ℃左右， 两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。 延伸 温度上升到72 ℃左右，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。 PCR扩增过程中的循环图示与规律 思考题：至少经过 轮PCR后，才能扩增出目的基因； 扩增n轮产物中，含有引物的DNA占 个，只含一种引物的DNA 个，含有两种引物的DNA 个。 n轮后，共消耗引物 个；第n轮，消耗引物 个。 2n-2 2n 2 3 2n+1-2 2n 1.反转录PCR又称逆转录PCR（RT-PCR），是以mRNA为模板进行的特殊PCR，过程如图。下列相关叙述错误的是（ C   ） A．图示过程需要控制温度，否则可能得不到产物 B．RT-PCR技术中，不需已知mRNA的全部序列 C．过程③中子链沿着模板链的5'→3'方向延伸 D．RT-PCR技术可应用于是否被RNA病毒感染的检测 2.（2023·天津节选）基因工程：制备新型酵母菌 (2)同源切割是一种代替限制酶、DNA连接酶将目的基因导入基因表达载体的方法。当目的基因两侧的小段序列与基因表达载体上某序列相同时，就可以发生同源切割，将目的基因直接插入。研究人员，运用同源切割的方式，在目的基因两端加上一组同源序列A．B，已知酵母菌体内DNA有许多A-B序列位点可以同源切割插入。构建完成的目的基因结构如图，则应选择图中的引物 对目的基因进行PCR。 P1和P6 【考题讲练一】2分钟 含有孔隙 (4)鉴定PCR的产物 方法：琼脂糖凝胶电泳来鉴定。 电泳原理：DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。 在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来。 4．某实验小组同学利用PCR技术扩增β-淀粉酶基因后，进行琼脂糖凝胶电泳检测时未出现扩增条带，其原因一般不包括（ C ） A．模板DNA溶液中含有酶抑制剂 B．TaqDNA聚合酶失活 C．引物特异性不强 D．变性温度过低 3.（2024·吉林）关于采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物的实验，下列叙述正确的是（  A  ） A．琼脂糖凝胶浓度的选择需考虑待分离DNA片段的大小 B．凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示DNA分子的具体位置 C．在同一电场作用下，DNA片段越长，向负极迁移速率越快 D．琼脂糖凝胶中的DNA分子可在紫光灯下被检测出来 非特异性条带（不止一条带）原因： ①引物特异性不强。 ②试剂被污染。包括水，酶，引物等。重新更换。 ③复性（退火）温度过低。④DNA聚合酶的质量不好。 【课堂小结】2min 一、基因工程的基本操作程序 1、目的基因的筛选与获取 (1)从基因文库中获取目的基因 (2)人工合成目的基因 (3)利用PCR获取和扩增目的基因 ①原理 ②条件 ③过程 ④产物鉴定方法：琼脂糖凝胶电泳 1.　在基因工程操作中，科研人员利用识别两种不同序列的限制酶(R1和R2)处理基因表达载体，进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图所示。以下相关叙述错误的是(　C　) A．电泳是指带电粒子在电场作用下发生迁移的过程，带电分子会向着电荷相反的电极移动 B．该载体最可能是环状DNA，两种限制酶在载体上各有一个酶切位点 C．限制酶R1和R2的酶切位点最短相距约200 bp D．DNA在琼脂糖凝胶中的迁移速率只与凝胶的浓度有关 【考题讲练】10min 30 2. 2020年8月16日，由我国军事医学研究院陈薇院士团队及康希诺生物联合申报的腺病毒载体新冠疫苗被授予专利权，是我国首个新冠疫苗专利。(1)新冠病毒是一种RNA病毒，通过其表面的S蛋白与宿主细胞膜表面ACE2受体结合而完成感染。