第10单元 专题加强10 PCR技术与基因编辑技术的应用-【优化探究】2026高考生物学一轮复习高考总复习配套课件（广东专版）

生物技术与工程 第十单元 专题加强10　PCR技术与基因编辑技术的应用 加强点1　PCR技术及其应用 1.原理与过程的归纳 2.PCR技术的应用类型 (1)采用RT⁃PCR技术检测RNA病毒感染 常规的PCR过程是由依赖DNA的DNA聚合酶以DNA作为模板进行扩增的,而RT⁃PCR则由依赖RNA的DNA聚合酶(逆转录酶)来完成。首先,由逆转录酶将RNA单链转录为与其互补的DNA(cDNA),再通过常规PCR和相应引物进行另一DNA链的合成以及DNA双链的扩增。RT⁃PCR是一种很灵敏的技术,可以检测很低拷贝数的RNA,广泛应用于遗传病的诊断,并且可以用于定量监测某种RNA的含量。 (2)利用反向PCR技术扩增已知DNA序列两侧的未知DNA序列 利用PCR技术进行基因扩增时,为了便于设计引物,要求目的基因两侧的序列是已知的。当DNA的某些序列已知,而需要扩增已知序列两端的未知序列时,可采用反向PCR技术。 (3)利用不对称PCR技术扩增大量单链DNA(ssDNA) 不对称PCR的原理是使用不等量的一对引物来扩增以产生大量的单链DNA,两条引物的比例通常为100∶1,这样随着PCR反应的进行,浓度低的引物很快被消耗光,高浓度引物随即产生大量的目的单链DNA。低浓度引物的加入保证了扩增过程具有足够多的模板,而高浓度引物则保证了单链DNA的大量合成。 (4)利用巢式PCR技术进行扩增 巢式PCR的目的在于目的片段的特异性扩增,需要根据目的片段设计外围引物和巢式引物。首先使用目的片段外围的引物对模板进行扩增,然后对其扩增产物进行纯化,并作为第二轮扩增的模板。第二轮扩增使用内部的巢式引物进行扩增得到目的片段,第二次PCR扩增得到的目的片段短于第一次扩增。巢式PCR的优点在于采取两轮PCR对目的片段进行扩增,如果第一轮得到的是非特异性片段,那么第二轮在错误片段上进行引物配对并扩增的概率极低,大大提升了特异性。缺点是由于对同一片段进行了两次PCR反应,引起交叉污染的概率较大。 (5)利用重叠延伸PCR技术进行定点突变 重叠延伸PCR也叫重组PCR。通过采用分别具有互补末端的引物扩增两条DNA,使两个PCR产物形成了同源区,从而在随后的扩增反应中通过同源区的延伸,将不同来源的扩增片段重叠拼接起来。该技术广泛应用于基因的定点突变、融合基因的构建、长片段的分步合成、目的基因的敲除等方面。 对点训练 1.(2025·广东佛山模拟)PCR技术是在DNA聚合酶作用下,在体外进行DNA大量扩增的一种分子生物技术。下列相关叙述错误的是(　　) A.扩增过程中,延伸的温度大于复性的温度,而小于变性的温度 B.设计引物时需要避免引物之间形成碱基互补配对,而造成引物自连 C.PCR扩增时,复性所需温度的设定与引物的长度和碱基组成无关 D.采用PCR技术对一个DNA进行扩增,第n次循环共需要引物2n个 C 解析:延伸的温度(72 ℃左右)要大于复性温度(50 ℃左右)但小于变性温度(90 ℃以上),A正确;设计的引物之间不能有碱基互补配对,否则引物自连,而不能与模板相连,B正确;复性温度与时间取决于引物的长度、碱基组成及其浓度,还有靶基因序列的长度,如果引物中G、C含量高,需要设定更高的复性温度,C错误;PCR技术大量扩增目的基因时,第n-1次生成2n-1个DNA分子,第n次复制形成2n个DNA,所以需要的引物数目为(2n-2n-1)×2=2n,D正确。 2.(2025·湖南长沙模拟)反转录PCR又称逆转录PCR(RT⁃PCR),是以mRNA为模板进行的特殊PCR,过程如图。下列相关叙述错误的是(　　) A.