第10单元 第6课时 基因工程的基本工具与操作程序-【优化探究】2026高考生物学一轮复习高考总复习配套课件（江苏专版）

生物技术与工程 第十单元 第6课时　基因工程的基本工具与操作程序 学习要求 1.阐明DNA重组技术的实现需要利用限制性内切核酸酶、DNA连接酶和载体三种基本工具。 2.阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定等步骤。 3.DNA的粗提取与鉴定实验。 4.利用聚合酶链式反应(PCR)扩增DNA片段并完成电泳鉴定,或运用软件进行虚拟PCR实验。 内容索引 NEIRONGSUOYIN 演练感悟 考点二 基因工程的基本操作程序 真题 课时 巩固提高 基因工程的基本工具 考点一 考点三 DNA的粗提取与鉴定、DNA片段的扩增及电泳鉴定 基因工程的基本工具 考点一 归纳 必备知识 1.基因工程的概念 DNA分子 　转基因 2.基因工程的诞生和发展 (1)肺炎链球菌转化实验不仅证明了遗传物质是DNA,还证明了DNA可以在同种生物的不同个体之间 。 (2)DNA双螺旋结构模型的建立和 的证明。 (3)中心法则的确立。 (4)遗传密码的破译。 (5)基因转移载体的发现。 的发现为DNA的切割、连接以及功能基因的获得创造了条件。 转移 半保留复制 多种限制酶、DNA连接酶和逆转录酶 归纳 必备知识 (6)DNA体外重组的实现。 (7)重组DNA表达实验的成功。 (8)DNA测序和合成技术的发明。 (9) 技术的发明。 (10)基因组编辑技术可以实现对特定基因的定点插入、敲除或替换。 PCR 归纳 必备知识 3.重组DNA技术的基本工具 (1)限制性内切核酸酶(简称“限制酶”) 原核生物 特定核苷酸序列 磷酸二酯键 归纳 必备知识 提醒:①限制酶作用的化学键只能是磷酸二酯键。②在切割含目的基因的DNA分子时,需用限制酶切割两次,产生4个末端。只有这样才能使目的基因的两端都有可连接的黏性末端或平末端。 归纳 必备知识 (2)DNA连接酶 磷酸二酯键 远远低于 归纳 必备知识 (3)载体 噬菌体 受体DNA上 限制酶切割位点 标记 归纳 必备知识 1.基因工程是人工操作导致的染色体变异,变异是不定向的。( ) 2.DNA连接酶可以连接目的基因与载体的氢键,形成重组DNA。( ) 3.限制性内切核酸酶、DNA连接酶和质粒是基因工程中常用的三种工具酶。( ) 4.质粒通常采用抗生素合成基因作为标记基因。( ) × × × × 错漏诊断 深研 核心问题 用DNA重组技术可以赋予生物以新的遗传特性,创造出更符合人类需要的生物产品。在此过程中需要使用多种工具酶,其中4种限制性内切核酸酶的切割位点如图所示。 回答下列问题。 (1)EcoRⅠ是一种_________________ ______酶,它通过识别特定的_________ _____切割特定位点。经SmaⅠ和EcoRⅤ切割出来的载体为______末端。  限制性内切核酸(或 核苷酸序　 平 限制) 列 深研 核心问题 用DNA重组技术可以赋予生物以新的遗传特性,创造出更符合人类需要的生物产品。在此过程中需要使用多种工具酶,其中4种限制性内切核酸酶的切割位点如图所示。 回答下列问题。 (2)DNA重组技术中所用的质粒载体具有一些特征。如质粒DNA分子上有复制原点,可以保证质粒在受体细胞中能　　　　;质粒DNA分子上有　　　　　　　　,便于外源DNA插入;质粒DNA分子上有标记基因(如某种抗生素抗性基因),利用抗生素可筛选出含质粒载体的宿主细胞,方法是_________________________________________________________________________________________________。 自我复制 限制酶切割位点 用含有该抗生素的培养基培养宿主细胞,能够存活的即为含有质粒载体的宿主细胞 深研 核心问题 用DNA重组技术可以赋予生物以新的遗传特性,创造出更符合人类需要的生物产品。在此过程中需要使用多种工具酶,其中4种限制性内切核酸酶的切割位点如图所示。 回答下列问题。 (3)若某科研团队将某种病毒的外壳蛋白基因(L1)连接在GFP基因的5'末端,获得了L1⁃GFP融合基因(简称为甲),并将其插入质粒P0,构建了真核表达载体P1,其部分结构和酶切位点的示意图如图所示,图中E1~E4四种限制酶产生的黏性末端各不相同。 据图判断,该团队在将甲插入质粒P0时,使用了两种限制酶,这两种酶是　　　　。使用这两种酶进行酶切是为了保证　　　　　　,也是为了保证　　　　　　　　　。  E1和E4 甲的完整　 甲与载体正确连接 深研 核心问题 用DNA重组技术可以赋予生物以新的遗传特性,创造出更符合人类需要的生物产品。在此过程中需要使用多种工具酶,其中4种限制性内切核酸酶的切割位点如图所示。 回答下列问题。 (4)图中C1酶基因以B链为转录模板链,转录时mRNA自身的延伸方向为_______。为了使C1酶基因按照正确的方向与已被酶切的HT质粒连接,克隆C1酶基因时在其两端添加了SmaⅠ和BamHⅠ的酶切位点。该基因内部没有这两种酶切位点。图中酶切位点1 和2所对应的酶 分别是_________ ____________。  5'→3' BamHⅠ、 SmaⅠ 1.与DNA有关的几种酶的比较 归纳提升 2.限制酶的选择 (1)不破坏目的基因原则:如图甲中可选择PstⅠ,而不选择SmaⅠ。 (2)保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则:质粒作为载体必须具备标记基因,所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构,如图乙中不选择SmaⅠ。若载体上有多个标记基因,则可合理对其中一些标记基因进行酶切破坏,从而达到比一个标记基因更高的筛选成功率,防止只有一个标记基因时出现的“假阳性”(即未成功导入目的基因的载体也能正常表达标记基因,造成无效筛选)。 (3)善用“双酶切”,注意方向性:目的基因所在序列和载体上存在多种酶切位点时,一般需要选择在目的基因所在序列和载体上都存在切割位点的两种不同的限制酶,对目的基因所在序列和载体进行剪切,即“双酶切法”。其优点和作用:①防止目的基因环化;②避免目的基因与载体反向连接,即用DNA连接酶连接后形成的重组DNA分子上,目的基因和载体启动子的方向(或描述为“RNA聚合酶的移动方向”)必须是相同的,否则目的基因导入后无法正常表达。如图甲、乙也可以选择PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶。 (4)巧用“同尾酶”:同尾酶指来源不同,但能产生相同黏性末端的限制酶。当不适合选择某种限制酶时,可用其同尾酶替换,以获得相同的黏性末端。 3.标记基因的作用 标记基因可用于检测目的基因是否导入受体细胞: 命题 考向突破 1.(2023·新课标卷)某同学拟用限制酶(酶1、酶2、 酶3 和酶4)、DNA 连接酶为工具,将目的基因(两端 含相应限制酶的识别序列和切割位点)和质粒进行 切割、连接,以构建重组表达载体。限制酶的切割 位点如图所示。 下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的 是(　　) A.质粒和目的基因都用酶3切割,用E.coli DNA连 接酶连接 B.质粒用酶3 切割、目的基因用酶1 切割,用T4 DNA 连接酶连接 C.质粒和目的基因都用酶1 和酶2 切割,用T4 DNA连 接酶连接 D.