专题23 基因工程及生物技术的安全性与伦理问题-【十年高考】备战2026年高考生物真题分类解析与应试策略（Word版）

专题二十三　基因工程及生物技术的安全性与伦理问题 考点72　基因工程的基本工具及操作程序 1.BD　解析基因A突变为致病基因a是由碱基对T—A被G—C替换造成的,A项错误。用Hind Ⅲ限制酶酶切A基因后会形成黏性末端,用AluⅠ限制酶酶切A基因后,形成的是平末端,B项正确。用AluⅠ限制酶切割a基因有3个酶切位点,而Hind Ⅲ酶切位点只有2个,所以两种限制酶分别酶切a基因产生的片段大小不同,C项错误。用Hind Ⅲ限制酶对基因a进行酶切,产生的片段与对基因A的酶切结果不同,通过电泳显示可以进行鉴定诊断,D项正确。 2.C　解析氯化钙处理大肠杆菌可使其处于感受态,提高转化效率,更多质粒(含目的基因或不含)导入,会增加蓝色(未插入目的基因,β-半乳糖苷酶基因完整)和白色(插入目的基因,β-半乳糖苷酶基因被破坏)菌落数,A项正确。仅含卡那霉素时,导入普通质粒和含目的基因质粒的大肠杆菌均会形成白色菌落,无法判定菌株是否含目的基因,B项正确。白色菌落仅说明β-半乳糖苷酶基因被破坏(可能插入目的基因),但目的基因不一定表达,不能直接判定为表达目标蛋白的菌株,C项错误。质粒K酶切后自身环化,导入大肠杆菌后β-半乳糖苷酶基因完整,可分解X-gal产生蓝色菌落,会使蓝色菌落偏多,D项正确。 3.A　解析琼脂糖凝胶的密度对其中DNA分子的迁移和分辨率有影响。根据所需分离的DNA片段大小,通常会选择适当浓度的琼脂糖凝胶。对于大型DNA片段(如基因组DNA或质粒DNA),一般选择低浓度琼脂糖凝胶,以便实现高效迁移所需较大孔径;对于小型DNA片段(如PCR产物或酶切片段),则需要选择高浓度琼脂糖凝胶以提供更好的分辨率和分离效果,A项正确。凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是用于确定样品迁移的位置,B项错误。在琼脂糖凝胶电泳中,施加电场后,会使得DNA片段向正极方向迁移,同时,DNA片段的迁移速率与其长度呈负相关,即越长的DNA片段,迁移速率越慢,C项错误。凝胶中的DNA分子通过染色,可以在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来,D项错误。 4.C　解析酵母菌培养液使用前要灭活所有细菌和真菌,A项错误。将含有酵母菌的培养基放置在28 ℃恒温培养箱中进行培养,B项错误。稀释涂布平板法常用来统计样品中活菌的数目,当样品的稀释度足够高时,培养基表面生长的单菌落,来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数,就能推测出样品中大约含有多少活菌,由此可知,可用稀释涂布平板法对酵母菌计数,C项正确。酵母菌是真核细胞,具有高尔基体和内质网,可以对合成的蛋白质进行加工和修饰,D项错误。 5.B　解析限制酶失活会使DNA完全不被酶切,此时应更换新的限制酶,A项正确。酶切条件不合适通常会使切割效果下降,此时应有部分DNA被酶切,B项错误。质粒DNA突变会导致限制酶识别位点缺失,进而造成限制酶无法进行切割,此时应更换为正常质粒,C项正确。质粒DNA上酶切位点被甲基化修饰,会导致对DNA甲基化敏感的限制酶无法进行酶切,此时应换用对DNA甲基化不敏感的限制酶,D项正确。 6.D　解析根据题中流程图可知,研究人员利用PCR技术获取目的基因,该过程称为目的基因的“扩增”或“克隆”,是一个化学过程;而“分离”是一个物理过程,A项错误。题干中说明了L-谷氨酸脱羧酶催化L-谷氨酸脱羧是高效生产γ-氨基丁酸的重要途径之一,即L-谷氨酸是高效生产γ-氨基丁酸的底物。E.coli B发酵生产γ-氨基丁酸时,L-谷氨酸钠的主要作用是作为发酵中酶促反应的底物,B项错误。E.coli A是发酵生产γ-氨基丁酸的菌株,E.coli B是往E.coli A细胞中导入L-谷氨酸脱羧酶基因后构建的高效生产γ-氨基丁酸的菌株。E.coli A和E.coli B都不会高效降解γ-氨基丁酸,否则无法实现生产,C项错误。根据图中信息,质粒上含有多克隆位点,其不仅可以被Nco Ⅰ和Kpn Ⅰ酶切,还可以被其他限制性内切酶酶切,只要在质粒的多克隆位点和目的基因两侧存在除Nco Ⅰ和Kpn Ⅰ外其他相同的限制性内切酶的酶切位点,就可以用相应酶替代Nco Ⅰ和Kpn Ⅰ构建重组质粒,D项正确。 7.C　解析E.coli DNA连接酶不能连接具有平末端的DNA片段,A项错误。质粒用酶3切割,目的基因用酶1切割,得不到相同的黏性末端,所以二者不能连接,B项错误。质粒和目的基因都用酶1和酶2切割,用T4 DNA连接酶能将目的基因和质粒连接起来,且避免了目的基因和质粒的自身环化,所以效率最高,C项正确。酶4会破坏抗生素抗性基因,即标记基因,D项错误。 8.B　解析由于引物只能引导子链从5'端到3'端延伸,根据碱基互补配对原则,其中一个引物序列为5'-TGCGCAGT-3',A项正确。根据三种酶的酶切位点,左侧的黏性末端是使用Nhe Ⅰ切割形成的,右侧的黏性末端是用Cfo Ⅰ切割形成的,B项错误。用步骤①的酶Nhe Ⅰ和Cfo Ⅰ对载体进行酶切,根据它们的识别位点以及原本DNA的序列,切割之后至少获得了2个片段,C项正确。图中形成的是黏性末端,E.coli DNA连接酶只能连接黏性末端;T4 DNA连接酶既可连接平末端,又可连接黏性末端,D项正确。 DNA连接酶 种类 E.coli DNA连接酶 T4 DNA连接酶 来源 大肠杆菌 T4噬菌体 特点 只缝合黏性末端 缝合黏性末端和平末端 作用 恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键,连接两个DNA片段 9.D　解析用一种限制酶切割,目的基因在质粒上可以正向或反向插入,进而导致基因转录产物的不同,A项正确。用一种限制酶切割后,质粒有可能发生自身环化,导致目的基因未能插入,B项正确。SphⅠ酶切会在重组质粒上产生特定的片段,通过DNA凝胶电泳技术可以分离和检测这些片段,从而确定重组质粒是否构建成功,C项正确。根据质粒图示,携带目的基因的受体菌需要同时具有AmpR和TetR基因才能在含有氨苄青霉素和四环素的培养基中形成菌落,若用SphⅠ酶切,会破坏四环素抗性基因(TetR),D项错误。 10.D　解析农杆菌中的Ti质粒上的T-DNA可转移至受体细胞,并且整合到受体细胞染色体的DNA上,故分别带有目的基因和标记基因的两个质粒,都带有T-DNA序列,进而成功整合到受体细胞染色体上,A项正确。该方法需要利用农杆菌转化法,在高转化频率的基础上,将目的基因和标记基因整合到染色体上,由图可知,标记基因和目的基因位于细胞中不同的染色体上,B项正确。通过杂交分离结果可知,经过有性繁殖阶段遗传重组后获得了四种类型细胞,其中包括只含目的基因的细胞,只含标记基因的细胞、既不含目的基因又不含标记基因的细胞和既含目的基因又含标记基因的细胞,C项正确。获得的无筛选标记转基因植株发生了基因重组,D项错误。 11.C　解析EcoR Ⅰ的酶切位点有6个碱基对,由于DNA分子的碱基组成为A、T、G、C,则某一位点出现该序列的概率为1/4×1/4×1/4×1/4×1/4×1/4=1/4 096,即4 096≈4 000个碱基对可能出现一个限制酶EcoR Ⅰ的酶切位点,故理论上得到DNA片段的平均长度(碱基对)约为4 000,C项正确。 12. 答案(1)复制原点　Xba Ⅰ　DNA聚合酶　Spe Ⅰ、Sma Ⅰ 550 (2)4　连接成环(或环化)　测序和序列比对 (3)不能 解析 (1)与复制有关的结构是复制原点。根据后面的信息“用限制酶切后补平”,即在DNA聚合酶的作用下游离的脱氧核苷酸连到脱氧核苷酸链的3'端,故需要用XbaⅠ对质粒进行切割,而不能用PstⅠ;提取质粒,切割后得到两条条带,需要两个切点,题干中给出长度的只有目的基因,故需要选择SpeⅠ和SmaⅠ两种限制酶进行切割,切割后会出现两种长度的片段,短的长度大约为550 bp,说明基因前端被补平,大肠杆菌中导入了正向重组质粒。 (2)限制酶识别序列越短,在识别序列出现的概率越高,切割得到的序列越短,根据题意选用识别序列为4个碱基对的限制酶。目的是通过PCR扩增出图乙中的未知序列,两种引物延伸方向相反,故需要把图乙中序列环化,或者首尾连接,再进行PCR。通过琼脂糖凝胶电泳仅能判断DNA片段长度,要判断是否为同一个基因需要进行测序或序列比对。 (3)野生型基因导入突变植株后无法确定其能否正常表达,故检测到野生型基因无法确定植株的表型。 13. 答案(1)引物　脱氧核苷酸　复性　PCR反应中DNA变性需高温,耐高温的DNA聚合酶能在高温下催化子链合成 (2)SmaⅠ和EcoRⅠ　磷酸二酯 (3)发黄色荧光且荧光定位于细胞壁　高 (4)转基因衣藻可通过细胞壁上的融合蛋白吸附培养液中的镉离子,减轻了镉离子对细胞的毒害　培养液中的镉离子浓度过高,超出融合蛋白的吸附能力,细胞内镉离子积累过多产生强毒害 (5)①　③ 解析 (1)PCR反应中,脱氧核苷酸(原料,随循环进行被消耗)和引物(与模板结合后被延伸,消耗减少)的分子数量逐渐降低。模板与引物在PCR反应的复性阶段结合(温度降低,引物与模板互补配对)。PCR中使用的DNA聚合酶需耐高温,因为PCR反应要经高温变性(使DNA解旋),普通酶会失活,耐高温的DNA聚合酶才能在高温环境下催化子链合成。 (2)观察载体上的酶切位点,结合基因连接顺序(SP7→CADR→GP1→YFP),根据限制酶识别序列及切割位点可知,载体中前两个酶切位点经NheⅠ和XbaⅠ酶切后形成的黏性末端一致,如果第一个基因CADR添加这两个限制酶的识别序列,与切割后的载体连接时会形成倒位连接,因此CADR两端添加NheⅠ(或XbaⅠ)和SmaⅠ两种限制酶的识别序列,先与载体连接。第二个基因GP1两端添加SmaⅠ和EcoRⅠ两种限制酶的识别序列,连接到已重组了CADR基因的载体上。最后YFP基因两端添加EcoRⅠ和EcoRⅤ两种限制酶的识别序列,连接到已重组了CADR和GP1两个基因的载体上,从而完成基因表达载体的构建。DNA连接酶催化载体和目的基因之间形成磷酸二酯键。 (3)融合蛋白含黄色荧光蛋白YFP,若表达成功,转基因衣藻在荧光显微镜下会发出黄色荧光且荧光定位于细胞壁(GP1使融合蛋白定位于细胞壁)。若融合蛋白能结合镉离子,转基因衣藻细胞壁的镉离子含量会高于野生型(野生型无CADR高效吸附作用)。 (4)转基因衣藻的生长优于野生型,原因是细胞壁上的融合蛋白能吸附培养液中的镉离子,减轻了镉离子对细胞的毒害(转基因衣藻通过细胞壁上的CADR减少镉进入细胞)。240 μmol/L镉离子浓度下,转基因衣藻和野生型衣藻的生长均受到抑制,是因为镉离子浓度过高,超出融合蛋白的吸附能力,细胞内镉离子积累过多产生强毒害。 (5)与化学药物法相比,转基因衣藻的优势:①可自我繁殖,无需持续投放,能长期发挥作用;③吸收富营养化物质:治理镉污染的同时,改善水体富营养化(如吸收N、P)。衣藻生长受镉离子浓度影响,非优势,②不符合题意;镉沿食物链传递,有风险,非优势,④不符合题意,故填①和③。 14. 答案(1)(4种)脱氧核苷酸　延伸 (2)5'端　AGATCT　BamHⅠ与EcoRⅠ (3)染色体DNA　2 　再分化 解析 (1)PCR扩增目的基因时,需要模板DNA、引物、4种脱氧核苷酸、含Mg2+的缓冲液和耐高温的DNA聚合酶。DNA聚合酶在PCR的延伸步骤中起作用,将单个脱氧核苷酸加到引物的3'端进行子链的延伸。 (2)为将S基因正确插入载体,PCR扩增S基因时需在引物的5'端添加相应的限制酶识别序列。根据S基因的转录方向可知,使用双酶切法保证目的基因插入方向正确,载体中含有BamHⅠ、EcoRⅠ和XbaⅠ三个酶切位点,而S基因上含有XbaⅠ、NdeⅠ、BamHⅠ的酶切位点,首先要保证S基因结构的完整性,不能在S基因两端添加XbaⅠ、NdeⅠ、BamHⅠ的限制酶识别序列,由表格信息可选择能与载体中限制酶切出相同黏性末端的限制酶,BglⅡ和BamHⅠ切割产生的黏性末端相同,结合S基因的转录方向可知S基因的左端为上游启动子一端,应在S基因上游添加BglⅡ的识别序列,即5'-AGATCT-3',下游直接添加EcoRⅠ的识别序列。因此,切割载体应选用的两种限制酶为BamHⅠ和EcoRⅠ。 (3)用携带S基因的农杆菌侵染栽培马铃薯愈伤组织时,基因表达载体中的T-DNA会转移并整合到愈伤组织细胞的染色体DNA上。据图可知,载体的T-DNA片段中抗性基因2含有启动子和终止子,可正常表达,若T-DNA成功整合到被侵染细胞的染色体DNA上,则该细胞就可具有抗性基因2对应的抗性,因此,抗性基因2可用于筛选成功转化的愈伤组织。该愈伤组织经再分化形成芽、根,继续培育可获得抗寒能力显著增强的马铃薯植株。 15. 答案(1)海藻和海泥中富含卡拉胶,其中存在较多的卡拉胶降解菌,方便筛选　稀释 (2)BamHⅠ　重组质粒连接处的序列不再是原来的限制酶识别序列 (3)使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态　卡拉胶　四环素 (4)44　该位点的氨基酸空间上离半胱氨酸更近,容易形成二硫键,而且保守度低,替换后对酶的功能影响较小 解析 (1)在长期的进化过程中,各种生物会逐渐形成适应各自环境的特性。海藻和海泥中富含卡拉胶,其中存在较多的卡拉胶降解菌,它们体内含有可以催化卡拉胶分解的酶系,使其能够利用卡拉胶作为碳源,从而在该种环境中生存繁衍。将培养后的菌液混匀并充分稀释后接种至微孔板中,再经培养和筛选就可获得CG活性最高的菌种。(2)转录过程是沿模板链的3'端到5'端进行的,所以转录模板链的5'端为靠近终止子的一端。分析图1,E.coli DNA连接酶连接黏性末端的效率较高,故不选用EcoR Ⅴ和Sma Ⅰ酶切,Xba Ⅰ与Spe Ⅰ切割后产生的黏性末端相同,容易反向连接,所以cg转录模板链的5'端最好含有BamH Ⅰ酶切位点。T4 DNA连接酶可以连接黏性末端和平末端。选用各不相同的双酶切组合和T4 DNA连接酶重复实验,若重组质粒连接处的序列不再是原来的限制酶识别序列,会导致重组质粒无法使用各自构建表达载体的双酶切组合进行切割。(3)先用Ca2+处理大肠杆菌细胞,可以使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。为筛选出成功导入表达载体的大肠杆菌,应在培养基中添加卡拉胶和四环素,培养一段时间后,根据菌落周围有无水解透明圈来判断。(4)已知空间上邻近的两个半胱氨酸易形成二硫键,从而提升蛋白质的耐热性。