2026年高考生物一轮复习 基因工程

高考生物一轮复习 基因工程 一．选择题（共20小题） 1．蛛丝蛋白是一种特殊纤维蛋白，具有强度高、韧性大等特点，在人工肌腱等医学领域有着诱人的前景。某研究小组提取一种丝绒蜘蛛中的蛛丝蛋白基因，将其导入大肠杆菌生产蛛丝蛋白。下列叙述正确的是（　　） A．构建蛛丝蛋白基因表达载体需要限制酶和DNA聚合酶 B．可通过显微注射的方法将蛛丝蛋白基因导入大肠杆菌 C．基因表达载体上的复制原点可调控蛛丝蛋白基因的表达 D．可通过蛋白质工程设计与改造蛛丝蛋白的结构以增强其韧性 2．某同学利用洋葱为实验材料，进行DNA粗提取和鉴定实验。下列有关叙述错误的是（　　） A．该同学也可选择鸡血、猪肝等动物细胞为实验材料提取DNA，但方法可能有所不同 B．将洋葱切碎加研磨液研磨、过滤后，滤液放置4℃冰箱中静置几分钟后，DNA存在于沉淀物中 C．向含有DNA的粗提取液中加入体积分数为95%的冷酒精后，出现的白色丝状物为DNA D．鉴定DNA时，需先将DNA溶解在2mol/LNaCl溶液，再加入二苯胺试剂并进行沸水浴加热 3．下列有关基因工程的叙述正确的是（　　） A．将目的基因导入植物细胞采用最多的方法是花粉管通道法 B．将某药用蛋白基因导入动物乳腺细胞中可获得乳腺生物反应器 C．目的基因扩增完成后的产物常用琼脂糖凝胶电泳进行鉴定 D．可通过RNA分子标记检测目的基因是否成功表达 4．t﹣PA蛋白能高效降解由纤维蛋白凝聚而成的血栓，是心梗和脑血栓的急救药。但t﹣PA与纤维蛋白结合的特异性不高，给心梗患者注射大量t﹣PA会诱发颅内出血。若将t﹣PA第84位的半胱氨酸换成丝氨酸，获得改良药物t﹣PA，能显著降低出血副作用。下列叙述正确的是（　　） A．对t﹣PA蛋白的改良，是以基因的结构和功能的关系为理论基础 B．在该研究中目前可行的直接操作对象是控制t﹣PA合成的基因 C．通过蛋白质工程制备t﹣PA蛋白可以不用构建基因表达载体 D．将改良的t﹣PA基因直接注入大肠杆菌，是生产改良t﹣PA蛋白的核心步骤 5．水蛭是我国的传统中药材，主要药理成分水蛭素为水蛭蛋白中重要成分之一，具有良好的抗凝血作用。科研人员拟通过蛋白质工程改造水蛭素结构，提高其抗凝血活性。将提取的水蛭蛋白经甲、乙两种蛋白酶水解后，分析水解产物中的肽含量及其抗凝血活性，结果如图所示。下列叙述错误的是（　　） A．水蛭蛋白经两种酶处理后水解产物的抗凝血活性差异主要与其肽含量有关 B．酶甲处理使水蛭素抗凝血活性提高的可能原因是使其有活性的结构域部位暴露 C．要获得水蛭素的基因，可以从水蛭细胞中提取mRNA，经逆转录获得目的基因 D．上述实验目的是了解水蛭素蛋白中影响抗凝血活性的部分以设计蛋白质三维结构 6．实验小组利用PCR技术获得了含有目的基因的DNA片段，并用图示的限制酶对其进行酶切，再用所得DNA片段成功构建了基因表达载体，下列叙述错误的是（　　） A．PCR技术中用到的一个引物的前8个碱基序列为5'﹣TGCGCAGT﹣3' B．步骤①中用到的限制酶是SpeⅠ和CfoⅠ C．用步骤①中的限制酶对质粒进行酶切，可至少获得2个DNA片段 D．可用E.coliDNA连接酶或T4DNA连接酶连接酶切后的目的基因片段和质粒 7．红豆草是一种品质优良的豆科多年生高蛋白牧草作物，被誉为“牧草皇后”。为提高红豆草的耐盐性、增大种植范围，科研人员将盐生植物碱蓬中的耐盐基因SsPSL转入红豆草中，对转基因耐盐红豆草DNA进行PCR，再对PCR的产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定。下列有关叙述错误的是（　　） A．利用PCR获取和扩增耐盐基因SsPSL，需添加一种引物，四种核糖核苷酸等组分 B．构建基因表达载体是培育转基因耐盐红豆草的核心工作 C．将植物材料和农杆菌共同培养之前，植物材料需要消毒处理 D．凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来 8．普通棉花中β﹣甘露糖苷酶（GhMnaA2）基因表达出的GhMnaA2能催化半纤维素降解，使棉纤维长度变短。为了培育长绒棉，科研人员构建了反义GhMnaA2基因表达载体（将正义GhMnaA2基因与载体反向连接），获得了转基因长绒棉新品种，具体过程如图所示，SmaⅠ，NotⅠ，HindⅢ和BamHⅠ为酶切位点。用SmaⅠ和NotⅠ切割某正义表达载体可获得3kb、18kb、28kb、59kb4种长度的DNA片段。下列叙述正确的是（　　） A．正义GhMnaA2基因的转录方向是B→A B．①过程所得到的表达载体均为反义表达载体 C．反义GhMnaA2基因可能通过抑制GhMnaA2基因的翻译来保证棉纤维长度 D．用NotⅠ切割反义表达载体获得的DNA片段的长度为21kb和87kb 9．DNA分子的碱基具有吸收260nm波长光的特性。当DNA两条链碱基紧密连接时，吸光度偏低；两条链分离时，吸光度升高，因此DNA变性可通过DNA溶液对260nm波长光的吸光度来检测。肺炎链球菌DNA的变性曲线如图所示，吸光度达到最大值的50%时的温度称为熔解温度（Tm）。下列说法正确的是（　　） A．加热会破坏脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键使DNA变性 B．A、T碱基对所占比例越高的DNA，变性曲线中Tm值越高 C．加热至约70℃时DNA两条链从一端向另一端逐渐分离 D．利用PCR技术检测目的基因时需要先将DNA变性 10．我国的科研团队首次发现了高粱细胞中AT1基因编码的AT1蛋白可以调节作物的耐碱性表型，对于提高作物在盐碱地的存活率具有重要意义。在盐碱地种植的作物会受胁迫产生过量的有害物质H2O2。图中的PIP2s为某种水通道蛋白，其磷酸化水平影响H2O2的跨膜运输，其机理如图所示。下列叙述错误的是（　　） A．盐碱环境可引起大多数作物胞内液渗透压上升，吸水能力增强 B．PIP2s失活的植物细胞在高渗溶液中仍可以发生质壁分离 C．敲除AT1基因将导致PIP2s蛋白磷酸化被抑制，促进H2O2外排 D．可以将耐碱基因的成果应用到大豆、油菜等更多的作物提高其抗逆性 11．科学家将外源抗虫基因（Bt抗虫蛋白基因）转入某茄科植物细胞中，并整合到该植物的线粒体DNA上，获得了具有抗虫性状的转基因植物。下列叙述，错误的是（　　） A．Bt抗虫蛋白在线粒体中的成功合成与密码子的通用性有关 B．叶肉细胞内有多个线粒体，这有利于增加该转基因植物的抗虫性 C．将该转基因植物与同种非转基因植物进行正、反交，所得子代均有抗虫性 D．该技术能有效避免或减少外源基因通过花粉向其他植物的转移 12．S基因与作物甜度相关，可用于培育转S基因作物新品系。已知S基因转录的模板链位于a链，转录时mRNA自身的延伸方向为5′→3′。如图，为使S基因按正确方向与质粒连接，酶切目的基因时选用的限制酶组合是（　　） A．BamHⅠ和HindⅢ B．BamHⅠ和EcoRⅠ C．MunⅠ和BamHⅠ D．EcoRⅠ和HindⅢ 13．下列关于DNA片段扩增及电泳鉴定实验的说法，错误的是（　　） A．放入PCR仪前，需要对离心管进行离心，使反应液集中在底部 B．配置琼脂糖溶液时，需要根据DNA片段的大小调节琼脂糖浓度 C．电泳时需要的两种缓冲液分别含有核酸染料和指示剂 D．电泳时，需要根据电泳槽阳极至阴极之间的距离设定电压 14．RDX是一种弹药使用后残留的危险污染物。研究人员将两个源于细菌的RDX降解酶基因XplA和XplB插入柳枝稷草染色体中，如图所示，使柳枝稷草获得降解实弹射击场土壤中RDX的能力。若要通过PCR检测所获转基因柳枝稷草中是否含有正确插入的XplA和XplB基因，应选择的引物组合是（　　） A．引物1+引物3 B．引物1+引物4 C．引物2+引物3 D．引物2+引物4 15．2022年1月7日，马兰里医学中心成功将猪心脏移植到一名57岁的心脏病患者身上，虽然这颗心脏仅仅存活了2个月，但仍然为异种器官移植的可行性提供了可观的数据。为了降低免疫排斥反应，研究者借助CRISPR/Cas9技术对移植的猪心脏进行了基因编辑。CRISPR/Cas9系统主要由向导RNA（sgRNA）和Cas9蛋白两部分组成，sgRNA可引导Cas9蛋白到特定基因位点进行切割、其机制如图所示。下列说法错误的是（　　） A．sgRNA通过与目标DNA序列互补配对引导Cas9蛋白到位 B．有时sgRNA会因错误结合而出现“脱靶”现象，一般sgRNA序列越短，脱靶率越低 C．Cas9蛋白作用于磷酸二酯键 D．可以通过设计sgRNA，靶向猪心脏的某个抗原蛋白基因的碱基序列，实现基因敲除 16．XhoⅠ和SalⅠ是两种限制酶，某段DNA上的酶切位点如图1所示，用此两种酶分别处理该DNA片段一段时间，电泳后的结果如图2所示。下列叙述，错误的是（　　） A．图1中两种限制酶识别的脱氧核苷酸序列不同 B．泳道①是使用SalⅠ处理后的酶切产物的电泳结果 C．图2中电泳移动速度最慢的是泳道②最上方的那条带 D．同时使用SalⅠ和XhoⅠ处理，酶切产物的电泳结果为7个条带 17．高温会造成叶绿体内活性氧（ROS）大量累积，类囊体薄膜的核心蛋白D1对ROS尤为敏感，极易受到破坏。