质粒和目的基因都用酶2 和酶4 切割,用E.coli DNA连接酶连接 C 解析:酶3切割后得到的是平末端,用T4 DNA连接 酶连接效率更高,A错误;质粒用酶3切割后得到平 末端,目的基因用酶1切割后得到的是黏性末端,二 者不能连接,B错误;质粒和目的基因都用酶1和酶2 切割后得到黏性末端,可以用T4 DNA连接酶连接, 能保证目的基因在质粒上连接的方向正确,此重组 表达载体的构建方案最合理且高效,C正确;若用酶2 和酶4切割质粒和目的基因,会破坏质粒上的抗生素抗性基因,连接形成的基因表达载体缺少标记基因,无法进行后续的筛选,D错误。 2.(2025·湖北荆州模拟)质粒是基因工程中最常用的载体,质粒有标记基因(如图所示),通过标记基因可以推知外源基因(目的基因)是否转移成功。质粒上箭头表示三种限制酶的酶切位点。外源基因插入的位置不同,细菌在培养基上的生长情况不同。如表是外源基因插入(插入点有a、b、c)后细菌的生长情况。下列有关叙述正确的是(　　) 项目 细菌在含氨苄青霉素的培养基上的生长情况 细菌在含四环素的培养基上的生长情况 ① 能生长 不能生长 ② 能生长 能生长 ③ 不能生长 能生长 A.质粒的复制原点上有RNA聚合酶的结合位点 B.①②③三种重组后细菌的外源基因插入点① 是a,②是c,③是b C.质粒被一种限制酶切开时,被水解的磷酸二酯 键有2个 D.将外源基因与质粒连接时需用DNA聚合酶 答案:C 解析:质粒的复制原点上有DNA聚合酶的结合位点,A错误;①②③三种重组后细菌的外源基因插入点①是b,②是c,③是a,B错误;将外源基因与质粒连接时需用DNA连接酶,D错误。 基因工程的基本操作程序 考点二 归纳 必备知识 1.目的基因的筛选与获取 (1)目的基因:在基因工程的设计和操作中,用于改变受体细胞 或获得预期 等的基因。 (2)筛选合适的目的基因 ①从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。 ②利用序列数据库和序列比对工具进行筛选。 性状 表达产物 (3)目的基因的获取 ①人工合成目的基因。 ②PCR获取和扩增目的基因。 a.PCR(聚合酶链式反应)是一项根据 的原理,在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件,对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。 b.PCR反应的条件:一定的缓冲液、DNA模板、2种 、4种_______ 、 DNA聚合酶,以及能自动调控温度的仪器。 DNA半保留复制 引物 苷酸 脱氧核 耐高温的 归纳 必备知识 c.PCR扩增的过程 d.PCR产物的鉴定:常采用 来鉴定。 ③通过构建 来获取目的基因。 90 50　 引物 72 耐高温的DNA 聚合酶 琼脂糖凝胶电泳 基因文库 归纳 必备知识  2.基因表达载体的构建——基因工程的核心 (1)目的:让目的基因 ,同时,使目的基因能够表达和发挥作用。 (2)基因表达载体的组成及作用 在受体细胞中稳定存在,并且遗传给下一代 启动子 标记基因 归纳 必备知识 提醒:启动子、起始密码子、终止子、终止密码子的辨析 项目 位置 作用 启动子 位于DNA分子上 RNA聚合酶识别和结合的部位,启动转录过程 起始密码子 位于mRNA分子上 决定翻译的开始 终止子 位于DNA分子上 决定转录的结束 终止密码子 位于mRNA分子上 决定翻译的结束 归纳 必备知识 (3)构建过程 归纳 必备知识 3.将目的基因导入受体细胞 子房 T⁃DNA　 　色体DNA　 染 受精卵 归纳 必备知识 归纳 必备知识 教材拾遗 (人教选择性必修3 P81“资料卡”)转化:目的基因进入受体细胞内,并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。此处“转化”与肺炎链球菌转化实验中的“转化”含义相同,实质都是基因重组。 提醒:农杆菌转化法中涉及的两次拼接和两次导入 第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T⁃DNA上,第二次拼接(非人工操作)是指插入目的基因的T⁃DNA拼接到受体细胞的染色体DNA上;第一次导入是将含目的基因的Ti质粒导入农杆菌,第二次导入(非人工操作)是指含目的基因的T⁃DNA导入受体细胞。 归纳 必备知识 4.目的基因的检测与鉴定 归纳 必备知识 归纳 必备知识 教材拾遗 (人教选择性必修3 P83“到社会中去”)转基因抗虫棉培育过程中,检测目的基因是否成功表达的常见两种方法是抗原—抗体杂交法、用棉叶饲喂棉铃虫。 1.目的基因一定是编码蛋白质的基因。( ) 2.真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2+激活。因此,PCR反应缓冲液中一般要添加Mg2+。( ) 3.基因表达载体中的启动子和终止子决定着翻译的开始与结束。( ) 4.Ti质粒上的T⁃DNA可与植物受体细胞的染色体DNA整合在一起。( ) 5.为培育抗除草剂的作物新品种,导入抗除草剂基因时只能以受精卵为受体。( ) 6.检测目的基因是否导入受体细胞可用抗原—抗体杂交技术。( ) × × × × √ √ 错漏诊断 深研 核心问题 1.PCR扩增过程中的循环图示与规律 ( 提示:病毒繁殖所需的原料、能量、场所均由宿主细胞提供,病毒自身仅提供模板。 循环次数 1 2 3 n DNA分子数 2 　　　  　　　  　　　  含引物A(或B)的 DNA分子数 1 　　　  　　　  　　　  同时含引物A、 B的DNA分子数 0= 21-2 　　　  　　　  　　　  共消耗的引物数量 2= 21+1-2 6= 22+1-2 14= 23+1-2 2n+1-2 4 8 2n 3 7 2n-1 2=22-2 6=23-2 2n-2 深研 核心问题 2.目的基因导入受体细胞之前,需构建基因表达载体,图甲、乙表示质粒及目的基因所在DNA片段,图中箭头表示相关限制酶的切割位点。 (1)构建基因表达载体时需要使用的工具酶为___________________ 。 (2)用图中质粒和DNA构建基因表达载体时,不能使用SmaⅠ切割,原因是_______ ___________________________________ ___________________。  限制酶和DNA连接酶 SmaⅠ 会破坏质粒的抗生素抗性基因和外源DNA中的目的基因 深研 核心问题 2.目的基因导入受体细胞之前,需构建基因表达载体,图甲、乙表示质粒及目的基因所在DNA片段,图中箭头表示相关限制酶的切割位点。 (3)构建基因表达载体时,可用EcoRⅠ同时切割质粒和外源DNA,但会导致_____ ____________________________________________等问题,为避免以上问题出现,应使用_____________________________ ___________两种限制酶。  (4)构建好的基因表达载体在目的基因前要加上　 　　 ,其是_____________识别和结合的部位。  目的 BamHⅠ和HindⅢ(或EcoRⅠ和 启动子 RNA聚合酶 基因和质粒的自身环化、目的基因不能 正向连接 HindⅢ) 深研 核心问题 3.如图为利用农杆菌转化法制备转基因植物的过程图,据图回答下列问题。 (1)在用农杆菌转化法将目的基因导入植物细胞的过程中,一定要将目的基因插入Ti质粒的T⁃DNA上的原因是什么? 提示:原因是农杆菌中的Ti质粒上的T⁃DNA可转移至被侵染的细胞,并且整合到该细胞的染色体DNA上。 深研 核心问题 3.如图为利用农杆菌转化法制备转基因植物的过程图,据图回答下列问题。 ( (2)将基因表达载体导入农杆菌细胞时,应怎样处理农杆菌细胞? 