由图2可知,第44位赖氨酸空间上离半胱氨酸更近,容易形成二硫键,从而提升蛋白质的耐热性,而且保守度低,替换后对酶的功能影响较小。 16. 答案(1)磷酸二酯键　不会破坏N基因及其启动子和终止子,保证N基因可以在菌株B2中顺利表达 (2)C—G、U—A、A—T (3)菌株B2基因组　无PCR产物 (4)减少环境污染;更安全,无火灾隐患;分解效率更高,高效利用秸秆资源等(答出2点即可) 解析 该工程菌的制备流程可概括为:①获得含有“M1+启动子+N基因+终止子+M2”序列的片段甲。②利用CRISPR/Cas9 技术将片段甲与细菌B1基因组中的“替换区”交换,从而将N基因插入细菌B1基因组,获得菌株B2。 (1)限制酶切割的化学键是磷酸二酯键。要保证N基因不被破坏且能正常表达,需把M1插入启动子之前,M2插入终止子之后。 (2)考查RNA与DNA的碱基配对情况。向导RNA与细菌B1基因组DNA互补配对可以形成的碱基对有G—C、C—G、U—A、A—T。 (3)片段甲若成功插入细菌B1基因组,则成为菌株B2,因此欲验证片段甲插入了细菌B1基因组,应该利用引物P1和P2对菌株B2基因组进行PCR扩增。如果有PCR产物,说明成功获得了菌株B2;如果没有PCR产物,说明片段甲没有插入细菌B1基因组。若以菌株B2基因组为模板与引物P3和P4进行PCR,因B2基因组中无引物P4结合序列,故无PCR产物。 (4)秸秆焚烧会产生大量有害气体,严重污染环境,且有很大的火灾隐患,焚烧对于有机物中的能量也是极大的浪费。利用高效降解纤维素的细菌处理秸秆的优点:减少环境污染;更安全,无火灾隐患;分解效率更高,高效利用秸秆资源等。 17. 答案(1)基因突变、基因重组、表观遗传等 (2)①采用引物1和4进行PCR扩增(或采用引物1和3以及引物2和4分别进行PCR扩增),用Sac Ⅱ和EcoR Ⅰ对PCR产物进行酶切　②氯霉素(或氯霉素+头孢霉素)　③脱水四环素　头孢霉素　④D 解析 (1)Sa为原核生物,产生抗药性可遗传变异的来源有基因突变、基因重组、表观遗传等。 (2)①由图1可知,质粒2上有Sac Ⅱ、EcoR Ⅰ酶切位点,而质粒1上只有Sac Ⅱ酶切位点,R基因的上、下游含有Sac Ⅱ、EcoR Ⅰ酶切位点,若要构建质粒2,采用引物1和4进行PCR扩增可得到整个R基因以及上下游片段,用Sac Ⅱ和EcoR Ⅰ对PCR产物进行酶切,然后回收上、下游片段,再与Sac Ⅱ酶切质粒1所得大片段连接,获得质粒2。②用质粒2转化临床分离的具有头孢霉素抗性、对氯霉素敏感的Sa,因为重组的质粒2上含有氯霉素抗性基因,所以可以将重组后的含质粒2的Sa涂布在含氯霉素(或氯霉素+头孢霉素)的平板上,能生存下来的菌落就是含质粒2的Sa单菌落。③已知质粒2上具有可被脱水四环素诱导表达的Sa致死基因,所以应使用含有脱水四环素的平板筛选不再含有质粒2的菌落。随后,需要获得不再具有头孢霉素抗性的R基因敲除菌株,以便进行分子鉴定。根据题意,要筛选的菌株无法在含头孢霉素的选择培养基上增殖,所以应在培养基中加入头孢霉素。④若R基因已被敲除,以含有引物2或引物3的引物组合(A、B、C组)进行PCR时,均无扩增产物,电泳结果应为空白,A、B、C三组不符合题意;以引物1与引物4进行PCR,若R基因已被敲除,产物长度应为上游片段+下游片段,约为1.9 kb,D组正确。 18. 答案(1)低　44(256)　GTTT　CAAT (2)卡那霉素　SacⅠ　④　(3)1/4 解析 (1)引物越短,DNA上与之配对的序列越多,即特异性越低。用BsaⅠ酶切大豆基因组的DNA序列,从其识别序列与切割位点可知,切出的黏性末端有4个碱基(N),由于N代表任一碱基,则理论上可产生的黏性末端最多有44(256)种。载体有上、下游两个BsaⅠ酶切位点,酶切后,载体上留下的黏性末端,左侧为5'-CAAT-3',右侧为5'-GTTT-3'。 (2)重组载体的T-DNA有卡那霉素抗性基因,导入大豆细胞后,可使用卡那霉素筛选出具有该抗生素抗性的植株①~④。从目标基因L部分序列来看,目标序列与突变序列均有BamHⅠ和EcoRⅠ的识别序列,用这两种酶酶切后,目标序列与突变序列会产生等长的片段,无法区分是否含有突变序列。但突变序列中有SacⅠ识别位点,使用该酶进行酶切,目标序列不被酶切,突变序列则被切为长、短两段,根据电泳结果,可知①③为杂合子,②为野生型,④为纯合突变植株。 (3)基因L成功突变的纯合植株体细胞中只有1条染色体有T-DNA插入,其抗生素抗性即来自T-DNA上的Kanr,就抗生素抗性而言,该突变株为杂合子,其自交子代中,突变位点纯合且对抗生素敏感的植株占1/4。 19. 答案(1)EcoR Ⅰ、Hind Ⅲ　(2)CaCl2　卡那霉素　S-F、P-R (3)启动子　C　(4)SOD-ELP50组沉淀蛋白含量比SOD组高　高温可使蛋白变性　纯化回收率高,杂蛋白少,常温下纯化有利于酶活性保持 解析 (1)目的基因应插入启动子和终止子之间,结合题意可知,ELP50应插入SOD基因之后,由题图可知,限制酶a和限制酶b分别是EcoR Ⅰ、Hind Ⅲ。 (2)成功转入pET-SOD-ELP50的大肠杆菌,需要使用PCR技术进行进一步验证筛选。正向引物选择S-F,而反向引物首先排除S-R,因为S-R和S-F只能PCR扩增到SOD基因片段,而不是SOD-ELP50片段。因为题干已经明确ELP50序列是(GTTCCTGGTGTTGGC)重复50次的序列,引物E-R与ELP50序列就存在着多个结合位点,导致PCR产物不能得到特异性目的条带,故不能选用引物E-R。所以,反向引物只能选引物P-R。 (3)RNA聚合酶与启动子结合后,驱动转录,翻译SOD-ELP50蛋白。由题图可知,决定SOD-ELP50融合蛋白的基因长度为462+750=1 212(bp),编码1 212÷3=404(个)氨基酸,已知蛋白质中氨基酸残基的平均相对分子质量约为0.11 kDa,融合蛋白的相对分子质量约为404×0.11=44.44(kDa),电泳后应该为条带C。 (4)由图3观察得知20 ℃时,加入NaCl后SOD-ELP50组沉淀蛋白含量比SOD组高。高温可使蛋白变性,离心后沉淀。通过横向分析20 ℃和100 ℃的SOD-ELP50相对含量,20 ℃时的SOD-ELP50含量已经占到100 ℃时的SOD-ELP50的90%左右,可得出纯化回收率高的结论。此外 20 ℃时SOD-ELP50组的大肠杆菌自身蛋白含量非常低,而100 ℃时SOD-ELP50组的大肠杆菌自身蛋白含量很高,这表明纯化得到的SOD-ELP50中的杂蛋白很少。20 ℃情况下有利于酶活性的保持,不会使蛋白变性。 20. 答案(1)两种引物分别与含hCD46基因的两条模板链结合 (2)EcoR Ⅰ和Not Ⅰ　Age Ⅰ和Hind Ⅲ (3)超数排卵　桑葚胚易于在小鼠子宫着床 (4)排除PCR体系中外源DNA的污染 (5)该小鼠能被麻疹病毒感染,且干扰素无法作用于IFNAR以应对感染 解析 (1)PCR每次循环包括变性、复性和延伸三步,复性温度下发生的扩增过程就是把复性这个步骤进行具体描述,即“两种引物分别与含有hCD 46基因的两条模板链结合”。 (2)由图可知,质粒中以及目的基因的两端含有限制酶EcoR Ⅰ和Not Ⅰ的识别序列,且这两个序列位于启动子和终止子之间,因此,将hCD46接入质粒应选用的限制酶组合是EcoR Ⅰ和Not Ⅰ(Sac Ⅰ会破坏目的基因,不能选用)。由于Age Ⅰ和Hind Ⅲ这两种限制酶可以将重组质粒分为含目的基因的片段和含有标记基因的片段,因此为提高转基因效率,同时避免标记基因进入胚胎体内,应选用Age Ⅰ和Hind Ⅲ限制酶组合将重组质粒变为线性DNA。 (3)为获取大量胚胎用于移植,可用促性腺激素处理小鼠a,使其超数排卵,受精后能获得更多的胚胎;将胚胎植入子宫模拟的是胚胎着床的过程,因此选择什么时期的胚胎用于移植,需要考虑该胚胎着床的成功率。 (4)PCR实验可能会受到外源DNA的污染,出现假阳性的结果。可通过设置不加DNA模板的对照组,排除PCR体系中外源DNA的污染。 (5)若能进一步构建既表达hCD46受体又敲除IFNAR基因的小鼠,则该转基因小鼠能接受抗原刺激,进而机体会分泌干扰素,但转基因小鼠的受体IFNAR无法表达,干扰素无法与相应的受体结合,因而干扰素无法起作用,故该小鼠对麻疹病毒具有高易感性。 21. 答案(1)5'端　两端包含Loxp序列的终止子　两端包含Loxp序列的可转录出终止密码子相应的DNA序列　电泳 (2)清除代谢产物、提供营养物质、调节pH、维持渗透压 (3)Cre/+A/+M-GFP/+floxM/floxM (4)添加四环素会竞争性结合A蛋白,无法激活T启动子,导致M基因不能表达,从而不能恢复被敲除的M基因的功能;不添加四环素,A蛋白基因表达激活T启动子,启动M基因表达,从而恢复被敲除的M基因的功能。通过添加和不添加四环素的自身对照,增加实验的准确性 解析 (1)引物的延伸方向为5'端→3'端,故应在引物的5'端添加限制酶的识别序列。在构建载体1时,想要阻断A基因的表达,可以在A基因之前添加终止序列。故从转录水平考虑,连接的片段可以是两端包含Loxp序列的终止子;从翻译水平考虑,连接的片段可以是两端包含Loxp序列的可转录出终止密码子相应的DNA序列。鉴定重组载体是否构建成功,往往需要限制酶切割载体后,再进行电泳进行比对。 (2)进行动物细胞培养时需定期更换培养液,目的是清除细胞代谢产物、为细胞提供营养物质、调节培养液pH、维持细胞渗透压等。 (3)由于Cre、A、M-GFP、floxM 4对基因遵循自由组合定律,故通过转基因得到的2组模型鼠通过杂交获得的子代,再进行一代杂交后最终获得基因型为Cre/+A/+M-GFP/+floxM/floxM的同时具有Cre、A、M-GFP、floxM 4种基因的实验鼠。 (4)四环素可竞争性结合A蛋白,抑制T启动子的活性。添加四环素与未添加相比,添加四环素会竞争性结合A蛋白,无法激活T启动子,导致M基因不能表达,从而不能恢复被敲除的M基因的功能;不添加四环素,A蛋白基因表达激活T启动子,启动M基因表达,从而恢复被敲除的M基因的功能。通过添加和不添加四环素的自身对照,增加实验的准确性。 22. 答案(1)脱氧核糖核苷酸(或脱氧核苷酸) (2)EcoR Ⅰ　酶切后形成的片段黏性末端相同,易自我环化;不能保证目标片段与载体定向连接(反向连接) (3)酶切后的空载体片段,启动子D+基因S片段　PCR (4)品种DN的基因S上游启动子效应比TL强,使得基因S表达量更高,种子更大 解析 (1)启动子是DNA非编码区上游的一段DNA序列,它是RNA聚合酶识别和结合的部位,用于启动DNA的转录。 (2)由于“启动子D+基因S”的DNA序列上存在EcoR Ⅰ的识别序列,若使用限制酶EcoR Ⅰ,会使“启动子D+基因S”的DNA序列被切断而导致目的基因被破坏。不宜同时选用酶Spe Ⅰ和Xba Ⅰ的原因是酶Spe Ⅰ和Xba Ⅰ切割DNA所产生的黏性末端相同,若用这两种限制酶切割,形成的DNA片段在构建基因表达载体时,容易出现自我环化,导致效率降低,且无法保证目的基因片段与载体片段单向连接,影响目的基因在受体细胞中的表达。 (3)DNA电泳可以分离不同大小的DNA片段,用限制酶对重组表达载体酶切后的产物不仅有“启动子D+基因S”片段,还有酶切后的空载体片段。因此电泳时,对照样品除指示分子大小的标准参照物外,还应有酶切后的空载体片段和“启动子D+基因S”片段。经验证的重组表达载体需转入农杆菌,检测转入是否成功一般采用PCR技术,来检测受体细胞的DNA上是否插入目的基因或目的基因是否转录出mRNA。 (4)最后得到的大豆品种DN较TL种子大,但导入再生植株YZ-1和再生植株YZ-2的目的基因S序列无差异,故可推测可能是品种DN的基因S上游启动子D的效应强于品种TL的启动子T,启动子D使基因S表达量更高,因而种子更大。 23. 答案(1)纤维素酶和果胶酶　生长素和细胞分裂素 (2)花药(或花粉)离体培养　用显微镜观察染色体数量 (3)①HindⅢ和BamHⅠ　交链格孢 ②PCR扩增基因L及其pL;插入Ti质粒中;利用农杆菌导入百合B体细胞,经培养获得转基因植株;筛选L表达量提高的转基因百合;用病原微生物侵染转基因百合,检测百合抗病能力。 解析 (1)因植物细胞细胞壁的成分主要是纤维素和果胶,而酶具有专一性,因此获得原生质体的方法是用纤维素酶和果胶酶对植物细胞进行处理,得到原生质体后使原生质体融合,形成杂种细胞,再用生长素和细胞分裂素诱导愈伤组织形成和分化,从而获得完整的杂种植株。 (2)获得单倍体植株常用花药(花粉)离体培养法。细胞有丝分裂中期,染色体形态稳定,数目清晰,便于观察,故鉴定百合单倍体植株的方法是利用显微镜观察根尖有丝分裂中期细胞中染色体的数目,如果染色体数目减少一半,则获得的植株为单倍体植株。 (3)①研究病原微生物对L的启动子pL活性的影响。需要构建重组质粒,将Ti质粒中gus基因上游启动子序列替换为pL。因此,首先需要将启动子pL进行酶切,插入Ti质粒上获得重组质粒,根据启动子pL两端的酶切位点和Ti质粒的结构特点,用Hind Ⅲ和BamHⅠ对pL进行酶切后,再与Ti质粒进行连接。GUS酶活性反映启动子pL活性,GUS酶活性越高表明启动子活性越高,从图c实验结果可发现三种病原微生物都能促进pL的活性,其中交链格孢侵染后,GUS酶活性最高,所以其促进作用最强。 ②中现发现栽培种百合B中也有L,但抗病性弱。若要增强该百合中L的表达量以提高其抗病原微生物的能力,结合基因工程的基本操作程序及植物转基因工程技术等内容可知,实验思路为:利用PCR扩增L基因及其pL;将其插入至Ti质粒中;利用农杆菌导入百合B体细胞,经培养获得转基因植株;筛选L表达量提高的转基因百合;用病原微生物侵染转基因百合,检测百合抗病能力。 24. 答案(1)细胞坏死　(2)分化　将抑制细胞分裂和分化的某基因也导入到棉花细胞中(或提高Bt毒蛋白基因的表达量,提高Bt毒蛋白的含量)　(3)数目　空间结构　 (4)避免棉铃虫的抗性基因频率增长过快 解析 (1)Bt毒蛋白被棉铃虫吞食后活化,导致细胞膜穿孔,细胞内含物流出而死亡,这属于细胞坏死。(2)肠干细胞是通过细胞分裂和分化产生新的肠道细胞的。可以将抑制细胞分裂和分化的某基因也导入到棉花细胞中,让棉铃虫的肠干细胞无法进行细胞的分裂和分化,从而提高转基因棉花杀虫效果。也可以提高Bt毒蛋白基因的表达量,提高Bt毒蛋白的含量,从而提高转基因棉花杀虫效果。(3)肠道细胞表面受体蛋白的数目或空间结构发生变化时,Bt毒蛋白结合较少或无法结合,导致棉铃虫对Bt毒蛋白产生抗性。