近期我国科学家将编码D1的psbA基因（位于叶绿体基因组）与高温响应的启动子连接，导入水稻细胞的核基因组中，补充了一条由高温响应启动子驱动的D1合成途径，与野生水稻相比，在高温下转基因水稻光能利用能力显著提高。下列说法错误的是（　　） A．该研究中高温响应的启动子属于诱导型启动子 B．转基因水稻CO2的同化速率较野生型水稻也相应提高 C．细胞原有的和补充的D1合成途径的mRNA转录场所相同 D．该研究为全球气候变暖造成的粮食高温胁迫提供了解决方案 18．关于“DNA粗提取和鉴定”以及“DNA片段的扩增及电泳鉴定”实验，下列说法错误的是（　　） A．将洋葱研磨液离心是为了加速杂质的沉淀 B．根据DNA在不同浓度NaCl溶液中的溶解度不同，可去除部分杂质 C．DNA分子在电场作用下可以带上正电荷或负电荷 D．PCR实验中使用的微量离心管和枪头在使用前需进行高压灭菌处理 19．用氨苄青霉素抗性基因（AmpR）、四环素抗性基因（TetR）作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建重组质粒，并转化到受体菌中。下列叙述不正确的是（　　） A．若用HindⅢ酶切，通过筛选可得到两种目的基因连入方向的重组质粒 B．若用PvuⅠ酶切，在含氨苄青霉素的培养基上形成的菌落一定不含目的基因 C．若用SphⅠ酶切，使用双抗生素平板筛选即可获得正确的重组质粒 D．若用ScaⅠ酶切，可通过琼脂糖凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建是否成功 20．免疫PCR是对微量抗原的一种检测方法。如图是利用该技术检测牛乳中微量抗生素的流程图：首先将抗体1固定在微板上，冲洗后加入待检的牛乳，再加入DNA标记的抗体2，进行PCR扩增，最后进行电泳检测。下列相关叙述正确的是（　　） A．图示抗原检测过程发生三次抗原与抗体的结合 B．图示过程所需抗体可用动物细胞工程技术制取 C．图示过程中三次冲洗都是为了去除未结合的抗体 D．PCR扩增获得产物的量只与标记DNA数量有关 二．解答题（共5小题） 21．东方果蝇会对水果造成严重影响，田间雌蝇数量与经济损失直接相关。 （1）研究发现，东方果蝇中dsx基因 　 　出的前体RNA在加工过程中具有独特的性别选择性剪接机制。利用这一特性研发雌性特异性致死基因系统。 （2）蓖麻毒素A（RTA）可通过破坏核糖体导致细胞死亡。研究者获得如图1所示的融合基因1，进而得到转基因果蝇。 ①根据图1，扩增dsx内含子应选择的引物是 　 　（选填字母）。 ②由于存在性别选择性剪接机制，雌雄转基因果蝇dsx基因前体RNA保留或剪切内含子和剪切识别序列情况不同，产生了不同版本的成熟mRNA，导致雌蝇特异性致死。判断转基因雌蝇中的成熟mRNA为 　 　（如图3填字母序号）。转基因的雄性个体不会致死的原因是 　 　。 （3）研究发现，RTA蛋白第212位甘氨酸替换为精氨酸会出现冷敏感效应（cs），即当温度由29℃变为18℃时，可抑制RTA蛋白对细胞的致死作用。利用此特性培育纯合转基因果蝇。 ①欲得到具有cs效应的RTAcs蛋白，推测对应的基因碱基序列，经定点突变获得融合基因2（如图2所示）。请在方框中画出可继续延伸的复性结果，要求标明每条链的5′端和3′端。 　 　 ②对转入融合基因2的果蝇进行以下操作： ⅰ：在29℃收集雄性果蝇（G0）。 ⅱ：G0与野生型果蝇杂交，筛选出转基因受精卵（G1）。 ⅲ：将每对亲本的受精卵（G1）均分为两组，分别在 18℃和29℃孵化培养，统计两组中雄性个体所占比例，若 　 　，则说明G1具有cs效应。 ⅳ：在 　 　℃继续培养具有cs效应的G1果蝇，使之连续多代自交，得到转基因纯合子。 22．光敏色素基因在调节作物生长发育中具有重要作用。为探讨玉米中光敏色素基因A（含大约256个碱基对）在棉花种质资源中的利用价值，研究人员将A基因转入到棉花中，对棉花受体细胞进行检测，并通过电泳技术分析结果。该过程所用质粒上相关限制酶的酶切位点如图甲所示，电泳检测结果如图乙所示。回答下列问题： （1）操作过程中需要用到的工具有 　 　，构建表达载体时应选用 　 　这两种限制酶处理质粒。 （2）为保证通过mRNA逆转录获得的光敏色素基因A和质粒的充分连接，一般需要在该基因上、下游引物的 　 　端分别添加酶切位点。一般在这两部位添加不同的酶切位点，主要目的是 　 　。 （3）A同学认为仅由图乙电泳结果不能确定1、3、4号转基因棉花均培育成功，理由是 　 　。 （4）在生物学领域，对光敏色素进行分子改造使用的技术是蛋白质工程。获得光敏色素分子的基本途径为：　 　→设计预期的光敏色素的分子结构→推测应有的 　 　→找到相对应的脱氧核苷酸序列。 23．利用乳酸菌构建表达抗原蛋白的工程菌是研究抗原应用的重要手段之一。口服的乳酸菌可在消化道内定植存活，其表达的抗原蛋白可锚定于细胞表面（穿过细胞膜展示在细胞表面），诱导机体产生免疫反应。科学家将某病毒抗原蛋白的部分编码序列（RBD）拼接成融合基因2RBD和3RBD，探究RBD的二聚体蛋白和三聚体蛋白能否模拟抗原蛋白中RBD的天然构象并获得高效免疫原性。重组质粒构建流程如图1所示，NcoⅠ和SacⅠ是pNZ8149质粒上的限制酶识别位点，U﹣M为信号肽﹣细胞壁锚定蛋白序列。回答下列问题： （1）为满足乳酸菌生长的特殊需求，培养基除了提供碳源、氮源、水和无机盐外，还需要添加 　 　，并在 　 　（填“有氧”或“无氧”）的环境条件下培养。 （2）拼接形成的融合基因不具备限制酶切割位点，利用PCR技术对融合基因进行扩增时，所用两种引物的5'端应分别添加 　 　序列，以实现融合基因定向插入质粒。 （3）为鉴定重组质粒是否构建成功，将重组质粒双酶切处理后电泳，结果如图2，泳道1为双酶切pNZ8149﹣2RBD，泳道2为双酶切pNZ8149﹣3RBD。泳道1两个条带大小分别为2507bp和2020bp，由此可知，融合基因3RBD的长度为 　 　bp，泳道2呈现一个条带的原因是 　 　。 （4）实验成功构建了表达融合蛋白的重组乳酸菌，结果发现，在蛋白表达量和稳定性相同的情况下，pNZ8149﹣2RBD菌株表面二聚体蛋白的含量比pNZ8149﹣3RBD菌株表面三聚体蛋白多，该现象说明 　 　。 24．瘦素是一种由脂肪组织合成和分泌的肽类激素。P载体含有的绿色荧光蛋白（GFP）基因能在真核细胞中表达GFP。将目的基因插入GFP基因后，能表达出目的蛋白和GFP的融合蛋白，根据荧光的强弱，可确定目的基因在细胞内的表达情况。为研究瘦素的功能，科学家构建了瘦素基因真核表达载体，检测瘦素基因在小鼠成纤维细胞中的表达情况。瘦素基因及P载体的结构如图所示。 回答下列问题。 （1）PCR扩增瘦素基因时，与引物1互补的a链左侧是脱氧核苷酸链的 　 　（填“5′”或“3′”）端。据图推测，构建该基因表达载体时，P载体上应有启动子、终止子、标记基因、复制原点、　 　。 （2）已知HindⅢ和BamHⅠ在P载体上的切割位点非常接近。为确定重组质粒是否构建成功，用HindⅢ、BamHⅠ分别对瘦素基因PCR产物、P载体和重组质粒双酶切，再进行电泳，结果如图所示。若重组质粒构建成功，请在图中将酶切结果对应位置的条带涂黑。 （3）Kanr/Neor是一种抗性基因，在真核细胞中表达具有新霉素抗性，而在原核细胞中表达具有卡那霉素抗性。同种基因在真核、原核细胞中表达结果不同，可能的原因是 　 　。本实验中为筛选转化的细胞，应在培养基中添加 　 　。 （4）为检测瘦素基因是否成功表达，可用的鉴定方法是 　 　（答出2种）。为进一步获得更多能表达融合蛋白的细胞，还需要进行 　 　。 25．科学家提出了利用基因工程改造大肠杆菌生产人胰岛素的方法：利用胰岛B细胞中的mRNA得到胰岛素基因，利用工程菌获得胰岛素。回答下列问题： （1）利用胰岛B细胞中的mRNA得到胰岛素基因需要 　 　酶。 （2）基因工程中的核心工作是 　 　，该过程需要的工具酶是 　 　。 （3）如图是利用基因工程生产人胰岛素过程中使用的质粒及目的基因的部分结构。 在设计PCR引物时最好添加限制酶 　 　的识别序列，选择依据是 　 　。 经GenBank检索后，得知胰岛素基因左端①处的碱基序列为﹣GCATTCTGAGGC﹣，则其中一种引物设计的序列是5′﹣　 　﹣3′。 高考生物一轮复习 基因工程 参考答案与试题解析 一．选择题（共20小题） 1．蛛丝蛋白是一种特殊纤维蛋白，具有强度高、韧性大等特点，在人工肌腱等医学领域有着诱人的前景。某研究小组提取一种丝绒蜘蛛中的蛛丝蛋白基因，将其导入大肠杆菌生产蛛丝蛋白。下列叙述正确的是（　　） A．构建蛛丝蛋白基因表达载体需要限制酶和DNA聚合酶 B．可通过显微注射的方法将蛛丝蛋白基因导入大肠杆菌 C．基因表达载体上的复制原点可调控蛛丝蛋白基因的表达 D．可通过蛋白质工程设计与改造蛛丝蛋白的结构以增强其韧性 【考点】蛋白质工程基本原理． 【专题】正推法；基因工程． 【答案】D 【分析】1、基因工程的基本操作步骤主要包括四步：①目的基因的筛选和获取；②基因表达载体的构建；③将目的基因导入受体细胞；④目的基因的检测与表达。 