第10单元 第6课时 基因工程的基本工具与操作程序-【优化探究】2026高考生物学一轮复习高考总复习配套课件（人教版单选）

生物技术与工程 第十单元 第6课时　基因工程的基本工具与操作程序 1.阐明DNA重组技术的实现需要利用限制性内切核酸酶、DNA连接酶和载体三种基本工具。2.阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定等步骤。3.DNA的粗提取与鉴定实验。4.利用聚合酶链式反应(PCR)扩增DNA片段并完成电泳鉴定,或运用软件进行虚拟PCR实验。 学习要求 演练感悟 考点三 考点二 真题 课时 巩固提高 考点一 内容索引 NEIRONGSUOYIN 基因工程的基本工具 基因工程的基本操作程序 DNA的粗提取与鉴定、DNA片段的扩增及电泳鉴定 基因工程的基本工具 考点一 归纳 必备知识 1.基因工程的概念 DNA分子 　转基因 2.基因工程的诞生和发展 (1)肺炎链球菌转化实验不仅证明了遗传物质是DNA,还证明了DNA可以在同种生物的不同个体之间_____。 (2)DNA双螺旋结构模型的建立和_____________的证明。 (3)中心法则的确立。 (4)遗传密码的破译。 (5)基因转移载体的发现。 __________________________________的发现为DNA的切割、连接以及功能基因的获得创造了条件。 转移 半保留复制 多种限制酶、DNA连接酶和逆转录酶 归纳 必备知识 (6)DNA体外重组的实现。 (7)重组DNA表达实验的成功。 (8)DNA测序和合成技术的发明。 (9)_____ 技术的发明。 (10)基因组编辑技术可以实现对特定基因的定点插入、敲除或替换。 PCR 归纳 必备知识 3.重组DNA技术的基本工具 (1)限制性内切核酸酶(简称“限制酶”) 原核生物 特定核苷酸序列 磷酸二酯键 归纳 必备知识 提醒:①限制酶作用的化学键只能是磷酸二酯键。②在切割含目的基因的DNA分子时,需用限制酶切割两次,产生4个末端。只有这样,才能使目的基因的两端都有可连接的黏性末端或平末端。 归纳 必备知识 (2)DNA连接酶 磷酸二酯键 远远低于 归纳 必备知识 归纳 必备知识 教材拾遗 (选择性必修3 P72“旁栏思考”改编)DNA连接酶和DNA聚合酶的作用区别是DNA连接酶连接的是两个DNA片段,而DNA聚合酶是将单个脱氧核苷酸依次连接到DNA单链的末端。 (3)载体 噬菌体 受体DNA上 限制酶切割位点 标记 归纳 必备知识 1.基因工程是人工操作导致的染色体变异,变异是不定向的。( ) 2.DNA连接酶可以连接目的基因与载体的氢键,形成重组DNA。 ( ) 3.限制性内切核酸酶、DNA连接酶和质粒是基因工程中常用的三种工具酶。 ( ) 4.质粒通常采用抗生素合成基因作为标记基因。 ( ) × × × × 错漏诊断 深研 核心问题 构建基因表达载体时,需要选择合适的限制酶切割含有目的基因的DNA片段和载体。已知限制性内切核酸酶Ⅰ的识别序列和切点是 ,限制性内切核酸酶Ⅱ的识别序列和切点是 ,根据图示分析并回答下列问题。 (1)请用图示法写出限制性内切核酸酶Ⅰ和限制性内切核酸酶Ⅱ切割后形成黏性末端的过程。 提示: 限制性内切核酸酶Ⅰ: 限制性内切核酸酶Ⅱ: 深研 核心问题 构建基因表达载体时,需要选择合适的限制酶切割含有目的基因的DNA片段和载体。已知限制性内切核酸酶Ⅰ的识别序列和切点是 ,限制性内切核酸酶Ⅱ的识别序列和切点是 ,根据图示分析并回答下列问题。 (2)切割图示中的目的基因和质粒应选用哪类限制酶?请说明理由。 提示: 用限制酶Ⅱ切割目的基因,用限制酶Ⅰ切割质粒。限制酶Ⅰ的识别序列包含限制酶Ⅱ的识别序列,因此限制酶Ⅱ也可切割限制酶Ⅰ的位点,故使用限制酶Ⅱ时,可在目的基因两端同时作切割,从而切出“目的基因”,但若使用限制酶Ⅱ切割质粒,会同时破坏质粒中的两个“标记基因”,故只能使用限制酶Ⅰ切割质粒。 深研 核心问题 构建基因表达载体时,需要选择合适的限制酶切割含有目的基因的DNA片段和载体。已知限制性内切核酸酶Ⅰ的识别序列和切点是 ,限制性内切核酸酶Ⅱ的识别序列和切点是 ,根据图示分析并回答下列问题。 (3)用两种不同的限制酶切割目的基因的优点是什么? 提示: (4)DNA连接酶和DNA聚合酶的作用相同吗? 提示: 防止质粒和目的基因的自身环化及质粒和目的基因的反向连接。 不相同。DNA连接酶连接的是两个DNA片段,而DNA聚合酶连接的是单个的脱氧核苷酸。 深研 核心问题 构建基因表达载体时,需要选择合适的限制酶切割含有目的基因的DNA片段和载体。已知限制性内切核酸酶Ⅰ的识别序列和切点是 ,限制性内切核酸酶Ⅱ的识别序列和切点是 ,根据图示分析并回答下列问题。 (5)实践中常用某些病毒载体作为基因工程工具,除具备普通“质粒载体”的条件外,还应具有的条件是什么? 提示: 对靶细胞具有较高的转化效率;不能增殖,对细胞无害。 1.与DNA有关的几种酶的比较 归纳提升 2.限制酶的选择 (1)不破坏目的基因原则:如图甲中可选择PstⅠ,而不选择SmaⅠ。 (2)保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则:质粒作为载体必须具备标记基因,所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构,如图乙中不选择SmaⅠ。若载体上有多个标记基因,则可合理对其中一些标记基因进行酶切破坏,从而达到比一个标记基因更高的筛选成功率,防止只有一个标记基因时出现的“假阳性”(即未成功导入目的基因的载体也能正常表达标记基因,造成无效筛选)。 (3)善用“双酶切”,注意方向性:目的基因所在序列和载体上存在多种酶切位点时,一般需要选择在目的基因所在序列和载体上都存在切割位点的两种不同的限制酶,对目的基因所在序列和载体进行剪切,即“双酶切法”。其优点和作用:①防止目的基因环化;②避免目的基因与载体反向连接,即用DNA连接酶连接后形成的重组DNA分子上,目的基因和载体启动子的方向(或描述为“RNA聚合酶的移动方向”)必须是相同的,否则目的基因导入后无法正常表达。如图甲、乙也可选择PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶。 (4)巧用“同尾酶”:同尾酶指来源不同,但能产生相同黏性末端的限制酶。当不适合选择某种限制酶时,可用其同尾酶替换,以获得相同的黏性末端。 3.标记基因的作用 标记基因可用于检测目的基因是否导入受体细胞: 命题 考向突破 1.(2023·新课标卷)某同学拟用限制酶(酶1、酶2、酶3 和酶4)、DNA 连接酶为工具,将目的基因(两端含相应限制酶的识别序列和切割位点)和质粒进行切割、连接,以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。 下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是(　　) A.质粒和目的基因都用酶3切割,用E.coli DNA连接酶连接 B.质粒用酶3 切割、目的基因用酶1 切割,用T4 DNA连接酶连接 C.质粒和目的基因都用酶1 和酶2 切割,用T4 DNA连接酶连接 D.