(4)将Bt毒蛋白转基因棉花与非转基因棉花混种,可避免棉铃虫的抗性基因频率增长过快,从而延缓棉铃虫对转基因棉花产生抗性。 25. 答案(1)蔗糖　参与蔗糖分解代谢,将液体培养基中的蔗糖分解生成葡萄糖　单位时间内培养液中葡萄糖的生成量(或单位时间内培养基中蔗糖的减少量等) (2)NV基因　>　T-DNA插入导致NV基因增加部分序列 (3)突变体　便于筛选出成功导入NV基因的重组DNA 解析 (1)据题表中野生型菌株的两组结果对比分析可知,野生型菌株加入蔗糖就会合成NV酶,不加就不会合成,推测蔗糖诱导了NV基因表达。题表中结果表明,当蔗糖和NV酶同时存在时,培养液中就会出现葡萄糖,由此说明NV酶的作用是催化蔗糖转化成葡萄糖。检测NV酶活性时,可以测定单位时间内培养液中葡萄糖的生成量或单位时间内培养基中蔗糖的减少量等。 (2)由题可知,突变体是通过T-DNA随机插入野生型菌株基因组DNA筛选获得的。在进行PCR扩增时,使用的引物需要与特定的DNA序列配对结合,才能启动DNA的扩增。野生型菌株的基因组DNA中没有T-DNA的插入,所以用与NV基因配对的引物进行扩增时,可以扩增出完整的NV基因片段。而突变体由于T-DNA的随机插入,导致NV基因中增加部分序列。这样一来,使用同样的引物进行扩增时,突变体扩增片段的长度就会大于野生型扩增片段的长度。因此若突变体扩增片段长度>野生型扩增片段长度,则表明突变体构建成功。从基因序列分析其原因是T-DNA插入导致NV基因增加部分序列。 (3)为进一步验证NV基因的功能,题表中的转基因菌株是将NV基因导入突变体细胞获得的。突变体由于NV基因发生突变,无法正常表达NV酶,导致相关生理功能缺失或异常。将正常的NV基因导入突变体细胞,如果能够恢复原本在突变体中缺失或异常的生理功能,就可以有力地证明NV基因确实具有特定的功能。在构建NV基因表达载体时,需要添加新的标记基因,原因是便于筛选出成功导入NV基因的重组DNA。 26. 答案(1)只有能利用羧甲基纤维素钠的微生物才能生长繁殖 菌落产生的纤维素酶的活性和量 (2)耐高温的DNA聚合酶 (3)基因表达载体的构建　限制酶、DNA连接酶 (4)繁殖能力强、生理结构和遗传物质简单、对环境因素敏感、容易进行遗传操作等　能吸收周围环境中DNA分子 (5)降解时的温度不同、降解时的pH不同 解析 (1)选择培养基只允许特定种类的微生物生长,同时抑制或阻止其他种类微生物生长。在以羧甲基纤维素钠为唯一碳源的选择培养基中,只有能利用羧甲基纤维素钠的微生物才能生长繁殖。刚果红能与培养基中的纤维素形成红色复合物,使得含有纤维素的培养基呈现红色。当纤维素被纤维素酶分解后,刚果红与纤维素的复合物就无法形成,培养基中就会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈。这个透明圈的大小直接反映了纤维素分解菌分解纤维素的能力。透明圈越大,说明纤维素分解菌分解纤维素的能力越强,即菌落产生的纤维素酶的活性强、量多。(2)扩增目的基因片段在PCR仪中进行,因此需要耐高温的DNA聚合酶。(3)根据图示中酶基因与质粒载体经过过程⑤构成重组质粒,推导出过程⑤为基因表达载体的构建,该过程需要限制酶和DNA连接酶。(4)大肠杆菌作为受体细胞的优点是繁殖能力强、生理结构和遗传物质简单、对环境因素敏感、容易进行遗传操作等。先用Ca2+ 处理细胞,使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态,然后再将重组的基因表达载体导入其中。(5)不同酶的最适温度、最适pH不同,当温度和pH改变时,酶促反应速率也会受到影响。 受体细胞的选择 (1)转基因植物:受体细胞可以选择受精卵和体细胞,一般选择体细胞。 (2)转基因动物:受体细胞一般选择受精卵,目的基因整合到受精卵的染色体 DNA上,随着细胞分裂能稳定遗传给下一代。 (3)转基因微生物:常用酵母菌、大肠杆菌等。 27. 答案(1)变性　氢键 (2)防止质粒或者目的基因的自身环化;防止质粒和目的基因的反向连接　T4　DNA连接酶 (3)处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态　利用DNA分子杂交技术,将大肠杆菌的基因组DNA提取出来,在含有目的基因的DNA片段上用放射性同位素等作标记,以此作为探针,使探针与基因组DNA杂交,如果显示出杂交带,就表明转化的大肠杆菌中含有重组质粒(或将转化的大肠杆菌在培养基上培养,一段时间后,采用抗原—抗体杂交技术检测大肠杆菌是否产生蛋白E,若有杂交带出现,则表明转化的大肠杆菌中含有重组质粒) (4)甘氨酸—脯氨酸—丝氨酸 解析 (1)PCR过程中,通过加热使模板DNA分子两条链之间的氢键断裂而解旋,引物与模板DNA单链相应互补序列结合,然后在DNA聚合酶的作用下进行延伸。(2)用酶a和酶b双酶切时,质粒上的两个黏性末端不同,目的基因两端的黏性末端不同,可防止质粒或者目的基因的自身环化,也能保证质粒与目的基因的正确连接。T4　DNA连接酶能催化DNA片段平末端的连接。(3)感受态细胞能够吸收周围环境中的DNA分子。利用DNA分子杂交技术,将大肠杆菌的基因组DNA提取出来,在含有目的基因的DNA片段上用放射性同位素等作标记,以此作为探针,使探针与基因组DNA杂交,如果显示出杂交带,就表明转化的大肠杆菌中含有重组质粒。或者将转化的大肠杆菌在培养基上培养,一段时间后,采用抗原—抗体杂交技术检测大肠杆菌是否产生蛋白E,若有杂交带出现,则表明转化的大肠杆菌中含有重组质粒。(4)蛋白E基因中的一段DNA编码序列是GGGCCCAAGCTGAGATGA,编码链与模板链互补,模板链与mRNA互补,因此mRNA上的序列为GGGCCCAAGCUGAGAUGA,若第一个核苷酸G缺失,则mRNA上的序列变为GGCCCAAGCUGAGAUGA,对应的肽链序列是甘氨酸—脯氨酸—丝氨酸。 28. 答案(1)细胞外　(2)P1和P6 (3)(i)缺乏尿嘧啶　二　(ii)含有5-氟乳清酸　(4)3 解析 (1)由题可知,酵母菌不能吸收淀粉,因此应在细胞外将淀粉分解从而被酵母菌利用,所以导入分解淀粉的酶发挥作用的场所在细胞外。 (2)由题可知,酵母菌体内DNA有许多A-B序列位点,为保证构建完成的目的基因是图中结构,引物应包含A.B序列和目的基因的部分序列,应选择P1和P6这对引物进行PCR。 (3)(i)选择了尿嘧啶合成基因(UGA)作为标记基因,则应该将导入目的基因的酵母菌放在缺乏尿嘧啶的培养基上进行筛选培养,如果导入成功,则能形成菌落。方式一,C和C'方向相反,如果切割,则末端在一条链上,不能连接,所以选择方式二,连接方向相同,切割后形成的末端便于连接。 (ii)由于尿嘧啶可以使5-氟乳清酸转化为对酵母菌有毒物质,所以切去UGA基因的酵母菌应在含有5-氟乳清酸的培养基上进行筛选培养。 (4)结合以上分析,C和C'的中间插入UGA,A和B之间插入目的基因,所以图3正确。 29. 答案(1)RNA聚合酶 　复制原点、标记基因、限制酶切割位点 (2)F1和R2或者F2和R1　a链 (3)J-V5融合蛋白 　不是 解析 (1)启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位;质粒作为载体,必须具备启动子、终止子、标记基因、复制原点和限制酶切割位点等。 (2)为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确,可对J基因和质粒中原部分序列进行PCR扩增,则可选择F1和R2或者F2和R1作为引物;据“J基因转录的模板链位于b链”可判断左端为b链的3'-端,引物F1的左端为5'-端,可推知引物F1与b链间碱基互补配对,其与图甲中J基因的a链相应部分的序列相同。 (3)据图乙可知,条带1既可与抗J蛋白抗体结合,又可与抗V5抗体结合,可推测出现条带1证明该细胞内合成了J蛋白和V5蛋白,即表达了J-V5融合蛋白;条带2只用抗J蛋白抗体检测出现,而用抗V5抗体检测未出现,说明该细胞表达的是单一的J蛋白,而非J-V5融合蛋白,可推测该J蛋白不是由重组质粒上的J基因表达的。 30. 答案(1)模板(片段F1、片段F2)、引物　延伸时间 (2)CD (3)限制性内切核酸酶(限制酶)、DNA连接酶 (4)BCD　(5)P3、P4 (6)琼脂糖凝胶电泳技术仅能用于分析待检测DNA分子的大小,无法确定待检测DNA分子的碱基序列 解析 (1)PCR反应的进行需要提供引物、酶、dNTP、模板和缓冲液(其中需要Mg2+)。分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时,配制的两个反应体系中不同的有模板(片段F1、片段F2)、引物。片段F1与片段F2大小不同,扩增程序中最主要的不同是延伸时间。 (2)由图1可知,引物F2-F用于扩增F2片段,引物F1-R用于扩增F1片段,C选项中5'-GACGAG-3'能与AnB1中左侧部分碱基进行互补配对,因此引物F2-F选用C。D选项中5'-CTGCAG-3'能与EGFP中的右侧部分序列进行碱基互补配对,因此引物F1-R选用D。 (3)重组质粒构建需要先使用同种限制酶切割质粒和目的基因,将二者切出相同的黏性末端,然后再用DNA连接酶将二者连接成重组质粒。将PCR产物片段与线性质粒载体混合后,在重组酶的作用下可形成环化质粒,不需要使用限制性内切核酸酶(限制酶)和DNA连接酶。 (4)用稀释涂布平板法培养计数时,为了使结果更准确,应选择有30~300个菌落的平板,A项正确。抗性平板上未长出菌落可能是因为培养基温度太高,也可能是其他原因,如转化失败等,B项错误。转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选,一般含有重组质粒的大肠杆菌才能发展为菌落,不会出现大量杂菌形成的菌落,C项错误。稀释涂布平板和平板划线法均为分离纯化细菌的方法,用稀释涂布平板法在抗性平板上长出的菌落一般需要连续多次划线纯化,D项错误。 (5)EGFP为720 bp,AnB1为390 bp,二者的总大小为720 bp+390 bp=1 100 bp,用引物F1-F和F2-R进行了PCR扩增,其大小接近于P1、P2,根据图中结果判断,可以舍弃的质粒有P3、P4。 (6)琼脂糖凝胶电泳技术仅能用于分析待检测DNA分子的大小,无法确定待检测DNA分子的碱基序列,因此对于PCR产物电泳结果符合预期的质粒,通常需进一步通过基因测序确认。 31. 答案(1)野生型　(2)载体　启动子和终止子　(3)①DA1基因和卡那霉素抗性基因　②75　③自交　100 解析 (1)根据题干信息可知,突变后的基因为隐性基因,则野生型DA1基因为显性基因,因此采用农杆菌转化法将野生型DA1基因转入突变体植株,若突变体表型确实由该突变造成,则转基因植株的种子大小应与野生型植株的种子大小相近。(2)利用PCR技术扩增DA1基因后,应该用同种限制性内切核酸酶对PCR产物和载体进行切割,再用DNA连接酶将两者连接起来。在基因表达载体中,启动子位于目的基因的首端,终止子位于目的基因的尾端,因此为确保插入的DA1基因可以正常表达,其上下游序列需具备启动子和终止子。(3)①将T0代植株的花序浸没在农杆菌(T-DNA上含有DA1基因和卡那霉素抗性基因)菌液中转化,再将获得的T1代种子播种在选择培养基(含有卡那霉素)上,在选择培养基上能够萌发并生长的阳性个体应该含有卡那霉素抗性基因,即表示其基因组中插入了DA1基因和卡那霉素抗性基因。②T1代阳性植株都含有DA1基因,由于T-DNA(其内部基因在减数分裂时不发生交换)可在基因组单一位点插入也可以同时插入多个位点,所以不确定是单一位点插入还是多个位点插入,若是单一位点插入,相当于一对等位基因的杂合子,其自交后代应该出现3∶1的性状分离比,即阳性率约75%的培养基中幼苗是单一位点插入的植株。③将单一位点插入的T2代阳性植株自交,再将得到的T3代种子按单株收种并播种于选择培养基上,若某培养基上全部为具有卡那霉素抗性的植株即为需要选择的植株,即阳性率达到100%的培养基中的幼苗即为目标转基因植株。根据图形分析,野生型和突变型基因片段的长度都是150 bp,野生型的基因上没有限制酶X的切割位点,而突变型的基因上有限制酶X的切割位点,结合图中的数据分析可知,电泳图中,野生型只有150 bp的条带,突变型有50 bp和100 bp的条带。 32.(1)1　4　5'　(2)XhoⅠ　(3)卡那霉素　(4)B　解析(5)PCR 解析 (1)由题图可知,若去除筛选效率较低的SacB,应选择引物1和4。进行PCR时,在引物作用下,DNA聚合酶从引物的3'端开始延伸DNA链,即DNA是从子链的5'端向3'端延伸的,因此在引物的5'端引入XhoⅠ酶识别序列。(2)图中载体4中RpsL的两侧具有XhoⅠ酶识别序列,载体3中不含XhoⅠ酶识别序列,如果将载体2和载体3连接形成高效筛选载体4,需要的引物应该含有XhoⅠ酶识别序列。(3)由题可知,载体5中含有RpsL(链霉素敏感基因)和KanR(卡那霉素抗性基因),将载体5导入链霉素不敏感(由RpsL突变造成)、卡那霉素敏感的受体菌,为获得成功导入载体5的菌株,应采用含有卡那霉素的平板进行初步筛选。(4)由题可知,载体5导入链霉素不敏感(由RpsL突变造成)而卡那霉素敏感的受体菌,受体菌中P1基因脱离载体5并整合到受体菌拟核DNA,且载体5上其他DNA片段全部丢失,因此该菌的表型为卡那霉素敏感、链霉素不敏感,B项正确。(5)通过PCR技术可以检测目的基因是否插入受体细胞的染色体DNA中或目的基因是否转录出了mRNA,因此可采用PCR技术鉴定成功整合P1基因的菌株。 33. 答案(1)能与P基因母链的一段碱基序列互补配对、短单链核酸 5'端　(2)P基因编码链的第一个碱基与EcoRⅠ识别序列的最后两个碱基编码一个氨基酸,导致mRNA的密码子被错位读取　在引物中的EcoRⅠ识别序列3'端添加1个碱基　(3)增强FLAG-P与UBC的结合　参与P与UBC的结合　(4)药物A通过增强P与UBC结合促进P降解 解析 (1)通过PCR特异性扩增P基因时,由于DNA聚合酶不能从头复制DNA,因此需要引物,引物是与目的基因(P基因)进行碱基互补配对的短单链DNA或RNA;DNA合成时,新链的延伸方向是5'端→3'端,引物是人为添加的,因此需要在5'端加上酶切位点便于保护目的基因。(2)融合基因转录出的mRNA序列正确,翻译出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正确,但P基因对应的氨基酸序列与P不同,说明P基因的翻译过程出错。