2、蛋白质工程：指以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求。 【解答】解：A、构建蛛丝蛋白基因表达载体需要限制酶和DNA连接酶，不需要DNA聚合酶，A错误； B、将目的基因导入微生物细胞常用感受态转化法，将目的基因导入动物细胞常用显微注射法，B错误； C、基因表达载体上的复制原点可调控蛛丝蛋白基因的复制，而不是表达，C错误； D、蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求。若需对蛛丝蛋白进行设计和改造以增强其韧性，可通过蛋白质工程来实现，D正确。 故选：D。 【点评】本题考查基因工程和蛋白质工程的相关知识，要求考生识记基因工程的操作步骤，掌握各操作步骤中需要注意的细节；识记蛋白质工程的基本程序，能结合所学的知识准确答题。 2．某同学利用洋葱为实验材料，进行DNA粗提取和鉴定实验。下列有关叙述错误的是（　　） A．该同学也可选择鸡血、猪肝等动物细胞为实验材料提取DNA，但方法可能有所不同 B．将洋葱切碎加研磨液研磨、过滤后，滤液放置4℃冰箱中静置几分钟后，DNA存在于沉淀物中 C．向含有DNA的粗提取液中加入体积分数为95%的冷酒精后，出现的白色丝状物为DNA D．鉴定DNA时，需先将DNA溶解在2mol/LNaCl溶液，再加入二苯胺试剂并进行沸水浴加热 【考点】DNA的粗提取与鉴定． 【专题】正推法；基因工程． 【答案】B 【分析】DNA粗提取和鉴定的原理： （1）DNA的溶解性：DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同；DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精。 （2）DNA的鉴定：在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会呈现蓝色。 【解答】解：A、理论上只要含有DNA的生物组织均可作为该实验的材料，因此鸡血，猪肝等均可作为提取DNA的材料，但方法可能有所不同，A正确； B、将洋葱切碎加研磨液研磨、过滤后，滤液放置4℃冰箱中静置几分钟后，DNA存在于上清液中，B错误； C、向含有DNA的粗提取液中加入体积分数为95%的冷酒精后，出现的白色丝状物为粗提取的DNA，C正确； D、鉴定DNA时，需先将DNA溶解在2mol/LNaCl溶液，再加入二苯胺试剂并进行沸水浴加热，待试管冷却后观察颜色变化，D正确。 故选：B。 【点评】本题主要考查DNA的粗提取与鉴定等相关知识点，意在考查学生对相关知识点的理解和掌握。 3．下列有关基因工程的叙述正确的是（　　） A．将目的基因导入植物细胞采用最多的方法是花粉管通道法 B．将某药用蛋白基因导入动物乳腺细胞中可获得乳腺生物反应器 C．目的基因扩增完成后的产物常用琼脂糖凝胶电泳进行鉴定 D．可通过RNA分子标记检测目的基因是否成功表达 【考点】基因工程的操作过程综合． 【专题】正推法；基因工程． 【答案】C 【分析】基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成； （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括复制原点、目的基因、启动子、终止子和标记基因等； （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是钙离子处理法； （4）目的基因的检测与鉴定： 分子水平上的检测： 检测目的基因是否导入或转录：PCR技术； 检测目的基因是否翻译成蛋白质：抗原﹣抗体杂交技术； 个体水平上的鉴定： 抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【解答】解：A、将目的基因导入植物细胞采用最多的方法是农杆菌转化法，A错误； B、将某药用蛋白基因导入动物受精卵中可获得乳腺生物反应器，B错误； C、PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来，C正确； D、目的基因是否成功表达可用抗原﹣抗体杂交法，D错误。 故选：C。 【点评】本题考查了基因工程的相关知识，意在考查考生理解所学知识要点，把握知识间内在联系的能力；能运用所学知识，对生物学问题作出准确的判断，难度适中。 4．t﹣PA蛋白能高效降解由纤维蛋白凝聚而成的血栓，是心梗和脑血栓的急救药。但t﹣PA与纤维蛋白结合的特异性不高，给心梗患者注射大量t﹣PA会诱发颅内出血。若将t﹣PA第84位的半胱氨酸换成丝氨酸，获得改良药物t﹣PA，能显著降低出血副作用。下列叙述正确的是（　　） A．对t﹣PA蛋白的改良，是以基因的结构和功能的关系为理论基础 B．在该研究中目前可行的直接操作对象是控制t﹣PA合成的基因 C．通过蛋白质工程制备t﹣PA蛋白可以不用构建基因表达载体 D．将改良的t﹣PA基因直接注入大肠杆菌，是生产改良t﹣PA蛋白的核心步骤 【考点】蛋白质工程基本原理． 【专题】正推法；基因工程． 【答案】B 【分析】蛋白质工程：指以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求（基因工程在原则上只能生产自然界已存在的蛋白质）。 【解答】解：A、对t﹣PA蛋白的改良，属于蛋白质工程的范畴，是以蛋白质的结构和功能的关系为理论基础，A错误； B、蛋白质的改造工程直接改变的是控制蛋白质合成所对应的基因，B正确； CD、蛋白质工程是基因工程的延伸，同样需要构建表达载体，构建基因表达载体是生产改良t﹣PA蛋白的核心步骤，CD错误。 故选：B。 【点评】本题主要考查蛋白质工程的内容，要求考生识记相关知识，并结合所学知识准确答题。 5．水蛭是我国的传统中药材，主要药理成分水蛭素为水蛭蛋白中重要成分之一，具有良好的抗凝血作用。科研人员拟通过蛋白质工程改造水蛭素结构，提高其抗凝血活性。将提取的水蛭蛋白经甲、乙两种蛋白酶水解后，分析水解产物中的肽含量及其抗凝血活性，结果如图所示。下列叙述错误的是（　　） A．水蛭蛋白经两种酶处理后水解产物的抗凝血活性差异主要与其肽含量有关 B．酶甲处理使水蛭素抗凝血活性提高的可能原因是使其有活性的结构域部位暴露 C．要获得水蛭素的基因，可以从水蛭细胞中提取mRNA，经逆转录获得目的基因 D．上述实验目的是了解水蛭素蛋白中影响抗凝血活性的部分以设计蛋白质三维结构 【考点】蛋白质工程基本原理． 【专题】坐标曲线图；基因工程． 【答案】A 【分析】据图可知，水蛭蛋白经甲、乙两种蛋白酶水解后，水解产物中的肽含量随着时间的延长均上升，且差别不大；而水解产物中抗凝血活性有差异，经酶甲处理后，随着酶解时间延长，抗凝血活性先上升后相对稳定，经酶乙处理后，随着酶解时间的延长，抗凝血活性先上升后下降，且酶甲处理后的酶解产物的抗凝血活性最终明显高于经酶乙处理的酶解产物的抗凝血活性；据此推测两种处理后酶解产物的抗凝血活性差异主要与肽的种类有关，导致其活性不同的原因可能是对水蛭蛋白进行酶解时所用酶的种类不同，导致水蛭蛋白水解产物的空间结构不同。 【解答】解：A、两种酶水解水蛭蛋白后，肽的含量的两条曲线比较接近，说明抗凝血的活性与肽的含量关联不大，A错误； B、酶甲处理后的酶解产物的抗凝血活性先上升后相对稳定，由此推测酶甲处理使水蛭素抗凝血活性提高的可能原因是使其有活性的结构域部位暴露，B正确； C、为了获得水蛭素基因，需要从细胞中提取水蛭素基因转录的mRNA，经逆转录获取目的基因，C正确； D、对水蛭素进行分子改造使用的技术是蛋白质工程，获得上述分子的基本途径为：预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有氨基酸序列→据氨基酸序列推出脱氧核苷酸序列（基因）→DNA合成，上述实验目的是了解水蛭素蛋白中影响抗凝血活性的部分以设计蛋白质三维结构，D正确。 故选：A。 【点评】本题考查蛋白质工程的相关知识，意在考查学生的识记能力和判断能力，运用所学知识综合分析问题的能力是解答本题的关键。 6．实验小组利用PCR技术获得了含有目的基因的DNA片段，并用图示的限制酶对其进行酶切，再用所得DNA片段成功构建了基因表达载体，下列叙述错误的是（　　） A．PCR技术中用到的一个引物的前8个碱基序列为5'﹣TGCGCAGT﹣3' B．步骤①中用到的限制酶是SpeⅠ和CfoⅠ C．用步骤①中的限制酶对质粒进行酶切，可至少获得2个DNA片段 D．可用E.coliDNA连接酶或T4DNA连接酶连接酶切后的目的基因片段和质粒 【考点】基因表达载体的构建；DNA片段的扩增与电泳鉴定；DNA连接酶． 【专题】模式图；基因工程． 【答案】B 【分析】DNA连接酶： （1）根据酶的来源不同分为两类：E.coliDNA连接酶、T4DNA连接酶。这二者都能连接黏性末端，此外T4DNA连接酶还可以连接平末端，但连接平末端时的效率比较低。 （2）DNA连接酶连接的是两个DNA片段之间的磷酸二酯键。 