质粒和目的基因都用酶2 和酶4 切割,用E.coli DNA连接酶连接 C 解析:酶3切割后得到的是平末端,用T4 DNA连接酶连接效率更高,A错误;质粒用酶3切割后得到平末端,目的基因用酶1切割后得到的是黏性末端,二者不能连接,B错误;质粒和目的基因都用酶1和酶2切割后得到黏性末端,可以用T4 DNA连接酶连接,能保证目的基因在质粒上连接的方向正确,此重组表达载体的构建方案最合理且高效,C正确;若用酶2和酶4切割质粒和目的基因,会破坏质粒上的抗生素抗性基因,连接形成的基因表达载体缺少标记基因,无法进行后续的筛选,D错误。 2.(2025·湖北荆州模拟)质粒是基因工程中最常用的载体,质粒有标记基因(如图所示),通过标记基因可以推知外源基因(目的基因)是否转移成功。质粒上箭头表示三种限制酶的酶切位点。外源基因插入的位置不同,细菌在培养基上的生长情况不同。如表是外源基因插入(插入点有a、b、c)后细菌的生长情况。下列有关叙述正确的是(　　) 项 目 细菌在含氨苄青霉素的培养基上的生长情况 细菌在含四环素的培养基上的生长情况 ① 能生长 不能生长 ② 能生长 能生长 ③ 不能生长 能生长 A.质粒的复制原点上有RNA聚合酶的结合位点 B.①②③三种重组后细菌的外源基因插入点①是a,②是c,③是b C.质粒被一种限制酶切开时,被水解的磷酸二酯键有2个 D.将外源基因与质粒连接时需用DNA聚合酶 答案:C 解析:质粒的复制原点上有DNA聚合酶的结合位点,A错误;①②③三种重组后细菌的外源基因插入点①是b,②是c,③是a,B错误;将外源基因与质粒连接时需用DNA连接酶,D错误。 基因工程的基本操作程序 考点二 归纳 必备知识 1.目的基因的筛选与获取 (1)目的基因:在基因工程的设计和操作中,用于改变受体细胞_____或获 得预期__________等的基因。 (2)筛选合适的目的基因 ①从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法 之一。 ②利用序列数据库和序列比对工具进行筛选。 性状 表达产物 (3)目的基因的获取 ①人工合成目的基因。 ②PCR获取和扩增目的基因 a.PCR(聚合酶链式反应)是一项根据__________________的原理,在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件,对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。 b.PCR反应的条件:一定的缓冲液、DNA模板、2种____、4种__________、__________DNA聚合酶,以及能自动调控温度的仪器。 DNA半保留复制 引物 脱氧核苷酸 耐高温的 归纳 必备知识 c.PCR扩增的过程 d.PCR产物的鉴定:常采用_________________来鉴定。 ③通过构建__________来获取目的基因。 琼脂糖凝胶电泳 基因文库 90 50 引物 72 耐高温的DNA聚合酶 归纳 必备知识 2.基因表达载体的构建——基因工程的核心 (1)目的:让目的基因_______________________________________,同时,使目的基因能够表达和发挥作用。 (2)基因表达载体的组成及作用 在受体细胞中稳定存在,并且遗传给下一代 启动子 　标记基因 归纳 必备知识 项目 位置 作用 启动子 位于DNA分子上 RNA聚合酶识别和结合的部位,启动转录过程 起始密码子 位于mRNA分子上 决定翻译的开始 终止子 位于DNA分子上 决定转录的结束 终止密码子 位于mRNA分子上 决定翻译的结束 归纳 必备知识 提醒:启动子、起始密码子、终止子、终止密码子的辨析 (3)构建过程 归纳 必备知识 3.将目的基因导 入受体细胞 子房 T⁃DNA 染色 体DNA 受精卵 归纳 必备知识 归纳 必备知识 教材拾遗 (选择性必修3 P81“资料卡”)(1)转化:目的基因进入受体细胞内,并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。此处“转化”与肺炎链球菌转化实验中的“转化”含义相同,实质都是基因重组。 (2)农杆菌特点 ①能在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物,而对大多数单子叶植物没有侵染能力,但随着转化方法的突破,用农杆菌侵染水稻、玉米等多种单子叶植物也取得了成功。 ②农杆菌细胞内含有Ti质粒,当它侵染植物细胞后,能将Ti质粒上的T⁃DNA转移到被侵染的细胞,并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。 提醒:农杆菌转化法中涉及的两次拼接和两次导入 第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T⁃DNA上,第二次拼接(非人工操作)是指插入目的基因的T⁃DNA拼接到受体细胞的染色体DNA上;第一次导入是将含目的基因的Ti质粒导入农杆菌,第二次导入(非人工操作)是指含目的基因的T⁃DNA导入受体细胞。 归纳 必备知识 4.目的基因的检测与鉴定 归纳 必备知识 归纳 必备知识 教材拾遗 (选择性必修3 P83“到社会中去”)转基因抗虫棉培育过程中,检测目的基因是否成功表达的常见两种方法是抗原—抗体杂交法、用棉叶饲喂棉铃虫。 1.目的基因一定是编码蛋白质的基因。( ) 2.真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2+激活。因此,PCR反应缓冲 液中一般要添加Mg2+。 ( ) 3.基因表达载体中的启动子和终止子决定着翻译的开始与结束。 ( ) 4.Ti质粒上的T⁃DNA可与植物受体细胞的染色体DNA整合在一起。 ( ) 5.为培育抗除草剂的作物新品种,导入抗除草剂基因时只能以受精卵为受 体。 ( ) 6.检测目的基因是否导入受体细胞可用抗原—抗体杂交技术。 ( ) × √ × √ × × 错漏诊断 深研 核心问题 1.Bt抗虫蛋白基因 (简称Bt基因)是培育转基因抗虫棉较为合适的目的基因,筛选Bt基因后可以利用PCR技术对其进行大量扩增。请回答下列问题。 (1)什么是引物?DNA复制时为什么需要引物? 提示: (2)PCR扩增Bt基因需要知道Bt基因的全部核苷酸序列吗? 提示: 引物是指一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。在DNA扩增时,DNA聚合酶不能从头开始合成DNA,只能从引物的3'端延伸DNA链,因此复制DNA时应加入两种引物。 不需要,只要知道Bt基因两端的部分核苷酸序列即可(以便根据这部分序列合成两种引物)。 深研 核心问题 1.Bt抗虫蛋白基因(简称Bt基因)是培育转基因抗虫棉较为合适的目的基因,筛选Bt基因后可以利用PCR技术对其进行大量扩增。请回答下列问题。 (3)PCR扩增过程中的循环图示与规律 如图所示,若一个Bt毒蛋白基因在PCR 中经过n轮循环,理论上得到多少个 DNA分子?含引物的DNA分子多少个? 含其中一种引物的DNA分子多少个? 同时含两种引物的DNA分子多少个? 共需要消耗多少个引物?含不等长脱氧核苷酸链的DNA分子多少个?含等长脱氧核苷酸链的DNA分子多少个? 提示:   深研 核心问题 2.目的基因导入受体细胞之前,需构建基因表达载体,图甲、乙表示质粒及目的基因所在DNA片段,图中箭头表示相关限制酶的切割位点。 (1)构建基因表达载体时需要使用的工具酶为___________________。  (2)用图中质粒和DNA构建基因表达载体时,不能使用SmaⅠ切割,原因是_______________________________________________________。 