由题图可知,P基因编码链的第一个碱基(A)与EcoRⅠ识别序列的最后两个碱基(TC)编码一个氨基酸,导致mRNA的密码子被错误读取,导致翻译过程出错。可在修改扩增P基因时使用的引物中的EcoRⅠ识别序列的3'端添加1个碱基解决该问题。(3)①组仅添加UBC,用UBC抗体检测,不出现杂交带;②组添加UBC和FLAG-P,出现杂交带;③组添加UBC、药物A和FLAG-P,杂交带更加明显,说明药物A的作用是增强FLAG-P与UBC的结合。②④组或③⑤组的差异在于②③组使用FLAG-P,出现杂交带;④⑤组使用FLAG-P△,不出现杂交带,据此推测P△中缺失的特定序列参与P与UBC的结合。(4)根据(3)的分析推测,药物A通过增强P与UBC结合,从而促进P被蛋白酶识别并降解,达到治疗的目的。 34. 答案(1)单倍体经秋水仙素处理后所得植株为纯合子,后代不会发生性状分离　秋水仙素　胚状体 (2)cDNA文库是由编码蛋白质的mRNA逆转录来的基因导入菌落而成的,基因工程中只需要转录出编码蛋白质的部分就可以,筛选比较简单易行　限制酶和DNA连接酶　抗生素　愈伤组织　DNA分子杂交技术 解析 (1)单倍体育种过程中,单倍体经秋水仙素处理后所得植株为纯合子,后代不会发生性状分离,可明显缩短育种年限。秋水仙素能抑制纺锤体的形成,使染色体数目加倍,因此将单倍体的愈伤组织培养于含秋水仙素的培养基上,可促进产生二倍体愈伤组织。胚状体可用于制造人工种子。(2)cDNA文库又叫部分基因文库,是由编码蛋白质的mRNA逆转录来的基因导入菌落而成的,而基因组文库包含了本物种的全部基因,基因工程中只需转录出编码蛋白质的部分即可,故选cDNA文库。在构建重组Ti质粒时,必须使用限制酶切割质粒使其具有与目的基因相同的黏性末端,之后再用DNA连接酶将目的基因和质粒连接成重组质粒。该重组的Ti质粒中含有抗生素抗性基因,故应在培养基中添加抗生素,以便对重组质粒进行筛选和鉴定。将目的基因导入植物细胞常用农杆菌转化法,即用含eui基因的农杆菌侵染愈伤组织,以便将eui基因导入愈伤组织,获得转基因再生植株。检测植株是否含有eui基因,可采取DNA分子杂交技术。 35. 答案(1)蛋白酶抑制剂可与害虫消化道中的蛋白酶结合形成复合物,阻断或降低蛋白酶活性,使害虫不能正常消化食物,以达到抗虫的目的　(2)基因表达载体的构建　(3)T-DNA 不适用于单子叶植物　(4)DNA分子杂交技术、mRNA分子杂交技术、抗原—抗体杂交技术　(5)接种实验　NaPI+StPinlA　解析与对照组相比,NaPI+StPinlA组虫体质量最小,且每株棉铃数最多　(6)定向改变　昆虫发生基因突变后,在胰蛋白酶抑制剂的选择下,抗性基因频率逐渐增高,从而提升了其抗胰蛋白酶抑制剂的能力,或胰蛋白酶抑制剂基因发生突变后不能编码出胰蛋白酶抑制剂 解析 (1)蛋白酶抑制剂可与害虫消化道中的蛋白酶结合形成复合物,从而阻断或降低蛋白酶的活性,使昆虫不能正常消化食物中的蛋白质。(2)基因工程的核心步骤是基因表达载体的构建。(3)农杆菌转化法的原理:农杆菌Ti质粒上的T-DNA可转移到该受体细胞,并且整合到该受体细胞的染色体DNA上。根据这一特点,将目的基因插入Ti质粒的T-DNA中,通过农杆菌的转化作用,就可以使目的基因进入植物细胞。该方法的不足之处是农杆菌是一种在土壤中生活的微生物,能在自然条件下感染双子叶植物和裸子植物,而对大多数单子叶植物没有感染能力。(4)检测目的基因在受体细胞基因组中的整合及其转录和翻译,即在分子水平上检测转基因生物的DNA上是否插入目的基因、目的基因是否转录出相应的mRNA、目的基因是否翻译成相应的蛋白质,可分别采用DNA分子杂交技术、分子杂交技术、抗原—抗体杂交技术等。(5)除了分子检测外,有时还需要进行个体生物学水平的鉴定。例如,一个抗虫的目的基因导入植物细胞后,是否赋予了植物抗虫特性,需要做抗虫的接种实验,以确定是否具有抗性以及抗性的程度。据题图分析可知,NaPI+StPinlA转基因棉花的抗虫效果最佳,因为饲喂NaPI+StPinlA的虫体质量最小,且每株棉铃数最多。(6)基因突变可产生新的等位基因,在自然选择的作用下,昆虫种群的基因频率会发生定向改变,导致昆虫朝着一定的方向不断进化。胰蛋白酶抑制剂转基因作物长期选择后,某些昆虫具有了抗胰蛋白酶抑制剂的能力,其分子机制可能是昆虫发生基因突变后,产生了抗胰蛋白酶抑制剂的基因,在胰蛋白酶抑制剂的选择下,抗性基因频率逐渐提高,从而增强了其抗胰蛋白酶抑制剂的能力;胰蛋白酶抑制剂基因发生突变后不能编码出胰蛋白酶抑制剂。 36. 答案(1)细胞质基质 (2)①包含BamHⅠ的识别序列　将GTG改为ATG ②原核生物复制原点　不能　③缺失尿嘧啶 (3)B 解析 (1)酵母细胞厌氧发酵即无氧呼吸的场所为细胞质基质。(2)①设计引物1的5'端序列,应考虑将编码起始密码子的序列由原核生物偏好的GTG转变为真核生物偏好的ATG,以便目的基因在酵母细胞中更好地表达;同时能通过双酶切以正确方向插入质粒,需要包含BamHⅠ的识别序列。②将重组质粒导入大肠杆菌,重组质粒上有原核生物复制原点,所以能在大肠杆菌中扩增。由于启动子存在物种特异性,重组质粒上带有真核酿酒酵母基因的启动子,故重组质粒上的乳酸脱氢酶编码序列在大肠杆菌中不能高效表达。③在缺乏尿嘧啶的选择培养基上,不能合成尿嘧啶的酿酒酵母菌株不能生存,导入重组质粒的酿酒酵母菌株因为获得了尿嘧啶合成酶基因而可以正常生存,从而能筛选出转基因酿酒酵母。(3)进一步优化发酵条件,使其更有利于乳酸菌的繁殖,可以提高其乳酸产量,A项正确。由于启动子存在物种特异性,使用乳酸菌LDH基因自身的启动子,在酵母细胞中不表达,B项错误。敲除酿酒酵母的丙酮酸脱羧酶基因,使酵母菌不能酿酒,从而提高乳酸产量,C项正确。对转基因酿酒酵母进行诱变育种,可能会出现乳酸菌的高产菌株,D项正确。 37. 答案(1)①RNA　解析②蛋白M上不含tag标签　③BC (2)①黏性末端碱基配对　DNA连接　②基因m的连接处、基因m的内部 (3)①受体菌在无尿嘧啶的培养基上无法生长,导入重组质粒的受体菌含有URA3基因可以长成菌落　②融合基因表达(或融合基因正确解码) 解析 (1)①以逆转录获得cDNA的方式,要先从真菌细胞中提取基因m转录出来的mRNA。②从构建好的重组质粒上看,tag序列位于目的基因下游,若m基因的转录产物mRNA上有终止密码子,核糖体移动到终止密码子多肽链就断开,则不会对tag序列的转录产物继续进行翻译,蛋白M上就不含tag标签。③“80 ℃以上再混入酶,然后直接从94 ℃开始PCR扩增”,故Taq酶最适催化温度范围为94 ℃左右,A项错误。PCR反应的最初加热过程中,样品温度上升到70 ℃之前,在较低的温度下引物可能与部分单链模板形成非特异性结合,并在Taq酶的作用下延伸,结果会导致引物错配形成的产物的扩增,影响反应的特异性;热启动可减少引物错配形成的产物的扩增,提高反应的特异性,B项正确。DNA分子复制具有方向性,都是从5'端向3'端延伸,C项正确。Taq酶没有特异性,与普通的DNA聚合酶相比,Taq酶更耐高温,D项错误。(2)①载体A只有一个SmaⅠ的酶切位点,故被SmaⅠ切开后,载体由环状变为链状DNA,将SmaⅠ切开的载体A与添加同源序列的m混合,用特定DNA酶处理形成黏性末端,然后降温以促进载体A与添加同源序列的m的黏性末端碱基互补配对。将A-m结合体导入大肠杆菌,利用大肠杆菌中的DNA聚合酶及DNA连接酶等,完成质粒的环化。②重组质粒中,载体A被SmaⅠ切开的位置已经与基因m相连,原来的酶切位点已不存在,若正确构建的重组质粒A—m仍能被SmaⅠ切开,则SmaⅠ的酶切位点可能在基因m的连接处或基因m内部。(3)①筛选目的菌株的机理是导入了质粒A-m的目的菌株由于含有URA3基因,能在无尿嘧啶的培养基上存活,而URA3基因缺失型酵母则不能存活。②若通过抗原—抗体杂交实验检测到酵母蛋白中含tag标签,说明位于tag标签上游的基因m应该正常表达,融合基因表达(或融合基因正确解码)。 38. 答案(1)DNA连接酶　(2)感受态细胞法　(3)碱基互补配对原则　目标DNA特定的核苷酸　(4)DNA分子杂交技术　出现杂交带　(5)CRISPR/Cas9重组质粒在受体细胞内进行转录和表达,转录的产物是sgRNA,表达的产物是Cas9蛋白,二者形成复合体,该复合体中的sgRNA可识别并与目标DNA序列特异性结合,从而插入到基因组DNA中 解析 (1)基因工程所需的工具酶有限制酶和DNA连接酶,限制酶负责切割,DNA连接酶负责连接,因此为构建CRISPR/Cas9重组质粒,需对含有特定sgRNA编码序列的DNA进行酶切处理,然后将其插入到经相同酶切处理过的质粒上,插入时所需要的酶是DNA连接酶。(2)大肠杆菌是原核生物,属于微生物,将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。(3)在CRISPR/Cas9基因编辑技术中,sgRNA是根据靶基因设计的引导RNA,准确引导Cas9切割与sgRNA配对的靶基因DNA序列。Cas9能借助sgRNA分子与目标DNA进行特异性结合的原因在于sgRNA分子上的碱基序列与目标DNA分子上的碱基序列可以通过碱基互补配对原则实现sgRNA与目标DNA特定序列的特定识别,进而定位;由此可见,Cas9在功能上属于限制酶,可切割目标DNA特定的核苷酸序列。(4)可利用DNA分子杂交技术判断基因敲除是否成功,若出现杂交带,则说明基因敲除成功。(5)CRISPR/Cas9重组质粒在受体细胞内进行转录和表达,转录的产物是sgRNA,表达的产物是Cas9蛋白,二者形成复合体,该复合体中的sgRNA可识别并与目标DNA序列特异性结合,从而插入到基因组DNA中。 39. 答案(1)灭菌　胰蛋白酶或胶原蛋白酶 (2)无机盐、葡萄糖、氨基酸、微量元素、促生长因子、血清或血浆(填写两种即可)　维持培养液的pH (3)RNA聚合酶的识别和结合位点,驱动转录出相应的mRNA　解析基质细胞悬液和空载体与基质细胞的混合培养液 促进 解析 (1)为避免细菌污染,手术器具应进行灭菌处理;动物组织取出剪碎后,用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理一定时间,可获得分散的动物组织细胞。(2)动物细胞培养时,培养基中营养物质应有无机盐、葡萄糖、氨基酸、微量元素、促生长因子、血清或血浆等;培养箱中为95%的空气和5%的CO2,其中5%的CO2的主要作用是维持培养液的pH。(3)启动子是RNA聚合酶的识别和结合位点,驱动转录出相应的mRNA。为了证明PDCD4基因对基质细胞凋亡的作用,以含PDCD4基因的表达载体和基质细胞的混合培养为实验组,还应设立两个对照组,分别为基质细胞悬液和空载体(排除空载体的作用)与基质细胞的混合培养液(空白对照)。经检测,实验组中PDCD4表达水平和细胞凋亡率显著高于对照组,说明该基因对基质细胞凋亡具有促进作用。 40. 答案(1)基因组文库　(2)限制酶和DNA连接酶　筛选含有目的基因的受体细胞　(3)农杆菌转化法　防止基因污染　(4)耐性　茎、叶 (5)将Cd运到液泡内　杨树植物体较大,吸收Cd的量多;杨树的茎、叶、根易获取 解析 (1)将酵母细胞的全部DNA提取、切割后与载体连接,导入受体菌的群体中储存,这是构建了酵母菌的基因组文库。(2)构建重组载体所需的两种酶是限制酶和DNA连接酶。标记基因的作用是将含有目的基因的受体细胞筛选出来。(3)将重组DNA分子导入双子叶植物细胞时采用最多的方法是农杆菌转化法。采用不育株系作为实验材料可有效防止基因污染。(4)从图1可以看出转基因植株的干重高于野生型,说明其对Cd具有更强的耐性。从图2可知,转基因植株的茎、叶中Cd含量较高,所以对其进行后续处理对于缓解土壤Cd污染最为方便有效。(5)YCF1特异定位于转基因植物细胞的液泡膜上,说明它可以运输Cd进入液泡中,使转基因杨树更好地适应高Cd环境。杨树与草本植物相比植株高大,吸收Cd的量更多,其根、茎、叶等组织器官易获取等使其成为Cd污染土壤修复的优势物种。 考点73　DNA的粗提取与鉴定及PCR技术 1.D　解析反应管中没有模板和引物,故要制备带有荧光标记的DNA探针,只能利用反应管中的DNA单链互为引物来实现,而且要保证产物中含有碱基被荧光标记的dATP,使之带有荧光标记。反应管①中的两条单链DNA可以错位互补形成如下双链: 但无法互为引物完成子链延伸。反应管②中的同种单链DNA可以错位互补形成如下双链: 虽可互为引物和模板,但却不需要碱基被荧光标记的dATP,不能使单链带上荧光标记。反应管③中的两条单链DNA可以错位互补形成如下双链: 可互为引物和模板,并利用碱基被荧光标记的dATP使每一条链都带上荧光标记。反应管④中的同种单链DNA可以错位互补形成如下双链: 可互为模板和引物,从链的3'端延伸,利用碱基被荧光标记的dATP使每一条链都带上荧光标记,D项正确。 本题是单选题中最难的题目,难在不易找到切入点。本题关键是信息的提取与处理。 (1)获取信息: ①制备荧光标记的DNA探针时,需要模板、引物、DNA聚合酶等。 ②在只含大肠杆菌DNA聚合酶、扩增缓冲液、H2O和4种脱氧核苷酸(dCTP、dTTP、dGTP和碱基被荧光标记的dATP)的反应管①~④中,分别加入如表所示的适量单链DNA。 ③已知形成的双链DNA区遵循碱基互补配对原则,且在本实验的温度条件下不能产生小于9个连续碱基对的双链DNA区。 ④能得到带有荧光标记的DNA探针的反应管。 (2)处理信息: 比较信息①②,可知反应管①~④中没有明确的模板与引物,只有表中所示的适量单链DNA,由此可知相关单链既是模板又是引物——联想重叠延伸PCR→相关单链要形成双链,并互为引物→子链延伸时利用碱基被荧光标记的dATP,使之标记。 2.A　解析组织研磨液中上清液的获取可以采用低温静置法或离心法,A项正确。研磨液在4 ℃冰箱中放置几分钟后,取上清液,其中含有DNA,不能再摇匀,B项错误。鉴定过程中需要沸水浴加热,会导致DNA变性,DNA的双螺旋结构发生改变,C项错误。仅设置一个只加2 mol/L的NaCl溶液的对照组即可排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰,D项错误。 3.D　解析根据图乙结果显示可知,F1-R1引物只扩增出一条条带,说明能够用于特异性扩增目的片段,A项正确。根据图乙信息可知,F1-R2引物扩增条带为三条,说明其不能用于特异性扩增目的片段,B项正确。根据图乙信息可知,F1-R1能扩增一条目的片段,F2-R1无法扩增目的片段,所以F2为无效引物,没有扩增功能,无法使用,C项正确。