【解答】解：A、由于引物只能引导子链从5'到3'，根据碱基互补配对原则，其中一个引物序列为5'TGCGCAGT﹣3'，A正确； B、根据三种酶的酶切位点，左侧的黏性末端是使用NheⅠ切割形成的，右边的黏性末端是用CfoⅠ切割形成的，B错误； C、用步骤①的酶对载体进行酶切，使用了NheⅠ和CfoⅠ进行切割，根据他们的识别位点以及原本DNA的序列，切割之后至少获得了2个片段，C正确； D、图中形成的是黏性末端，E.coliDNA连接酶只能连接黏性末端，T4DNA连接酶既可连接平末端，又可连接黏性末端，所以可用E.coliDNA连接酶或T4DNA连接酶连接酶切后的目的基因片段和质粒，D正确。 故选：B。 【点评】本题考查基因工程的相关知识，要求考生识记基因工程的操作工具及操作步骤，掌握各操作工具的作用和各操作步骤中需要注意的细节，能正确分析题图，再结合所学的知识准确答题。 7．红豆草是一种品质优良的豆科多年生高蛋白牧草作物，被誉为“牧草皇后”。为提高红豆草的耐盐性、增大种植范围，科研人员将盐生植物碱蓬中的耐盐基因SsPSL转入红豆草中，对转基因耐盐红豆草DNA进行PCR，再对PCR的产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定。下列有关叙述错误的是（　　） A．利用PCR获取和扩增耐盐基因SsPSL，需添加一种引物，四种核糖核苷酸等组分 B．构建基因表达载体是培育转基因耐盐红豆草的核心工作 C．将植物材料和农杆菌共同培养之前，植物材料需要消毒处理 D．凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来 【考点】DNA片段的扩增与电泳鉴定． 【专题】正推法；PCR技术；基因工程． 【答案】A 【分析】PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关，凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来。 【解答】解：A、利用PCR获取和扩增耐盐基因SsPSL，需添加两种引物，四种脱氧核苷酸等组分，A错误； B、构建基因表达载体是基因工程的核心，B正确； C、为防止杂菌污染，将植物材料和农杆菌共同培养之前，植物材料需要消毒处理，C正确； D、DNA分子的大小和构象等有关，凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来，D正确。 故选：A。 【点评】本题考查PCR技术、基因工程的相关知识，要求考生理解识记有关技术的原理及操作步骤，掌握各操作步骤中需要注意的细节，能将教材中的知识结合题中信息进行迁移应用。 8．普通棉花中β﹣甘露糖苷酶（GhMnaA2）基因表达出的GhMnaA2能催化半纤维素降解，使棉纤维长度变短。为了培育长绒棉，科研人员构建了反义GhMnaA2基因表达载体（将正义GhMnaA2基因与载体反向连接），获得了转基因长绒棉新品种，具体过程如图所示，SmaⅠ，NotⅠ，HindⅢ和BamHⅠ为酶切位点。用SmaⅠ和NotⅠ切割某正义表达载体可获得3kb、18kb、28kb、59kb4种长度的DNA片段。下列叙述正确的是（　　） A．正义GhMnaA2基因的转录方向是B→A B．①过程所得到的表达载体均为反义表达载体 C．反义GhMnaA2基因可能通过抑制GhMnaA2基因的翻译来保证棉纤维长度 D．用NotⅠ切割反义表达载体获得的DNA片段的长度为21kb和87kb 【考点】基因表达载体的构建． 【专题】模式图；基因工程． 【答案】C 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。 【解答】解：A、由图可知，NotI的酶切位点靠近GhMnaA2基因转录的起始端，其转录方向是A→B，A错误； B、①过程得到的表达载体可能为反义表达载体，也可能为正义表达载体，B错误； C、反义GhMnaA2基因转录出来的RNA与正常转录的mRNA互补，从而阻止其与核糖体结合，即反义GhMnaA2基因可能通过抑制GhMnaA2基因的翻译来保证棉纤维长度，C正确； D、用SmaI和NotI切割正义表达载体可获得3kb、18kb、28kb、59kb 4种长度的DNA片段，据此判断左侧SmaI和NotI之间的长度是59kb，A 位置的SmaI和NotI之间的长度是3kb，B位置处的SmaI和NotI之间的长度是18kb，右上角E6位置好处SmaI和NotI之间的长度是28kb。故用NotI切割反义表达载体获得的DNA片段的长度应分别为18kb+28kb＝46kb和3kb+59kb＝62kb，D错误。 故选：C。 【点评】本题主要考查的是基因工程的操作的相关知识，意在考查学生对基础知识的理解掌握，难度适中。 9．DNA分子的碱基具有吸收260nm波长光的特性。当DNA两条链碱基紧密连接时，吸光度偏低；两条链分离时，吸光度升高，因此DNA变性可通过DNA溶液对260nm波长光的吸光度来检测。肺炎链球菌DNA的变性曲线如图所示，吸光度达到最大值的50%时的温度称为熔解温度（Tm）。下列说法正确的是（　　） A．加热会破坏脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键使DNA变性 B．A、T碱基对所占比例越高的DNA，变性曲线中Tm值越高 C．加热至约70℃时DNA两条链从一端向另一端逐渐分离 D．利用PCR技术检测目的基因时需要先将DNA变性 【考点】DNA片段的扩增与电泳鉴定；DNA的结构层次及特点． 【专题】坐标曲线图；DNA分子结构和复制；PCR技术． 【答案】D 【分析】DNA变性的本质原因是：DNA双螺旋分子结构在某种因素的作用下，DNA分子互补碱基对之间的氢键断裂，使.DNA分子双螺旋结构疏散，双链裂解变成单链，进行解链反应，解链后即称为DNA变性。 【解答】解：A、加热是使DNA分子互补碱基对之间的氢键断裂，使DNA分子双螺旋结构疏散，双链裂解变成单链，进行解链反应，使DNA变性，A错误； B、A、T碱基对有两个氢键，C、G碱基对有三个氢键，A、T碱基对所占比例越高的DNA变性时需要的温度越低，即变性曲线中Tm值越低，B错误； C、加热至约70℃时DNA两条链同时分离，C错误； D、利用PCR技术检测目的基因时，需要先将DNA变性，使DNA双链打开，D正确。 故选：D。 【点评】本题考查DNA结构和复制等相关知识，意在考查学生的识记能力和判断能力，运用所学知识综合分析问题的能力。 10．我国的科研团队首次发现了高粱细胞中AT1基因编码的AT1蛋白可以调节作物的耐碱性表型，对于提高作物在盐碱地的存活率具有重要意义。在盐碱地种植的作物会受胁迫产生过量的有害物质H2O2。图中的PIP2s为某种水通道蛋白，其磷酸化水平影响H2O2的跨膜运输，其机理如图所示。下列叙述错误的是（　　） A．盐碱环境可引起大多数作物胞内液渗透压上升，吸水能力增强 B．PIP2s失活的植物细胞在高渗溶液中仍可以发生质壁分离 C．敲除AT1基因将导致PIP2s蛋白磷酸化被抑制，促进H2O2外排 D．可以将耐碱基因的成果应用到大豆、油菜等更多的作物提高其抗逆性 【考点】基因工程在农牧、医疗、食品等方面的应用；细胞的吸水和失水；物质跨膜运输的方式及其异同． 【专题】模式图；物质跨膜运输． 【答案】C 【分析】当细胞液的浓度小于外界溶液的浓度时，细胞液中的水就透过原生质层进入外界溶液中，使细胞壁和原生质层都出现一定程度的收缩，由于原生质层比细胞壁伸缩性大，表现出质壁分离；当细胞液的浓度大于外界溶液的浓度时，外界溶液中水就透过原生质层进入细胞液中，整个原生质层就会慢慢恢复原来的状态，表现出质壁分离的复原。 【解答】解：A、盐碱环境可引起大多数作物细胞失水，细胞内渗透压上升，吸水能力增强，A正确； B、PIP2s是水通道蛋白一种，PIP2s失活水分子依然可以通过其他水通道蛋白或者自由扩散进出细胞，因此在高渗溶液仍可以发生质壁分离，B正确； C、AT1蛋白能够抑制PIP2s蛋白的磷酸化，敲除AT1基因将解除其对PIP2s蛋白磷酸化的抑制，促进H2O2外排，C错误； D、可以通过基因工程将耐碱基因的成果应用到大豆、油菜等更多的作物提高其抗逆性，D正确。 故选：C。 【点评】本题主要考查物质跨膜运输、基因工程的应用等相关知识点，意在考查学生对相关知识点的理解和掌握。 11．科学家将外源抗虫基因（Bt抗虫蛋白基因）转入某茄科植物细胞中，并整合到该植物的线粒体DNA上，获得了具有抗虫性状的转基因植物。下列叙述，错误的是（　　） A．Bt抗虫蛋白在线粒体中的成功合成与密码子的通用性有关 B．叶肉细胞内有多个线粒体，这有利于增加该转基因植物的抗虫性 C．将该转基因植物与同种非转基因植物进行正、反交，所得子代均有抗虫性 D．该技术能有效避免或减少外源基因通过花粉向其他植物的转移 【考点】基因工程的操作过程综合． 【专题】正推法；基因工程． 【答案】C 【分析】基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成；（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等，标记基因可便于目的基因的鉴定和筛选。 （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法； （4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因——PCR技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA——PCR技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质——抗原﹣抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【解答】解：A、将外源抗虫基因（Bt抗虫蛋白基因）转入茄科植物细胞线粒体DNA并且成功表达，说明不同生物之间共用一套遗传密码，与密码子的通用性有关，A正确； B、叶肉细胞内有多个线粒体，这有利于增加该转基因植物的抗虫性，B正确； C、该转基因植物的抗虫基因整合到线粒体DNA上，属于细胞质遗传，与同种非转基因植物进行正、反交，所得子代是否有抗虫性是由母本决定的，C错误； D、该转基因植物的抗虫基因整合到线粒体DNA上，属于细胞质遗传，能有效避免或减少外源基因通过花粉向其他植物的转移，D正确。 故选：C。 【点评】本题主要考查的是基因工程的操作的相关知识，意在考查学生对基础知识的理解掌握，难度适中。 12．S基因与作物甜度相关，可用于培育转S基因作物新品系。已知S基因转录的模板链位于a链，转录时mRNA自身的延伸方向为5′→3′。如图，为使S基因按正确方向与质粒连接，酶切目的基因时选用的限制酶组合是（　　） A．BamHⅠ和HindⅢ B．BamHⅠ和EcoRⅠ C．MunⅠ和BamHⅠ D．EcoRⅠ和HindⅢ 【考点】基因表达载体的构建． 【专题】模式图；基因工程． 【答案】A 【分析】构建基因表达载体的过程：首先用一定的限制酶切割载体，使它出现一个切口；然后用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段；再利用DNA连接酶将目的基因片段拼接到载体的切口处，这样就形成了一个重组DNA分子 【解答】解：据图分析，S基因内部含有MunⅠ限制酶识别序列，质粒上EcoRⅠ识别位点没有在启动子和终止子之间，不宜选择；为使S基因按正确方向与质粒连接，则需要两种限制酶进行切割，综上可知，选择BamHⅠ和HindⅢ，A正确，BCD错误。 故选：A。 【点评】本题主要考查基因工程等相关知识等相关知识，意在考查考生理解所学知识要点，把握知识间内在联系的能力。 13．下列关于DNA片段扩增及电泳鉴定实验的说法，错误的是（　　） A．放入PCR仪前，需要对离心管进行离心，使反应液集中在底部 B．配置琼脂糖溶液时，需要根据DNA片段的大小调节琼脂糖浓度 C．电泳时需要的两种缓冲液分别含有核酸染料和指示剂 D．电泳时，需要根据电泳槽阳极至阴极之间的距离设定电压 【考点】DNA片段的扩增与电泳鉴定． 【专题】正推法；PCR技术． 【答案】C 【分析】电泳的原理：待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小、性状不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。 【解答】解：A、使用PCR技术的具体操作顺序是：按配方准备好各组分一用微量移液器将各组分依次加入微量离心管中→离心使反应液集中在离心管底部→设计好PCR仪的循环程序一进行PCR反应，因此放入PCR仪前，需要对离心管进行离心，使反应液集中在底部，A正确； B、PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关，因此根据DNA片段大小配制一定质量分数的琼脂糖溶液以便分离DNA分子，B正确； C、凝胶载样缓冲液内含指示剂，琼脂糖溶液加入核酸染料，电泳缓冲液不含有核酸染料，C错误； D、接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5V/cm，D正确。 故选：C。 【点评】本题考查了PCR技术的相关知识，意在考查考生理解所学知识要点，把握知识间内在联系的能力；能运用所学知识，对生物学问题作出准确的判断，难度适中。 14．RDX是一种弹药使用后残留的危险污染物。研究人员将两个源于细菌的RDX降解酶基因XplA和XplB插入柳枝稷草染色体中，如图所示，使柳枝稷草获得降解实弹射击场土壤中RDX的能力。若要通过PCR检测所获转基因柳枝稷草中是否含有正确插入的XplA和XplB基因，应选择的引物组合是（　　） A．引物1+引物3 B．引物1+引物4 C．引物2+引物3 D．引物2+引物4 【考点】DNA片段的扩增与电泳鉴定． 【专题】模式图；PCR技术． 【答案】A 【分析】引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。用于PCR 的引物长度通常为20～30个核苷酸，检测所获转基因柳枝稷草中是否含有正确插入的XplA和XplB基因，应该是扩增包括XplA和Xp1B基因和两侧T﹣DNA基因片段。 【解答】解：A、若正确插入，引物1以Xp1B的模板链为模板可以扩增出XplB基因加部分左侧T﹣DNA基因片段，引物3可以扩增出XplA基因和XplB基因片段，可以正确判断XplA和XplB基因插入顺序，A正确； B、引物1可以扩增出XplB基因加部分左侧T﹣DNA基因片段，引物4可以扩增出XplA基因加部分右侧T﹣DNA基因片段，但是无法确定XplA和XplB基因插入位置是否正确，B错误； C、引物2和引物3可以扩增出XplA、XpIB基因，证明两者同时存在，无法确定其是否插入到T﹣DNA 上，C错误； D、引物2可以扩增出XplB基因加部分XplA基因片段，引物4可以扩增出XplA基因加部分右侧T﹣DNA基因片段，但是无法确定XplA和XplB的正确插入顺序，D错误。 故选：A。 【点评】本题主要考查PCR技术及应用的相关知识，要求学生有一定的理解分析能力，能够结合题干信息和所学知识进行分析应用。 15．2022年1月7日，马兰里医学中心成功将猪心脏移植到一名57岁的心脏病患者身上，虽然这颗心脏仅仅存活了2个月，但仍然为异种器官移植的可行性提供了可观的数据。为了降低免疫排斥反应，研究者借助CRISPR/Cas9技术对移植的猪心脏进行了基因编辑。CRISPR/Cas9系统主要由向导RNA（sgRNA）和Cas9蛋白两部分组成，sgRNA可引导Cas9蛋白到特定基因位点进行切割、其机制如图所示。下列说法错误的是（　　） A．sgRNA通过与目标DNA序列互补配对引导Cas9蛋白到位 B．有时sgRNA会因错误结合而出现“脱靶”现象，一般sgRNA序列越短，脱靶率越低 C．Cas9蛋白作用于磷酸二酯键 D．可以通过设计sgRNA，靶向猪心脏的某个抗原蛋白基因的碱基序列，实现基因敲除 【考点】基因工程在农牧、医疗、食品等方面的应用． 【专题】模式图；基因工程． 【答案】B 【分析】CRISPR/Cas9基因编辑技术中，sgRNA是根据目标DNA人工设计合成的向导RNA，与Cas9蛋白结合形成复合物。由图可知，向导RNA能特异性识别目标DNA上相关序列并与之结合，从而使CRISPR/Cas9系统能精准识别相关基因。Cas9蛋白相当于限制酶，能使目标DNA中的磷酸二酯键断开，从而实现对DNA双链的切割。 【解答】解：A、由于DNA和RNA之间可进行碱基互补配对，因而sgRNA可以特异性识别目标DNA分子，进而引导Cas9蛋白到特定基因位点进行切割，A正确； B、sgRNA序列越短，DNA分子上与其互补的特定序列会越多，错误结合概率越高，脱靶率越高，B错误； C、Cas9蛋白为限制酶，可作用于磷酸二酯键进而可以将目标基因剪切下来，C正确； D、根据CRISPR/Cas9系统的作用，可以通过设计sgRNA，靶向猪心脏的某个抗原蛋白基因的碱基序列，实现基因敲除，D正确。 故选：B。 【点评】本题结合图解，考查基因工程技术的应用，要求考生识记基因工程的操作工具及各操作工具的作用，能正确分析题文和题图，明确其中的原理，再结合所学的知识准确答题。 16．XhoⅠ和SalⅠ是两种限制酶，某段DNA上的酶切位点如图1所示，用此两种酶分别处理该DNA片段一段时间，电泳后的结果如图2所示。下列叙述，错误的是（　　） A．图1中两种限制酶识别的脱氧核苷酸序列不同 B．泳道①是使用SalⅠ处理后的酶切产物的电泳结果 C．图2中电泳移动速度最慢的是泳道②最上方的那条带 D．同时使用SalⅠ和XhoⅠ处理，酶切产物的电泳结果为7个条带 【考点】限制性内切核酸酶；DNA片段的扩增与电泳鉴定． 【专题】模式图；基因工程． 【答案】D 【分析】根据图1可知，该DNA中含有2个XhoⅠ酶切位点和3个SalⅠ酶切位点。结合图2中，①有4种片段，②有3种片段可知，前者是SalⅠ酶切产物，后者是XhoⅠ酶切产物。 