限制酶和DNA连接酶 SmaⅠ会破坏质粒的抗生素抗性基因和外源DNA中的目的基因 深研 核心问题 2.目的基因导入受体细胞之前,需构建基因表达载体,图甲、乙表示质粒及目的基因所在DNA片段,图中箭头表示相关限制酶的切割位点。 (3)构建基因表达载体时,可以用EcoRⅠ同时切割质粒和外源DNA,但会导致_______________________________________________等问题,为避免以上问题出现,应使用____________________ _________________两种限制酶。  (4)构建好的基因表达载体在目的基因前要加上_______,其是__________ 识别和结合的部位。  目的基因和质粒的自身环化、目的基 因不能正向连接 BamHⅠ和HindⅢ(或 EcoRⅠ和HindⅢ) 启动子 RNA聚合酶 3.如图为利用农杆菌转化法制备转基因植物的过程图,据图回答下列问题。 深研 核心问题 (1)在用农杆菌转化法将目的基因导入植物细胞的过程中,一定要将目的基因插入Ti质粒的T⁃DNA上的原因是什么? 提示: 原因是农杆菌中的Ti质粒上的T⁃DNA可转移至被侵染的细胞,并且整合到该细胞的染色体DNA上。 3.如图为利用农杆菌转化法制备转基因植物的过程图,据图回答下列问题。 深研 核心问题 (2)将基因表达载体导入农杆菌细胞时,应怎样处理农杆菌细胞? 提示: 基因表达载体(重组质粒)导入农杆菌细胞时,要用Ca2+处理农杆菌细胞,使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。 3.如图为利用农杆菌转化法制备转基因植物的过程图,据图回答下列问题。 深研 核心问题 (3)植物基因工程常用的受体细胞为什么是体细胞,而动物基因工程一般只用受精卵? 提示: 植物体细胞的全能性较高,可经植物组织培养过程形成完整植物体,因此受体细胞可以是体细胞;动物体细胞的全能性受到严格限制,因此动物基因工程中的受体细胞一般只用受精卵。 3.如图为利用农杆菌转化法制备转基因植物的过程图,据图回答下列问题。 深研 核心问题 (4)大肠杆菌和酵母菌在基因工程中都可以作为受体细胞,但用于生产需要加工和分泌的蛋白质时酵母菌更有优势,为什么? 提示: 大肠杆菌为原核细胞,而酵母菌为真核细胞(具有多种细胞器),所以酵母菌在用于生产需要加工和分泌的蛋白质时比大肠杆菌有优势。 1.PCR技术与体内DNA复制的比较 归纳提升 2.根据Ti质粒的T⁃DNA片段选择限制酶,图中甲、乙、丁Ti质粒均不宜选取,而丙Ti质粒宜选取(设切割目的基因的限制酶为XbaⅠ和SacⅠ)。 3.筛选出含有目的基因的受体细胞 (1)原理:将目的基因插入含有两种抗生素抗性基因的载体时,如果插入某种抗生素抗性基因内部,则会导致该抗生素抗性基因失活。如图,目的基因插入四环素抗性基因内部,则四环素抗性基因失活。 (2)被转化的细菌有三种:含环状目的基因的细菌、含重组质粒的细菌、含自身环化质粒的细菌。 (3)筛选方法:将混合处理后的细菌先放在含氨苄青霉素的培养基上培养,能生长的是含重组质粒的细菌和含自身环化质粒的细菌,如图1、2、3、4、5菌落,再利用无菌的绒布影印到含有四环素的培养基上,如图能生长的菌落为2、3、4,则在含四环素培养基上不生长的即为含有目的基因的菌落(1、5菌落)。最后,可在含氨苄青霉素的培养基上挑取1、5菌落进行培养。 命题 考向突破 1.(2025·黑龙江大庆模拟)利用PCR技术扩增目的基因,其原理与细胞内DNA复制类似,过程如图所示。图中引物为单链DNA片段,它是子链合成延伸的基础。下列叙述错误的是(　　) A.引物A、B不能进行碱基互补配对 B.复性的目的是让引物与单链DNA相结合 C.延伸时,DNA聚合酶从引物的3'端连接脱氧核苷酸 D.第二轮循环后,同时含有引物A、B的DNA占100% D 解析:如果引物A和引物B发生碱基互补配 对则不能与相应模板链结合,无法完成子 链的延伸,故引物A、B不能进行碱基互补 配对,A正确;复性的目的是让引物通过碱 基互补配对与单链DNA结合,B正确;延伸 时,在DNA聚合酶的作用下,将4种脱氧核苷酸连接到引物的3'端,C正确;DNA复制为半保留复制,第二轮循环即DNA复制2次,共形成22=4个DNA分子,其中含有最初模板链的2个DNA分子只含有引物A或引物B,其余2个DNA分子均含有引物A和引物B,所以第二轮循环产物中同时含有引物A和引物B的DNA片段占50%,D错误。 2.(2024·重庆卷)大豆是重要的粮油作物,提高大豆产量是我国农业领域的重要任务。我国研究人员发现,基因S在大豆品种DN(种子较大)中的表达量高于品种TL(种子较小),然后克隆了该基因(两品种中基因S序列无差异)及其上游的启动子序列,并开展相关研究。 (1)基因S启动子的基本组成单位是___________________________。  脱氧核糖核苷酸(脱氧核苷酸) 解析:启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位,用于启动DNA的转录,是一段DNA片段,其基本组成单位是四种脱氧核糖核苷酸。 (2)通过基因工程方法,将DN克隆的“启动子D+基因S”序列导入无基因S的优质大豆品种YZ。根据如图所示信息(不考虑未标明序列)判断构建重组表达载体时,为保证目标序列的完整性,不宜使用的限制酶是_______;此外,不宜同时选用酶SpeⅠ和XbaⅠ,原因是___________________________________ __________________________________________。  EcoRⅠ 酶切后形成的片段黏性末端相同,易自身环化;不能保证目的基因片段与载体正向连接 解析: 根据图示信息可知,“启动子D+基因S”的DNA序列上存在EcoRⅠ的识别序列,若使用限制酶EcoRⅠ,会使目的基因序列被破坏。根据图中限制酶的识别序列可知,SpeⅠ和XbaⅠ切割产生的黏性末端相同,若用这两种限制酶切割,形成的DNA片段在构建基因表达载体时,容易出现自身环化,以及无法保证目的基因片段与载体正向连接,影响目的基因在受体细胞中的表达。 (3)为验证“启动子D+基因S”是否连接在表达载体上,可用限制酶对重组表达载体酶切后进行电泳。电泳时,对照样品除指示分子大小的标准参照物外,还应有_______________________________________________。  经验证的重组表达载体需转入农杆菌,检测转入是否成功的技术是______。  酶切后的空载体片段和“启动子D+基因S”片段 PCR 解析: DNA电泳可以分离不同大小的DNA片段,用限制酶对重组表达载体酶切后的产物不仅有“启动子D+基因S”片段,还有酶切后的空载体片段,因此电泳时,对照样品除指示分子大小的标准参照物外,还应有酶切后的空载体片段和“启动子D+基因S”片段。在分子水平上检测目的基因是否转入成功可通过PCR等技术检测受体细胞的DNA上是否插入目的基因或目的基因是否转录出mRNA。 (4)用检测后的农杆菌转化大豆品种YZ所得再生植株YZ⁃1的种子变大。同时将从TL克隆的“启动子T+基因S”序列成功导入YZ,所得再生植株YZ⁃2的种子也变大,但小于YZ⁃1。综合分析,大豆品种DN较TL种子大的原因是________________________________________________________ ______________。  