图示过程需要控制温度,否则可能得不到产物 B.RT⁃PCR技术中,不需要已知mRNA的全部序列 C.过程③中子链沿着模板链的5'→3'方向延伸 D.RT⁃PCR技术可应用于RNA病毒感染的检测 C 解析:过程③中,在引物作用下,DNA聚合酶从引物3'端开始延伸DNA链,即子链沿着模板链的3'→5'方向延伸,C错误。 3.(2025·安徽安庆模拟)常规PCR只能扩增两引物间的DNA区段,要扩增已知DNA序列两侧的未知DNA序列,可以用反向PCR技术。反向PCR技术扩增的原理如图所示。下列叙述正确的是(　　) A.酶切阶段,L中不能含有酶切时所选限制酶的识别序列 B.环化阶段,可选E.coli DNA连接酶而不能选T4 DNA连接酶 C.应选择引物2和引物3进行PCR,且二者不能互补配对 D.PCR扩增,每轮循环前应加入限制酶将环状DNA切割成线状 答案:A 解析:在酶切阶段,已知序列L中不能含有酶切时所选限制酶的识别序列,否则会将已知序列L切断,造成序列识别混乱,A正确;T4 DNA连接酶或E.coli DNA连接酶都可以用来连接黏性末端,因此环化 阶段,可选用E.coli DNA连接酶或T4 DNA连接酶, B错误;PCR过程需要两种引物,能分别与目的基因 两条链的3'端通过碱基互补配对结合,为保证延伸 的是已知序列两侧的未知序列,应该选择引物1和 引物4,且二者间不能互补配对,C错误;PCR的扩增 只需要第一次循环前加入足够的限制酶,并不需要 每轮都加入,D错误。 4.不对称PCR是利用不等量的一对引物来产生大量单链DNA(ssDNA)的方法。加入的一对引物中含量较少的被称为限制性引物,含量较多的被称为非限制性引物。PCR反应的最初的若干次循环中,其扩增产物主要是双链DNA(dsDNA),但当限制性引物消耗完后,就会产生大量的ssDNA。不对称PCR的简单过程如图所示。假设模板DNA分子初始数量为a个,6次循环后开始扩增产生 ssDNA。下列叙述错误的是(　　) A.限制性引物和非限制性引物均需要依 据模板DNA的碱基序列来设计 B.据图可知,最后大量获得的ssDNA与图 中甲链的碱基序列相同 C.该不对称PCR过程中需要(26-1)a个限制性引物 D.上述过程中子链分别沿限制性引物的5'端、非限制性引物的3'端延伸 答案:D 解析:PCR扩增时需要已知目的基因两侧的碱基序列来设计引物,因此限制性引物和非限制性引物均需要依据模板DNA的碱基序列来设计,A正确;非限制性引物与乙链结合,最后大量获得的ssDNA与图中甲链的碱基序列一致,B正确;PCR扩增时引物是新子链的一部分,假设模板DNA分子初始数量为a个,6次循环后产生26个DNA分子,因此该不对称PCR过程中需要(26-1)a个限制性引物,C正确;扩增时 耐高温的DNA聚合酶将4种脱氧核苷酸 连接至引物的3'端,D错误。 5.(2025·江苏无锡模拟)巢式PCR指利用两套 PCR引物对模板进行两轮PCR扩增,从第二轮 的扩增产物中获得目的基因片段,具体过程如 图。巢式PCR首先要根据DNA模板序列设计 两对引物。利用第一对外引物对靶DNA进行 15到30个循环的标准扩增。第一轮扩增结束 后,将一小部分起始扩增产物稀释后加入第二 轮扩增体系中作为模板,利用第二对引物进行标准扩增并得到产物。下列相关叙述错误的是(　　) A.PCR反应体系的缓冲液中需要加入Mg2+用于激活DNA聚合酶 B.与传统PCR相比,巢式PCR能减少非特异性产物的形成 C.第一轮的扩增产物是第二轮扩增的模板,第二轮扩增产物更短 D.如果第一次PCR引物过量,剩余引物在第二次PCR后不会有产物 答案:D 解析:PCR(聚合酶链式反应)是一种分子生物学技术,用于在体外扩增特定的DNA片段, PCR反应缓冲液中需要加入Mg2+激活DNA聚合酶,A正确;因为同时和两套引物都互补的靶序列很少,所以巢式PCR能减少非特异性产物的形成,B正确;第一 轮扩增的产物是第二轮扩增的模板,第二轮产物更短,C正确;如果第一次PCR引物过量,剩余引物在第二次PCR后由于有模板存在,仍会有产物, D错误。 