提示:基因表达载体(重组质粒)导入农杆菌细胞时,要用Ca2+处理农杆菌细胞,使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。 提示:病毒繁殖所需的原料、能量、场所均由宿主细胞提供,病毒自身仅提供模板。 深研 核心问题 3.如图为利用农杆菌转化法制备转基因植物的过程图,据图回答下列问题。 (3)大肠杆菌和酵母菌在基因工程中都可以作为受体细胞,但用于生产需要加工和分泌的蛋白质时酵母菌更有优势,为什么? 提示:大肠杆菌为原核细胞,而酵母菌为真核细胞(具有多种细胞器),所以酵母菌在用于生产需要加工和分泌的蛋白质时比大肠杆菌有优势。 1.PCR技术与体内DNA复制的比较 归纳提升 2.根据Ti质粒的T⁃DNA片段选择限制酶,图中甲、乙、丁Ti质粒均不宜选取,而丙Ti质粒宜选取(设切割目的基因的限制酶为XbaⅠ和SacⅠ)。 3.筛选出含有目的基因的受体细胞 (1)原理:将目的基因插入含有两种抗生素抗性基因的载体时,如果插入某种抗生素抗性基因内部,则会导致该抗生素抗性基因失活。如图,目的基因插入四环素抗性基因内部,则四环素抗性基因失活。 (2)被转化的细菌有三种:含环状目的基因的细菌、含重组质粒的细菌、含自身环化质粒的细菌。 (3)筛选方法:将混合处理后的细菌先放在含氨苄青霉素的培养基上培养,能生长的是含重组质粒的细菌和含自身环化质粒的细菌,如图1、2、3、4、5菌落,再利用无菌的绒布影印到含有四环素的培养基上,如图能生长的菌落为2、3、4,则在含四环素培养基上不生长的即为含有目的基因的菌落(1、5菌落)。最后,可在含氨 苄青霉素的培养基上挑取1、5菌落进行培养。 1.(多选)(2025·江苏淮安模拟)反向PCR是一种通过已知序列设计引物对未知序列进行扩增的技术,其过程如图所示。下列叙述错误的有(　　) 命题 考向突破 A.应选择引物1和引物4进行PCR扩增 B.设计的引物中GC碱基含量越高,退火温度越低 C.PCR产物是包含所有已知序列和未知序列的环状DNA分子 D.整个过程需用到限制酶、DNA连接酶、耐高温的DNA聚合酶及逆转录酶 答案:BCD 解析:DNA子链合成的方向为5'端到3'端,引物需要与模板的3'端结合,该过程需要对未知序列进行扩增,因此要通过已知序列设计引物对未知序列进行扩增,故应选择引物1和引物4进行PCR扩增,A正确;G与C之间有3个氢键,A与T之间有2个氢键,故GC碱基含量越高,氢键的含量越多,退火的温度越高,B错误;PCR产物是包含所有已知序列和未知序列的链状DNA分子,C错误;整个过程需用到限制酶、DNA连接酶和耐高温的DNA聚合酶,不需要逆转 录酶,D错误。 2.(2024·江苏卷)为了高效纯化超氧化物歧 化酶(SOD),科研人员将ELP50片段插入pET ⁃SOD构建重组质粒pET⁃SOD⁃ELP50,以融 合表达SOD⁃ELP50蛋白,过程如图1。其中, ELP50是由人工合成的DNA片段,序列为:限 制酶a识别序列⁃(GTTCCTGGTGTTGGC)50⁃ 限制酶b识别序列,50为重复次数。请回答下列 问题。  (1)步骤①双酶切时,需使用的限制酶a和限制酶b分别是____________________。  解析:目的基因应插入启动子和终止子之间,结合题意可知,ELP50应插入SOD之后,由图可知,限制酶a和限制酶b分别是EcoRⅠ、Hind Ⅲ。 EcoRⅠ、Hind Ⅲ (2)步骤②转化时,科研人员常用　　　　处理大肠杆菌,使细胞处于感受态;转化后的大肠杆菌采用含有　　　　　　的培养基进行筛选。用PCR技术筛选成功导入pET⁃SOD⁃ ELP50的大肠杆菌,应选用的一对引物是　　　　　　。 CaCl2 卡那霉素 S⁃F和E⁃R 解析: 转化细菌时常用CaCl2处理,使其处于容易吸收外来DNA分子的状态。由图可知,重组DNA含有卡那霉素抗性基因,所以转化后的大肠杆菌应采用含有卡那霉素的培养基进行筛选。成功导入的pET⁃SOD⁃ELP50同时含有pET⁃SOD和ELP50,结合图示可知,引物S⁃F和E⁃R对应序列包含SOD和ELP50的相应序列,可特异性对pET⁃SOD⁃ELP50进行扩增,根据扩增产物相对分子质量的大小可判断大肠杆菌中是否导入pET⁃SOD⁃ELP50。 (3)步骤③大肠杆菌中RNA聚合酶与　　　　结合, 驱动转录,翻译SOD⁃ELP50蛋白。已知蛋白质中氨 基酸残基的平均相对分子质量约为0.11 kDa,将表达 的蛋白先进行凝胶电泳,然后用SOD抗体进行杂交, 显示的条带应是　　　　(从图2的“A~D”中选填)。 解析: RNA聚合酶与启动子结合后,启动转录。由图可知,决定SOD⁃ELP50融合蛋白的基因长度为462+750=1 212 bp,编码1 212÷3=404个氨基酸,已知蛋白质中氨基酸残基的平均相对分子质量约为0.11 kDa,融合蛋白的相对分子质量约为404×0.11 kDa=44.44 kDa,电泳后应该为条带C。 启动子 C (4)步骤④为探寻高效纯化SOD⁃ELP50蛋白的方法,科研人员研究了温度、NaCl对SOD⁃ELP50蛋白纯化效果的影响,部分结果如图3。 (ⅰ)20 ℃时,加入NaCl后实验结果是____________________________ 。 (ⅱ)100 ℃时,导致各组中所有蛋白都沉淀的原因是_______________。  (ⅲ)据图分析,融合表达SOD⁃ELP50蛋白的优点有_________________ 　。  SOD⁃ELP50组纯化蛋白数量更多　 高温使蛋白变性 利于SOD蛋白纯化,杂蛋白较少,有利于酶活性的保持 低温下添加NaCl有 解析: (ⅰ)由图可知,20 ℃时,与不加NaCl比较,加入NaCl后纯化蛋白数量更多。 (ⅱ)100 ℃时,温度过高,导致蛋白质变性沉淀。 (ⅲ)20 ℃,加入NaCl时,与SOD比较,SOD⁃ELP50组沉淀中蛋白质相对含量较高,说明低温下添加NaCl有利于SOD蛋白纯化,杂蛋白较少,有利于酶活性的保持。 DNA的粗提取与鉴定、DNA片段的扩增及电泳鉴定 考点三 归纳 必备知识 1.DNA粗提取与鉴定 (1)基本原理 2 mol/L 二苯胺　 (2)操作流程 95% 沸水 归纳 必备知识 提醒:加入酒精和用玻璃棒搅拌时,动作要轻缓,以免加剧DNA分子的断裂,导致DNA分子不能形成丝状沉淀。 归纳 必备知识 2.DNA片段的扩增及电泳鉴定 (1)实验原理 ①PCR原理:利用了 原理,通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。 ②电泳原理:DNA分子具有可解离的基团,在一定的pH下,这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下,这些带电分子会向着与它所带电荷 的电极移动,这个过程就是电泳。 ③PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的 等有关。 DNA的热变性 相反 大小和构象 归纳 必备知识 (2)实验步骤 离心管 归纳 必备知识 (3)DNA的电泳鉴定 微量移液器 紫外灯 归纳 必备知识  提醒:①为避免外源DNA等因素的污染,PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。 ②在向微量离心管中添加反应组分时,每吸取一种试剂后,移液器上的枪头都必须更换,避免试剂的污染。 ③电泳时,DNA的相对分子量越大,迁移速率越慢;DNA的相对分子量越小,迁移速率越快。 归纳 必备知识 ( 提示:病毒繁殖所需的原料、能量、场所均由宿主细胞提供,病毒自身仅提供模板。 深研 核心问题 1.思考并回答下列有关DNA粗提取与鉴定的问题。 (1)本实验不能用哺乳动物成熟的红细胞作为实验材料,原因是_______ 。  (2)在DNA的粗提取与鉴定实验中,实验过程中要充分地搅拌和研磨,如果研磨不充分,会对实验结果产生怎样的影响? 提示:研磨不充分会使细胞核内的DNA释放不完全,提取的DNA量变少,导致看不到丝状物或沉淀物,用二苯胺试剂鉴定不显示蓝色。 物成熟的红细胞无细胞核和其他细胞器(无DNA) 哺乳动 2.请回答下列有关DNA片段的扩增及电泳鉴定的问题。 (1)DNA的电泳鉴定实验中,影响DNA分子迁移速率的因素有哪些? 提示:凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等。 深研 核心问题 (2)电泳鉴定结果的分析:凝胶中的DNA分子通过染色,可以在波长为 　　 　的紫外灯下被检测出来。  ①成功扩增出DNA片段的判断依据是__________________________ 　　 　　。  ②进行电泳鉴定的结果应该是　　　　条条带。 如图所示,该片段大小约为　　　　bp。  300 nm　 DNA条带 可以在紫外灯下直接观察到 一 750 深研 核心问题 (3)若操作者进行电泳鉴定的结果不止一条条带,请分析产生这个结果的可能原因。 提示:操作过程中混入限制酶将DNA片段切割成片段或含有其他DNA片,以此为模板进行了扩增。 深研 核心问题 1.(2024·安徽卷)下列关于“DNA粗提取与鉴定”实验的叙述,错误的是(　　) A.实验中如果将研磨液更换为蒸馏水,DNA提取的效率会降低 B.利用DNA和蛋白质在酒精中的溶解度差异,可初步分离DNA C.DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同,该原理可用于纯化DNA粗提物 D.将溶解的DNA粗提物与二苯胺试剂反应,可检测溶液中是否含有蛋白质杂质 命题 考向突破 D 解析:研磨液有利于DNA的溶解,换为蒸馏水,DNA提取的效率会降低,A正确;DNA不溶于酒精溶液,但细胞中的某些蛋白质溶于酒精,可分离DNA,B正确;DNA在NaCl溶液中的溶解度随着NaCl浓度的变化而改变,因此可用不同浓度的NaCl溶液对DNA进行粗提取,C正确;在沸水浴的条件下,DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色,因此二苯胺试剂用于鉴定DNA,D错误。 2.(2024·辽宁卷)关于采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物的实验,下列叙述正确的是(　　) A.琼脂糖凝胶浓度的选择需考虑待分离DNA片段的大小 B.凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示DNA分子的具体位置 C.在同一电场作用下,DNA片段越大,向负极迁移速率越快 D.琼脂糖凝胶中的DNA分子可以在紫光灯下被检测出来 A 解析:琼脂糖凝胶的浓度会影响DNA分子在凝胶中的迁移率和分辨率,琼脂糖凝胶的浓度通常是根据所需分离的DNA片段大小来选择的。对于较大的DNA片段,比如基因组DNA或质粒DNA,通常选择较低浓度的琼脂糖凝胶,因为它们需要更大的孔径来有效迁移。而对于较小的DNA片段,比如PCR产物或酶切片段,则需要选择较高浓度的琼脂糖凝胶,以提供更好的分辨率和分离效果,A正确;凝胶载样缓冲液指示剂通常是一种颜色较深的染料,可以作为电泳进度的指示分子,当溴酚蓝到凝胶2/3处时(可看蓝色条带),则停止电泳,B错误;在琼脂糖凝胶电泳中,当电场作用时,DNA片段实际上是向正极迁移的,而不是向负极迁移。同时,DNA片段的迁移速率与其大小成反比,即DNA片段越大,迁移速率越慢,C错误;琼脂糖凝胶中的DNA分子染色后,可在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来,D错误。 3.(2025·河北保定模拟)用PCR方法检测转基因植株是否成功导入目的基因时,得到电泳图谱如图所示,其中1号为DNA标准样液(Marker),2~10号为PCR产物;其中2号的模板为野生型植株DNA,3~9号的模板为转基因植株的DNA,10号使用蒸馏水代替模板DNA。PCR时加入的模板DNA如图所示。据此做出的分析不合理的是(　　) A.PCR产物的分子大小在250至500 bp之间 B.3号样品植株导入的目的基因一定能成功表达 C.9号样品对应植株不是所需的转基因植株 D.10号的电泳结果能确定反应体系等对实验结果没有干扰 答案:B 解析:PCR过程中,可以通过设计特定的引物来扩增特定的DNA片段。3~9号是转基因植株,理论上应包含目的基因,结合2号野生型植株和10号蒸馏水组的结果,推测包含目的基因的片段大小应为250~500 bp,A合理;3号PCR结果包含250~500 bp片段,包含目的基因,但导入的目的基因不一定能成功表达,B不合理;9号PCR结果不包含250~500 bp片段,所以不是所需转基因植株,C合理;10号放入蒸馏水,可排除反应体系等对实验结果的干扰,D合理。 真题　演练感悟 2 3 1 1.(2023·江苏卷)某生物社团利用洋葱进行实验。下列相关叙述正确的是(　　) A.洋葱鳞片叶内表皮可代替半透膜探究质膜的透性 B.洋葱匀浆中加入新配制的斐林试剂,溶液即呈砖红色 C.制作根尖有丝分裂装片时,解离、漂洗、按压盖玻片都能更好地将细胞分散开 D.粗提取的DNA溶于2 mol/L NaCl溶液中,加入二苯胺试剂后显蓝色 A 4 5 解析:洋葱鳞片叶内表皮的原生质层具有选择透过性,可代替半透膜探究质膜的透性,A正确;洋葱匀浆中加入新配制的斐林试剂后,需要水浴加热才可能出现砖红色沉淀,若出现砖红色,则可说明洋葱匀浆中含有还原糖,B错误;制作根尖有丝分裂装片时,解离、按压盖玻片的目的都是为了获得单层细胞,即这些操作均能更好地将细胞分散开,C错误;粗提取的DNA溶于2 mol/L NaCl溶液中,加入二苯胺试剂后经过沸水浴加热可显蓝色,D错误。 2 3 1 4 5 2.(2024·湖南卷)某同学将质粒DNA进行限制酶酶切时,发现DNA完全没有被酶切,分析可能的原因并提出解决方法。下列叙述错误的是(　　) A.限制酶失活,更换新的限制酶 B.酶切条件不合适,调整反应条件如温度和酶的用量等 C.质粒DNA突变导致酶识别位点缺失,更换正常质粒DNA D.酶切位点被甲基化修饰,换用对DNA甲基化不敏感的限制酶 B 2 3 1 4 5 解析:限制酶失活会使DNA完全不被酶切,此时应更换新的限制酶,A正确;酶切条件不合适通常会使切割效果下降,甚至酶失活不发挥作用,此时应调整反应条件如温度和pH等,调整酶的用量没有作用,B错误;质粒DNA突变会导致限制酶识别位点缺失,进而造成限制酶无法进行切割,此时应更换为正常质粒,C正确;质粒DNA上酶切位点被甲基化修饰,会导致对DNA甲基化敏感的限制酶无法进行酶切,此时应换用对DNA甲基化不敏感的限制酶,D正确。 2 3 1 4 5 3.(2024·山东卷)关于“DNA的粗提取与鉴定”实验,下列说法正确的是(　　) A.整个提取过程中可以不使用离心机 B.研磨液在4 ℃冰箱中放置几分钟后,应充分摇匀再倒入烧杯中 C.鉴定过程中DNA双螺旋结构不发生改变 D.仅设置一个对照组不能排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰 A 2 3 1 4 5 解析:在DNA的粗提取与鉴定实验中,可将获得的研磨液用纱布过滤后,在4 ℃的冰箱中放置几分钟,再取上清液,也可以直接将研磨液用离心机离心后取上清液,A正确;研磨液在4 ℃冰箱中放置几分钟后,DNA在上清液中,应取上清液倒入烧杯中,B错误;鉴定过程中用沸水浴加热,DNA双螺旋结构会发生改变,C错误;加入二苯胺试剂后沸水浴处理的时间要在5分钟以上,且要等到冷却后再观察结果,这样才可以观察到较为明显的显色反应,仅设置一个对照组可以排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰,D错误。 