大豆品种DN的基因S上游启动子效应比TL强,使得基因S表达量更高,种子更大 解析: 根据题目信息可知,再生植株YZ⁃1导入的目的基因为取自大豆品种DN的“启动子D+基因S”序列,再生植株YZ⁃2导入的目的基因为取自品种TL的“启动子T+基因S”序列,结合题目信息“两品种中基因S序列无差异”可推测,大豆品种DN的基因S上游的启动子D的效应强于TL的启动子T,启动子D使基因S表达量更高,因而种子更大。 DNA的粗提取与鉴定、DNA片段的扩增及电泳鉴定 考点三 归纳 必备知识 1.DNA粗提取与鉴定 (1)基本原理 2 mol/L 　二苯胺 (2)操作流程 95% 　沸水 归纳 必备知识 提醒:加入酒精和用玻璃棒搅拌时,动作要轻缓,以免加剧DNA分子的断 裂,导致DNA分子不能形成丝状沉淀。 归纳 必备知识 2.DNA片段的扩增及电泳鉴定 (1)实验原理 ①PCR原理:利用了_______________原理,通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。 ②电泳原理:DNA分子具有可解离的基团,在一定的pH下,这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下,这些带电分子会向着与它所带电荷_____的电极移动,这个过程就是电泳。 ③PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的_____________等有关。 DNA的热变性 相反 大小和构象 归纳 必备知识 (2)实验步骤 离心管 归纳 必备知识 (3)DNA的电泳鉴定 微量移液器灯 紫外灯 归纳 必备知识 提醒:①为避免外源DNA等因素的污染,PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。 ②在向微量离心管中添加反应组分时,每吸取一种试剂后,移液器上的枪头都必须更换,避免试剂的污染。 ③电泳时,DNA的相对分子量越大,迁移速率越慢;DNA的相对分子量越小,迁移速率越快。 归纳 必备知识 (1)本实验不能用哺乳动物成熟的红细胞作为实验材料,原因是__________________________________________________。  (2)在DNA的粗提取与鉴定实验中,实验过程中要充分地搅拌和研磨,如果研磨不充分,会对实验结果产生怎样的影响? 提示: 1.思考并回答下列有关DNA粗提取与鉴定的问题。 深研 核心问题 哺乳动物成熟的红细胞无细胞核和其他细胞器(无DNA) 研磨不充分会使细胞核内的DNA释放不完全,提取的DNA量变少,导致看不到丝状物或沉淀物,用二苯胺试剂鉴定不显示蓝色。 (1)DNA的电泳鉴定实验中,影响DNA分子迁移速率的因素有哪些? 提示: (2)电泳鉴定结果的分析:凝胶中的DNA分子通过染色,可以在波长为________的紫外灯下被检测出来。  ①成功扩增出DNA片段的判断依据是____ ________________________________。  ②进行电泳鉴定的结果应该是____条条带。 如图所示,该片段大小约为_____ bp。 深研 核心问题 2.请回答下列有关DNA片段的扩增及电泳鉴定的问题。 300 nm　 可以 在紫外灯下直接观察到DNA条带 一　 750 凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等。 深研 核心问题 2.请回答下列有关DNA片段的扩增及电泳鉴定的问题。 (3)若操作者进行电泳鉴定的结果不止一条条带,请分析产生这个结果的可能原因。 提示: 操作过程中混入限制酶将DNA片段切割成片段或含有其他DNA片段,以此为模板进行了扩增。 命题 考向突破 1.(2024·安徽卷)下列关于“DNA粗提取与鉴定”实验的叙述,错误的是 (　　) A.实验中如果将研磨液更换为蒸馏水,DNA提取的效率会降低 B.利用DNA和蛋白质在酒精中的溶解度差异,可以初步分离DNA C.DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同,该原理可用于纯化DNA粗提物 D.将溶解的DNA粗提物与二苯胺试剂反应,可以检测溶液中是否含有蛋白质杂质 D 解析:研磨液有利于DNA的溶解,换为蒸馏水,DNA提取的效率会降低,A正确;DNA不溶于酒精溶液,但细胞中的某些蛋白质溶于酒精,可分离DNA,B正确;DNA在NaCl溶液中的溶解度随着NaCl浓度的变化而改变,因此可用不同浓度的NaCl溶液对DNA进行粗提取,C正确;在沸水浴的条件下,DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色,因此二苯胺试剂用于鉴定DNA,D错误。 2.(2024·辽宁卷)关于采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物的实验,下列叙述正确的是(　　) A.琼脂糖凝胶浓度的选择需考虑待分离DNA片段的大小 B.凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示DNA分子的具体位置 C.在同一电场作用下,DNA片段越大,向负极迁移速率越快 D.琼脂糖凝胶中的DNA分子可以在紫光灯下被检测出来 A 解析:琼脂糖凝胶的浓度会影响DNA分子在凝胶中的迁移率和分辨率,琼脂糖凝胶的浓度通常是根据所需分离的DNA片段大小来选择的。对于较大的DNA片段,比如基因组DNA或质粒DNA,通常选择较低浓度的琼脂糖凝胶,因为它们需要更大的孔径来有效迁移。而对于较小的DNA片段,比如PCR产物或酶切片段,则需要选择较高浓度的琼脂糖凝胶,以提供更好的分辨率和分离效果,A正确;凝胶载样缓冲液指示剂通常是一种颜色较深的染料,可以作为电泳进度的指示分子,当溴酚蓝到凝胶2/3处时(可看蓝色条带),则停止电泳,B错误;在琼脂糖凝胶电泳中,当电场作用时,DNA片段实际上是向正极迁移的,而不是向负极迁移。同时,DNA片段的迁移速率与其大小成反比,即DNA片段越大,迁移速率越慢,C错误;琼脂糖凝胶中的DNA分子染色后,可在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来,D错误。 3.(2025·河北保定模拟)用PCR方法检测转基因植株是否成功导入目的基因时,得到电泳图谱如图所示,其中1号为DNA标准样液(Marker),2~10号为PCR产物;其中2号的模板为野生型植株DNA,3~9号的模板为转基因植株的DNA,10号使用蒸馏水代替模板DNA。PCR时加入的模板DNA如图所示。据此作出的分析不合理的是(　　) A.PCR产物的分子大小在250至500 bp之间 B.3号样品植株导入的目的基因一定能成功表达 C.9号样品对应植株不是所需的转基因植株 D.10号的电泳结果能确定反应体系等对实验结果没有干扰 答案:B 解析:PCR过程中,可以通过设计特定的引物来扩增特定的DNA片段。3~9号是转基因植株,理论上应包含目的基因,结合2号野生型植株和10号蒸馏水组的结果,推测包含目的基因的片段大小应为250~500 bp,A合理;3号PCR结果包含250~500 bp片段,包含目的基因,但导入的目的基因不一定能成功表达,B不合理;9号PCR结果不包含250~500 bp片段,所以不是所需转基因植株,C合理;10号放入蒸馏水,可排除反应体系等对实验结果的干扰,D合理。 