研制疫苗时，通过RT­PCR(反转录—聚合酶链式反应)获取S蛋白基因所需要的酶是 。据图1分析，选择的引物是 ，其作用是 。(2)PCR的产物一般通过电泳来鉴定，结果如图2所示。1号泳道为标准(Marker)，2号泳道为阳性对照(提纯的S蛋白基因片段)，3号泳道为实验组。标准(Marker)的实质为不同已知长度的DNA片段混合物，3号泳道的杂带出现的原因一般有 (至少答出两点)。(3)腺病毒是一种DNA病毒，基因组中的E1区蛋白与腺病毒的复制有关而且对宿主细胞的毒性很强。科研中将去除E1基因构建的复制缺陷型腺病毒作为运载S蛋白基因的载体，经过改造后的腺病毒应该具备的特点有 (至少答出两点)。试说明科研中选用复制缺陷型腺病毒做载体制备新冠疫苗的原因是 .　 （1）逆转录酶、耐高温的DNA聚合酶 Ⅱ、Ⅲ 使耐高温的DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸 （2）模板受到污染；引物的特异性不强 (3)能够侵染宿主细胞；具有多个限制酶切割位点；不能复制 避免人体因重组腺病毒增殖而感染，进而提高疫苗的安全性 【板书设计】 一、基因工程的基本操作程序 1、目的基因的筛选与获取 (1)从基因文库中获取目的基因 (2)人工合成目的基因 (3)利用PCR获取和扩增目的基因 ①原理 ②条件 ③过程 ④产物鉴定方法：琼脂糖凝胶电泳 【作业布置】完成课时作业1-8题 （2024·浙江）疟疾是一种严重危害人类健康的红细胞寄生虫病，可用氯喹治疗。疟原虫pfcrt基因编码的蛋白，在第76位发生了赖氨酸到苏氨酸的改变，从而获得了对氯喹的抗性。对患者进行抗性筛查，区分氯喹敏感患者和氯喹抗性患者，以利于分类治疗。 研究人员根据pfcrt基因的序列，设计了F1、F2、R1和R2等4种备选引物，用于扩增目的片段，如图甲所示。为选出正确和有效的引物，以疟原虫基因组DNA为模板进行PCR，产物的电泳结果如图乙所示。 2．下列关于引物F1、F2、R1和R2的叙述，错误的是（ D   ） A．F1-R1引物可用于特异性地扩增目的片段 B．F1-R2引物不能用于特异性地扩增目的片段 C．F2为无效引物，没有扩增功能，无法使用 D．R2引物可用于特异性地扩增目的片段 3．为了筛查疟原虫感染者，以及区分对氯喹的敏感性。现有6份血样，处理后进行PCR。产物用限制酶ApoⅠ消化，酶解产物的电泳结果如图所示。 1~6号血样中，来自于氯喹抗性患者的是（  B  ） A．1号和6号 B．2号和4号 C．3号和5号 D．1号、2号、4号和6号 【课前提问】2min 1.什么是引物？引物的作用？ 第3章 第2节 基因工程的基本操作程序 选择性必修3　生物技术与工程 第2课时 课件类型：A 【复习目标】1分钟 【考点解读】1分钟 1.阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定等步骤。 2.利用聚合酶链式反应(PCR)扩增DNA片段并完成电泳鉴定。 基因工程是近年的高频考点，主要集中在限制酶的选择、基因表达载体的构建及各组分的作用、利用PCR技术获取和扩增目标DNA片段，并用电泳鉴定PCR的产物等。几乎都是情境信息题，考查学生获取和加工信息、分析和推理的能力：涉及农业、医药、卫生等，与其它技术工程常综合考查。 如2024年广东卷; 2024年吉林卷、2023年天津；2021年广东卷T22、全国乙卷T38、山东卷T25、天津卷T16等。 (2023•广东•T20)种子大小是作物重要的产量性状。研究者对野生型拟南芥（2n=10）进行诱变筛选到一株种子增大的突变体。通过遗传分析和测序，发现野生型DAI基因发生一个碱基G到A的替换，突变后的基因为隐性基因，据此推测突变体的表型与其有关，开展相关实验。回答下列问题： （1）拟采用农杆菌转化法将野生型DA1基因转入突变体植株，若突变体表型确由该突变造成，则转基因植株的种子大小应与　　　　　　　　　　　　植株的种子大小相近。 (2)用PCR反应扩增DAI基因，用限制性核酸内切酶对PCR产物和 进行切割，用DNA连接酶将两者连接。为确保插入的DAI基因可以正常表达，其上下游序列需具备 。 36 (3)转化后，T-DNA（其内部基因在减数分裂时不发生交换）可在基因组单一位点插入也可以同时插入多个位点。在插入片段均遵循基因分离及自由组合定律的前提下，选出单一位点插入的植株，并进一步获得目的基因稳定遗传的植株（如图），用于后续验证突变基因与表型的关系。 ①农杆菌转化T0代植株并自交，将T1代种子播种在选择培养基上，能够萌发并生长的阳性个体即表示其基因组中插入了_________。 ②T1代阳性植株自交所得的T2代种子按单株收种并播种于选择培养基，选择阳性率约_________ %的培养基中幼苗继续培养。 ③将②中选出的T2代阳性植株_______（填“自交”、“与野生型杂交”或“与突变体杂交”）所得的T3代种子按单株收种并播种于选择培养基，阳性率达到____%的培养基中的幼苗即为目标转基因植株。为便于在后续研究中检测该突变，研究者利用PCR扩增野生型和突变型基因片段，再使用限制性核酸内切酶X切割产物，通过核酸电泳即可进行突变检测，相关信息见下，在电泳图中将酶切结果对应位置的条带涂黑 。 质粒 基因的前端，RNA聚合酶识别和结合的部位；驱动基因转录出mRNA 基因的尾端，能终止mRNA的转录 作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来 ②终止子： ④复制原点 ③标记基因 ①启动子 DNA复制起始的一段序列 2．基因表达载体的构建—基因工程的核心工作 【知识梳理一】 基因工程的操作25min (1)操作目的 使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。 (2)基因表达载体组成及作用 (2)基因表达载体组成及作用 常考：启动子具有物种特异性和组织特异性 —— 例如用乳腺生物反应器生产药用蛋白的时候(教材90页) 药用蛋白基因连接在乳腺蛋白基因的启动子后面 B [2024浙江6月-T23] 结果显示目的基因在转基因牛乳汁中的脱落细胞内表达，而不在牛耳组织细胞内表达，原因是什么？______。 构建的表达载体只含有乳腺特异性启动子，只能在乳腺细胞中启动转录，而在牛耳细胞中不能表达。 2．基因表达载体的构建—基因工程的核心工作 —— 枯草芽孢杆菌分泌可降解纤维素的一种酶，这种酶由W基因编码。为在乳酸杆菌中表达W基因，在构建基因表达载体时，W基因上游启动子应选择___________（填写字母）。 A．枯草芽孢杆菌启动子        B．乳酸杆菌启动子        C．农杆菌启动子 ①用一定的限制酶切割载体，使它出现一个切口； ②用同种限制酶或能产生 相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段 ③利用DNA连接酶将目的基因片段拼接到载体的切口处，这样就形成了一个重组DNA分子。 质粒 限制酶 限制酶切割位点 限制酶 限制酶切割位点 获取目的基因 目的基因 DNA连接酶 重组DNA分子 目的基因 质粒 (3)基因表达载体的构建过程 2．基因表达载体的构建—基因工程的核心工作 问题：使用一种DNA限制酶（单酶切）进行切割，会得到几种重组DNA? 有何缺点？怎么改进？ ①质粒自我环化 DNA连接酶 连接 ②目的基因自我环化 DNA连接酶 连接 ③目的基因与质粒反向连接，造成目的基因不能正确表达 反向连接 重组DNA a d c a 启动子 方向 目的基因转录方向 限制酶切割 a b c d DNA连接酶 连接 a、b、c、d四个黏性末端相同 (3)基因表达载体的构建过程 两种产生不同黏性末端的限制酶（双酶切）切割质粒和含有目的基因的DNA 总结：限制酶的选择原则 (1)不破坏目的基因原则：如图甲中可选择PstⅠ，而不选择SmaⅠ。 (2)保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则：所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择SmaⅠ。 (3)确保出现相同黏性末端原则：通常选择与切割目的基因相同的限制酶切割质粒，如图中PstⅠ；为避免目的基因和质粒自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图也可选择PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶。 (3)基因表达载体的构建过程 1.[2022湖北节选] 提取品系乙的mRNA，通过基因重组技术，以Ti质粒为表达载体，以品系甲的叶片外植体为受体，培有出转S基因的新品系。 3）如图是S基因的cDNA和载体的限制性内切核酸酶（限制性核酸内切酶）酶谱。为了成功构建重组表达载体，确保目的基因插入载体中方向正确，最好选用_____________________酶切割S基因的cDNA和载体。 XbaⅠ、HindⅡ 【考题讲练一】3分钟 生物种类 植物 动物 微生物 常用方法 农杆菌转化法(常用) 花粉管通道法（我国独创） 显微注射法 Ca2＋处理法 受体细胞 体细胞或受精卵 受精卵 原核细胞 (1)常用方法： 3. 将目的基因导入受体细胞 【知识梳理一】 基因工程的操作25min 常考Ca2+处理微生物细胞： 可使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。 44 [农杆菌转化法] ①农杆菌特点：易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力。 ②原理：植物受损伤时伤口处分泌物（酚类化合物）可吸引农杆菌，农杆菌中的Ti质粒上的T-DNA可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上。(常考) 农杆菌转化法中的两次拼接和两次导入： 第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T－DNA上 第二次拼接(非人工操作)是指插入目的基因的T－DNA拼接到受体细胞的染色体DNA上； 第一次导入是将含目的基因的Ti质粒导入农杆菌 第二次导入(非人工操作)是指含目的基因的T－DNA导入受体细胞。 植物组织培养 类型 步骤 检测与鉴定内容 方法 分子检测 第一步 目的基因是否插入到转基因生物染色体DNA上 PCR技术或 分子杂交技术 第二步 目的基因是否转录出了mRNA 第三步 目的基因是否翻译出蛋白质 第四步：个体水平鉴定 转基因生物是否表现出相应的特性 抗原-抗体杂交技术 抗虫或抗病的接种实验 【知识梳理一】 基因工程的操作25min 4.目的基因的检测与鉴定 DNA分子杂交技术：利用探针 (即使用放射性同位素标记含有目的基因的DNA片段），最后观察是否出现杂交带 【考题讲练】2.（2023·湖北·T4）用氨苄青霉素抗性基因（AmpR）、四环素抗性基因（TetR）作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体（重组质粒），并转化到受体菌中。下列叙述错误的是（　 　） A．若用HindⅢ酶切，目的基因转录的产物可能不同 B．若用PvuⅠ酶切，在含Tet（四环素）培养基中的菌落，不一定含有目的基因 C．若用SphⅠ酶切，可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否 D．若用SphⅠ酶切，携带目的基因的受体菌在含Amp（氨苄青霉素）和Tet的培养基中能形成菌落 D 质粒同时含2种标记基因:如果插入某种抗生素抗性基因内部，则会导致该抗生素抗性基因失活。如图，目的基因插入了四环素抗性基因内部，则四环素抗性基因失活 三、基因工程的基本操作程序 2、基因表达载体的构建 (1)目的： (2)基因表达载体的组成及作用 (3)基因表达载体的构建过程 3、将目的基因导入受体细胞 4、目的基因的检测与鉴定 【课堂小结】2min 1.