2 3 1 4 5 4.(多选)(2024·湖南卷)最早的双脱氧测序法是PCR反应体系中,分别再加入一种少量的双脱氧核苷三磷酸(ddATP、ddCTP、ddGTP或ddTTP),子链延伸时,双脱氧核苷三磷酸也遵循碱基互补酸对原则。以加入ddATP的体系为例:若配对的为ddATP,延伸终止;若配对的为脱氧腺苷三磷酸(dATP),继续延伸;PCR产物变性后电泳检测。通过该方法测序某疾病患者及对照个体的一段序列,结果如图所示。下列叙述正确的是(　　) 2 3 1 4 5 A.上述PCR反应体系中只加入一种引物 B.电泳时产物的片段越小,迁移速率越慢 C.5'⁃CTACCCGTGAT⁃3'为对照个体的一段序列 D.患者该段序列中某位点的碱基C突变为G 答案:AC 2 3 1 4 5 解析:利用双脱氧测序法时,PCR反应体系中加入的模板是待测的单链DNA,故只需加入一种引物,A正确;电泳时,产物的片段越大,迁移速率越慢,B错误;依据分析中双脱氧测序法的原理,可以确定每个泳道中的条带(DNA片段)的3'终端的碱基,如+ddATP的泳道中出现的条带(DNA片段)的3'终端碱基就是A。另外由于每个片段的起始点相同,但终止点不同,因此可以通过比较片段的长度来确定DNA序列中每个位置上的碱基;图示电泳方向为从上→下,即对应的DNA片段为长→短,则对应的DNA测序结果为3'→5',由图可知对照个体的电泳结果最短的条带为+ddCTP泳道组的条带,说明该DNA片段5'端第一个碱基为C,因此对照个体的测序结果为5'⁃CTACCCGTGAT⁃3',患者的测序结果为5'⁃CTACCTGTGAT⁃3',C正确;对比患者和对照个体的测序结果可知,患者该段序列中某位点的碱基C突变为T,D错误。 2 3 1 4 5 5.(2023·江苏卷)为了将某纳米抗体和绿色荧光蛋白基因融合表达,运用重组酶技术构建质粒,如图1所示。请回答下列问题。 2 3 1 4 5 (1)分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时,配制的两个反应体系中不同的有__________________________,扩增程序中最主要的不同是______ 。 解析:PCR反应进行的条件有引物、酶、dNTP、模板和缓冲液(其中需要Mg2+)。分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时,配制的两个反应体系中不同的有模板(片段F1、片段F2)、引物。 PCR过程需要两种引物,能分别与目的 基因两条链的3'端通过碱基互补配对结 合。引物设计是决定PCR反应成败的最 重要因素,因此扩增程序中最主要的不同 是引物。 模板(片段F1、片段F2)、引物 引物 2 3 1 4 5 (2)有关基因序列如图2。引物F2⁃F、F1⁃R应在下列选项中选用___。  A.ATGGTG------CAACCA B.TGGTTG------CACCAT C.GACGAG------CTGCAG D.CTGCAG------CTCGTC EGFP基因序列: 5'ATGGTGAGCAAGGGC--------GACGAGCTGTACAAG 3' AnB1基因序列: 5'CATGTCCAGCTGCAG--------CCAAAACCACAACCA 3' 图2 CD 2 3 1 4 5 解析: 引物的作用是使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始延伸DNA链,因此引物与模板链3'端互补,与5'端的碱基序列相同。由图1可知,引物F2⁃F的部分序列既能与F1片段(EGFP)的后部分5'端序列相同,又能与F2片段(ANB1)的前部分5'端序列相同,C选项中5'-GACGAG-3'在EGFP基因中存在,5'-CTGCAG-3'在ANB1基因 中存在,因此引物F2⁃F选用C。由图1可 知,引物F1⁃R与引物F2⁃F碱基是互补的, 应选用D。 2 3 1 4 5 (3)将PCR产物片段与线性质粒载体混合后,在重组酶作用下可形成环化质粒,直接用于转化细菌。这一过程与传统重组质粒构建过程相比,无需使用的酶主要有　　　　　　 　　　　。  解析: 传统重组质粒构建需要使用限制性内切核酸酶(限制酶)切割质粒,使其具有与目的基因相同的黏性末端,之后再用DNA连接酶将目的基因和质粒连接成重组质粒。将PCR产物片段与线性质粒载体混合后,在DNA连接酶的作用下可形成环化质粒,不需要使用限制性内切核酸酶(限制酶)。 限制性内切核酸酶(限制酶) 2 3 1 4 5 (4)转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选,下列叙述错误的有　　　　。  A.稀释涂布平板需控制每个平板有30~300个菌落 B.抗性平板上未长出菌落的原因一般是培养基温度太高 C.抗性平板上常常会出现大量杂菌形成的菌落 D.抗性平板上长出的单菌落无需进一步划线纯化 ABC 2 3 1 4 5 解析: 转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选,用稀释涂布平板法筛选时,菌落数可能低于30,A错误;培养基冷却后才能接种,抗性平板上未长出菌落,一般不是培养基温度太高所致,B错误;转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基进行筛选,一般只有含重组质粒的大肠杆菌才能发展为菌落,故不会出现大量杂菌形成的菌落,C错误;稀释涂布平板法和平板划线法均为分离纯化细菌的方法,用稀释涂布平板法在抗性平板上长出的单菌落无需进一步划线纯化,D正确。 2 3 1 4 5 (5)为了验证平板上菌落中的质粒是否符合设计,用不同菌落的质粒为模板,用引物F1⁃F和F2⁃R进行了PCR扩增,质粒P1~P4的扩增产物电泳结果如图3。根据图中结果判断,可以舍弃的质粒有　　　　。  P3、P4 2 3 1 4 5 解析: EGFP的长度为720 bp,AnB1的长度为390 bp,二者的总大小为720+390=1 110 bp,用引物F1⁃F和F2⁃R进行PCR扩增,其产物大小接近于P1、P2,根据图3中结果判断,可以舍弃的 质粒有P3、P4。 2 3 1 4 5 (6)对于PCR产物电泳结果符合预期的质粒,通常需进一步通过基因测序确认,原因是_________________________________________________ 　。  解析: 琼脂糖凝胶电泳技术仅能用于分析待检测DNA分子的大小,无法确定待检测DNA分子的碱基序列,因此对于PCR产物电泳结果符合预期的质粒,通常需进一步通过基因测序确认。 小,无法确定待检测DNA分子的碱基序列 琼脂糖凝胶电泳技术仅能用于分析待检测DNA分子的大 2 3 1 4 5 课时 巩固提高 100 2 3 5 6 7 8 9 11 12 1 4 10 D 1.(2025·河南郑州模拟)下列关于基因工程的叙述,不正确的是(　　) A.基因工程的生物学原理是基因重组 B.通过基因工程技术能够定向改造生物的遗传性状 C.基因的“分子缝合针”是DNA连接酶 D.