真题　演练感悟 2 3 1 4 1.(2024·湖南卷,改编)最早的双脱氧测序法是PCR反应体系中,分别再加入一种少量的双脱氧核苷三磷酸(ddATP、ddCTP、ddGTP或ddTTP),子链延伸时,双脱氧核苷三磷酸也遵循碱基互补酸对原则。以加入ddATP的体系为例:若配对的为ddATP,延伸终止;若配对的为脱氧腺苷三磷酸(dATP),继续延伸;PCR产物变性后电泳检测。通过该方法测序某疾病患者及对照个体的一段序列,结果如图所示。下列叙述正确的是(　　) 2 3 1 4 A.上述PCR反应体系中加入二种引物 B.电泳时产物的片段越小,迁移速率越慢 C.5'⁃CTACCCGTGAT⁃3'为对照个体的一段序列 D.患者该段序列中某位点的碱基C突变为G 答案:C 2 3 1 4 解析:利用双脱氧测序法时,PCR反应体系中加入的模板是待测的单链DNA,故只需加入一种引物,A错误;电泳时,产物的片段越大,迁移速率越慢,B错误;依据分析中双脱氧测序法的原理,可以确定每个泳道中的条带(DNA片段)的3'终端的碱基,如+ddATP的泳道中出现的条带(DNA片段)的3'终端碱基就是A。另外由于每个片段的起始点相同,但终止点不同,因此可以通过比较片段的长度来确定DNA序列中每个位置上的碱基;图示电泳方向为从上→下,即对应的DNA片段为长→短,则对应的DNA测序结果为3'→5',由图可知对照个体的电泳结果最短的条带为+ddCTP泳道组的条带,说明该DNA片段5'端第一个碱基为C,因此对照个体的测序结果为5'⁃CTACCCGTGAT⁃3',患者的测序结果为5'⁃CTACCTGTGAT⁃3',C正确;对比患者和对照个体的测序结果可知,患者该段序列中某位点的碱基C突变为T,D错误。 2 3 1 4 2.(2024·湖南卷)某同学将质粒DNA进行限制酶酶切时,发现DNA完全没有被酶切,分析可能的原因并提出解决方法。下列叙述错误的是(　　) A.限制酶失活,更换新的限制酶 B.酶切条件不合适,调整反应条件如温度和酶的用量等 C.质粒DNA突变导致酶识别位点缺失,更换正常质粒DNA D.酶切位点被甲基化修饰,换用对DNA甲基化不敏感的限制酶 B 2 3 1 4 解析:限制酶失活会使DNA完全不被酶切,此时应更换新的限制酶,A正确;酶切条件不合适通常会使切割效果下降,甚至酶失活不发挥作用,此时应调整反应条件如温度和pH等,调整酶的用量没有作用,B错误;质粒DNA突变会导致限制酶识别位点缺失,进而造成限制酶无法进行切割,此时应更换为正常质粒,C正确;质粒DNA上酶切位点被甲基化修饰,会导致对DNA甲基化敏感的限制酶无法进行酶切,此时应换用对DNA甲基化不敏感的限制酶,D正确。 2 3 1 4 3.(2024·山东卷)关于“DNA的粗提取与鉴定”实验,下列说法正确的是 (　　) A.整个提取过程中可以不使用离心机 B.研磨液在4 ℃冰箱中放置几分钟后,应充分摇匀再倒入烧杯中 C.鉴定过程中DNA双螺旋结构不发生改变 D.仅设置一个对照组不能排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰 A 2 3 1 4 解析:在DNA的粗提取与鉴定实验中,可将获得的研磨液用纱布过滤后,在4 ℃的冰箱中放置几分钟,再取上清液,也可以直接将研磨液用离心机离心后取上清液,A正确;研磨液在4 ℃冰箱中放置几分钟后,DNA在上清液中,应取上清液倒入烧杯中,B错误;鉴定过程中用沸水浴加热,DNA双螺旋结构会发生改变,C错误;加入二苯胺试剂后沸水浴处理的时间要在5分钟以上,且要等到冷却后再观察结果,这样才可以观察到较为明显的显色反应,仅设置一个对照组可以排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰,D错误。 2 3 1 4 4.(2024·新课标卷)某研究小组将纤维素酶基因(N)插入某种细菌(B1)的基因组中,构建高效降解纤维素的菌株(B2)。该小组在含有N基因的质粒中插入B1基因组的M1与M2片段;再经限制酶切割获得含N基因的片段甲,片段甲两端分别为M1与M2;利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术将片段甲插入B1的基因组,得到菌株B2。酶切位点(Ⅰ~Ⅳ)、引物(P1~P4)的结合位置、片段甲替换区如图所示,→表示引物5'→3'方向。回答下列问题。 2 3 1 4 (1)限制酶切割的化学键是___________。为保证N基因能在菌株B2中表达,在构建片段甲时,应将M1与M2片段分别插入质粒的Ⅰ和Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ酶切位点之间,原因是________________________________________________。  磷酸二酯键 保证基因启动子、终止子完整,从而保证N基因正常表达 解析:限制酶切割的化学键为磷酸二酯键。在构建片段甲时,应将M1与M2片段分别插入质粒的Ⅰ和Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ酶切位点之间,保证基因启动子、终止子完整,从而保证N基因正常表达。 2 3 1 4 (2)CRISPR/Cas9技术可以切割细菌B1基因组中与向导RNA结合的DNA。向导RNA与B1基因组DNA互补配对可以形成的碱基对有G—C和_____________________。  C—G、A—T、U—A 解析: RNA的碱基组成为A、U、G、C,DNA的碱基组成为A、T、G、C,向导RNA与B1基因组DNA互补配对可以形成的碱基对有G—C和C—G、A—T、U—A。 2 3 1 4 (3)用引物P1和P2进行PCR可验证片段甲插入了细菌B1基因组,所用的模板是________________;若用该模板与引物P3和P4进行PCR,实验结果是____________________。  不能扩增出目的基因 菌株B2的基因组 解析: 用引物P1和P2进行PCR可扩增N基因,验证片段甲插入了细菌B1基因组,所用的模板是菌株B2的基因组;用该模板与引物P3和P4进行PCR, 因为P3不能与菌株B2基因组的模板链结合,实验结果是不能扩增出DNA片段。 2 3 1 4 (4)与秸秆焚烧相比,利用高效降解纤维素的细菌处理秸秆的优点是__________________________ (答出2点即可)。 不污染环境、增加土壤养分 解析: 与秸秆焚烧相比,利用高效降解纤维素的细菌处理秸秆的优点是不污染环境、增加土壤养分。 课时 巩固提高 95 2 3 5 6 7 8 9 11 12 1 4 10 13 1.(2025·河南郑州模拟)下列关于基因工程的叙述,不正确的是(　　) A.基因工程的生物学原理是基因重组 B.通过基因工程技术能够定向改造生物的遗传性状 C.基因的“分子缝合针”是DNA连接酶 D.基因工程中常用的载体质粒在动植物细胞广泛存在 D 2 3 5 6 7 8 9 11 12 1 4 10 13 解析:基因工程的核心是构建重组的DNA分子,因此早期也将基因工程称为重组DNA技术,即基因工程的生物学原理是基因重组,A正确;基因工程能按照人们的意愿,定向创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品,故基因工程技术能够定向改造生物的遗传性状,B正确;基因工程的常用工具有限制酶、DNA连接酶和载体,其中DNA连接酶是基因的“分子缝合针”,C正确;基因工程中常用的载体质粒存在于许多细菌和酵母菌等生物中,D错误。 