根据图乙信息可知,F1-R1引物只扩增出一条条带,F1-R2引物扩增条带为三条,说明R2引物无法特异性地扩增目的片段,D项错误。 4.B　解析根据题干信息可知,疟原虫pfcrt基因编码的蛋白,在第76位发生了赖氨酸到苏氨酸的改变,从而获得了对氯喹的抗性。根据酶切位点可知,在具有氯喹抗性患者的基因组中没有ApoⅠ酶切位点,而敏感性患者的基因组中具有该酶切位点,因此对6份血样处理后进行PCR,产物用限制酶ApoⅠ消化,酶解产物的电泳结果中出现两条带则为敏感性基因,只有一条带的为抗性基因,所以1~6号血样中,来自氯喹抗性患者的是2号和4号,B项符合题意,3号和5号没有得到条带,可能未感染疟原虫,A、C、D三项不符合题意。 根据ApoⅠ酶识别序列和酶切位点,去分析图甲中氯喹敏感患者和氯喹抗性患者的疟原虫pfcrt基因序列,在具有氯喹抗性患者的基因组中没有ApoⅠ酶切位点,而敏感患者的基因组中具有该酶切位点,故氯喹敏感患者的基因可被限制酶切为两段,而氯喹抗性患者的基因不能被该限制酶酶切,仍为一个DNA分子。 5.B　解析细胞学说的提出先于电子显微镜的发明,光学显微镜的发明促进了细胞学说的提出,A项错误。差速离心法是通过不同的离心速率将细胞内大小不同的细胞器分离开来,其应用促进了对细胞器的认识,B项正确。花期主要受植物激素和环境等因素影响,光合作用的解析 与花期控制技术的成熟没有直接关系,C项错误。PCR技术的发明关键在于耐高温的DNA聚合酶的应用,而不是RNA聚合酶的发现,D项错误。 6.B　解析PCR是在体外进行DNA扩增的技术,故配制PCR反应体系时,应加入等量的4种脱氧核糖核苷酸溶液作为扩增原料,A项错误。在凝胶中添加核酸染料,电泳后PCR产物可以在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来,B项正确。酵母培养基应该用湿热灭菌的方法进行灭菌,而不是煮沸消毒,C项错误。为了避免高温杀死菌种,接种环烧红后需要先冷却,再蘸取酵母菌液在培养基上划线培养,获得单菌落,D项错误。 7.AC　解析利用双脱氧测序法时,PCR反应体系中加入的模板是待测的单链DNA,故只需加入一种引物,A项正确。电泳时产物的片段越大,迁移速率越慢,B项错误。对照个体测序结果为5'-CTACCCGTGAT-3',患者个体测序结果为5'-CTACCTGTGAT-3',对比可知,患者该段序列中某位点的碱基C突变为T,C项正确,D项错误。 电泳图像的辨析 DNA电泳是基因工程中最基本的技术之一,其原理是利用带电分子的带电性质以及DNA分子本身大小和形状不同,使带电分子在电场作用下产生不同的迁移速率,进而达到分离和鉴定的目的。 辨析电泳图像时,首先要明确电泳方向及条带对应的含义,根据电泳方向确定DNA片段的大小及相应序列或碱基,进而判断脱氧核苷酸链的方向。 该题中以对照个体电泳图像为例,按照电泳方向最短的DNA单链序列第一个碱基为C,第二个碱基为T,依次类推得到总序列为CTACCCGTGAT,因为DNA子链的延伸方向为5'端到3'端,所以该序列为5'-CTACCCGTGAT-3'。 8.D　解析研磨液有利于DNA的溶解,更换为蒸馏水,DNA提取的效率会降低,A项正确。DNA不溶于酒精,但细胞中的某些蛋白质溶于酒精,所以利用DNA和蛋白质在酒精中的溶解度差异,可初步分离DNA,B项正确。DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同,它能溶于2 mol/L的NaCl溶液,可利用该原理对DNA进行粗提取,C项正确。在沸水浴的条件下,DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色,故二苯胺试剂可用于鉴定DNA,但不能检测溶液中是否含有蛋白质杂质,D项错误。 9.B　解析由题图甲可知,启动子可以启动Gata3基因转录,GFP基因整合在了Gata3基因的下游,所以Gata3基因的启动子能控制GFP基因的表达,A项错误。因GFP基因整合在了Gata3基因的下游,故转录时先合成Gata3基因的mRNA再合成GFP基因的mRNA,翻译时先合成Gata3蛋白,再合成GFP蛋白,B项正确。整合GFP基因后,核酸片段变长,2号个体只有大片段,是Gata3-GFP基因纯合子,4号个体只有小片段,是野生型,C项错误。用引物1和引物3进行PCR扩增,野生型小鼠不能得到扩增产物,杂合子和Gata3-GFP基因纯合子都只能扩增出大片段,无法区分纯合子和杂合子,D项错误。 10.B　解析低温时DNA酶的活性较低,过滤液沉淀过程在4 ℃冰箱中进行是为了防止DNA降解,A项正确。离心研磨液是为了使细胞碎片沉淀,B项错误。沸水浴条件下,DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色,C项正确。由于是粗提取,因此粗提取的DNA中很可能含有蛋白质,D项正确。 11.A　解析粗提取DNA时,向鸡血细胞溶液中加入一定量的蒸馏水,鸡血细胞吸水涨破,释放内容物,过滤后DNA存在于滤液中,但DNA主要与蛋白质结合,以染色体的形式存在,所以使用木瓜蛋白酶,可以分解蛋白质,DNA仍然存在于得到的滤液中,然后加入体积分数为95%的酒精,使其溶解度下降,DNA析出,呈白色丝状物,A项正确。37~40℃的水浴箱中保温10~15 min不能使蛋白质变性析出,也不能使DNA析出,B项错误。向鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水并搅拌,过滤后在得到的滤液中加入与滤液体积相等的、体积分数为95%的冷却的酒精,此时DNA析出,不会进入滤液中,C项错误。加入NaCl调节浓度至2 mol/L→过滤→调节滤液中NaCl浓度至0.14 mol/L,DNA在0.14 mol/L的NaCl溶液中溶解度小,DNA析出,不会进入滤液中,D项错误。 12. 答案(1)174/174 (2)等位基因 (3)标记重捕　第一次捕获(鉴定)的个体数为24,第二次捕获(鉴定)的个体数为32,其中有10个与第一次相同,故貉的种群数量为:24×32÷10≈77 (4)根据雄性貉的Y染色体特有序列,设计相应引物,对现有每个个体的DNA样品进行PCR扩增电泳分析,鉴定其性别,计算出性别比例。 解析 (1)由图2可知,个体B扩增后的电泳条带只有长度为174的,故其“基因型”为174/174。 (2)根据题干信息可知,通过微卫星“基因”鉴别不同个体的原理是对微卫星“基因”扩增后进行电泳分析,以确定其“基因型”,所以微卫星“基因”数目和“等位基因”的数目越多,个体特异的“基因型组合”越多,能够区分的个体数就越多。 (3)第一次采集粪便进行DNA检测,相当于标记重捕法中的第一次捕获并标记,第二次检测相当于重捕,然后统计出其中被标记的个体数,即与第一次检测相同的个体数,进行进一步计算。第一次捕获(鉴定)的个体数为24,第二次捕获(鉴定)的个体数为32,其中有10个与第一次相同,故貉的种群数量为:24×32÷10≈77。 (4)Y染色体上具有其特有的碱基序列,例如微卫星DNA。根据雄性貉的Y染色体特有序列,设计相应引物,对现有每个个体的DNA样品进行PCR扩增电泳分析,鉴定其性别,计算出性别比例。 13. 答案(1)捕食和种内竞争　物理信息、化学信息和行为信息　资源和空间 (2)互利共生 (3)①上清液　②溶解DNA　③Taq DNA聚合酶(或耐高 温的DNA聚合酶)和4种脱氧核苷酸 (4)互补配对　含有rbcL基因的DNA片段　丙、丁　甲、乙 (5)ab 解析 (1)川金丝猴警戒行为可监测捕食者,当有天敌入侵时会发出信号躲避敌害,这体现了生物之间的捕食关系;这种警戒行为还可监测同种个体,这体现了生物之间的种内竞争关系。信息类型有物理信息、化学信息和行为信息等。自然条件下资源和空间有限,川金丝猴根据获取的信息及时作出反应,可为争夺资源和空间获得更多机会。 (2)川金丝猴与消化道中参与高纤维食物消化的微生物共同生活,相互依存,彼此有利,属于互利共生关系。 (3)①样本中加入裂解液,使DNA释放出来,离心后细胞膜等结构在沉淀物中,上清液中含有DNA,向上清液中加入乙醇,因为DNA不溶于乙醇,会有丝状物析出,取沉淀即为粗提取的DNA。 ②上一步得到的沉淀物主要是DNA,加入纯水的目的是溶解DNA。 ③分析题表可知,PCR反应体系中还缺少Taq DNA聚合酶(或耐高温的DNA聚合酶)和4种脱氧核苷酸。 (4)引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。PCR扩增的产物可用琼脂糖凝胶电泳来鉴定,因此对4个样本的扩增产物进行DNA电泳条带分析,能检出的样本是含有rbcL基因的DNA片段。据题图可知,植物甲和植物乙测序部分的碱基序列完全一致,植物丙和植物丁的碱基序列均与植物甲有区别,对川金丝猴粪便DNA进行扩增并测序,得到的序列有图中的3种序列,可知川金丝猴摄食的植物至少有三种,其中一定含有的植物是丙和丁,但是无法确定摄食甲和乙其中的一种还是二者均被摄食。因此,若要更准确鉴定出川金丝猴摄食的植物,还需选用甲和乙的保守序列再设计引物,对川金丝猴粪便DNA进行扩增、测序分析。 (5)建立生态廊道可以帮助种群间建立联系,促进种群间基因交流,是保护川金丝猴的有效措施之一,a正确;保护川金丝猴栖息地的植被和它喜食的植物,可以提高其环境容纳量,是保护川金丝猴的有效措施之一,b正确;用标记重捕法对川金丝猴定期重捕,会干扰其正常生活,不能有效保护川金丝猴,c错误;就地保护是对川金丝猴最有效的保护,不能主要依赖迁地保护,d错误。 14. 答案(1)稀释涂布平板法或平板划线法　筛选出能抑制稻瘟病致病菌的内生放线菌,并确定其适宜生长温度 (2)大量扩增　②　同源区段交换时,未正确发生R基因的敲除(或交换后仍保留完整R基因,或发生了其他非目标基因区域的交换) (3)实验思路:取等量的稻瘟病致病菌培养液,分为两组,一组加入含高效合成铁载体的内生放线菌培养物,另一组加入等量不含铁载体的内生放线菌培养物;在相同且适宜的条件下培养,一段时间后检测并比较两组培养液中稻瘟病致病菌的数量(或观察生长情况)。 解析 (1)从混杂的微生物中分离筛选目的菌,常用稀释涂布平板法或平板划线法接种。稀释涂布平板法可对微生物计数并分离单菌落,平板划线法能分离单菌落。采集有病斑的水稻叶片制备研磨液,接种到选择培养基上并在不同温度下培养,目的是筛选出能抑制稻瘟病致病菌的内生放线菌,同时确定该菌适宜生长的温度,因为不同微生物对温度等环境条件需求不同,通过此操作可获得目的菌并掌握其生长习性。 (2)PCR技术利用DNA半保留复制原理,通过变性(DNA解旋)、复性(引物与模板结合)、延伸(Taq酶催化子链合成)三步循环,实现基因片段的大量扩增,为后续检测提供足够模板。构建R基因敲除株,根据图1,正常含有R基因的片段经引物1和2 PCR扩增后片段长度与敲除R基因的不同。结合图2,菌落②扩增出的片段长度与其他不同,符合R基因敲除后片段变化,故R基因敲除株为菌落②。菌落④扩增出的片段长度异常,原因可能是同源区段交换时,未正确发生R基因的敲除,比如交换后仍保留完整R基因,或交换发生在非目标区域,导致扩增片段与预期敲除株不同。 (3)要验证“内生放线菌通过对铁离子的竞争性利用抑制稻瘟病致病菌生长”,实验变量是“铁离子竞争(通过铁载体实现)”。 分组:取等量稻瘟病致病菌培养液,分为两组,实验组加入含高效合成铁载体的内生放线菌培养物,模拟铁离子竞争,对照组加入等量不含铁载体的内生放线菌培养物,排除其他干扰。 培养与检测:在相同且适宜的条件下培养,一段时间后检测两组培养液中稻瘟病致病菌的数量(或观察生长情况),若实验组稻瘟病致病菌数量少于对照组,可说明内生放线菌通过铁离子竞争性利用抑制其生长。 15. 答案(1)磷脂、蛋白质　发出星射线,形成纺锤体 (2)溶解DNA　耐高温的DNA聚合酶　3' (3)①a、B　②1 100　③Q4　④蛋白质X参与中心体的形成　(4)逆转录　32 解析 (1)纤毛膜由细胞膜延伸形成,其化学成分与细胞膜一致,主要由磷脂、蛋白质组成。中心体存在低等植物细胞与动物细胞中,在有丝分裂中的功能是在前期发出星射线,形成纺锤体。 (2)分离提取细胞样品中DNA时,利用DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同,可通过交替调节NaCl溶液的浓度,将DNA分离出来。DNA在2.0 mol/L的NaCl溶液中的溶解度最大,高于或低于这一浓度时,DNA的溶解度均会下降。因而在实验中可添加NaCl至2.0 mol/L,以溶解DNA。PCR扩增时,需在耐高温的DNA聚合酶的催化下,从引物的3'端开始进行DNA子链的延伸,从而获得扩增产物。 (3)①利用PCR技术扩增DNA片段时,由于DNA聚合酶只能从引物的3'端进行DNA子链的延伸,引物应分别与DNA分子的两条模板链互补,据题图可知,应选择图Ⅱ中的引物a和引物b。②根据图Ⅱ可知,PCR目的产物的长度约为300+800=1 100bp。③确保M及连接处序列正确,Y-M的连接处上游含有Hind Ⅲ+EcoR Ⅴ的识别序列,下游含有EcoR Ⅴ+BamH Ⅰ的识别序列,根据题干信息构建Y-M重组质粒(在EcoRⅤ位点插入片段),Y-M的连接处测序后部分序列应含有EcoR Ⅴ+BamH Ⅰ的识别序列,根据EcoR Ⅴ识别位点,应选择序列Q4。④对照质粒Y-GFP(仅表达GFP)与实验质粒Y-M分别导入细胞,发现对照组整个细胞均有绿色荧光,而实验组荧光集中在纤毛基部,说明蛋白质X参与中心体的组成。 (4)采用荧光定量PCR法检测健康人与病人基因Z的转录水平,以研究另一纤毛病相关基因Z表达变化,首先要采集样本、提取总RNA,经逆转录形成cDNA,再以cDNA作为模板进行PCR扩增。PCR扩增结果显示,在总cDNA模板量相等的条件下,健康人Ct值为15,而病人Ct值为20,说明病人基因Z表达较弱。设健康人Z基因相应的cDNA数为x,病人Z基因相应的cDNA数为y,则有x×215=y×220,从理论上估算,在PCR扩增20个循环的产物中,健康人样品的目的产物大约是病人的25=32倍。 考点74　基因工程的应用及蛋白质工程 1.C　解析胰岛素在动物体内由胰岛B细胞合成后,通过胞吐释放出细胞,A项正确。胰岛素属于蛋白质类激素,所以化学合成胰岛素的原料是氨基酸,B项正确。启动子具有物种及组织特异性。在利用大肠杆菌生产胰岛素时,需要将胰岛素基因与大肠杆菌特异性启动子等调控元件重组在一起,导入大肠杆菌;在利用乳腺生物反应器生产胰岛素时,需要将胰岛素基因与乳腺中特异性表达基因的启动子等调控元件重组在一起,导入哺乳动物受精卵中,C项错误。