基因工程中常用的载体质粒在动植物细胞广泛存在 13 解析:基因工程的核心是构建重组的DNA分子,因此早期也将基因工程称为重组DNA技术,即基因工程的生物学原理是基因重组,A正确;基因工程能按照人们的意愿,定向创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品,故基因工程技术能够定向改造生物的遗传性状,B正确;基因工程的常用工具有限制酶、DNA连接酶和载体,其中DNA连接酶是基因的“分子缝合针”,C正确;基因工程中常用的载体质粒存在于许多细菌和酵母菌等生物中,D错误。 2 3 5 6 7 8 9 11 12 1 4 10 13 2.(2025·江苏南京模拟)如图是利用基因工程培育抗虫植物的示意图。以下相关叙述正确的是(　　) A.①②的操作中需要使用限制酶和DNA聚合酶参与 B.一般情况下⑤只要表现出抗虫性状,就表明植株发生了可遗传变异 C.③→④过程利用了膜的结构特性,重组Ti质粒整合到④的染色体上 D.④的染色体上若含有抗虫基因,则⑤就表现出抗虫性状 B 2 3 5 6 7 8 9 11 12 1 4 10 13 解析:①②表示重组质粒的构建,重组质粒的构建需要限制酶和DNA连接酶参与,不需要DNA聚合酶,A错误;一般情况下,⑤只要表现出抗虫性状就表明抗虫基因表达了,即发生了可遗传变异(属于基因重组),B正确;③→④过程利用了农杆菌中的Ti质粒上的T⁃DNA具有可转移至受体细胞并且整合到受体细胞染色体的DNA上的特点,C错误;受体细胞的染色体上含抗虫基因,并不代表该基因就一定成功表达,因此不能确定⑤是否表现出抗虫性状,D错误。 2 3 5 6 7 8 9 11 12 1 4 10 13 3.如图为某种质粒的简图,小箭头所指分别为限制性内切核酸酶EcoRⅠ、BamHⅠ的酶切位点,P为转录的启动部位。已知目的基因的两端有EcoRⅠ、BamHⅠ的酶切位点,受体细胞为无任何抗药性的原核细胞。下列有关叙述正确的是(　　) 2 3 5 6 7 8 9 11 12 1 4 10 13 A.将含有目的基因的DNA与质粒分别用 EcoRⅠ酶切,在DNA连接酶作用下,生成的 由两个DNA片段连接形成的产物有两种 B.DNA连接酶的作用是将酶切后得到的黏 性末端连接起来,形成一个重组质粒时形成两个磷酸二酯键 C.为了防止目的基因反向连接和质粒自身环化,酶切时可选用的酶是EcoRⅠ和BamHⅠ D.能在含青霉素的培养基中生长的受体细胞中已成功导入该目的基因 答案:C 2 3 5 6 7 8 9 11 12 1 4 10 13 解析:根据题意,目的基因的两端有EcoRⅠ、BamHⅠ的酶切位点,将含有目的基因的DNA用EcoRⅠ酶切,会得到目的基因片段;根据质粒的简图可知,将质粒用EcoRⅠ酶切,会得到与质粒周长等长的链状DNA;因此将含有目的基因的DNA与质粒分别用EcoRⅠ酶切,在DNA连接酶作用下,可生成目的基因—目的基因片段、目的基因—质粒片段、质粒—质粒片段正、反连接共六种产物,A错误;DNA连接酶的作用是将酶切后得到的黏性末端或平末端连接起来,形成一个重组质粒,该过程形成四个磷酸二酯键,B错误;EcoRⅠ和BamHⅠ的识别序列不同,获取目的基因和切割质粒时,同时选用EcoRⅠ和BamHⅠ切割,目的基因两端形成的末端不同,切割后的质粒两端形成的末端不同,再用DNA连接酶连接,可以防止目的基因反向连接和质粒自身环化,C正确;导入普通质粒的大肠杆菌和导入重组质粒的大肠杆菌都能在含青霉素的培养基中生长,因此能在含青霉素的培养基中生长的受体细胞不一定含有目的基因,D错误。 2 3 5 6 7 8 9 11 12 1 4 10 13 4.(2025·湖北十堰模拟)作为基因工程的运输工具——载体,必须具备的条件及理由是(　　) A.具有多个限制酶切点,以便于目的基因的表达 B.具有某些标记基因,以使目的基因能够与其结合 C.能够在宿主细胞中稳定地保存下来并大量复制,以便目的基因能够稳定的存在和扩大数量 D.对宿主细胞无伤害,以便于重组DNA的鉴定和选择 C 2 3 5 6 7 8 9 11 12 1 4 10 13  解析:质粒等载体应具有多个限制酶切点,以便于目的基因的插入,A错误;质粒等载体应具有某些标记基因,以便于重组DNA的筛选,B、D错误;质粒等载体应能够在宿主细胞中稳定地保存下来并大量复制,以便目的基因能够稳定的存在和扩大数量,C正确。 2 3 5 6 7 8 9 11 12 1 4 10 13 5.(2025·山东菏泽模拟)下列关于“DNA的粗提取与鉴定”“DNA片段的扩增与电泳鉴定”实验的叙述,错误的是(　　) A.选取新鲜的菜花作为材料进行研磨是因为其DNA含量高 B.研磨时需加入缓冲液,防止DNA在pH发生变化时降解或变性 C.在凝胶中,DNA分子的迁移速率与DNA分子的大小、构象等有关 D.PCR产物出现拖尾可能是非特异性扩增过多,可适当降低复性温度 D 2 3 5 6 7 8 9 11 12 1 4 10 13 解析:新鲜的菜花DNA含量丰富,易获取,可以作为DNA粗提取的材料,A正确;研磨时需加入缓冲液,稳定溶液pH,防止DNA在pH发生变化时降解或变性,B正确;电泳鉴定DNA利用的原理是DNA在电场的作用下,会向着与它所带电荷相反的电极移动,在凝胶中,DNA分子的迁移速率与凝胶浓度、DNA分子的大小、构象等有关,C正确;复性温度越低,引物和底物越容易结合,错配情况增多,造成PCR特异性降低,故PCR产物出现拖尾可能是非特异性扩增过多,可适当提高复性温度,D错误。 2 3 5 6 7 8 9 11 12 1 4 10 13 6.(2025·江苏盐城模拟)常见的启动子可分为三类:组成型启动子,驱动基因在所有细胞、组织和器官中持续表达;组织特异型启动子,调控基因只在某些特定的部位中表达;诱导型启动子,通常在光、盐等信号作用下,使目的基因的转录水平有所提高。下列相关叙述错误的是(　　) A.细胞分化与组织特异型启动子和组成型启动子均有关 B.乳腺生物反应器的构建需要将目的基因连接在诱导型启动子的下游 C.真核生物细胞中,一般一个启动子只能启动一个基因的转录 D.强启动子可使基因高水平表达,启动子的强弱主要取决于其与RNA聚合酶的亲和性 B 2 3 5 6 7 8 9 11 12 1 4 10 13 解析:根据题干信息“组成型启动子,驱动基因在所有细胞、组织和器官中持续表达”,所以在细胞分化过程中,与组成型启动子有关,“组织特异型启动子,调控基因只在某些特定的部位中表达”,所以细胞分化与组织特异型启动子的调控也有关,A正确;“组织特异型启动子,调控基因只在某些特定的部位中表达”,构建乳腺生物反应器时需要将目的基因连接在组织特异型启动子的下游,导入细胞中,保证基因在乳腺细胞中表达,B错误;一般情况下,真核生物细胞中,一个启动子只能启动一个基因的转录,C正确;强启动子可使基因高水平表达,启动子的强弱主要取决于其与RNA聚合酶的亲和性,D正确。 2 3 5 6 7 8 9 11 12 1 4 10 13 7.如图是人体个体发育不同时期红细胞中珠蛋白(血红蛋白组成蛋白)基因表达的情况。下列相关叙述正确的是(　　) A.甲基化可能会阻止解旋 酶和RNA聚合酶先后结合 启动子 B.甲基化位点差异导致珠 蛋白基因在时间上发生了选择性表达 C.12周时起γ⁃珠蛋白基因会持续在红细胞内表达 D.ɛ⁃珠蛋白基因和γ⁃珠蛋白基因这对等位基因之间可以发生重组 2 3 5 6 7 8 9 11 12 1 4 10 13 B 解析:启动子是RNA聚合酶识别和结合的位点,可驱动基因转录出mRNA,启动子被甲基化后,甲基化可能会阻止RNA聚合酶结合启动子,A错误;据图可知,胚胎发育至第6周,ε⁃珠蛋白基因表达,γ⁃珠蛋白基因由于启动子发生甲基化不能表达,胚胎发育至第12周,ε⁃珠蛋白基因由于启动子被甲基化不能表达,γ⁃珠蛋白基因表达,说明甲基化位点差异导致珠蛋白基因在时间上发生了选择性表达,B正确;题图显示,胚胎发育至第12周,γ⁃珠蛋白基因表达,据此不能说明12周时起γ⁃珠蛋白基因会持续在红细胞内表达,C错误;ε⁃珠蛋白基因和γ⁃珠蛋白基因位于同一个DNA分子上,不属于等位基因,D错误。 