2 3 5 6 7 8 9 11 12 1 4 10 13 D 2.(2025·辽宁抚顺模拟)限制性内切核酸酶HindⅢ和XhoⅠ的识别序列及切割位点分别为GCTT和CGAG,下列相关叙述正确的是(　　) A.两种限制酶是在同一种生物中分离出来的 B.两种限制酶切割DNA形成的黏性末端相同 C.用Hind Ⅲ酶切割含目的基因的DNA片段和用XhoⅠ酶切割质粒后,目的基因和质粒能连接成重组质粒 D.实验中可通过控制反应时间、酶的浓度等控制酶切效果 2 3 5 6 7 8 9 11 12 1 4 10 13 解析:限制酶命名是用生物属名的头一个字母与种名的头两个字母组成的,由此可知HindⅢ和XhoⅠ是从不同的生物中分离得到的,A错误;两种限制酶识别和切割的序列分别为GCTT和CGAG,则两者切割后形成的黏性末端分别是AGCT—、TCGA—,B错误;两种限制酶切割形成的黏性末端不同,无法连接成重组质粒,C错误。 2 3 5 6 7 8 9 11 12 1 4 10 13 3.如图为某种质粒的简图,小箭头所指分别为限制性内切核酸酶EcoRⅠ、BamHⅠ的酶切位点,P为转录的启动部位。已知目的基因的两端有EcoRⅠ、BamHⅠ的酶切位点,受体细胞为无任何抗药性的原核细胞。下列有关叙述正确的是(　　) 2 3 5 6 7 8 9 11 12 1 4 10 13 A.将含有目的基因的DNA与质粒分别用EcoRⅠ酶切,在DNA连接酶作用下,生成的由两个DNA片段连接形成的产物有两种 B.DNA连接酶的作用是将酶切后得到的黏性末端连接起来,形成一个重组质粒时形成两个磷酸二酯键 C.为了防止目的基因反向连接和质粒自身环化,酶切时可选用的酶是EcoRⅠ和BamHⅠ D.能在含青霉素的培养基中生长的受体细胞中已成功导入该目的基因 答案:C 2 3 5 6 7 8 9 11 12 1 4 10 13 解析:根据题意,目的基因的两端有EcoRⅠ、BamHⅠ的酶切位点,将含有目的基因的DNA用EcoRⅠ酶切,会得到目的基因片段;根据质粒的简图可知,将质粒用EcoRⅠ酶切,会得到与质粒周长等长的链状DNA;因此将含有目的基因的DNA与质粒分别用EcoRⅠ酶切,在DNA连接酶作用下,可生成目的基因—目的基因片段、目的基因—质粒片段、质粒—质粒片段正反连接共六种产物,A错误;DNA连接酶的作用是将酶切后得到的黏性末端或平末端连接起来,形成一个重组质粒,该过程形成四个磷酸二酯键,B错误;EcoRⅠ和BamHⅠ的识别序列不同,获取目的基因和切割质粒时,同时选用EcoRⅠ和BamHⅠ切割,目的基因两端形成的末端不同,切割后的质粒两端形成的末端不同,再用DNA连接酶连接,可以防止目的基因反向连接和质粒自身环化,C正确;导入普通质粒的大肠杆菌和导入重组质粒的大肠杆菌都能在含青霉素的培养基中生长,因此能在含青霉素的培养基中生长的受体细胞不一定含有目的基因,D错误。 2 3 5 6 7 8 9 11 12 1 4 10 13 4.(2025·湖北十堰模拟)作为基因工程的运输工具——载体,必须具备的条件及理由是(　　) A.具有多个限制酶切点,以便于目的基因的表达 B.具有某些标记基因,以使目的基因能够与其结合 C.能够在宿主细胞中稳定地保存下来并大量复制,以便目的基因能够稳定的存在和扩大数量 D.对宿主细胞无伤害,以便于重组DNA的鉴定和选择 C 2 3 5 6 7 8 9 11 12 1 4 10 13 解析:质粒等载体应具有多个限制酶切点,以便于目的基因的插入,A错误;质粒等载体应具有某些标记基因,以便于重组DNA的筛选,B、D错误;质粒等载体应能够在宿主细胞中稳定地保存下来并大量复制,以便目的基因能够稳定的存在和扩大数量,C正确。 2 3 5 6 7 8 9 11 12 1 4 10 13 5.(2025·山东菏泽模拟)下列关于“DNA的粗提取与鉴定”“DNA片段的扩增与电泳鉴定”实验的叙述,错误的是(　　) A.选取新鲜的菜花作为材料进行研磨是因为其DNA含量高 B.研磨时需加入缓冲液,防止DNA在pH发生变化时降解或变性 C.在凝胶中,DNA分子的迁移速率与DNA分子的大小、构象等有关 D.PCR产物出现拖尾可能是非特异性扩增过多,可适当降低复性温度 D 2 3 5 6 7 8 9 11 12 1 4 10 13 解析:新鲜的菜花DNA含量丰富,易获取,可以作为DNA粗提取的材料,A正确;研磨时需加入缓冲液,稳定溶液pH,防止DNA在pH发生变化时降解或变性,B正确;电泳鉴定DNA利用的原理是DNA在电场的作用下,会向着与它所带电荷相反的电极移动,在凝胶中,DNA分子的迁移速率与凝胶浓度、DNA分子的大小、构象等有关,C正确;复性温度越低,引物和底物越容易结合,错配情况增多,造成PCR特异性降低,故PCR产物出现拖尾可能是非特异性扩增过多,可适当提高复性温度,D错误。 2 3 5 6 7 8 9 11 12 1 4 10 13 6.(2025·河南洛阳模拟)如图表示PCR过程中某个阶段反应体系的情况,①②③④表示相关物质,L、R表示方向。下列叙述正确的是(　　) A.②链从L到R的方向为3'→5',①②链均可作为子链合成的模板 B.PCR过程需要通过解旋酶断开氢键,且为边解旋边复制 C.以1个DNA为模板经3次循环需消耗8个引物③ D.物质③的5'端添加了某序列,至少需经2次循环才可获得该序列的双链产物 D 2 3 5 6 7 8 9 11 12 1 4 10 13 解析:根据DNA分子中两条链的反向平行关系可判断,②链从L到R的方向为5'→3',题图中①②链均可作为子链合成的模板,A错误;PCR过程需要通过高温处理使双链中氢键断裂成为单链,再通过降温使子链和引物之间形成双链结构,而后调节温度使子链沿着引物的3'端延伸,B错误;以1个DNA为模板经3次循环产生的DNA分子数目为23=8 个,则需消耗引物③的数目为(8×2-2)÷2=7 个,C错误;物质③的5'端添加了某序列,至少需经2次循环才可获得以该序列为模板合成的双链产物,D正确。 2 3 5 6 7 8 9 11 12 1 4 10 13 7.(2025·安徽蚌埠模拟)土壤农杆菌侵染植物细胞时,Ti质粒上的T⁃DNA片段转入植物的基因组。利用农杆菌以Ti质粒作为载体进行转基因,下列相关叙述正确的是(　　) A.目的基因应插入T⁃DNA片段外,以防止破坏T⁃DNA B.用Ca2+处理农杆菌,以利于其侵染植物细胞 C.Ti质粒是一种环状DNA分子,没有双螺旋结构 D.可以用PCR技术检测外源DNA是否整合到植物的染色体DNA上 D 2 3 5 6 7 8 9 11 12 1 4 10 13 解析:在农杆菌转化法中,需要将目的基因插入T⁃DNA片段上,有利于介导外源DNA整合到植物的染色体DNA上,A错误;农杆菌侵染植物细胞不需要用Ca2+处理,B错误;Ti质粒是一种环状DNA分子,是存在于细菌细胞质中的DNA,具有双螺旋结构,C错误;可以用PCR技术检测外源DNA是否整合到植物的染色体DNA上,D正确。 2 3 5 6 7 8 9 11 12 1 4 10 13 8.(2025·广东深圳模拟)用氨苄青霉素抗性基因 (AmpR)、四环素抗性基因(TetR)作为标记基因构 建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片 段和用不同限制酶酶切后的质粒,构建基因表达载体(重组质粒),并导入受体菌中。