备课素材：模拟“希尔反应”-2025-2026学年高一上学期生物人教版必修1

模拟“希尔反应” “希尔反应”是高中生物学必修1《分子与细胞》第5章“探究光合作用原理”科学史中的重要内容。该实验说明水在光下被分解产生02，同时也表明O2的产生和糖类的合成不是同一个化学反应，划分出光反应和暗反应2个阶段。但由于该实验操作繁琐、试剂比例确定困难、实验条件难以控制、实验过程中生成性问题复杂等原因，教材中并未对此实验的细节加以介绍，也没有安排开展相应的实验教学活动。只停留在实验分析上的学习，不利于充分发展学生的生物学学科 核心素养。 1.实验原理 希尔反应是指离体的叶绿体在适当条件下发生水的光解、产生02，同时将加人的氧化剂或电子受体（高铁盐）还原的过程。利用希尔应可以“探究02的来源”，叶绿体悬浮液在有H2O、无CO2的条件下发生希尔反应，说明水的光解产生了O2 氧化剂2，6-二氯酚靛酚（DCPIP/2,6-D)是一种蓝色染料，接受希尔反应产生的电子和H+后，被还原为无色（图1）。 通过直接观察颜色变化，或者进一步用分光光度计测定反应前后吸光度的变化，可以定性观察或者定量测定希尔反应。 2.实验过程 2.1 材料和器具 实验材料和试剂：新鲜的菠菜，0.4mol/L蔗糖，0.05mol/LTris，0.01molANaCl，HCl,0.1%的2，6-二氯酚靛酚（用叶绿体提取液溶解、避光保存）,0.1 mol/L草酸铁（避光保存）,1%的酚酞（1 g酚酞溶于100mL95%的乙醇中），1mol/L的NaOH溶液等。 实验器具：离心机、天平、剪刀、离心管、研钵、纱布、锥形瓶、量筒、烧杯、玻璃棒、电子pH计、载玻片、盖玻片、显微镜、5mL注射器、橡胶管、移液器等。 2.2 实验步骤 2.2.1制备离体叶绿体悬浮液 首先，配制与叶绿体等渗的叶绿体提取液（将13.69g蔗糖、0.058gNaCl和 0.606gTris溶于100mL超纯水中，用HCl调pH至7.6);选用新鲜的菠菜叶片，用剪刀去除主脉，超纯水洗净擦干，称取12g放入冰浴过的研钵中；加入15mL预冷的叶绿体提取液，以及少量石英砂，在研钵中快速研磨1min，继续加入10mL预冷提取液，研磨30s，注意研磨不要过于用力，以不连续研磨和把叶片磨成小块为宜；研磨成匀浆后，用4层纱布过滤于烧杯中；滤液用1 000r/min离心2min，弃去沉淀，收集上清液；上 清液用3000r/min离心5min，弃去上清液，沉淀即是叶绿体；最后，用20提取液悬浮沉定作置于冰浴备用，或者暂时存放4℃冰箱中（经检验，10h后依然存在活性)。需要注意，为了保持叶绿体活性，提取过程应迅速，尽量在冰上操作，以保持温度0~4℃。提取用的研钵、提取液等都应在冰上预冷。 2.2.2 模拟希尔反应探究O2来源 希尔反应只有在无CO2的条件下进行，才能证明水的光解产生O2，进而初步验证02的来源。利用碱中和法，用1mol/L的NaOH调叶绿体提取液的pH至8.4，可使反应液中无游离CO2。在此基础上，采用以下装置进行反应（图2），可最大限度地保证反应装置中无空气，排除整个体系中CO2的干扰。 具体操作步骤如下：首先排干净2个注射器中的空气；用胶管连接的注射器吸取肺绿体恳浮液2.5mL，用另一个带针头的注射器吸取氧化剂2，6-二氯酚靛酚170μL(用移液器取270μL氧化剂于1.5mL离心管，用带针头的注射器吸取离心管中的氧化剂，使液面下降至0.1mL的刻度线，即可准确吸取170μL，且不会吸人空气）。将2个 注射器用胶管连接，然后缓慢将叶绿体悬浮液推进氧化剂中，再推回混匀；贴上标签，遮光组用锡箔纸包好，与照光组同时置于灯光下；5min后观察实验现象。操作注射器时动作轻缓，尽量不要产生气泡。 3.实验结果和结论 反应5min后进行观察，遮光组无明显变化而照光组的离体叶绿体悬浮液由深蓝绿色变浅绿色，且产生细密的气泡（图3）。 说明离体叶绿体在光照下发生希尔反应，把蓝色的氧化型2，6-二氯酚靛酚还原成无色的还原型2，6-二氯酚靛酚。由此可以得出结论，离体叶绿体在光照下使H2O发生光解，产生02，推测光合作用产生的O2可能来源于水。在课堂教学中，需要进一步分析鲁宾和卡门实验，以进会步验证02来源。 4.实验过程中遇到的问题和解决方案 4.1 叶绿体的提取 不同的文献和资料中提取叶绿体的方法各不相同，主要涉及材料选取、提取液配制、物料比的控制，以及最终稀释比例等问题。此外，文献中对离心（转速控制、离心时间甚至取上清液还是沉淀)的描述差别较大，对探究过程造成一定的干扰。经过大量的实验对比，尝试了菠菜和小白菜、磷酸盐缓冲液和Tris-HCl缓冲液、不同转速和时间、取上清液和沉淀等，并经过显微镜镜检（图4)和实验，最终确定了提取方案和稀释比例。 由图4可知，“先1 000 r/min离心取上清液，再3000 r/min离心取沉淀”的方法可以有效提取出叶绿体（图4-a、b)，考虑到用量 和反应效率，最后选用20mL/提取液悬浮叶绿体。 