利用蛋白质工程可以对胰岛素进行改造,生成具有不同作用特性的胰岛素类似物,包括速效胰岛素,D项正确。 2.B　解析生长素能促进子房发育果实,用特异启动子诱导表达iaaM(生长素合成基因)可获得无子果实,A项合理。大量表达ipt(细胞分裂素合成关键基因),细胞分裂素含量升高,细胞分裂素和生长素的比例较高时,有利于芽的分化,B项不合理。赤霉素能促进细胞伸长,从而引起茎秆伸长和植物增高,提高ga2ox(氧化赤霉素的酶基因)的表达水平可使赤霉素含量降低,从而能获得矮化品种,C项合理。乙烯能促进果实成熟,在果实中表达acs(乙烯合成关键酶基因)的反义基因,即抑制乙烯的合成,果实成熟会延迟,D项合理。 3.D　解析由题干知,在N0的α和β亚基之间加入一段连接肽,可获得热稳定的融合型腈水合酶(N1),则N1与N0氨基酸序列有所不同,这可能是影响其热稳定性的原因之一,A项正确。蛋白质工程属于基因工程,其作用的对象是基因,故加入连接肽需要通过改造基因实现,B项正确。N1的化学本质是蛋白质,获得N1的过程需要进行转录和翻译,C项正确。由于酶具有高效性,因此在检测N1的活性时需先将其置于高温环境,再与底物充分混合,D项错误。 4. 答案(1)序列数据库　XhoⅠ　XbaⅠ　DNA连接酶 (2)其他模板　1　实验组1的电泳条带大小与基因N的大小接近 (3)GCC (4)香树脂醇 解析 (1)可从序列数据库中查询基因N的编码序列,设计特定引物。如图1所示,a链为转录模板链,所以右端为启动子端,为保证基因N与质粒pYL正确连接,右端要与质粒pYL中用限制酶SpeⅠ切出的末端(5'-A 3'-TGATC)相连,而限制酶SpeⅠ会将基因N切断,所以引物2的5'端应引入限制酶XbaⅠ的识别序列,以便切出与SpeⅠ相同的末端进行连接;引物1的5'端则引入限制酶XhoⅠ的识别序列。PCR扩增基因N,特异性酶切后,利用DNA连接酶连接DNA片段。 (2)在第5组的PCR反应中,使用无菌水代替实验组的模板DNA,目的是检验PCR反应中是否有其他模板的污染。初步判断实验组1的质粒中成功插入了基因N,理由是重组质粒的大小约9.5 kb,质粒pYL的大小约7.2 kb,所以基因N的大小约为2.3 kb,使用引物1和引物2进行PCR扩增的是基因N,实验组1的电泳条带大小约为2.3 kb,与基因N的大小接近。 (3)a是诱变第240位脯氨酸编码序列的引物(GCA为诱变序列),据图可知,a的5'端显示的前三个碱基GCA即为第240位脯氨酸替换为丙氨酸后对应的密码子序列;又因为 b、c、d其中一条是诱变第243位苯丙氨酸的引物,其配对模板与a的配对模板相同,据图可知,只有c的序列与a的序列(244位~250位)相同,故c链为诱变第243位苯丙氨酸的引物,5'端显示的前三个碱基为第243位苯丙氨酸替换为丙氨酸后对应的密码子序列GCC。据此分析,丙氨酸的密码子除GCA外,还有GCC。 (4)进一步检测转基因酵母菌发酵得到的香树脂醇含量并进行比较,可以选出最优的香树脂醇合酶基因的改造方案。 5. 答案(1)稳定性差异　选择性表达 (2)C (3)各组织器官中G和H的mRNA (4) 解析 (1)细胞分化是指在个体发育中,由一个或一种细胞增殖产生的后代,在形态、结构和生理功能上发生稳定性差异的过程,其实质是基因的选择性表达。 (2)根据题干信息“增强子位于基因上游或下游,与基本启动子共同组成基因表达的调控序列”可知,增强子是含有特定碱基序列的DNA片段,增强子、基本启动子和它们调控的基因位于同一条染色体上,A、B项正确。根据图C分析可知,一个增强子可作用于多个基因的基本启动子,如图中的报告基因与内源基因,C项错误。根据题干信息“很多增强子具有组织特异的活性”可知,很多增强子在不同组织中的活性不同,D项正确。 (3)若要确定这两个基因是否为心脏特异表达的基因,可以对其转录产物进行检测,即通过PCR等技术检测各器官细胞中G和H两个基因是否转录出相应的mRNA进行判断。 (4)由题干信息分析可知,增强子位于基因上游或下游,与基本启动子共同组成基因表达的调控序列,基因工程所用表达载体中的启动子,包含增强子和基本启动子。增强子捕获载体的插入位点位于基因外部,不会造成基因突变。只有当增强子捕获载体的插入位点位于基因内部,才会造成该增强子所调控的基因发生突变。为研究某目的基因的功能,可将图B所示载体去掉基本启动子,则该载体插入基因内部后才会发挥作用,如下图。 6. 答案(1)水解蛋白质,使蛋白质与DNA分离,便于后续操作中蛋白质的去除和DNA的提取　溶解蛋白质,析出DNA (2)PCR　人工合成 (3)RNA聚合酶识别和结合的部位　提高基因转录效率 (4)HygBR　(5)F3　R2　(6)D 解析 (1)从苏云金杆菌提取DNA时,加入蛋白酶的作用是溶解蛋白质,使蛋白质与DNA分离,便于后续操作中蛋白质的去除和DNA的提取,提取过程中加入体积分数为95%的预冷酒精可以溶解蛋白质,析出DNA。(2)由题图可知,获得目的基因的方法是PCR和人工合成。(3)启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位,驱动基因转录。插入两个启动子可以转录出更多的mRNA分子,再进一步翻译出更多的蛋白质,提高了基因的表达量。(4)质粒上的基因在T-DNA上可以整合到宿主的核DNA上,从而在宿主细胞内表达,T-DNA外的基因不能在宿主细胞内表达。由题图可知,KanR在T-DNA外,不能在宿主细胞内表达;HygBR在T-DNA上,可以整合到宿主的核DNA上,从而在宿主细胞内表达。故用HygBR基因对应的抗生素初步筛选转化的棉花愈伤组织。(5)由题图可知,目的基因左侧为人工合成序列,右侧为1 363—1 848序列,人工合成序列的上链左端有F3引物结合位点且向右延伸,1 363—1 848序列的下链右端有R2引物结合位点且向左延伸,故引物选择F3和R2。(6)蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础,通过改造或合成基因,来改造现有蛋白质,或制造一种新的蛋白质,以满足人类生产和生活的需求。而基因工程原则上只能生产自然界中已有的蛋白质。用1—1 362合成基因序列和1 363—1 848天然基因序列表达出新的抗虫蛋白,属于蛋白质工程。 7. 答案(1)氮源、碳源　(2)PT7、PBAD和PBAD　 基因2、3正常表达出无活性蛋白,被蓝光激活后再启动基因1表达　(3)抑制杂菌,去除丢失质粒的菌株　(4)该处细胞激活T7RNAP,酪氨酸酶基因表达并合成黑色素　(5)将酪氨酸酶替换成能催化合成其他色素的酶(或将酪氨酸酶替换成不同颜色蛋白) 解析 (1)培养基的营养物质包括水、无机盐、碳源、氮源和特殊营养物质等。培养工程菌需要优化培养基的碳源、氮源等营养条件,并控制环境条件如CO2浓度。(2)由题图二a可知,蓝光照射下,T7RNAP N端-nMag与T7RNAP C端-pMag结合,导致无活性的T7RNAP变成有活性的T7RNAP。蓝光处理后,RNA聚合酶(T7RNAP)识别启动子①使基因1转录获得相应的mRNA,再以其为模板通过翻译过程获得酪氨酸酶,酪氨酸酶催化染色液中的酪氨酸形成黑色素,可见基因2、3正常表达出无活性蛋白,被蓝光激活后再启动基因1表达。综合上述分析可知,为实现蓝光控制染色,启动子①②及③依次为PT7、PBAD和PBAD。(3)大观霉素属于抗生素,抗生素具有抑制杂菌的作用。光控表达载体携带大观霉素抗性基因。长时间培养时在培养液中加入大观霉素,可以抑制杂菌生长,还可以去除丢失质粒的菌株。(4)蓝光能够激活T7RNAP,表达出酪氨酸酶,酪氨酸酶催化酪氨酸形成黑色素。故用蓝光照射已长出的BC菌膜并继续培养一段时间,随后将其转至染色池处理,发现只有经蓝光照射的区域被染成黑色。(5)如果生产其他颜色图案的BC膜,需要将酪氨酸酶替换成能催化合成其他色素的酶(或将酪氨酸酶替换成不同颜色蛋白)。 8. 答案(1)胚乳特异表达基因的　终止转录　Hind Ⅲ　EcoRⅠ (2)农杆菌转化　r2HN基因是否转录　抗原—抗体杂交 (3)1/4　子代不发生性状分离　(4)体液　细胞　(5)生产成本低;转基因水稻易获得(或“安全性高”或“种子蛋白易纯化”或“水稻自花传粉不易发生基因污染”) 解析 (1)由题意可知,若使r2HN基因仅在水稻胚乳表达,GtP(启动子)应为水稻胚乳中特异表达的基因的启动子。Nos为终止子,其作用为终止转录过程。GtP内部含有KpnⅠ的酶切位点,用KpnⅠ酶切会破坏启动子,Nos下游含有SacⅠ的酶切位点,用SacⅠ酶切会使目的基因无法插入启动子和终止子之间,进而无法表达,故构建基因表达载体时,可选择限制酶HindⅢ和EcoRⅠ对r2HN基因与载体进行酶切。(2)水稻是单子叶植物,可用农杆菌转化法将r2HN基因导入水稻愈伤组织。为检测r2HN基因表达情况,可通过PCR技术检测r2HN基因是否转录出了mRNA,通过抗原—抗体杂交技术检测r2HN基因是否翻译出r2HN蛋白。(3)选择单一位点插入目的基因的植株(用AO表示)进行自交一代,根据分离定律,r2HN纯合体植株(AA)占1/4,无r2HN基因的纯合体植株(OO)占1/4,杂合体植株(AO)占1/2。由于纯合体植株遗传性状稳定,故选择r2HN纯合体植株进行后续研究。(4)通过体液免疫,机体可产生较多抗体,通过细胞免疫,机体可产生较多细胞毒性T细胞。由题图可知,实验组的抗体和CD8+T细胞(细胞毒性T细胞)的相对值明显高于对照组,因此获得的r2HN疫苗能够成功激活鸡的体液免疫和细胞免疫。(5)利用水稻作为生物反应器生产r2HN疫苗,具有生产成本低、生物安全性较高、提取和处理目标产物容易等优点。 9. 答案(1)蛋白质　(2)③　(3)②③　(4)标记基因 (5)筛选出导入目的基因的大肠杆菌(鉴定目的基因是否插入表达载体)　5.7　(6)逆转录 解析 (1)根据蛋白质的功能改变基因的结构,最终获得耐高温的β-淀粉酶,这属于蛋白质工程。 (2)PCR的原理是DNA复制,以DNA的两条链为模板在耐热的DNA聚合酶作用下合成子链。 (3)根据β-淀粉酶的编码序列,替换的碱基在编码序列中,则利用的引物应该把编码序列全部扩增在内,故所用的引物是②③。 (4)作为基因工程载体的质粒应包含:复制原点、限制酶的切割位点、标记基因、启动子和终止子,根据图2的表达载体可知还应包括目的基因和标记基因。 (5)题中目的基因通过基因表达载体导入大肠杆菌中,大肠杆菌菌落的质粒DNA经琼脂糖凝胶电泳确定DNA片段长度,这一操作的目的是筛选出导入目的基因的大肠杆菌。正确连接的基因表达载体只有一个EcoR Ⅰ酶切位点,则切割后的长度为4.2+1.5=5.7 kb。 (6)转录是以DNA为模板合成RNA的过程,通过PCR在分子水平上确定目的基因是否转录,则需要以RNA为模板逆转录出DNA作为PCR反应的模板。 10. 答案(1)负反馈调节　过量的赖氨酸类似物 (2)①基因数据库　②融合　③受体细胞　激活　④桑葚胚或囊胚　⑤转基因牛耳组织细胞　DNA酶　模板　构建的表达载体只含有乳腺特异性启动子,只能在乳腺细胞中启动转录,而在牛耳细胞中不能转录表达 解析 (1)负反馈调节是指在一个系统中,系统工作的效果,反过来又作为信息调节该系统的工作,并且使系统工作的效果减弱或受到限制,有助于系统保持稳定。植物细胞合成的赖氨酸达到一定浓度时,能抑制合成过程中两种关键酶的活性,导致赖氨酸含量维持在一定浓度水平,这种调节方式属于负反馈调节。如果想得到抗赖氨酸类似物的细胞突变体可在培养基中添加过量的赖氨酸类似物。(2)①当需要某一片段时,可根据目的基因的有关信息,如根据基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色体上的位置、基因的转录产物,以及基因的表达产物蛋白质等特性从基因数据库中获取目的基因。②表达载体包裹到磷脂等构成的脂质体内,根据细胞膜的成分分析,脂质体可与BEF膜发生融合。③去核的卵母细胞作为受体细胞,其处于减数第二次分裂中期,因为卵母细胞中含有促使细胞核表达全能性的物质和营养条件。电融合的作用除了促进细胞融合,同时起到了激活重组细胞发育的作用。④胚胎发育到适宜阶段可取出向受体移植。牛、羊一般要培养到桑葚胚或囊胚阶段,植入代孕母牛子宫角,直至小牛出生。⑤排除未知变量对实验产生的不利影响。本实验以非转基因牛耳组织细胞作为阴性对照,为了检测到转基因牛耳组织细胞中存在目的基因,应以含目的基因的转基因牛耳组织细胞为阳性对照。为了除去DNA污染,可以用DNA酶使其水解。将总RNA经逆转录形成cDNA,并以此为PCR的模板进行扩增。目的基因在转基因牛乳汁中的脱落细胞内表达,而不在牛耳组织细胞内表达,原因是构建的表达载体只含有乳腺特异性启动子,只能在乳腺细胞中启动转录,而在牛耳细胞中不能转录表达。 阳性对照和阴性对照 阳性对照:阳性是已知的对测量结果有影响的因素,目的是确定实验程序无误。按照当前实验方案一定能得到正面预期结果的对照实验。 阴性对照:与阳性对照相反,按照当前的实验方案一定不能得到正面预期结果的对照实验。 11. 答案(1)显微注射　(2)监测灵敏度更高　(3)②　D　(4)激活ERE诱导Gal4表达,Gal4结合UAS诱导dg表达,生殖细胞凋亡　(5)避免转基因斑马鱼逃逸带来生物安全问题 解析 (1)在基因工程中,将目的基因导入受体有多种方法,根据不同的受体选取不同的方法,导入动物受精卵的最佳方式是显微注射。(2)由题图可知,方案1中是采取E物质—受体复合物激活ERE进而激活GFP基因的表达,而方案2是采取E物质—受体复合物激活ERE,进而诱导Gal4基因表达,产生Gal4蛋白,然后再激活UAS,诱导GFP基因的表达,与方案1相比,方案2的检测灵敏度会更高。(3)现拟制备一种不育的监测鱼SM,亲本X是可以产生配子的,同时必须保证亲本X和MO的后代SM既可以检测到物质E,又是不育的。所以为了亲本X可以正常产生配子,雌激素类物质可以使①活化,则导入的启动子不能为①和③,选择④则无法使SM不育,则启动子最好选择②;而基因应该是不育相关的基因,则应该为仅导致生殖细胞凋亡的基因(dg)。由于亲本X中不含有Gal4基因编码的Gal4蛋白,则在亲本X的细胞内不会启动UAS,则仅导致生殖细胞凋亡的基因(dg)也不会表达,而在X和MO的后代SM细胞中会同时出现Gal4基因编码的Gal4蛋白和启动子UAS,所以基因dg可以在SM细胞中表达,使SM的生殖细胞凋亡,从而使SM不育。所以选取方案2中的启动子UAS以及仅仅导致生殖细胞凋亡的基因(dg),这样可以制备出不育的监测鱼SM,且检测的灵敏度高。(4)由上述分析可知,成体SM自身会产生雌激素(E物质),与受体结合后激活ERE,进而诱导Gal4表达,Gal4结合UAS诱导生殖细胞凋亡的基因dg表达,生殖细胞凋亡后,则SM不育。