根据题目所提供的信息,下列叙述正确的是(　　) A.若用Hind Ⅲ酶切质粒和目的基因,转录的产物可能不同 B.若用Hind Ⅲ和ScaⅠ酶切,一定可防止目的基因与质粒的反向连接 C.若用PvuⅠ酶切,在含四环素的培养基中形成的菌落,一定含有目的基因 D.若用SphⅠ酶切,筛选时应先将转化处理的菌液涂布到含四环素的培养基中长成菌落,再影印接种到含氨苄青霉素的培养基中 A 2 3 5 6 7 8 9 11 12 1 4 10 13 解析:若用Hind Ⅲ酶切质粒,目的基因可能正向插入,也可能反向插入,转录的产物可能不同,A正确;由于质粒中有2个ScaⅠ酶的切割位点,因而用Hind Ⅲ和ScaⅠ酶切不一定能防止目的基因与质粒的反向连接,B错误;用PvuⅠ酶切会破坏氨苄青霉素抗性基因,则重组质粒中只有四环素抗性基因,因此成功导入重组质粒的受体细胞具有对四环素的抗性,同时若导入的是不含目的基因的空质粒,受体细胞依然具有对四环素的抗性,故在含四环素的培养基中形成的菌落,不一定含有目的基因,C错误;用SphⅠ酶切会破坏四环素抗性基因(TetR),氨苄青霉素抗性基因(AmpR)不受影响,即重组质粒中含氨苄青霉素抗性基因(AmpR),因此携带目的基因的受体菌在含氨苄青霉素的培养基中能形成菌落,在含四环素的培养基中不能形成菌落,因此,筛选时应先将转化处理的菌液涂布到含氨苄青霉素的培养基中长成菌落,再影印接种到含四环素的培养基中,即只在含氨苄青霉素的培养基上生长的菌落为目的菌,D错误。 2 3 5 6 7 8 9 11 12 1 4 10 13 9.(2025·广东惠州模拟)图甲为培育转基因生物时选用的载体,图乙是含有目的基因的一段DNA序列,图中标注了相关限制酶的酶切位点。下列叙述错误的是(　　) A.若通过PCR技术提取该目的基因,应该选用引物甲和引物丙 B.构建基因表达载体时应选用BclⅠ和HindⅢ这两种限制酶以及DNA连接酶 C.若将基因表达载体导入大肠杆菌中,需用Ca2+处理大肠杆菌 D.只利用含四环素的培养基就可以直接筛选出成功导入表达载体的受体细胞 D 2 3 5 6 7 8 9 11 12 1 4 10 13 解析:PCR技术要求两种引物分别和目的基因的两条单链结合,沿相反的方向合成子链,故所用的引物组成为图乙中的引物甲和引物丙,A正确;选择的限制酶应在目的基因两端存在识别位点,BamHⅠ会使两种抗性基因被破坏,且Sau3AⅠ在质粒上不存在酶切位点,同时为防止目的基因自身环化,应选BclⅠ和Hind Ⅲ两种限制酶切割,B正确;将目的基因导入微生物大肠杆菌细胞中,需要用Ca2+处理大肠杆菌,使之处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态,C正确;选择的BclⅠ和Hind Ⅲ这两种限制酶作用时会破坏氨苄青霉素抗性基因,但不会破坏四环素抗性基因,因此应该先用含四环素的培养基筛选出含有基因表达载体和普通质粒的大肠杆菌,再用含氨苄青霉素的培养基筛选含重组质粒的大肠杆菌,D错误。 2 3 5 6 7 8 9 11 12 1 4 10 13 10.(2025·北京海淀模拟)OsGLO1、EcCAT、EcGCL和TSR四个基因分别编码四种不同的酶,研究人员将这些基因分别与叶绿体转运肽(引导合成的蛋白质进入叶绿体)基因连接,构建多基因表达载体(载体中部分序列如图所示),利用农杆菌转化法转化水稻,在水稻叶绿体内构建了一条新代谢途径,提高了水稻的产量。下列叙述正确的是 (　　) 2 3 5 6 7 8 9 11 12 1 4 10 13 A.可用抗原—抗体杂交技术检测四种酶在转基因水稻中的表达量 B.四个基因转录时都以DNA的同一条单链为模板 C.应选用含卡那霉素的培养基筛选被农杆菌转化的水稻细胞 D.四个基因都在水稻叶绿体内进行转录和翻译 答案:A 2 3 5 6 7 8 9 11 12 1 4 10 13 解析:可用抗原—抗体杂交技术检测四种酶在转基因水稻中的表达量,杂交带相对量越多,表明目的基因翻译成的蛋白质含量越高,A正确;由题图可知,在同一个T⁃DNA中OsGLO1的启动子启动转录的方向与其他三个基因的不同,说明四个基因转录时并不都以DNA的同一条单链为模板,B错误;卡那霉素抗性基因不在T⁃DNA中,而潮霉素抗性基因在T⁃DNA中,应选用含潮霉素的培养基筛选被农杆菌转化的水稻细胞,C错误;利用农杆菌转化法转化水稻,可使目的基因插入水稻细胞中染色体的DNA上,所以与叶绿体转运肽基因连接的四个基因,在水稻细胞核内进行转录,在核糖体中进行翻译,D错误。 2 3 5 6 7 8 9 11 12 1 4 10 13 11.(2025·广东佛山模拟)枯草芽孢杆菌可分泌纤维素酶。研究者筛选到一株降解纤维素能力较强的枯草芽孢杆菌菌株(B菌),从中克隆得到了一种纤维素酶(C1酶)基因。将获得的C1酶基因与高效表达载体(HT质粒)连接,再导入B菌,以期获得降解纤维素能力更强的工程菌。 (1)对克隆到的C1酶基因测序,与数据库中的C1酶基因编码序列相比有两个碱基对不同,但两者编码出的蛋白的氨基酸序列相同,这是因为________________________________________________________。  密码子具有简并性,发生碱基的改变仍然可能编码同一种氨基酸 解析:由于密码子具有简并性,所以即使克隆到的C1酶基因测序,与数据库中的C1酶基因编码序列相比有两个碱基对不同,仍然可能编码同一种氨基酸。 2 3 5 6 7 8 9 11 12 1 4 10 13 (2)C1酶基因以B链为转录模板链,转录时mRNA自身的延伸方向为5'→3'。为了使C1酶基因按照正确的方向与已被酶切的HT质粒连接,克隆C1酶基因时在其两端添加了SmaⅠ和BamHⅠ的酶切位点。该基因内部没有这两种酶切位点。图1中酶切位点1和2所对应的酶分别是___________________________。  BamHⅠ、SmaⅠ(顺序不能调换) 2 3 5 6 7 8 9 11 12 1 4 10 13 解析: 根据题干信息“以B链为转录模板链,转录时mRNA自身的延伸方向为5'→3'”,所以B链的方向是从3'→5',根据质粒上启动子的方向,所以B链3'端应该用BamHⅠ进行切割,而其5'端应该用SmaⅠ进行切割。 2 3 5 6 7 8 9 11 12 1 4 10 13 (3)将纤维素含量为20%的培养基分为三组,一组接种工程菌,对照组1不进行处理,对照组2进行相应处理。在相同条件下培养96小时,检测培养基中纤维素的含量。结果(图2)说明工程菌降解纤维素的能力最强。对照组2的处理应为___________________________________。  向培养基中接种未导入C1酶基因的B菌 解析: 本实验的目的是证明工程菌降解纤维素的能力最强,所以对照组1不作处理,组3是添加工程菌,组2的处理是直接用纤维素酶进行纤维素分解,即向培养基中接种未导入C1酶基因的B菌。 2 3 5 6 7 8 9 11 12 1 4 10 13 12.(2025·辽宁沈阳模拟)生长素参与植物生长发育的调节,生长素运输蛋白(PINI)对IAA的极性运输具有重要作用。为研究35S启动子(一种来自病毒的强启动子)能否引起下游基因的过量表达,研究人员将35S启动子与PINI基因转入拟南芥,观察PINI过量表达对植物的影响。 (1)获取PINI基因的mRNA后,通过RT⁃PCR扩增获取PINI基因(DNA)时所需要的酶是_______________________。