(2023•广东•T20)种子大小是作物重要的产量性状。研究者对野生型拟南芥（2n=10）进行诱变筛选到一株种子增大的突变体。通过遗传分析和测序，发现野生型DAI基因发生一个碱基G到A的替换，突变后的基因为隐性基因，据此推测突变体的表型与其有关，开展相关实验。回答下列问题： （1）拟采用农杆菌转化法将野生型DA1基因转入突变体植株，若突变体表型确由该突变造成，则转基因植株的种子大小应与　　　　　　　　　　　　植株的种子大小相近。 (2)用PCR反应扩增DAI基因，用限制性核酸内切酶对PCR产物和 进行切割，用DNA连接酶将两者连接。为确保插入的DAI基因可以正常表达，其上下游序列需具备 。 (1)野生型（2分） (2)运载体     启动子和终止子 【当堂检测】10min 51 (3)转化后，T-DNA（其内部基因在减数分裂时不发生交换）可在基因组单一位点插入也可以同时插入多个位点。在插入片段均遵循基因分离及自由组合定律的前提下，选出单一位点插入的植株，并进一步获得目的基因稳定遗传的植株（如图），用于后续验证突变基因与表型的关系。 ①农杆菌转化T0代植株并自交，将T1代种子播种在选择培养基上，能够萌发并生长的阳性个体即表示其基因组中插入了_________。 ②T1代阳性植株自交所得的T2代种子按单株收种并播种于选择培养基，选择阳性率约_________ %的培养基中幼苗继续培养。 ③将②中选出的T2代阳性植株_______（填“自交”、“与野生型杂交”或“与突变体杂交”）所得的T3代种子按单株收种并播种于选择培养基，阳性率达到____%的培养基中的幼苗即为目标转基因植株。为便于在后续研究中检测该突变，研究者利用PCR扩增野生型和突变型基因片段，再使用限制性核酸内切酶X切割产物，通过核酸电泳即可进行突变检测，相关信息见下，在电泳图中将酶切结果对应位置的条带涂黑 。 卡那霉素抗性基因或抗卡那霉素基因或目的基因或DA1基因（2分） 75 自交 100 [2023全国甲卷] 接种疫苗是预防传染病的一项重要措施，乙肝疫苗的使用可有效阻止乙肝病毒的传播，降低乙型肝炎发病率。乙肝病毒是一种DNA病毒。重组乙肝疫苗的主要成分是利用基因工程技术获得的乙肝病毒表面抗原（一种病毒蛋白）。回答下列问题。3）目的基因导入酵母细胞后，若要检测目的基因是否插入染色体中，需要从酵母细胞中提取_______________进行DNA分子杂交，DNA分子杂交时应使用的探针是_______________________________________________________。4）若要通过实验检测目的基因在酵母细胞中是否表达出目的蛋白，请简要写出实验思路_________________________ 核染色体 标记的目的基因DNA片段 通过使用相应抗体，利用抗原-抗体杂交技术， 检测mRNA是否翻译形成蛋白质 三、基因工程的基本操作程序 2、基因表达载体的构建 (1)目的： (2)基因表达载体的组成及作用 (3)基因表达载体的构建过程 3、将目的基因导入受体细胞 4、目的基因的检测与鉴定 【板书设计】 【作业布置】完成课时作业9-12题 【课前提问】2min 基因工程的基本操作程序有哪些？核心步骤是？ 第3章 第3节 基因工程的应用 选择性必修3　生物技术与工程 课件类型：A 备课人：闫积苗 议课时间：第5周 上课时间：第6周 【复习目标】1分钟 【考点解读】1分钟 1.举例说明基因工程在农牧、食品及医药等行业的广泛应用改善了人类的生活品质。 2.举例说明依据人类需要对原有蛋白质结构进行基因改造、生产目标蛋白的过程。 基因工程是近年的高频考点，主要集中在限制酶的选择、基因表达载体的构建及各组分的作用、利用PCR技术获取和扩增目标DNA片段，并用电泳鉴定PCR的产物等。几乎都是情境信息题，考查学生获取和加工信息、分析和推理的能力：涉及农业、医药、卫生等，与其它技术工程常综合考查。 