6.如图表示利用重叠延伸PCR技术改造目的基因的原理。下列相关叙述错误的是(　　) A.图示操作结束后可继续选用引物1、4 进行PCR4,以获得大量改造后的目的基因 B.操作中引物2和引物3序列应含有拟突变 位点,且可以互补 C.应选用引物1和引物4进行PCR3,以获得 大量目的基因序列 D.此过程实现的基因序列改变属于基因突 变,未发生基因重组 C 解析:图示过程结束后,以获得的改造后的目的基因为模板,选用引物1、4,继续扩增获得大量改造后的目的基因,A正确;实现基因的定点诱变时,需要根据目的基因序列设计两种常规引物,以及根据拟突变位点处碱基序列的位置设计两种突变引物,图中属于突变引物的是引物2、3;与常规引物相 比,图中的2、3两种引物必须有一段互补的序列,可以进行碱基互补配对,而且应含有拟突变位点,否则无法实现进行PCR3筛选的突变产物的形成,B正确;进行重叠延伸时,上链和下链在突变位点处的碱基序列互补,能起到引物2、3的作用,因此不需要另加引物,即可得到进行PCR3筛选的突变产物,C错误;由“利用重叠延伸PCR技术实现了基因的定点诱变”可知,此过程实现的基因序列改变属于基因突变,未发生基因重组,D正确。 加强点2　基因编辑技术及其应用 CRISPR/Cas9基因编辑技术能对基因进行定点编辑,其原理是由一条单链向导RNA(sgRNA)引导内切核酸酶Cas9到一个特定的基因位点进行切割(如图)。 CRISPR复合体中的sgRNA的主要功能是与靶向基因(目的基因)上特定碱基序列互补,从而定向引导Cas9蛋白与靶向基因结合,并在特定位点切割DNA。 CRISPR/Cas9基因编辑技术培育转基因生物,与传统的基因工程相比,其明显优点是可将目的基因定点插入所需位点,避免了因目的基因随机插入宿主细胞DNA引起的生物安全性问题。CRISPR/Cas9基因编辑技术在基因治疗、基因水平进行动植物的育种、研究基因的功能等方面有广阔的应用前景。 对点训练 7.(2025·广东广州模拟)CRISPR/Cas9系统主要由向导RNA(SgRNA)和Cas9蛋白两部分组成,SgRNA可引导Cas9蛋白到特定基因位点进行切割,其机制如图所示。下列说法正确的是(　　) A.Cas9蛋白相当于限制酶,切割特定基因位点 的脱氧核糖和碱基之间的化学键 B.向导RNA可以在逆转录酶的催化下合成,合 成的原料包括四种核糖核苷酸 C.CRISPR/Cas9技术编辑基因有时会因SgRNA错误结合而出现“脱靶”现象,一般SgRNA序列越长,脱靶率越低 D.对不同目标DNA进行编辑时,使用Cas9蛋白和相同的SgRNA进行基因编辑 C 解析:Cas9蛋白切割特定基因位点,相当于限制酶,作用于脱氧核糖和磷酸之间的磷酸二酯键,A错误;向导RNA是以DNA的一条链为模板通过转录形成的,可以在RNA聚合酶的催化下合成,合成的原料包括四种核糖核苷酸,B错误;CRISPR/Cas9技术编辑基因有时会因SgRNA错误结合而出现“脱靶”现象,SgRNA的序列越短,可识别的DNA上的特定碱基序列越短,越容易发生脱靶现象,即脱靶率越高,一般SgRNA序列越长,脱靶率越低,C正确;在对不同目标DNA进行编辑时,应使用Cas9 蛋白和不同的SgRNA结合进而实现对不同基因 的编辑,D错误。 8.(2025·湖北宜昌模拟)CRISPR/Cas9基因编辑技术根据靶基因序列设计向导sgRNA,精确引导核酸酶Cas9切割与sgRNA配对的DNA,相关酶在修复断裂DNA的过程中会改变连接部位的碱基序列。