2 3 5 6 7 8 9 11 12 1 4 10 13 8.(2025·广东惠州模拟)图甲为培育转基因生物时选用的载体,图乙是含有目的基因的一段DNA序列,图中标注了相关限制酶的酶切位点。下列叙述错误的是(　　) A.若通过PCR技术提取该目 的基因,应该选用引物甲和引 物丙 B.构建基因表达载体时应选用 BclⅠ和HindⅢ这两种限制酶以及DNA连接酶 C.若将基因表达载体导入大肠杆菌中,需用Ca2+处理大肠杆菌 D.只利用含四环素的培养基就可以直接筛选出成功导入表达载体的受体细胞 2 3 5 6 7 8 9 11 12 1 4 10 13 B 解析:PCR技术要求两种引物分别和目的基因的两条单链结合,沿相反的方向合成子链,故所用的引物组成为图乙中的引物甲和引物丙,A正确;选择的限制酶应在目的基因两端存在识别位点,BamHⅠ会使两种抗性基因被破坏,且Sau3AⅠ在质粒上不存在酶切位点,同时为防止目的基因自身环化,应选BclⅠ和Hind Ⅲ两种限制酶切割,B正确;将目的基因导入微生物大肠杆菌细胞中,需要用Ca2+处理大肠杆菌,使之处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态,C正确;选择的BclⅠ和Hind Ⅲ这两种限制酶作用时会破坏氨苄青霉素抗性基因,但不会破坏四环素抗性基因,因此应该先用含四环素的培养基筛选出含有基因表达载体和普通质粒的大肠杆菌,再用含氨苄青霉素的培养基筛选含重组质粒的大肠杆菌,D错误。 2 3 5 6 7 8 9 11 12 1 4 10 13 9.(多选)OsGLO1、EcCAT、EcGCL和TSR四个基因分别编码四种不同的酶,研究人员将这些基因分别与叶绿体转运肽(引导合成的蛋白质进入叶绿体)基因连接,构建多基因表达载体(载体中部分序列如图所示),利用农杆菌转化法转化水稻,在水稻叶绿体内构建了一条新代谢途径,提高了水稻的产量。下列叙述错误的是(　　) 2 3 5 6 7 8 9 11 12 1 4 10 13 A.可用抗原—抗体杂交技术检测四种酶在转基因水稻中的表达量 B.四个基因转录时都以DNA的同一条单链为模板 C.应选用含卡那霉素的培养基筛选被农杆菌转化的水稻细胞 D.四个基因都在水稻叶绿体内进行转录和翻译 答案:BCD 2 3 5 6 7 8 9 11 12 1 4 10 13 解析:可用抗原—抗体杂交技术检测四种酶在转基因水稻中的表达量,杂交带相对量越多,表明目的基因翻译成的蛋白质含量越高,A正确;由题图可知,在同一个T⁃DNA中OsGLO1的启动子启动转录的方向与其他三个基因的不同,说明四个基因转录时并不都以DNA的同一条单链为模板,B错误;卡那霉素抗性基因不在T⁃DNA中,而潮霉素抗性基因在T⁃DNA中,应选用含潮霉素的培养基筛选被农杆菌转化的水稻细胞,C错误;利用农杆菌转化法转化水稻,可使目的基因插入水稻细胞中染色体的DNA上,所以与叶绿体转运肽基因连接的四个 基因,在水稻细胞核内进行转 录,在核糖体中进行翻译,D错误。 2 3 5 6 7 8 9 11 12 1 4 10 13 10.(多选)(2025·江苏扬州模拟)大肠杆菌经溶菌酶和洗涤剂处理后,拟核DNA就会缠绕在细胞壁碎片上,静置一段时间,质粒分布在上清液中,利用上述原理可初步获得质粒DNA。用三种限制酶处理提取的产物,电泳结果如图所示。下列叙述正确的是(　　) 2 3 5 6 7 8 9 11 12 1 4 10 13 A.可利用DNA在酒精中溶解度较大 的特点来提取质粒DNA B.将提取的DNA溶于2 mol/L NaCl溶 液后,可用二苯胺试剂进行鉴定 C.凝胶中的DNA分子通过染色,可在紫外灯下被检测出来 D.根据电泳结果,质粒上没有限制酶Ⅰ和Ⅱ的切割位点,有限制酶Ⅲ的切割位点 答案:BC 2 3 5 6 7 8 9 11 12 1 4 10 13 解析:蛋白质可溶于酒精,而DNA在冷 酒精中溶解度很低,所以在提取DNA 时加入酒精,使可溶于酒精的蛋白质 等物质溶解,让DNA析出,A错误;由于 DNA在2 mol/L NaCl溶液中溶解度较 大,且在一定温度下,DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色,所以将提取的DNA溶于2 mol/L NaCl溶液后,可用二苯胺试剂在沸水条件下进行鉴定,B正确;凝胶中的DNA分子通过染色,可在紫外灯下出现一定的颜色特征,从而被检测出来,C正确;质粒的本质是环状的DNA,限制酶Ⅰ和Ⅱ处理后电泳只有一条条带,可能是该质粒上有一个切割位点,也可能没有切割位点,D错误。 2 3 5 6 7 8 9 11 12 1 4 10 13 11.(2024·新课标卷)某研究小组将纤维素酶基因(N)插入某种细菌(B1)的基因组中,构建高效降解纤维素的菌株(B2)。该小组在含有N基因的质粒中插入B1基因组的M1与M2片段;再经限制酶切割获得含N基因的片段甲,片段甲两端分别为M1与M2;利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术将片段甲插入B1的基因组,得到菌株B2。酶切位点(Ⅰ~Ⅳ)、引物(P1~P4)的结合位置、片段甲替换区如图所示,→表示引物5'→3'方向。回答下列问题。 2 3 5 6 7 8 9 11 12 1 4 10 13  (1)限制酶切割的化学键是　　 　　。为保证N基因能在菌株B2中表达,在构建片段甲时,应将M1与M2片段分别插入质粒的Ⅰ和Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ酶切位点之间,原因是________________________________________ 　。  解析:限制酶切割的化学键为磷酸二酯键。在构建片段甲时,应将M1与M2片段分别插入质粒的Ⅰ和Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ酶切位点之间,保证基因启动子、终止子完整,从而保证N基因正常表达。 磷酸二酯键　 正常表达 保证基因启动子、终止子完整,从而保证N基因 1 2 3 5 6 7 8 9 11 12 1 4 10 13 (2)CRISPR/Cas9技术可以切割细菌B1基因组中与向导RNA结合的DNA。向导RNA与B1基因组DNA互补配对可以形成的碱基对有G—C和　 　　　。 解析: RNA的碱基组成为A、U、G、C,DNA的碱基组成为A、T、G、C,向导RNA与B1基因组DNA互补配对可以形成的碱基对有G—C和C—G、A—T、U—A。 C—G、A—T、U—A 2 3 5 6 7 8 9 11 12 1 4 10 13 (3)用引物P1和P2进行PCR可验证片段甲插入了细菌B1基因组,所用的模板是　　　 　;若用该模板与引物P3和P4进行PCR,实验结果是　 。  解析: 用引物P1和P2进行PCR可扩增N基因,验证片段甲插入了细菌B1基因组,所用的模板是菌株B2的基因组;用该模板与引物P3和P4进行PCR,因为P3不能与菌株B2基因组的模板链结合,实验结果是不能扩增出DNA片段。 菌株B2的基因组　 不能扩增出目的基因 2 3 5 6 7 8 9 11 12 1 4 10 13 (4)与秸秆焚烧相比,利用高效降解纤维素的细菌处理秸秆的优点是_________________________ (答出2点即可)。 解析: 与秸秆焚烧相比,利用高效降解纤维素的细菌处理秸秆的优点是不污染环境、增加土壤养分。 不污染环境、增加土壤养分 2 3 5 6 7 8 9 11 12 1 4 10 13 12.