如2024年广东卷; 2024年吉林卷、2023年天津；2021年广东卷T22、全国乙卷T38、山东卷T25、天津卷T16等。 （2024·广东卷，21）（13分）驹形杆菌可合成细菌纤维素（BC）并将其分泌到胞外组装成膜。作为一种性能优异的生物材料，BC膜应用广泛。研究者设计了酪氨酸酶（可催化酪氨酸形成黑色素）的光控表达载体，将其转入驹形杆菌后构建出一株能合成BC膜并可实现光控染色的工程菌株，为新型纺织原料的绿色制造及印染工艺升级提供了新思路（图一）。 （2）研究者利用T7噬菌体来源的RNA聚合酶（T7RNAP）及蓝光光敏蛋白标签，构建了一种可被蓝光调控的基因表达载体（光控原理见图二a，载体的部分结构见图二b）。构建载体时，选用了通用型启动子PBAD（被工程菌RNA聚合酶识别）和特异型启动子PT7（仅被T7RNAP识别）。为实现蓝光控制染色，启动子①②及③依次为　　，理由是　　　。（3）光控表达载体携带大观霉素（抗生素）抗性基因。长时间培养时在培养液中加入大观霉素，其作用为　　　　（答两点）。 （4）根据预设的图案用蓝光照射已长出的BC菌膜并继续培养一段时间，随后将其转至染色池处理，发现只有经蓝光照射的区域被染成黑色，其原因是　　　　　　　。 （5）有企业希望生产其他颜色图案的BC膜。按照上述菌株的构建模式提出一个简单思路。 1. 农牧业方面的应用 抗虫功 能的基因 抗 病基因 降解或抵抗 [知识梳理一] 基因工程的应用20min 蛋白质编 码基因 花青素代谢相关的基因 外源生长激素基因 乳糖酶基因 乳汁 1. 农牧业方面的应用 [知识梳理一] 基因工程的应用20min 工程菌 牛凝乳酶的基因 基因 工程菌 2. 基因工程在食品工业方面的应用 [知识梳理一] 基因工程的应用20min 3. 医药卫生领域的应用 基因改造 显 微注射 抗原决定基因 克隆 免疫排斥 [知识梳理一] 基因工程的应用20min Q1：怎么使得目的基因只在乳腺中高效表达？ 乳腺蛋白基因的启动子+乳腺蛋白基因+药用蛋白基因 Q2：构建的基因表达载体用什么方法导入什么受体细胞？ 显微注射法，受体细胞是受精卵 Q3：乳腺生物反应器生产药用蛋白的缺点？ ①只有在泌乳期才能生产； ②只有诞下雌性动物才能生产； Q4：可用什么替代？ 替代：膀胱生物反应器； 优点：不受性别和发育时期的限制 [知识梳理一] 基因工程的应用20min 比较内容 乳腺生物反应器 工程菌 含义 让外源基因在哺乳动物的乳腺中特异表达，利用动物的乳腺组织生产药物蛋白 指用基因工程的方法，使外源基因得到高效表达的微生物 基因表达 合成的药物蛋白与天然蛋白相同 受体细胞 3. 医药卫生领域的应用 细菌合成的药物蛋白可能没有活性 微生物细胞 动物受精卵 [知识梳理一] 基因工程的应用20min 比较内容 乳腺生物反应器 工程菌 目的基因 导入方式 生产条件 不需要严格灭菌，温度等外界条件对其影响不大 药物提取 从动物乳汁中提取 从微生物细胞或其培养液中提取 3. 医药卫生领域的应用 显微注射法 Ca2＋处理法 需要严格灭菌，严格控制工程菌所需的温度、pH、营养物质浓度等外界条件 [知识梳理一] 基因工程的应用20min 1.利用基因工程技术生产人胰岛素时，构建重组质粒的过程如图所示，该方法获得的胰岛素分子因容易发生聚合而影响效果。下列说法正确的是(　A　) A．为避免目的基因任意连接和载体自身环化，应选用SmaⅠ、PstⅠ两种酶对它们进行 处理 B．基因表达载体除目的基因、标记基因外，还必须有起始密码子和终止密码子等 C．利用乳腺生物反应器生产人胰岛素时，应选用哺乳动物的乳腺细胞为受体细胞 D．可利用蛋白质工程技术直接对胰岛素分子进行改造，使其功能更符合人类的要求 [考题讲练一] 2min 一、基因工程的应用 1、基因工程在农牧业方面的应用 2、基因工程在食品工业方面的应用 3、基因工程在医药卫生领域的应用 【课堂小结】2min 1.红细胞生成素(EPO)是体内促进红细胞生成的一种激素物质，是当今最成功的基因工程药物，可用于治疗肾衰性贫血等疾病。由于天然EPO来源极为有限，目前临床使用的红细胞生成素主要来自基因工程技术生产的重组人红细胞生成素(rhEPO)。