科研人员通过删除编码PD⁃1蛋白基因的2、3、4片段造成蛋白质的功能缺失,制作PD⁃1基因敲除鼠的流程如图1所示。将体外转录获得的Cas9 mRNA和sgRNA导入小鼠的受精卵中,获得了12只基因编辑小鼠。利用PCR鉴定小鼠的基因型,电泳结果如图2所示。已知P1和P2是PCR的引物,下列相关分析正确的是(　　) A.核酸酶Cas9敲除2、3、4片段作用在 磷酸二酯键,引起的变异属于基因重组 B.欲将基因的2、3、4共3个片段切除,敲 除前需要设计3个向导sgRNA C.图2中,4和12个体杂交的子代均为基因 敲除纯合子(不考虑性别) D.图2中,3、5、9个体的体内均能检测到 PD⁃1基因,8和10个体则不能检测到该基因 答案:C 解析:图1中,通过删除编码PD⁃1蛋白功能区的2、3、4片段造成蛋白的功能性缺失,指的是将野生型基因内部的部分碱基剪切,作用在磷酸二酯键,改变的是基因内部的碱基序列,属于可遗传变异中的基因突变,A错误;图1中,需要将基因的2、3、4共3个片段切除,需要设计片段2和片段4的2个sgRNA,B错误;基因敲除后,其核苷酸数量减少,电泳时移动速度快,距离加样孔远,即4和12个体均为敲除纯合子,杂交的子代均为基因敲除纯合子,C正确;3和8个体的基因未敲除,5个体和9个体为基因敲除杂合子,体内均能检测到PD⁃1基因,10个体为突变基因纯合子不能检测到PD⁃1基因,D错误。  9.(2025·广东云浮模拟)水蛭素是一种蛋白质,可用于预防和治疗血栓。某科研团队运用重叠延伸PCR技术在水蛭素基因中的特定位点引入特定突变,使水蛭素第47位的天冬酰胺(密码子为AAC、AAU)替换为赖氨酸(密码子为AAA、AAG),从而提高水蛭素的抗凝血活性。原理如图。 注:图中的引物2和3的突起处代表与模板链不能互补的突变位点。 (1)由以上事例可知,要对蛋白质的结构进行改造,需要通过____________ _______________来完成。  (2)若拟突变位点的碱基对为A—T,则需要让其突变为　　　　　　　才能达到目的。引物2的突变位点(突起处)应设计为　　　　 (假设引物为单链DNA)。  解析:若拟突变位点的碱基对为A—T,则需要让其突变为T—A或C—G,对应的密码子由AAU变成AAA或由AAC变成AAG,即可使天冬酰胺替换为赖氨酸。 改造基因(或 基因定点突变) T—A或C—G A或G (3)在第一阶段获得2种具有重叠片段DNA的过程中,引物1、引物2组成的反应系统和引物3、引物4组成的反应系统中均进行一次复制,共产生___种DNA分子。该阶段必须将引物1、2和引物3、4置于不同反应系统中,这是因为______________________________________________________ _________________________。 解析:若两个反应系统均进行一次复制,则会产生3种不同的DNA分子,因为引物1和4产生的DNA分子相同。 3 引物2和3中存在互补配对片段,置于同一反应系统时 会结合而失去作用 (4)利用重叠延伸PCR技术还可以将两个不同来源的DNA片段拼接起来。有人想利用该技术把基因M和N拼接在一起,设计基因M的引物M1、M2,基因N的引物N1、N2。在设计这4种引物时,特别要注意的问题是______ ____________________________________________________________。  解析:重叠互补引物的设计是重叠延伸PCR技术成功的关键。拼接基因M和N时,设计引物需要注意找到两种基因的重叠部分,即M1、M2中的一种引物与N1、N2中的一种引物必须具有互补配对的片段。 M2中的一种引物与N1、N2中的一种引物必须具有互补配对的片段 M1、 $$