4.2 创造无CO2的条件 如何去除CO2是“通过模拟希尔反应验证氧气来源”的关键。针对这个问题，尝试用碱性溶液（石灰水/NaOH）吸收空气中CO2的化学方法，以及用注射器抽空气的物理方法，但前者不能完全吸收反应液中的CO2，后者不仅去除不完全，且对叶绿体造成损伤。 经查阅文献发现，在现行的水质化验分析中，1水中游离CO2的测定采用SL80一1994《中华人民共和国行业标准》凹。该方法属于碱中和滴定法，原理为：用NaOH滴定溶液中CO2，可发生如下反应： 当其达到滴定终点时，溶液的pH约为8.3，即可用pH判定游离CO2的存在。选择变色临界值为pH8.3的酚酞作为指示剂，pH<8.3时，酚酞显示无色，溶液中有游离CO2存在;当液体pH>8.3时，酚酞由无色转为红色，溶液中无游游离CO2存在， 反应液中的氧化剂2,6-二氯酚靛酚呈碱性，菠菜叶绿体悬浮液则因为样品和提取条件的不同，检测出的 pH 范围为8.0~8.3。只需将其用NaOH调pH至8.4，即可保证反应液中无CO2。至此，只需让反应容器里无空气即可。采用2个注射器连接的装置（图2)，只要注射器先排尽空气，吸取时避免吸人空气，就可以避免外界CO2混入。 用pH8.4的叶绿体提取液与酚酞反应模拟实验，对装置进行检测，发现反应体系中的pH可以维持在使酚酞变色的范围内（图5-a），表明反应环境中无CO2。 值得注意的是，调pH对叶绿体的活性是有影响的。将叶绿体悬浮液的pH从8.0调至8.4再进行反应，可观察到反应效率明显降低（图5-b)。 有文献表明，pH升至8.4时，1h后叶绿体活性有大幅度下降。因此，调pH后应尽快进行反应，且需根据调pH的程度来选择氧化剂和叶绿体的反应比例。 4.3 选用氧化剂 能作为希尔反应电子和氢受体的为希尔氧化剂。常见的有：2，6-二氯酚靛酚、草酸铁、高铁氰化钾、苯醌、NADP+、NAD+等。 本实验中尝试了 0.1%的 2,6- 二氯酚靛 酚和0.1 mol/L的草酸铁。经测试，加人草酸铁产生的气泡相对于2，6-二氯酚靛酚快且多，但无明显的颜色变化（图6）。 教师可以根据实验需要适当选用这2种氧化剂。 4.4 确定叶绿体悬浮液和氧化剂的用量比例 氧化剂2,6-二氯酚靛酚呈深蓝色，如果氧化剂过多，即便发生反应，也观察不出颜色变化，且气泡不容易观察；如果氧化剂过少，则颜色对比不够明显。此外，还需要有一个适宜的反应时间，不能太慢或太快，因此，控制氧化剂和叶绿体悬浮液的用量比例十分重要。 设计系列比例梯度的实验进行结果对比。2.5 mL叶绿体悬浮液分别与100、150、200、250μL的0.1%2,6-二氣酚靛酚组合反应。结果发现，加人100μL2,6-二氯酚靛酚颜色变化不明显;加人250μL虽然产生气泡，但未有明显的颜色变化（图7-a);则最佳比例以150~200 μL2,6-二氯酚靛酚为宜，此区间变色比较显著，且气泡比较明显。在150~200μL内进一步设置梯度，最终选定2.5mL叶绿体悬浮液（按本提取方法中的稀释比例)与170μL0.1%2,6-二氯酚靛酚反应。在将 pH由8.0调至8.4 的情况下，此比例反应前后颜色对比显著，且气泡最容易观察(图7-b、图3)。如果pH需要调的程度 不大（如由8.2调至8.4)，则采用2.5mL叶绿体悬浮液与200μL0.1% 2,6氯酚靛酚最佳（图7-b）。 此外，将反应时间增加到10~15 min，气泡更容易观察。 4.5 实验过程中的生成性问题——2,6-二氯酚靛酚反应后颜色反复变化 在观察实验结果时发现，不同体积的2,6-二氯酚靛酚与2.5 mL叶绿体悬浮液反应5 min后，颜色由蓝变绿；但放置几个小时，颜色变回蓝色（图8，）；再放回灯光下，过一会儿又会变绿色。直至 叶绿体失去活性，溶液逐渐褪色变为浅绿色。 最初考虑这种颜色的反复变化是由于叶绿体悬浮液中某些杂质影响了反应，但改进提取叶绿体的方法后仍然存在此变化，且没有查到任何文献提到这种现象。根据2,6-二氯酚靛酚的特性，02可以将脱色的2,6-二氯酚靛酚氧化变回蓝色。由此分析，实验中观察到的现象，可能是希尔反应产生的O2再次将被还原的2，6-二氯酚靛酚氧化，致使颜色反复变化。而时间过长，叶绿体失去活性，希尔反应不再发生，颜色便会固定不变。 此外，在以2，6-二氯酚靛酚为氧化剂发生希尔反应的过程中，2，6-二氯酚靛酚由蓝色被还原为无色，这种颜色变化与希尔反应在4~5min内呈线性关系，因此不仅可以定性观察，还可以定量测定。用分光光度计测定2，6-二氯酚靛酚反应前后吸光度A的变化，即可测出希尔反应强度，可在一定程度上表示光合作用速率（强度）。因此，本体系还可以用于后续“探究环境因素对光合作用强度的影响”的实验教学。在不同环境因素下（光照强度、光质、CO2浓度、温度等）进行希尔反应，用分光光度计测定吸光度，即可定量测定出不同环境因素下的光合作用强弱。 学科网（北京）股份有限公司 $$