(2025·江苏扬州模拟)植物蔗糖转运蛋 白(SUT)主要负责植物体内蔗糖的长距离运 输,影响植物的生长和发育,决定作物的产量 和品质。SUT基因家族中的StSUT2基因主要 在花和老叶中表达,科学家借助Gateway克隆 技术通过构建StSUT2植物超表达载体,为初探其功能提供基础。Gateway克隆技术包括TOPO反应和LR反应(如图1、图2所示),ccdB基因编码毒性蛋白,会导致细胞死亡。请回答下列有关问题。 2 3 5 6 7 8 9 11 12 1 4 10 13 (1)从植物的　　　　　　细胞中提取总mRNA,经过　　　　过程获得cDNA,根据　　　　　　　　　　　　　　 设计引物进行PCR扩增,即可获得大量的StSUT2基因。 解析:为获得大量StSUT2基因,应首先从植物的花或老叶细胞中提取总mRNA,通过逆转录过程获得cDNA,然后根据StSUT2基因两端的序列设计两种引物进行PCR扩增,进而获得大量的StSUT2基因。 花或老叶 逆转录 StSUT2基因两端的部分碱基序列 2 3 5 6 7 8 9 11 12 1 4 10 13 (2)利用图1中的TOPO反应可以将目的基因PCR产物连入入门载体,该载体上的相应序列可被拓扑异构酶(TOPO)识别并在相应位点断开 　　　　　键,形成一端为平末端,一端为黏性末端的载体,并将其与拓扑异构酶酶切后的StSUT2基因进行连接。拓扑异构酶与基因工程的____________________功能相似。为确保StSUT2基因定向连接入门载体,在扩增StSUT2基因时,可在引物中引入5'⁃　　　　　⁃3'序列。 磷酸二酯　 限制酶和DNA连接酶 CACC 2 3 5 6 7 8 9 11 12 1 4 10 13 解析: 载体上的相应序列可被拓扑异构酶(TOPO)识别并在相应位点断开磷酸二酯键,形成一端为平末端,一端为黏性末端的载体,并将其与拓扑异构酶酶切后的StSUT2基因进行连接。由此可知拓扑异构酶与基因工程的限制酶和DNA连接酶功能相似。由于目的基因左侧碱基序列为GTGG,因此在扩增StSUT2基因时,可在引物中引入5'⁃CACC⁃3'序列,以确保StSUT2基因定向连接入门载体。 2 3 5 6 7 8 9 11 12 1 4 10 13 (3)图2中LR反应可借助入门载体上的attL位点和目的载体上的attR位点,将入门载体中的目的基因与目的载体中的相应片段实现同源重组,得到含目的基因的目的载体。然后与大肠杆菌混合培养,在培养基中添加适量　　 　　以促进目的基因转化。经上述处理培养后,存活的大肠杆菌中导入的应该是含目的基因的目的载体,而不是目的载体,原因是_____________________________________________________ _______________________________ ____________________________ _____________________________。  CaCl2(Ca2+) 含目的基因的目的载体中无ccdB基因,导入含目的基因的目的载体的大肠杆菌不会死亡) 目的载体中含有ccdB基因,导入目的载体的大肠杆菌会死亡(或 2 3 5 6 7 8 9 11 12 1 4 10 13 解析: 用Ca2+处理后的大肠杆菌会处于能吸收周围环境中DNA分子的生理状态,因此在培养基中添加适量CaCl2可以促进目的基因转化。据题干信息可知,目的载体中含有ccdB基因,ccdB基因编码毒性蛋白,会导致细胞死亡,因此若将目的载体导入大肠杆菌,大肠杆菌会死亡。 2 3 5 6 7 8 9 11 12 1 4 10 13 (4)通过比较含StSUT2基因入门载体的转基因植物细胞、含StSUT2基因超表达载体的转基因植物细胞和非转基因植物细胞中的____________ 　　　　　,从而确定StSUT2基因是否成功超量表达。 解析: 为确定StSUT2基因是否成功超量表达,可通过比较含StSUT2基因入门载体的转基因植物细胞、含StSUT2基因超表达载体的转基因植物细胞和非转基因植物细胞中的StSUT2转运蛋白含量确定结论。 蛋白含量 StSUT2转运 2 3 5 6 7 8 9 11 12 1 4 10 13 13.(2024·福建卷)病毒感染初期,机 体会分泌干扰素并作用于细胞受体 IFNAR来应对感染。麻疹是由麻疹 病毒感染引起的急性传染病。已知 人白细胞分化抗原46(hCD46)是麻疹 病毒入侵细胞的主要受体,小鼠没有该受体,科研人员构建hCD46转基因小鼠用于相关研究,部分流程如图所示。 2 3 5 6 7 8 9 11 12 1 4 10 13 回答下列问题。 (1)利用PCR技术获取目的基因hCD46,复性温度下发生的扩增过程是____________________________________________。 解析:利用PCR技术获取目的基因hCD46,复性温度下发生的变化是两种引物分别与解开的两条模板链进行碱基互补配对,为子链的延伸做准备,即表现为两种引物分别与含hCD46基因的两条模板链结合。 两种引物分别与含hCD46基因的两条模板链结合 2 3 5 6 7 8 9 11 12 1 4 10 13 (2)将hCD46接入质粒应选用的限制酶组合是　　　　　　　。为提高转基因效率,同时避免标记基因进入胚胎体内,应选用_______________ 限制酶组合将重组质粒变为线性DNA。 解析: 结合图示可知,质粒中以及目的基因的两端含有限制酶EcoRⅠ和NotⅠ的识别序列,且这两个序列位于启动子和终止子之间,因此,将hCD46接入质粒应选用的限制酶组合是EcoRⅠ和NotⅠ。为提高转基因效率,同时避免标记基因进入胚胎体内,应选用AgeⅠ和Hind Ⅲ限制酶组合将重组质粒变为线性DNA,因为这两种限制酶可以将重组质粒分为含目的基因的片段和含有标记基因的片段。 EcoRⅠ和NotⅠ AgeⅠ和Hind Ⅲ 2 3 5 6 7 8 9 11 12 1 4 10 13 (3)为获取大量胚胎用于移植,可用激素处理小鼠a,使其　 　　　。将胚胎移植到小鼠c的子宫中,应选用桑葚胚的原因是 ________________ ________。  解析: 为获取大量胚胎用于移植,可用激素处理小鼠a,使其超数排卵,为获取大量的供体胚胎做准备。将胚胎移植到小鼠c的子宫中,通常选用桑葚胚的原因是桑葚胚易于在小鼠子宫着床,进而可以提高胚胎的存活率。 超数排卵 子宫着床 桑葚胚易于在小鼠 2 3 5 6 7 8 9 11 12 1 4 10 13 (4)利用PCR技术对子代小鼠进行hCD46基因检测,应设置不加DNA模板的对照组,目的是________________________________ 。 解析: 利用PCR技术对子代小鼠进行hCD46基因检测,应设置不加DNA模板的对照组作为空白对照,这样可以排除PCR体系中外源DNA的污染,提高实验结果的可信度。 排除PCR体系中外源DNA的污染 2 3 5 6 7 8 9 11 12 1 4 10 13 (5)若能进一步构建既表达hCD46受体又敲除IFNAR基因的小鼠,则该小鼠对麻疹病毒具有高易感性,原因是_____________________________ 　 。  解析:若能进一步构建既表达hCD46受体又敲除IFNAR基因的小鼠,则该转基因小鼠能接受抗原刺激,进而机体会分泌干扰素,但干扰素无法与相应的受体结合,因为转基因小鼠的受体IFNAR无法表达,因而干扰素无法起作用,因此,该小鼠对麻疹病毒具有高易感性。 素无法作用于IFNAR以应对感染 该小鼠能被麻疹病毒感染,且干扰 2 3 5 6 7 8 9 11 12 1 4 10 13 $$