【解答】解：A、不同的限制酶识别并切割的脱氧核苷酸序列不同，图1中两种酶识别的脱氧核苷酸序列不同，A正确； B、根据图2分析泳道①中是用SalⅠ处理（其有3处切割位点，切割后产生4个DNA片段）得到的酶切产物，B正确； C、电泳移动速度快慢主要与DNA片段大小有关，泳道②最上方的那条带离点样孔最近，所以移动速度最慢，C正确； D、由题图可知，若用SalⅠ和XhoⅠ同时切割该DNA，该DNA的每个酶切位点都会被切开，则将被切成6个片段，如果6个片段分子大小不同则在泳道中出现6条条带，如果其中有片段分子大小相同，则条带数目小于6条，D错误。 故选：D。 【点评】本题考查基因工程等相关知识点，意在考查根据题干中信息以及所学知识相结合解决问题的能力。 17．高温会造成叶绿体内活性氧（ROS）大量累积，类囊体薄膜的核心蛋白D1对ROS尤为敏感，极易受到破坏。近期我国科学家将编码D1的psbA基因（位于叶绿体基因组）与高温响应的启动子连接，导入水稻细胞的核基因组中，补充了一条由高温响应启动子驱动的D1合成途径，与野生水稻相比，在高温下转基因水稻光能利用能力显著提高。下列说法错误的是（　　） A．该研究中高温响应的启动子属于诱导型启动子 B．转基因水稻CO2的同化速率较野生型水稻也相应提高 C．细胞原有的和补充的D1合成途径的mRNA转录场所相同 D．该研究为全球气候变暖造成的粮食高温胁迫提供了解决方案 【考点】基因工程在农牧、医疗、食品等方面的应用；遗传信息的转录和翻译． 【专题】正推法；基因工程． 【答案】C 【分析】诱导型启动子：当诱导物存在时，可以激活或抑制目的基因的表达。 【解答】解：A、结合题意，该研究中高温响应的启动子属于诱导型启动子，A正确； B、与野生水稻相比，在高温下转基因水稻光能利用能力显著提高，故转基因水稻CO2的同化速率较野生型水稻也相应提高，B正确； C、编码D1的psbA基因位于叶绿体基因组，转录场所为叶绿体，而补充的D1合成途径的mRNA转录场所为细胞核，C错误； D、该研究可以使植物在高温下固定二氧化碳增多，为全球气候变暖造成的粮食高温胁迫提供了解决方案，D正确。 故选：C。 【点评】本题考查基因工程等相关知识点，要求考生识记相关知识点，能结合所学的知识准确答题。 18．关于“DNA粗提取和鉴定”以及“DNA片段的扩增及电泳鉴定”实验，下列说法错误的是（　　） A．将洋葱研磨液离心是为了加速杂质的沉淀 B．根据DNA在不同浓度NaCl溶液中的溶解度不同，可去除部分杂质 C．DNA分子在电场作用下可以带上正电荷或负电荷 D．PCR实验中使用的微量离心管和枪头在使用前需进行高压灭菌处理 【考点】DNA的粗提取与鉴定；DNA片段的扩增与电泳鉴定． 【专题】正推法；从生物材料提取特定成分． 【答案】C 【分析】电泳法：利用分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状不同，使带电分子产生不同的迁移速率，从而实现样品中各种分子的分离。原理：在一定的pH下，多肽、核酸等生物大分子的可解离基团会带上正电或负电，在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。 【解答】解：A、将洋葱研磨液离心是为了加速杂质的沉淀，A正确； B、根据DNA在不同浓度NaCl溶液中的溶解度不同，可去除部分杂质，B正确； C、DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带点分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，C错误； D、PCR实验中使用的微量离心管、枪头、蒸馏水在使用前都必须进行高压蒸汽灭菌处理，D正确。 故选：C。 【点评】本题考查“DNA粗提取和鉴定”以及“DNA片段的扩增及电泳鉴定”实验的相关知识，意在考查学生的识记能力和判断能力，具备运用所学知识综合分析问题的能力是解答本题的关键。 19．用氨苄青霉素抗性基因（AmpR）、四环素抗性基因（TetR）作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建重组质粒，并转化到受体菌中。下列叙述不正确的是（　　） A．若用HindⅢ酶切，通过筛选可得到两种目的基因连入方向的重组质粒 B．若用PvuⅠ酶切，在含氨苄青霉素的培养基上形成的菌落一定不含目的基因 C．若用SphⅠ酶切，使用双抗生素平板筛选即可获得正确的重组质粒 D．若用ScaⅠ酶切，可通过琼脂糖凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建是否成功 【考点】基因表达载体的构建． 【专题】模式图；基因工程． 【答案】C 【分析】分析题图，图中质粒内，氨苄青霉素抗性基因（AmpR）内含有ScaⅠ和PvuⅠ的酶切位点，四环素抗性基因（TetR）内含有HindⅢ、SphⅠ和SalⅠ的酶切位点。 【解答】解：A、若用HindⅢ酶切，由于形成的黏性末端相同，因此目的基因可正向连接到质粒中，也可反向连接到质粒中，即通过筛选可得到两种目的基因连入方向的重组质粒，A正确； B、氨苄青霉素抗性基因（AmpR）内含有ScaⅠ和PvuⅠ的酶切位点，若用PvuⅠ酶切，目的基因的插入会破坏氨苄青霉素抗性基因，因此在含氨苄青霉素的培养基上形成的菌落一定不含目的基因，B正确； C、SphⅠ的酶切位点位于四环素抗性基因中，若用SphⅠ酶切，重组质粒中含氨苄青霉素抗性基因（AmpR），而导入空质粒的含有氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因，因此携带目的基因的受体菌在含Amp（氨苄青霉素）的培养基中能形成菌落，在含Tet的培养基中不能形成菌落，故若用SphⅠ酶切，使用双抗生素平板筛选即可获得含有正确的重组质粒的菌体，而非获得正确的重组质粒，C错误； D、若用SalⅠ酶切，目的基因可能正向插入，也可能反向插入，可通过琼脂糖凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否，D正确。 故选：C。 【点评】本题考查基因工程的相关知识，意在考查学生的识记能力和判断能力，具备运用所学知识综合分析问题的能力是解答本题的关键。 20．免疫PCR是对微量抗原的一种检测方法。如图是利用该技术检测牛乳中微量抗生素的流程图：首先将抗体1固定在微板上，冲洗后加入待检的牛乳，再加入DNA标记的抗体2，进行PCR扩增，最后进行电泳检测。下列相关叙述正确的是（　　） A．图示抗原检测过程发生三次抗原与抗体的结合 B．图示过程所需抗体可用动物细胞工程技术制取 C．图示过程中三次冲洗都是为了去除未结合的抗体 D．PCR扩增获得产物的量只与标记DNA数量有关 【考点】DNA片段的扩增与电泳鉴定． 【专题】模式图；PCR技术． 【答案】B 【分析】免疫PCR是一种抗原检测系统，将一段已知序列的DNA片段标记到抗体2上，通过抗原抗体的特异性识别并结合，抗体2会和固定抗体1、抗生素形成复合物“固定抗体1—抗生素—抗体2”，再用PCR方法将这段DNA进行扩增，通过检测PCR产物的量，即可推知固定抗体1上吸附的抗生素的量。 【解答】解：A、据图可知，图示抗原检测过程分别与抗体1和抗体2结合了一次，共发生两次抗原与抗体的结合，A错误； B、图示过程所需抗体可通过动物细胞工程技术（单克隆抗体技术）制取，B正确； C、图示过程，第一次冲洗是为了去除未结合的抗体1，第二次冲洗是为了去除未结合的抗生素和牛奶成分，第三次冲洗是为了去除未结合的抗体2，C错误； D、PCR扩增获得产物的量与标记DNA数量、扩增次数等有关，D错误。 故选：B。 【点评】本题主要考查的是DNA片段的扩增与电泳鉴定的相关知识，意在考查学生对基础知识的理解掌握，难度适中。 二．解答题（共5小题） 21．东方果蝇会对水果造成严重影响，田间雌蝇数量与经济损失直接相关。 （1）研究发现，东方果蝇中dsx基因 　转录　出的前体RNA在加工过程中具有独特的性别选择性剪接机制。利用这一特性研发雌性特异性致死基因系统。 （2）蓖麻毒素A（RTA）可通过破坏核糖体导致细胞死亡。研究者获得如图1所示的融合基因1，进而得到转基因果蝇。 ①根据图1，扩增dsx内含子应选择的引物是 　ad　（选填字母）。 ②由于存在性别选择性剪接机制，雌雄转基因果蝇dsx基因前体RNA保留或剪切内含子和剪切识别序列情况不同，产生了不同版本的成熟mRNA，导致雌蝇特异性致死。判断转基因雌蝇中的成熟mRNA为 　C　（如图3填字母序号）。转基因的雄性个体不会致死的原因是 　在雄性个体中，融合基因1的成熟mRNA含有dsx内含子的对应序列，无法表达完整的RTA蛋白，不会导致细胞死亡　。 （3）研究发现，RTA蛋白第212位甘氨酸替换为精氨酸会出现冷敏感效应（cs），即当温度由29℃变为18℃时，可抑制RTA蛋白对细胞的致死作用。利用此特性培育纯合转基因果蝇。 ①欲得到具有cs效应的RTAcs蛋白，推测对应的基因碱基序列，经定点突变获得融合基因2（如图2所示）。请在方框中画出可继续延伸的复性结果，要求标明每条链的5′端和3′端。 　　 ②对转入融合基因2的果蝇进行以下操作： ⅰ：在29℃收集雄性果蝇（G0）。 