每次PCR循环分为3步,其中所需温度最低的一步称为______。  逆转录酶、DNA聚合酶 复性 2 3 5 6 7 8 9 11 12 1 4 10 13 解析:由PINI基因的mRNA作为模板合成PINI基因(DNA)是逆转录过 程,然后再进行PCR,故需要逆转录酶、DNA聚合酶。PCR循环包括变 性(90 ℃以上)、复性(50 ℃左右)、延伸(72 ℃左右)三步,温度最低的 是复性。 2 3 5 6 7 8 9 11 12 1 4 10 13 (2)PINI基因不能直接导入受体细胞,需要构建PINI表达载体。构建PINI表达载体的目的是______________________________________________ ______________________________________________________。  有利于PINI基因在受体细胞中稳定存在,并遗传给下一代;有利于PINI基因在受体细胞中表达和发挥作用 解析: 构建PINI表达载体,有利于PINI基因随表达载体在受体细胞中稳定存在,并遗传给下一代;表达载体中有启动子和终止子,有利于PINI基因在受体细胞中表达和发挥作用。 2 3 5 6 7 8 9 11 12 1 4 10 13 (3)为将PINI基因以正确方向插入质粒需要双酶切。在设计引物时,需在引物的5'端加入相应的酶切位点。已知PINI基因的1链为转录的模板链,据图分析,引物1和引物2的酶切位点对应的限制酶分别为_____________ _______________,理由是________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。  PstⅠ、EcoRⅠ (顺序不可颠倒) PINI基因中含有XhoⅠ,引物上的酶切位点不能 为XhoⅠ,1链为转录的模板链,该链在启动子后的方向应为3'→5',因此,引物2应位于PINI基因的上游,其上应构建EcoRⅠ的酶切位点;引物1应位于PINI基因的下游,其上应构建PstⅠ的酶切位点 2 3 5 6 7 8 9 11 12 1 4 10 13 解析: 已知PINI基因的1链为转录的模板链,DNA模板链转录方向是从3'端向5'端,RNA链的合成方向是从5'端向3'端,根据题图2中质粒的35S启动子的转录方向,PINI基因的引物2端应接入35S启动子的后面,位于PINI基因的上游,引物1端接入终止子端,位于PINI基因的下游,所以引物2的酶切位对应的限制酶点是EcoRⅠ、引物1的酶切位点对应的限制酶是PstⅠ,不能用XhoⅠ进行酶切,XhoⅠ会将PINI基因切断。 2 3 5 6 7 8 9 11 12 1 4 10 13 (4)提取转基因拟南芥的DNA,用相应引物扩增出35S启动子和PINI基因。为检测目的基因是否导入拟南芥,应电泳检测扩增产物中的__________,不检测另一种的原因是__________________________________________ ______________________________________。  也可以在个体水平上进行检测,方法是_____________________________ _____________________。  35S启动子　 拟南芥细胞中原本存在PINI基因,检测PINI基因无法确定外源PINI基因是否导入受体细胞 对转基因拟南芥喷洒适宜浓度的 除草剂,观察能否存活 2 3 5 6 7 8 9 11 12 1 4 10 13 解析: 检测目的基因是否导入拟南芥,应电泳检测扩增产物中的35S启动子,不能检测PINI基因。因为拟南芥细胞中原本存在PINI基因,检测PINI基因无法确定外源PINI基因是否导入受体细胞。也可在个体水平上进行检测,由于基因表达载体中含有抗除草剂基因,可以对转基因拟南芥喷洒适宜浓度的除草剂,观察能否存活,能存活的是转基因成功的拟南芥。 2 3 5 6 7 8 9 11 12 1 4 10 13 13.(2024·福建卷)病毒感染初期,机体会分泌干扰素并作用于细胞受体IFNAR来应对感染。麻疹是由麻疹病毒感染引起的急性传染病。已知人 白细胞分化抗原46(hCD46)是麻疹病毒入侵细胞的主要受体,小鼠没有该 受体,科研人员构建hCD46转基因小鼠用于相关研究,部分流程如图所示。 2 3 5 6 7 8 9 11 12 1 4 10 13 回答下列问题。 (1)利用PCR技术获取目的基因hCD46,复性温度下发生的扩增过程是___________________________________________。  两种引物分别与含hCD46基因的两条模板链结合 解析:利用PCR技术获取目的基因hCD46,复性温度下发生的变化是两种引物分别与解开的两条模板链进行碱基互补配对,为子链的延伸做准备,即表现为两种引物分别与含hCD46基因的两条模板链结合。 2 3 5 6 7 8 9 11 12 1 4 10 13 (2)将hCD46接入质粒应选用的限制酶组合是____________。为提高转基因效率,同时避免标记基因进入胚胎体内,应选用_____________限制酶组合将重组质粒变为线性DNA。  EcoRⅠ和NotⅠ 　AgeⅠ和HindⅢ 解析: 结合图示可知,质粒中以及目的基因的两端含有限制酶EcoRⅠ和NotⅠ的识别序列,且这两个序列位于启动子和终止子之间,因此,将hCD46接入质粒应选用的限制酶组合是EcoRⅠ和NotⅠ。为提高转基因效率,同时避免标记基因进入胚胎体内,应选用AgeⅠ和HindⅢ限制酶组合将重组质粒变为线性DNA,因为这两种限制酶可以将重组质粒分为含目的基因的片段和含有标记基因的片段。 2 3 5 6 7 8 9 11 12 1 4 10 13 (3)为获取大量胚胎用于移植,可用激素处理小鼠a,使其___________。将胚胎移植到小鼠c的子宫中,应选用桑葚胚的原因是________________ __________。  　子宫着床 超数排卵 桑葚胚易于在小鼠 解析: 为获取大量胚胎用于移植,可用激素处理小鼠a,使其超数排卵, 为获取大量的供体胚胎做准备。将胚胎移植到小鼠c的子宫中,通常选 用桑葚胚的原因是桑葚胚易于在小鼠子宫着床,进而可以提高胚胎的存活率。 2 3 5 6 7 8 9 11 12 1 4 10 13 (4)利用PCR技术对子代小鼠进行hCD46基因检测,应设置不加DNA模板的对照组,目的是_____________________________。  排除PCR体系中外源DNA的污染 解析: 利用PCR技术对子代小鼠进行hCD46基因检测,应设置不加DNA模板的对照组作为空白对照,这样可以排除PCR体系中外源DNA的污染,提高实验结果的可信度。 2 3 5 6 7 8 9 11 12 1 4 10 13 (5)若能进一步构建既表达hCD46受体又敲除IFNAR基因的小鼠,则该小鼠对麻疹病毒具有高易感性,原因是______________________________ _______________________________。  该小鼠能被麻疹病毒感染,且干扰 素无法作用于IFNAR以应对感染 解析: 若能进一步构建既表达hCD46受体又敲除IFNAR基因的小鼠,则该转基因小鼠能接受抗原刺激,进而机体会分泌干扰素,但干扰素无法与相应的受体结合,因为转基因小鼠的受体IFNAR无法表达,因而干扰素无法起作用,因此,该小鼠对麻疹病毒具有高易感性。 $$