其简要生产流程如图，下列相关叙述正确的是(　C　) A．过程①用到的工具酶有DNA聚合酶、限制酶和DNA连接酶 B．构建的重组表达载体中终止子的作用是终止翻译过程 C．检测重组细胞是否表达出rhEPO常用抗原—抗体杂交技术 D．用乳腺生物反应器生产EPO可将人EPO基因导入哺乳动物体细胞获得 [当堂训练] 10min 2.（2024·广东卷，21）（13分）驹形杆菌可合成细菌纤维素（BC）并将其分泌到胞外组装成膜。作为一种性能优异的生物材料，BC膜应用广泛。研究者设计了酪氨酸酶（可催化酪氨酸形成黑色素）的光控表达载体，将其转入驹形杆菌后构建出一株能合成BC膜并可实现光控染色的工程菌株，为新型纺织原料的绿色制造及印染工艺升级提供了新思路（图一）。 （1）研究者优化了培养基的　　　　　　（答两点）等营养条件，并控制环境条件，大规模培养工程菌株后可在气液界面处获得BC菌膜（菌体和BC膜的复合物）。 （3）光控表达载体携带大观霉素（抗生素）抗性基因。长时间培养时在培养液中加入大观霉素，其作用为　　　　（答两点）。 （4）根据预设的图案用蓝光照射已长出的BC菌膜并继续培养一段时间，随后将其转至染色池处理，发现只有经蓝光照射的区域被染成黑色，其原因是　　　　　　　。 （5）有企业希望生产其他颜色图案的BC膜。按照上述菌株的构建模式提出一个简单思路　　　　。 【答案】（13分） （1）碳源、氮源（2分） （2）PT7，PBAP，PBAP（3分）　　基因2和基因3正常表达无活性产物（1分），蓝光激活后再启动基因1表达有活性产物（1分） （3）抑制杂菌（1分）；去除丢失质粒的菌株（1分） （4）该处细胞蓝光激活T7RNAP（1分）/酪氨酸酶表达并合成黑色素（1分）（二选一） （5）将酪氨酸酶替换为催化其他颜色合成的酶（将酪氨酸酶基因替换为表达其他颜色的基因/将酪氨酸酶替换成不同颜色蛋白）（2分） 碳源、氮源（2分） 2.（2024·广东卷，21）（13分）驹形杆菌可合成细菌纤维素（BC）并将其分泌到胞外组装成膜。作为一种性能优异的生物材料，BC膜应用广泛。研究者设计了酪氨酸酶（可催化酪氨酸形成黑色素）的光控表达载体，将其转入驹形杆菌后构建出一株能合成BC膜并可实现光控染色的工程菌株，为新型纺织原料的绿色制造及印染工艺升级提供了新思路（图一）。 （2）研究者利用T7噬菌体来源的RNA聚合酶（T7RNAP）及蓝光光敏蛋白标签，构建了一种可被蓝光调控的基因表达载体（光控原理见图二a，载体的部分结构见图二b）。构建载体时，选用了通用型启动子PBAD（被工程菌RNA聚合酶识别）和特异型启动子PT7（仅被T7RNAP识别）。为实现蓝光控制染色，启动子①②及③依次为　　　　，理由是　　　　　　　　　。     （3）光控表达载体携带大观霉素（抗生素）抗性基因。长时间培养时在培养液中加入大观霉素，其作用为　　　　（答两点）。 （4）根据预设的图案用蓝光照射已长出的BC菌膜并继续培养一段时间，随后将其转至染色池处理，发现只有经蓝光照射的区域被染成黑色，其原因是　　　　　　　。 （5）有企业希望生产其他颜色图案的BC膜。按照上述菌株的构建模式提出一个简单思路　　　　。 【答案】（13分） （1）碳源、氮源（2分） （2）PT7，PBAP，PBAP（3分）　　基因2和基因3正常表达无活性产物（1分），蓝光激活后再启动基因1表达有活性产物（1分） （3）抑制杂菌（1分）；去除丢失质粒的菌株（1分） （4）该处细胞蓝光激活T7RNAP（1分）/酪氨酸酶表达并合成黑色素（1分）（二选一） （5）将酪氨酸酶替换为催化其他颜色合成的酶（将酪氨酸酶基因替换为表达其他颜色的基因/将酪氨酸酶替换成不同颜色蛋白）（2分） （2）PT7，PBAP，PBAP（3分）　　基因2和基因3正常表达无活性产物（1分），蓝光激活后再启动基因1表达有活性产物（1分） 2.（2024·广东卷，21）（13分）驹形杆菌可合成细菌纤维素（BC）并将其分泌到胞外组装成膜。作为一种性能优异的生物材料，BC膜应用广泛。