ⅱ：G0与野生型果蝇杂交，筛选出转基因受精卵（G1）。 ⅲ：将每对亲本的受精卵（G1）均分为两组，分别在 18℃和29℃孵化培养，统计两组中雄性个体所占比例，若 　18℃组雄性个体所占比例小于29℃组　，则说明G1具有cs效应。 ⅳ：在 　18　℃继续培养具有cs效应的G1果蝇，使之连续多代自交，得到转基因纯合子。 【考点】基因工程的操作过程综合． 【专题】图文信息类简答题；基因工程． 【答案】（1）转录 （2）ad C 在雄性个体中，融合基因1的成熟mRNA含有dsx内含子的对应序列，无法表达完整的RTA蛋白，不会导致细胞死亡 （3） 18℃组雄性个体所占比例小于29℃组 18 【分析】1、基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品；基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，又叫做DNA重组技术。 2、基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成； （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等，标记基因可便于目的基因的鉴定和筛选。启动子是驱动基因转录的元件，而终止子是指示转录终止的位置； （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法； （4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因——PCR技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA——PCR技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质——抗原﹣抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【解答】解：（1）转录是以DNA的一条链为模板合成RNA的过程，东方果蝇中dsx基因（DNA）通过转录形成前体RNA。 （2）①用于PCR扩增的引物是根据一段已知目的基因的核苷酸序列来设计的，这一对引物位于基因上游和下游，根据图1，扩增dsx内含子应选择的引物是ad。 ②RTA基因表达出的蓖麻毒素A（RTA）可通过破坏核糖体导致细胞死亡，由此可知，雌蝇特异性致死的原因是转基因雌蝇个体中含有完整的RTA基因，能成功表达出蓖麻毒素A（RTA），由此判断转基因雌蝇中的成熟mRNA为C。而在雄性个体中，融合基因1的成熟mRNA含有dsx内含子的对应序列，无法表达完整的RTA蛋白，不会导致细胞死亡，因此雄性个体不会致死。 （3）①图2虚线方框中的两条链在延伸过程中，既可作为模板又可以起到相当于引物的作用，使耐高温的DNA聚合酶能够从两条链的3’端开始连接脱氧核苷酸，继续延伸的复性结果如下：。 ②由题意可知：RTA蛋白第212位甘氨酸替换为精氨酸会出现冷敏感效应（cs），即当温度由29℃变为18℃时，可抑制RTA蛋白对细胞的致死作用。 对转入融合基因2的果蝇进行以下操作： ⅰ：在29℃收集雄性果蝇（G0）（全为转基因雄性果蝇）。 ⅱ：G0与野生型果蝇杂交，筛选出转基因受精卵（G1）。 ⅲ：将每对亲本的受精卵（G1）均分为两组，分别在18℃和29℃孵化培养，统计两组中雄性个体所占比例，若G1具有cs效应，则18℃组雄性个体所占比例小于29℃组。 ⅳ：在18℃时可抑制RTA蛋白对细胞的致死作用，为通过多代自交得到转基因纯合子，应在18℃继续培养具有cs效应的G1果蝇。 故答案为： （1）转录 （2）ad C 在雄性个体中，融合基因1的成熟mRNA含有dsx内含子的对应序列，无法表达完整的RTA蛋白，不会导致细胞死亡 （3） 18℃组雄性个体所占比例小于29℃组 18 【点评】本题主要考查的是基因工程的操作的相关知识，意在考查学生对基础知识的理解掌握，难度适中。 22．光敏色素基因在调节作物生长发育中具有重要作用。为探讨玉米中光敏色素基因A（含大约256个碱基对）在棉花种质资源中的利用价值，研究人员将A基因转入到棉花中，对棉花受体细胞进行检测，并通过电泳技术分析结果。该过程所用质粒上相关限制酶的酶切位点如图甲所示，电泳检测结果如图乙所示。回答下列问题： （1）操作过程中需要用到的工具有 　限制性内切核酸酶（限制酶）、DNA连接酶和载体　，构建表达载体时应选用 　BclⅠ和HindⅢ　这两种限制酶处理质粒。 （2）为保证通过mRNA逆转录获得的光敏色素基因A和质粒的充分连接，一般需要在该基因上、下游引物的 　5'　端分别添加酶切位点。一般在这两部位添加不同的酶切位点，主要目的是 　使DNA片段能定向插入表达载体，减少自连　。 （3）A同学认为仅由图乙电泳结果不能确定1、3、4号转基因棉花均培育成功，理由是 　由图乙可知1、3、4号均成功导入光敏色素基因A，但转基因棉花是否培育成功还需要进行生物个体水平上的鉴定　。 （4）在生物学领域，对光敏色素进行分子改造使用的技术是蛋白质工程。获得光敏色素分子的基本途径为：　预期的光敏色素的功能　→设计预期的光敏色素的分子结构→推测应有的 　氨基酸序列　→找到相对应的脱氧核苷酸序列。 【考点】基因工程的操作过程综合． 【专题】图文信息类简答题；基因工程． 【答案】（1）限制性内切核酸酶（限制酶）、DNA连接酶和载体；BclⅠ和HindⅢ （2）5'；使DNA片段能定向插入表达载体，减少自连 （3）由图乙可知1、3、4号均成功导入光敏色素基因A，但转基因棉花是否培育成功还需要进行生物个体水平上的鉴定 （4）预期的光敏色素的功能；氨基酸序列 【分析】基因工程技术的基本步骤：1、目的基因的获取；2、基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤；3、将目的基因导入受体细胞；4、目的基因的检测与鉴定。 【解答】解：（1）该操作需借助基因工程才能实现，因此操作过程中需要用到的工具有限制性内切核酸酶、DNA连接酶和载体。由图可知：构建基因表达载体时，应选用BclI和HindⅢ这两种限制酶，若用BamHI，则目的基因会产生相同的末端而出现自身环化的现象且破坏标记基因。 （2）DNA合成方向总是从子链的5'端向3'端延伸，酶切位点应设置在扩增序列的外侧，这样酶切时不会破坏目的基因的序列，因此应添加在引物的5'端，加入不同的限制酶酶切位点，在酶切后会形成不同的末端，从而保证DNA片段能定向插入表达载体，减少自连。 （3）光敏色素基因A含大约256个碱基对，由图乙可知1、3、4号均成功导入光敏色素基因A，但转基因棉花是否培育成功还需要进行生物个体水平上的鉴定。 （4）在生物学领域，对光敏色素进行分子改造使用的技术是蛋白质工程。获得光敏色素分子的基本途径为：预期的光敏色素的功能→设计预期的光敏色素的分子结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列。 故答案为： （1）限制性内切核酸酶（限制酶）、DNA连接酶和载体；BclⅠ和HindⅢ （2）5'；使DNA片段能定向插入表达载体，减少自连 （3）由图乙可知1、3、4号均成功导入光敏色素基因A，但转基因棉花是否培育成功还需要进行生物个体水平上的鉴定 （4）预期的光敏色素的功能；氨基酸序列 【点评】本题考查基因工程的相关知识，意在考查学生的识记能力和判断能力，具备运用所学知识综合分析问题的能力是解答本题的关键。 23．利用乳酸菌构建表达抗原蛋白的工程菌是研究抗原应用的重要手段之一。口服的乳酸菌可在消化道内定植存活，其表达的抗原蛋白可锚定于细胞表面（穿过细胞膜展示在细胞表面），诱导机体产生免疫反应。科学家将某病毒抗原蛋白的部分编码序列（RBD）拼接成融合基因2RBD和3RBD，探究RBD的二聚体蛋白和三聚体蛋白能否模拟抗原蛋白中RBD的天然构象并获得高效免疫原性。重组质粒构建流程如图1所示，NcoⅠ和SacⅠ是pNZ8149质粒上的限制酶识别位点，U﹣M为信号肽﹣细胞壁锚定蛋白序列。回答下列问题： （1）为满足乳酸菌生长的特殊需求，培养基除了提供碳源、氮源、水和无机盐外，还需要添加 　维生素　，并在 　无氧　（填“有氧”或“无氧”）的环境条件下培养。 （2）拼接形成的融合基因不具备限制酶切割位点，利用PCR技术对融合基因进行扩增时，所用两种引物的5'端应分别添加 　限制酶NcoⅠ和SacⅠ的识别　序列，以实现融合基因定向插入质粒。 （3）为鉴定重组质粒是否构建成功，将重组质粒双酶切处理后电泳，结果如图2，泳道1为双酶切pNZ8149﹣2RBD，泳道2为双酶切pNZ8149﹣3RBD。泳道1两个条带大小分别为2507bp和2020bp，由此可知，融合基因3RBD的长度为 　2686bp　bp，泳道2呈现一个条带的原因是 　双酶切pNZ8149﹣3RBD后产生的两个片段大小相近　。 （4）实验成功构建了表达融合蛋白的重组乳酸菌，结果发现，在蛋白表达量和稳定性相同的情况下，pNZ8149﹣2RBD菌株表面二聚体蛋白的含量比pNZ8149﹣3RBD菌株表面三聚体蛋白多，该现象说明 　二聚体蛋白比三聚体蛋白更容易穿过细胞膜从而展示在细胞表面　。 【考点】基因工程的操作过程综合． 【专题】图文信息类简答题；基因工程． 【答案】（1）维生素 无氧 （2）限制酶NcoⅠ和SacⅠ的识别 （3）2686bp 双酶切pNZ8149﹣3RBD后产生的两个片段大小相近 （4）二聚体蛋白比三聚体蛋白更容易穿过细胞膜从而展示在细胞表面 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成；（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等；（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样；（4）目的基因的检测与鉴定。 【解答】解：（1）为满足乳酸菌生长的特殊需求，培养基除了提供碳源、氮源、水和无机盐外，还需要添加维生素，乳酸菌属于厌氧菌，需要在无氧的环境条件下培养。 （2）根据质粒上启动子、终止子与限制酶识别序列的位置关系可知，为保证融合基因定向插入，应选择两种限制酶切割，所用两种引物的5'端应分别添加限制酶NcoⅠ和SacⅠ的识别序列。 （3）由图可知pNZ8149﹣2RBD和pNZ8149﹣3RBD的碱基对分别为4527bp和5193bp，所以RBD长度为5193﹣4527＝666bp，泳道1为双酶切pNZ8149﹣2RBD，两个条带大小分别为2507bp和2020bp，所以融合基因3RBD的长度为666+2020＝2686bp，泳道2呈现一个条带的原因是双酶切pNZ8149﹣3RBD后产生的两个片段大小相近。 （4）实验成功构建了表达融合蛋白的重组乳酸菌，结果发现，在蛋白表达量和稳定性相同的情况下，pNZ8149﹣2RBD菌株表面二聚体蛋白的含量比pNZ8149﹣3RBD菌株表面三聚体蛋白多，由于抗原蛋白需穿过细胞膜展示在细胞表面，因此该现象说明二聚体蛋白比三聚体蛋白更容易穿过细胞膜从而展示在细胞表面。 故答案为： （1）维生素 无氧 （2）限制酶NcoⅠ和SacⅠ的识别 （3）2686bp 双酶切pNZ8149﹣3RBD后产生的两个片段大小相近 （4）二聚体蛋白比三聚体蛋白更容易穿过细胞膜从而展示在细胞表面 【点评】本题主要考查的是基因工程的操作的相关知识，意在考查学生对基础知识的理解掌握的能力，难度适中。 24．瘦素是一种由脂肪组织合成和分泌的肽类激素。P载体含有的绿色荧光蛋白（GFP）基因能在真核细胞中表达GFP。将目的基因插入GFP基因后，能表达出目的蛋白和GFP的融合蛋白，根据荧光的强弱，可确定目的基因在细胞内的表达情况。为研究瘦素的功能，科学家构建了瘦素基因真核表达载体，检测瘦素基因在小鼠成纤维细胞中的表达情况。瘦素基因及P载体的结构如图所示。 回答下列问题。 （1）PCR扩增瘦素基因时，与引物1互补的a链左侧是脱氧核苷酸链的 　3'　（填“5′”或“3′”）端。据图推测，构建该基因表达载体时，P载体上应有启动子、终止子、标记基因、复制原点、　HindⅢ和BamHⅠ切割位点　。 （2）已知HindⅢ和BamHⅠ在P载体上的切割位点非常接近。为确定重组质粒是否构建成功，用HindⅢ、BamHⅠ分别对瘦素基因PCR产物、P载体和重组质粒双酶切，再进行电泳，结果如图所示。若重组质粒构建成功，请在图中将酶切结果对应位置的条带涂黑。 （3）Kanr/Neor是一种抗性基因，在真核细胞中表达具有新霉素抗性，而在原核细胞中表达具有卡那霉素抗性。同种基因在真核、原核细胞中表达结果不同，可能的原因是 　Kanr/Neor抗性基因在真核与原核细胞中有不同的启动子（或转录后的加工不同或翻译后的加工不同）　。本实验中为筛选转化的细胞，应在培养基中添加 　新霉素　。 （4）为检测瘦素基因是否成功表达，可用的鉴定方法是 　抗原—抗体杂交、检测细胞绿色荧光的强度　（答出2种）。为进一步获得更多能表达融合蛋白的细胞，还需要进行 　动物细胞培养　。 【考点】基因工程的操作过程综合． 【专题】模式图；基因工程． 【答案】（1）3'；HindⅢ和BamHⅠ切割位点 （2） （3）Kanr/Neor抗性基因在真核与原核细胞中有不同的启动子（或转录后的加工不同或翻译后的加工不同）；新霉素 （4）抗原—抗体杂交、检测细胞绿色荧光的强度；动物细胞培养 【分析】基因工程的基本操作程序：目的基因的筛选和获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测和鉴定。 【解答】解：（1）PCR扩增瘦素基因时，引物1需与脱氧核苷酸链的3'端相结合。据图推测，构建该基因表达载体时，P载体上应有启动子、终止子、标记基因、复制原点、HindⅢ和BamHⅠ切割位点。 （2）如图，HindⅢ和BamHⅠ对瘦素基因PCR产物酶切后的条带为第2个条带；P载体为4700bp，且HindⅢ和BamHⅠ在P载体上的切割位点非常接近，故HindⅢ和BamHⅠ切割P载体之后的条带在标准条带5000bp附近，即第1个条带；重组质粒是目的基因和质粒拼接形成的，故双酶切后形成2个条带，如图： 。 （3）同种基因在真核、原核细胞中表达结果不同，可能的原因是Kanr/Neor抗性基因在真核与原核细胞中有不同的启动子（或转录后的加工不同或翻译后的加工不同）。由题意，实验目的为检测瘦素基因在小鼠成纤维细胞中的表达情况，重组质粒需要导入真核细胞，即实验中筛选转化的细胞使应在培养基中添加新霉素。 （4）由题意，P载体含有的绿色荧光蛋白（GFP）基因，故为检测瘦素基因是否成功表达，可用的鉴定方法是抗原—抗体杂交、检测细胞绿色荧光的强度。进行动物细胞培养，可以获得更多能表达融合蛋白的细胞。 故答案为： （1）3'；HindⅢ和BamHⅠ切割位点 （2） （3）Kanr/Neor抗性基因在真核与原核细胞中有不同的启动子（或转录后的加工不同或翻译后的加工不同）；新霉素 （4）抗原—抗体杂交、检测细胞绿色荧光的强度；动物细胞培养 【点评】本题考查基因工程等相关知识，意在考查学生的识记能力和判断能力，运用所学知识综合分析问题的能力是解答本题的关键。 25．科学家提出了利用基因工程改造大肠杆菌生产人胰岛素的方法：利用胰岛B细胞中的mRNA得到胰岛素基因，利用工程菌获得胰岛素。回答下列问题： （1）利用胰岛B细胞中的mRNA得到胰岛素基因需要 　逆转录/反转录　酶。 （2）基因工程中的核心工作是 　基因表达载体的构建　，该过程需要的工具酶是 　限制酶和DNA连接酶　。 （3）如图是利用基因工程生产人胰岛素过程中使用的质粒及目的基因的部分结构。 在设计PCR引物时最好添加限制酶 　EcoRⅠ和XhoⅠ　的识别序列，选择依据是 　MunⅠ会破坏氨苄青霉素抗性基因，SalⅠ和NheⅠ会破坏目的基因　。 经GenBank检索后，得知胰岛素基因左端①处的碱基序列为﹣GCATTCTGAGGC﹣，则其中一种引物设计的序列是5′﹣　GAATTCCGTAAGACTCCG　﹣3′。 【考点】基因工程的操作过程综合． 【专题】图文信息类简答题；物质跨膜运输． 【答案】（1）逆转录/反转录 （2）基因表达载体的构建 限制酶和DNA连接酶 （3）EcoRⅠ和XhoⅠMunⅠ会破坏氨苄青霉素抗性基因，SalⅠ和NheⅠ会破坏目的基因 GAATTCCGTAAGACTCCG 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。 【解答】解：（1）mRNA在逆转录酶的催化作用下通过逆转录过程把遗传信息传递到DNA分子，就获得了胰岛素基因。 （2）基因工程的核心是基因表达载体的构建，该过程中需要使用限制酶（切割目的基因和运载体）和DNA连接酶（连接切割后的目的基因和运载体）。 （3）由图可知，对于目的基因，SalⅠ和NheⅠ的作用位点在目的基因的中间，会破坏目的基因，则在引物设计时不能选用这两种限制酶，同时质粒上MunⅠ的其中一个作用位点是在标记基因上，所以只能选择EcoRⅠ和XhoⅠ两种限制酶，故在设计PCR引物时最好添加限制酶EcoRⅠ和XhoⅠ的识别序列；为了目的基因能正确表达，由目的基因的转录方向可知，目的基因必须左侧连接启动子，已知胰岛素基因左端①处的碱基序列为—GCATTCTGAGGC—，根据两种酶在质粒上的位置上可知，EcoRⅠ识别序列需要添加在目的基因的左侧，XhoⅠ的识别序列需要添加在目的基因的右侧，其中一种引物设计的序列是胰岛素基因左端①处的碱基序列为为—GCATTCTGAGGC—，由于DNA合成时，新链的延伸方向为5′→3′，即其中一种引物与模板链3′（①处互补的位置）碱基互补配对，还需要再左侧加上﹣GATTC序列，所以其中一种引物设计的序列为5′﹣GAATTCCGTAAGACTCCG﹣3′。 故答案为： （1）逆转录/反转录 （2）基因表达载体的构建 限制酶和DNA连接酶 （3）EcoRⅠ和XhoⅠMunⅠ会破坏氨苄青霉素抗性基因，SalⅠ和NheⅠ会破坏目的基因 GAATTCCGTAAGACTCCG 【点评】本题考查基因工程的相关知识，意在考查学生的识记能力和判断能力、运用所学知识综合分析问题的能力。 学科网（北京）股份有限公司 $$