研究者设计了酪氨酸酶（可催化酪氨酸形成黑色素）的光控表达载体，将其转入驹形杆菌后构建出一株能合成BC膜并可实现光控染色的工程菌株，为新型纺织原料的绿色制造及印染工艺升级提供了新思路（图一）。 （3）光控表达载体携带大观霉素（抗生素）抗性基因。长时间培养时在培养液中加入大观霉素，其作用为　　　　（答两点）。 （4）根据预设的图案用蓝光照射已长出的BC菌膜并继续培养一段时间，随后将其转至染色池处理，发现只有经蓝光照射的区域被染成黑色，其原因是　　　　　　　。 （5）有企业希望生产其他颜色图案的BC膜。按照上述菌株的构建模式提出一个简单思路。 （3）抑制杂菌（1分）；去除丢失质粒的菌株（1分） （4）该处细胞蓝光激活T7RNAP（1分）/酪氨酸酶表达并合成黑色素（1分）（二选一） （5）将酪氨酸酶替换为催化其他颜色合成的酶（将酪氨酸酶基因替换为表达其他颜色的基因/将酪氨酸酶替换成不同颜色蛋白）（2分） （2022·广东卷，22）（12分）“绿水逶迤去，青山相向开”大力发展低碳经济已成为全社会的共识。基于某些梭菌的特殊代谢能力，有研究者以某些工业废气（含CO2等一碳温室气体，多来自高污染排放企业）为原料，通过厌氧发酵生产丙酮，构建一种生产高附加值化工产品的新技术。 （1）研究者针对每个需要扩增的酶基因（如图）设计一对　　　　　　　　，利用PCR技术，在优化反应条件后扩增得到目标酶基因。 （2）研究者构建了一种表达载体pMTL80k，用于在梭菌中建立多基因组合表达库，经筛选后提高丙酮的合成量。该载体包括了启动子、终止子及抗生素抗性基因等，其中抗生素抗性基因的作用是　　　　　　　　，终止子的作用是　　　　　　　　。 （3）培养过程中发现重组梭菌大量表达上述酶蛋白时，出现了生长迟缓的现象，推测其原因可能是　　　　，此外丙酮的积累会伤害细胞，需要进一步优化菌株和工艺才能扩大应用规模。 （4）这种生产高附加值化工产品的新技术，实现了　 ，体现了循环经济特点。从“碳中和”的角度看，该技术的优势在于　　　，具有广泛的应用前景和良好的社会效益。     （1）引物（2分） （2）筛选含有目的基因的细胞（菌体）（2分）　　提供转录终止信号（2分） （3）酶蛋白大量表达需要消耗大量能量，而厌氧代谢功能不足（2分） （4）工业废气的资源化（2分）　　通过捕获二氧化碳（1分）、实现固碳减排（1分） （2021·广东.22）非细胞合成技术是一种运用合成生物学方法，在细胞外构建多酶催化体系，获得目标产物的新技术，其核心是各种酶基因的挖掘、表达等。中国科学家设计了4步酶促反应的非细胞合成路线（如图），可直接用淀粉生产肌醇（重要的医药食品原料），以期解决高温强酸水解方法造成的严重污染问题，并可以提高产率。     （1）研究人员采用PCR技术从土壤微生物基因组中扩增得到目标酶基因。此外，获得酶基因的方法还有___________。（答出两种即可） （2）高质量的DNA模板是成功扩增出目的基因的前提条件之一。在制备高质量DNA模板时必须除去蛋白，方法有___________。（答出两种即可） （3）研究人员使用大肠杆菌BL21作为受体细胞、pET20b为表达载体分别进行4种酶的表达。表达载体转化大肠杆菌时，首先应制备___________细胞。为了检测目的基因是否成功表达出酶蛋白，需要采用的方法有___________。 （4）依图所示流程，在一定的温度、pH等条件下，将4种酶与可溶性淀粉溶液混合组成一个反应体系。若这些酶最适反应条件不同，可能导致的结果是___________。在分子水平上，可以通过改变___________，从而改变蛋白质的结构，实现对酶特性的改造和优化。 基因文库中获取、人工合成法     盐析法、酶解法或高温变性     感受态     抗原-抗体杂交技术     有的酶失活而使反应中断      基因的碱基序列 一、基因工程的应用 1、基因工程在农牧业方面的应用 2、基因工程在食品工业方面的应用 3、基因工程在医药卫生领域的应用 【板书设计】 【作业布置】完成课时作业 $$