(5)监测鱼属于转基因生物,目前安全性不确定,为了避免转基因斑马鱼逃逸带来生物安全问题,需要SM不育。 12. 答案(1)引物　(2)作为标记基因,筛选含有基因表达载体的受体细胞　终止转录(使转录在需要的地方停下来 )　(3)二氧化碳等气体用于大量合成丙酮,而不是用于重组梭菌的生长 (4)废物的资源化　不仅不排放二氧化碳,而且还可以利用工业废气中的二氧化碳 解析 (1)PCR技术的前提是需要根据目标基因两端的碱基序列设计一对引物,引物与模板链结合后,Taq酶才能从引物的3'端延伸子链。(2)在基因表达载体中,抗生素抗性基因属于标记基因,所以用含某种抗生素的培养基可筛选出导入目的基因的受体细胞。终止子是处于目的基因下游的一段序列,它是转录结束的信号,转录时遇到终止子就停止。(3)重组梭菌大量表达题述酶蛋白时,在这些酶蛋白的作用下,二氧化碳等气体大量用于合成丙酮,而不是用于重组梭菌的生长,所以会导致梭菌生长迟缓。(4)根据题意可知,这种生产高附加值化工产品的新技术,以高污染企业排放的二氧化碳等一碳温室气体为原料,实现了废物的资源化,体现了循环经济的特点。从“碳中和”的角度看,该技术在生产丙酮的过程中不仅不排放二氧化碳,而且还可以利用工业废气中的二氧化碳,有利于减缓温室效应,并实现较高的经济效益,所以具有广泛的应用前景和良好的社会效益。 13. 答案(1)多肽链　mRNA　密码子的简并性　(2)化学合成法　从基因文库中获取　DNA双链复制　(3)种类　提取的水蛭蛋白的酶解时间和处理的酶的种类不同,导致水蛭蛋白的空间结构有不同程度破坏　(4)取三支试管,分别放入等量的蛋白质工程改造后的水蛭素、水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素,再分别加入等量的同一动物的新鲜血液,静置一段时间后,观察三支试管中血液凝集情况 解析 (1)根据蛋白质工程的原理可知,物质a是多肽链,物质b是mRNA,由于密码子的简并性,密码子不同,合成的蛋白质空间构象也可能相同。(2)基因工程中获取目的基因的方法有PCR技术扩增、化学合成法、cDNA法以及从基因文库中获取等。PCR技术的原理是DNA双链复制。(3)根据图解可以看出,两种肽的含量差异不大,因此主要是种类的差异。导致两种酶解产物抗凝血活性不同的原因可能是提取的水蛭蛋白的酶解时间和处理的酶的种类不同,导致水蛭蛋白的空间结构有不同程度破坏。(4)取三支试管,分别放入等量的蛋白质工程改造后的水蛭素、水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素,再分别加入等量的同一动物的新鲜血液,静置一段时间后,观察三支试管中血液凝集情况。 14. 答案(1)逆转录(反转录)　PCR扩增　(2)A　(3)(重组腺病毒)进入细胞　表达抗原　(4)重组腺病毒DNA在人体细胞中持续表达抗原,反复刺激机体免疫系统。 解析 (1)新冠病毒是RNA病毒,其遗传物质是RNA,若要得到与其对应的cDNA,则要进行逆转录/反转录。用cDNA扩增出目的基因(S基因)需要利用PCR扩增技术。(2)重组疫苗作为抗原需要被人体免疫系统识别,而重组疫苗中的S基因是从新冠病毒中提取的,所以重组疫苗中的S基因应编码病毒与细胞都能识别的蛋白,A项正确,B、C、D项错误。(3)重组疫苗对人体来说属于外来异物,即抗原,故人体接种疫苗后,重组腺病毒进入人体细胞,其在人体细胞内表达出抗原,引发机体产生特异性免疫——细胞免疫和体液免疫,因此该疫苗发挥作用的过程是:接种疫苗→(重组腺病毒)进入细胞→表达抗原→诱发特异性免疫反应。(4)接种疫苗后,由于长时间内,接种者体内仍能检测到重组腺病毒DNA,而DNA会不断表达出S蛋白,S蛋白作为抗原刺激机体,故机体会反复针对抗原产生特异性免疫应答。 考点75　生物技术的安全性与伦理问题 1.B　解析在转基因抗虫棉种子中混入少量常规种子,则常规种子长成的普通植株能为敏感型(不抗虫)个体提供生存空间,增加与抗性个体的竞争,避免抗性基因频率升高过快,提高了抗虫棉的抗虫持久性,A项不符合题意。大面积种植转基因抗虫棉并使用杀虫剂会导致害虫大量死亡,能生存的大多数都具有抗性基因,抗性基因频率会越来越高,B项符合题意。转基因抗虫棉与小面积的常规棉间隔种植以及转基因抗虫棉大田周围设置常规棉隔离带的作用机理与A选项相似,都可以使敏感型个体存活,提高抗虫棉的抗虫持久性,C、D二项不符合题意。 2.A　解析在长时间高温的作用下,会导致食物中的一些维生素遭到破坏,A项正确。转基因抗虫是利用靶向技术,对非靶标生物无毒性,故转基因抗虫棉能杀死害虫,但不一定对人有毒,B项错误。消毒液能够杀死物体表面的大部分细菌,但不能用于人体内杀菌,C项错误。如果孩子的血型和父母都不一样,也可能是亲生的,如:A型血和B型血的父母也可以生出O型血的孩子,D项错误。 学科网（北京）股份有限公司 $$ 专题二十三　基因工程及 生物技术的安全性与伦理问题 考点 2016~2020年 2021年 2022年 2023年 2024年 2025年 合计 72.基因工程的基本工具及操作程序 0 7 4 6 17 6 40 73.DNA的粗提取与鉴定及PCR技术 0 1 2 1 8 3 15 74.基因工程的应用及蛋白质工程 0 3 3 2 5 1 14 75.生物技术的安全性与伦理问题 0 1 0 1 0 0 2 命题热度 本专题命题热度非常高() 课程标准 备考策略 1.阐明DNA重组技术的实现需要利用限制性内切核酸酶、DNA连接酶和载体三种基本工具 　　从近几年高考来看,试题以非选择题为主,主要围绕基因工程的基本工具、操作步骤及DNA粗提取、电泳技术、蛋白质工程等知识点考查,生物技术的安全性和伦理问题基本不考查。试题情境和设问形式丰富多样,重点突出对信息获取、实验探究、语言表述等能力的考查。同时,试题的开放性进一步增加,对考生的思辨能力、创新能力提出了新的要求。 在高考备考中,考生复习时应在夯实必备知识的基础上,理解知识的应用,如根据重组DNA技术的具体情境选择合适的基本工具、在具体情境中获取目的基因、依据目的基因和载体选择限制性内切核酸酶、依据受体细胞的种类选择基因表达载体导入的方法等,同时还要扩大复习的广度,全面梳理教材及习题资源,扩充自己的储备材料(如各种PCR操作过程及应用),提升信息提取与加工、逻辑推理、语言表达等能力。 2.阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的获取、基因表达载体的构建、目的基因导入受体细胞和目的基因及其表达产物的检测鉴定等步骤 3.举例说明基因工程在农牧、食品及医药等行业的广泛应用改善了人类的生活品质 4.概述人们根据基因工程原理,进行蛋白质设计和改造,可以获得性状和功能更符合人类需求的蛋白质 5.举例说明依据人类需要对原有蛋白质结构进行基因改造、生产目标蛋白的过程 6.举例说出日常生活中的转基因产品,探讨转基因技术在应用过程中带来的影响 7.举例说出生殖性克隆人面临的伦理问题 考点72基因工程的基本工具及操作程序答案P449　 1.(2025·江苏,19,3分,难度★★★)(多选)图示人体正常基因A突变为致病基因a及Hind Ⅲ切割位点。AluⅠ限制酶识别序列及切割位点为,下列相关叙述正确的有 (　　) A.基因A突变为a是一种碱基增添的突变 B.用两种限制酶分别酶切A基因后,形成的末端类型不同 C.用两种限制酶分别酶切a基因后,产生的片段大小一致 D.产前诊断时,该致病基因可选用HindⅢ限制酶开展酶切鉴定 2.(2025·安徽,15,3分,难度★★★)质粒K中含有β-半乳糖苷酶基因,将该质粒导入大肠杆菌细胞后,其编码的酶可分解X-gal,产生蓝色物质,进而形成蓝色菌落,如图所示。科研小组以该质粒作为载体,采用基因工程技术实现人源干扰素基因在大肠杆菌中的高效表达。下列叙述错误的是 (　　) A.使用氯化钙处理大肠杆菌以提高转化效率,可增加筛选平板上白色和蓝色菌落数 B.如果筛选平板中仅含卡那霉素,生长出的白色菌落不可判定为含目的基因的菌株 C.因质粒K中含两个标记基因,筛选平板中长出的白色菌落即为表达目标蛋白的菌株 D.若筛选平板中蓝色菌落偏多,原因可能是质粒K经酶切后自身环化并导入了大肠杆菌 3.(2024·黑吉辽,7,2分,难度★★★)关于采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物的实验,下列叙述正确的是 (　　) A.琼脂糖凝胶浓度的选择需考虑待分离DNA片段的大小 B.凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示DNA分子的具体位置 C.在同一电场作用下,DNA片段越长,向负极迁移速率越快 D.琼脂糖凝胶中的DNA分子可在紫光灯下被检测出来 4.(2024·江苏,9,2分,难度★★)酵母菌是基因工程中常用的表达系统。下列相关叙述正确的是 (　　) A.酵母菌培养液使用前要灭活所有细菌,但不能灭活真菌 B.酵母菌是真核细胞,需放置在CO2培养箱中进行培养 C.可用稀释涂布平板法对酵母菌计数 D.该表达系统不能对合成的蛋白质进行加工和修饰 5.(2024·湖南,5,2分,难度★★)某同学将质粒DNA进行限制酶酶切时,发现DNA完全没有被酶切,分析可能的原因并提出解决方法。下列叙述错误的是 (　　) A.限制酶失活,更换新的限制酶 B.酶切条件不合适,调整反应条件如温度和酶的用量等 C.质粒DNA突变导致酶识别位点缺失,更换正常质粒DNA D.酶切位点被甲基化修饰,换用对DNA甲基化不敏感的限制酶 6.(2024·江西,12,2分,难度★★★)γ-氨基丁酸在医药等领域有重要的应用价值。利用L-谷氨酸脱羧酶(GadB)催化L-谷氨酸脱羧是高效生产γ-氨基丁酸的重要途径之一。研究人员采用如图方法将酿酒酵母S的L-谷氨酸脱羧酶基因(gadB)导入生产菌株E.coli A,构建了以L-谷氨酸钠为底物高效生产γ-氨基丁酸的菌株E.coli B。下列叙述正确的是 (　　) A.上图表明,可以从酿酒酵母S中分离得到目的基因gadB B.E.coli B发酵生产γ-氨基丁酸时,L-谷氨酸钠的作用是供能 C.E.coli A和E.coli B都能高效降解γ-氨基丁酸 D.可以用其他酶替代Nco Ⅰ和Kpn Ⅰ构建重组质粒 7.(2023·全国新课标,6,6分,难度★★★)某同学拟用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA连接酶为工具,将目的基因(两端含相应限制酶的识别序列和切割位点)和质粒进行切割、连接,以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。 下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是 (　　) A.质粒和目的基因都用酶3切割,用E.coli DNA连接酶连接 B.质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割,用T4 DNA连接酶连接 C.质粒和目的基因都用酶1和酶2切割,用T4 DNA连接酶连接 D.质粒和目的基因都用酶2和酶4切割,用E.coli DNA连接酶连接 8.(2023·重庆,12,3分,难度★★★)某小组通过PCR(假设引物长度为8个碱基短于实际长度)获得了含有目的基因的DNA片段,并用限制酶进行酶切(下图),再用所得片段成功构建了基因表达载体。下列叙述错误的是 (　　) A.其中一个引物序列为5'-TGCGCAGT-3' B.步骤①所用的酶是Spe Ⅰ和Cfo Ⅰ C.用步骤①的酶对载体进行酶切,至少获得了2个片段 D.酶切片段和载体连接时,可使用E.coliDNA连接酶或T4DNA连接酶 9.(2023·湖北,4,2分,难度★★★★)用氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、四环素抗性基因(TetR)作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒,构建基因表达载体(重组质粒),并转化到受体菌中。下列叙述错误的是 (　　) A.若用HindⅢ酶切,目的基因转录的产物可能不同 B.若用PvuⅠ酶切,在含Tet(四环素)培养基中的菌落,不一定含有目的基因 C.若用SphⅠ酶切,可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否 D.若用SphⅠ酶切,携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)和Tet的培养基中能形成菌落 10.(2021·江苏,13,2分,难度★★★)下图是剔除转基因植物中标记基因的一种策略,下列相关叙述错误的是 (　　) A.分别带有目的基因和标记基因的两个质粒,都带有T-DNA序列 B.该方法建立在高转化频率基础上,标记基因和目的基因须转到不同染色体上 C.若要获得剔除标记基因的植株,转化植株必须经过有性繁殖阶段遗传重组 D.获得的无筛选标记转基因植株发生了染色体结构变异 11.(2021·湖北,7,2分,难度★★)限制性内切酶EcoR I识别并切割双链DNA,用EcoR Ⅰ完全酶切果蝇基因组DNA,理论上得到DNA片段的平均长度(碱基对)约为 (　　) 　　　　　　　　　　　　　　　 A.6 B.250 C.4 000 D.24 000 12.(2025·山东,25,12分,难度★★★)种子休眠是抵御穗发芽的一种机制。通过对Ti质粒的改造,利用农杆菌转化法将Ti质粒上的T-DNA随机整合到小麦基因组中,筛选到2个种子休眠相关基因的插入失活纯合突变体。与野生型相比,突变体种子的萌发率降低。小麦基因组序列信息已知。 注LB/RB为T-DNA的边界序列;Kanr为卡那霉素抗性基因;bp为碱基对。 甲　Ti质粒与抗除草剂基因信息 (1)Ti质粒上与其在农杆菌中的复制能力相关的结构为　　　　　　。选用图甲中的SmaⅠ对抗除草剂基因X进行完全酶切,再选择SmaⅠ和　　　　　对Ti质粒进行完全酶切,将产生的黏性末端补平,补平时使用的酶是　　　　　　　。利用DNA连接酶将酶切后的包含抗除草剂基因X的片段与酶切并补平的Ti质粒进行连接,构建重组载体,转化大肠杆菌;经卡那霉素筛选并提取质粒后再选用限制酶　　　　　进行完全酶切并电泳检测,若电泳结果呈现一长一短2条带,较短的条带长度近似为　　　　bp,则一定为正向重组质粒。  (2)为证明这两个突变体是由于T-DNA插入小麦基因组中同一基因导致的,提取基因组DNA,经酶切后产生含有T-DNA的基因组片段(图乙)。在此酶切过程中,限于后续PCR难以扩增大片段DNA,最好使用识别序列为　　　　(填“4”“6”或“8”)个碱基对的限制酶,且T-DNA中应不含该酶的酶切位点。需首先将图乙的片段　　　　　　　,才能利用引物P1和P2成功扩增未知序列。PCR扩增出未知序列后,进行了一系列操作,其中可以判断出2条片段的未知序列是否属于同一个基因的操作为　　　　　　　　　　　　　　　(填“琼脂糖凝胶电泳”或“测序和序列比对”)。  注P1、P2表示引物。 乙　基因组DNA酶切后含T-DNA的片段 (3)通过农杆菌转化法将构建的含有野生型基因的表达载体转入突变植株,如果检测到野生型基因,　　　　(填“能”或“不能”)确定该植株的表型为野生型。  13.(2025·河北,22,14分,难度★★★★)为治理水体中对生物有毒害的镉污染,研究者构建了分泌信号肽SP7、镉离子结合蛋白CADR、定位于细胞壁的蛋白GP1和黄色荧光蛋白YFP编码序列融合表达的载体,转入单细胞衣藻,实现CADR大量合成、分泌并定位于细胞壁,以吸附水体中的镉离子。回答下列问题。 (1)在DNA聚合酶、引物、模板DNA和脱氧核苷酸中,随着PCR反应进行,分子数量逐渐减少的是　　　　和　　　　。模板与引物在PCR反应的　　　　阶段开始结合。PCR中使用的DNA聚合酶需耐高温,其原因为　  　。  (2)载体中可用的酶切位点信息和拟构建载体的部分结构如图1所示。在将CADR、GP1和YFP基因逐个构建到载体时,为避免错误连接,需向以上三个基因的两端分别添加限制酶识别序列,其中GP1两端应添加　　　　　　　　(填两种限制酶)的识别序列。用DNA连接酶连接时,可催化载体和目的基因之间形成　　　　　键。  图1 (3)若在荧光显微镜下观察到转基因衣藻表现为　　　　　　　　　　　　　　　　,初步表明融合蛋白表达成功。将转基因衣藻和野生型衣藻置于含镉离子的培养液中培养一段时间后,若转基因衣藻细胞壁比野生型衣藻细胞壁的镉离子含量　　　　　,则表明融合蛋白能结合镉离子。  (4)将转基因衣藻和野生型衣藻在不同镉离子浓度的培养液中培养6 d后,检测细胞密度,结果见图2。转基因衣藻在含有不同浓度镉离子的培养液中生长均优于野生型衣藻的原因可能是  　。  240 μmol/L镉离子浓度下,转基因衣藻和野生型衣藻生长均被明显抑制的原因可能是      　。  注镉离子对渗透压的影响忽略不计。 图2 (5)转基因衣藻可用于水体镉污染治理,与施加化学药物法相比,能体现出其环境治理优势的两个特性是　　　　　和　　　　　。(填标号)  ①衣藻作为生物材料在水体中可自我繁殖 ②衣藻生长速率受镉离子浓度影响 ③衣藻可吸收水体中能引起富营养化的物质 ④衣藻吸附的镉可沿食物链传递 14.(2025·陕晋宁青,21,10分,难度★★★)马铃薯作为重要农作物,提高其冷耐受性可拓展优质马铃薯的种植区域。我国科研人员发现,野生马铃薯中S基因的表达与其冷耐受性调控有关,将该基因导入栽培马铃薯中可显著增强其抗寒能力。回答下列问题。 (1)PCR扩增目的基因时,需要模板DNA、引物、　　　　　　　　、含Mg2+的缓冲液和耐高温的DNA聚合酶。DNA聚合酶在PCR的　　　　　　步骤中起作用。  (2)图中标识了载体和S基因中限制酶的切割位点。为将S基因正确插入载体,PCR扩增S基因时需在引物的　　　　　(填“5'端”或“3'端”)添加限制酶识别序列,结合上表分析,上游引物应添加的碱基序列是5'-　　　　　　　　-3',切割载体时应选用的两种限制酶是　　　　　　　　。PCR扩增产物和载体分别被限制酶切割后,经纯化和连接,获得含S基因的表达载体并导入农杆菌。  (3)用携带S基因的农杆菌侵染栽培马铃薯愈伤组织时,基因表达载体中T-DNA进入愈伤组织细胞,将S基因整合到　　　　　上,抗性基因　　　　　　可用于筛选成功转化的愈伤组织。该愈伤组织经　　　　　形成芽、根,继续培育可获得抗寒能力显著增强的马铃薯植株。  15.(2025·河南,21,11分,难度★★★)卡拉胶是一类源于海洋红藻的大分子多糖,可被某些细菌降解为具有多种应用前景的卡拉胶寡糖。某研究小组拟筛选具有高活性卡拉胶酶(CG)的菌种用于生产卡拉胶寡糖。回答下列问题: (1)选择海藻和海泥作为样本筛选卡拉胶降解菌的原因是　。  将培养后的菌液混匀并充分　　　　,再接种至微孔板中,经培养和筛选获得了CG活性最高的菌种。  (2)为构建携带cg(CG的编码基因)的大肠杆菌表达载体(图1),对cg的PCR扩增产物和质粒进行双酶切,随后用E.coli DNA连接酶连接。为保证连接准确性和效率,cg转录模板链的5'端最好含有　　　　酶切位点。另有两组同学选用了各不相同的双酶切组合和T4 DNA连接酶重复上述实验,获得的部分重组质粒分子大小符合预期,但均无法使用各自构建表达载体的双酶切组合进行切割,其原因是　。  限制酶的识别序列和切割位点如下: 图1 (3)为将构建好的表达载体转入大肠杆菌,需要先用Ca2+处理大肠杆菌细胞,目的是　　　　　　　　　　　　　　　,随后在含　　　　和　　　　的培养基中培养一段时间后,根据菌落周围有无水解透明圈筛选目的菌株。  (4)已知空间上邻近的两个半胱氨酸易形成二硫键,从而提升蛋白质的耐热性。为提高CG的耐热性,研究人员分析了五个氨基酸位点的空间距离和保守度(保守度值越大表明该位点对酶的功能越关键),如图2所示。根据分析结果,选择第　　　　位的氨基酸替换成半胱氨酸最合适,原因是　  　。  注虚线长度代表氨基酸间的空间距离图2 16.(2024·全国新课标,35,12分,难度★★★★★)某研究小组将纤维素酶基因(N)插入某种细菌(B1)的基因组中,构建高效降解纤维素的菌株(B2)。该小组在含有N基因的质粒中插入B1基因组的M1与M2片段;再经限制酶切割获得含N基因的片段甲,片段甲两端分别为M1与M2;利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术将片段甲插入B1的基因组,得到菌株B2。酶切位点(Ⅰ~Ⅳ)、引物(P1~P4)的结合位置、片段甲替换区如图所示,→表示引物5'→3'方向。回答下列问题。 (1)限制酶切割的化学键是　　　　　　　。为保证N基因能在菌株B2中表达,在构建片段甲时,应将M1与M2片段分别插入质粒的Ⅰ和Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ酶切位点之间,原因是　    　。  (2)CRISPR/Cas9 技术可以切割细菌B1基因组中与向导RNA结合的DNA。向导RNA与B1基因组DNA 互补配对可以形成的碱基对有G—C和　　　　 　　　　　　　　　。  (3)用引物P1和P2进行PCR可验证片段甲插入了细菌B1基因组,所用的模板是　　　　;若用该模板与引物P3和P4进行PCR,实验结果是　。  (4)与秸秆焚烧相比,利用高效降解纤维素的细菌处理秸秆的优点是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　(答出2点即可)。  17.(2024·天津,16,14分,难度★★★★)金黄色葡萄球菌(简称Sa)是人体重要致病细菌,不规范使用抗生素易出现多种抗药性Sa。 (1)Sa产生抗药性可遗传变异的来源有  　(至少答出2点)。  (2)推测Sa产生头孢霉素抗性与其R基因有关。为验证该推测,以图1中R基因的上、下游片段和质粒1构建质粒2,然后通过同源重组(质粒2中的上、下游片段分别与Sa基因组中R基因上、下游片段配对,并发生交换)敲除Sa的R基因。 Sa部分基因组 注1 kb=1 000碱基对;Y是可被脱水四环素(不作为 抗生素起作用)诱导表达的Sa致死基因。 图1 ①根据图1信息,简述质粒2的构建过程(需包含所选引物和限制酶):　　　　　　　,然后回收上、下游片段,再与Sac Ⅱ酶切质粒1所得大片段连接,获得质粒2。  ②用质粒2转化临床分离的具有头孢霉素抗性、对氯霉素敏感的Sa,然后涂布在含　　　　　　的平板上,经培养获得含质粒2的Sa单菌落。  ③将②获得的单菌落多次传代以增加同源重组敲除R基因的概率,随后稀释涂布在含　　　　的平板上,筛选并获得不再含有质粒2的菌落。从这些菌落分别挑取少许菌体,依次接种到含　　　　的平板上,若无法增殖,则对应菌落中细菌的R基因疑似被敲除。  ④以③获得的菌株基因组为模板,采用不同引物组合进行PCR扩增,电泳检测结果如图2,表明R基因已被敲除的是　　　　　　(单选)。  图2 18.(2024·山东,25,12分,难度★★★★★)研究发现基因L能够通过脱落酸信号途径调控大豆的逆境响应。利用基因工程技术编辑基因L,可培育耐盐碱大豆品系。在载体上的限制酶BsaⅠ切点处插入大豆基因L的向导DNA序列,将载体导入大豆细胞后,其转录产物可引导核酸酶特异性结合基因组上的目标序列并发挥作用。载体信息、目标基因L部分序列及相关结果等如图所示。 图甲:载体信息 LB/RB:T-DNA的边界序列;Kanr:卡那霉素抗性基因;Ampr:氨苄青霉素抗性基因 图乙:目标基因L部分序列 图丙:限制酶识别序列、切割位点及电泳结果 (1)用PCR技术从大豆基因组DNA中扩增目标基因L时,所用的引物越短,引物特异性越　　　　(填“高”或“低”)。限制酶在切开DNA双链时,形成的单链突出末端为黏性末端,若用BsaⅠ酶切大豆基因组DNA,理论上可产生的黏性末端最多有　　　　种。载体信息如图甲所示,经BsaⅠ酶切后,载体上保留的黏性末端序列应为5'-　　　-3'和5'-　　　　-3'。  (2)重组载体通过农杆菌导入大豆细胞,使用抗生素　　　　　筛选到具有该抗生素抗性的植株①~④。为了鉴定基因编辑是否成功,以上述抗性植株的DNA为模板,通过PCR扩增目标基因L,部分序列信息及可选用的酶切位点如图乙所示,PCR产物完全酶切后的电泳结果如图丙所示。据图可判断选用的限制酶是　　　　　,其中纯合的突变植株是　　　　　(填序号)。  (3)实验中获得1株基因L成功突变的纯合植株,该植株具有抗生素抗性,检测发现其体细胞中只有1条染色体有T-DNA插入。用抗生素筛选这个植株的自交子代,其中突变位点纯合且对抗生素敏感的植株所占比例为　　　　,筛选出的敏感植株可用于后续的品种选育。  19.(2024·江苏,23,12分,难度★★★★)为了高效纯化超氧化物歧化酶(SOD),科研人员将ELP50片段插入pET-SOD构建重组质粒pET-SOD-ELP50,以融合表达SOD-ELP50蛋白,过程如图1。其中,ELP50是由人工合成的DNA片段,序列为:限制酶a识别序列-(GTTCCTGGTGTTGGC)50-限制酶b识别序列,50为重复次数。请回答下列问题。 图1 (1)步骤①双酶切时,需使用的限制酶a和限制酶b分别是　。  (2)步骤②转化时,科研人员常用　　　　处理大肠杆菌,使细胞处于感受态;转化后的大肠杆菌采用含有　　　　　　的培养基进行筛选。用PCR技术筛选成功导入pET-SOD-ELP50的大肠杆菌,应选用的一对引物是　　　　　　。  (3)步骤③大肠杆菌中RNA聚合酶与　　　　结合,驱动转录,翻译SOD-ELP50蛋白。已知蛋白质中氨基酸残基的平均相对分子质量约为0.11 kDa,将表达的蛋白先进行凝胶电泳,然后用SOD抗体进行杂交,显示的条带应是　　　　(从图2的“A~D”中选填)。  图2 (4)步骤④为探寻高效纯化SOD-ELP50蛋白的方法,科研人员研究了温度、NaCl对SOD-ELP50蛋白纯化效果的影响,部分结果如图3。 图3 (ⅰ)20 ℃时,加入NaCl后实验结果是  　。  (ⅱ)100 ℃时,导致各组中所有蛋白都沉淀的原因是　。  (ⅲ)据图分析,融合表达SOD-ELP50蛋白的优点有  　。  20.(2024·福建,17,13分,难度★★★★)病毒感染初期,机体会分泌干扰素并作用于细胞受体IFNAR来应对感染。麻疹是由麻疹病毒感染引起的急性传染病。已知人白细胞分化抗原46(hCD46)是麻疹病毒入侵细胞的主要受体,小鼠没有该受体,科研人员构建hCD46转基因小鼠用于相关研究,部分流程如图所示。 回答下列问题。 (1)利用PCR技术获取目的基因hCD46,复性温度下发生的扩增过程是　。  (2)将hCD46接入质粒应选用的限制酶组合是   　　　　　　　　。为提高转基因效率,同时避免标记基因进入胚胎体内,应选用　　　　　　　　限制酶组合将重组质粒变为线性DNA。  (3)为获取大量胚胎用于移植,可用激素处理小鼠a,使其　　　　　　。将胚胎移植到小鼠c的子宫中,应选用桑葚胚的原因是　  　。  (4)利用PCR技术对子代小鼠进行hCD46基因检测,应设置不加DNA模板的对照组,目的是  　。  (5)若能进一步构建既表达hCD46受体又敲除IFNAR基因的小鼠,则该小鼠对麻疹病毒具有高易感性,原因是  　。  21.(2024·广西,21,14分,难度★★★★)M蛋白与“记忆”的形成密切相关。科研人员制备了M基因表达可控的实验模型小鼠,主要制备流程见下图。实验模型小鼠通过特异性表达Cre重组酶来敲除两个LoxP位点间的序列,同时利用体内表达的蛋白A激活诱导型T启动子。利用融合绿色荧光蛋白基因的M基因(M-GFP)的表达,恢复小鼠自身被敲除的M基因功能,同时便于示踪。回答下列问题。 注基因型A/+指的是A基因被嵌合在细胞同源染色体中的一条,即可表示为Aa;两端添加上LoxP位点的M基因称为floxM。 (1)在PCR扩增片段①和②时,通常会在所用引物的一端添加被限制酶识别的序列,该序列添加的位置位于引物　　　　(选填“3'端”或“5'端”)。在构建载体1时,为了阻断A基因的表达,从转录水平考虑,连接的片段可以是　　　　;而从翻译水平考虑,连接的片段可以是　　　　　。为了鉴定载体2是否构建成功,需要限制酶切割载体后,再进行　　　　　。  (2)培养小鼠胚胎干细胞需定时更换培养液,其目的是  　(至少答2方面)。  (3)为了快速高效繁育出含有4对基因(遵循自由组合定律)的实验模型小鼠,应将培育出的基因型Cre/+A/+小鼠和M-GFP/+floxM/+小鼠分别与基因型floxM/floxM小鼠杂交,杂交获得的子代,再进行一代杂交后最终获得基因型为　　　　实验模型小鼠。  (4)为了实现M基因的表达可控,在实验模型小鼠喂食时,可添加竞争性结合A蛋白的四环素,抑制T启动子的活性。添加四环素与未添加相比,目的是　。  22.(2024·重庆,19,11分,难度★★★★)大豆是重要的粮油作物,提高大豆产量是我国农业领域的重要任务。我国研究人员发现,基因S在大豆品种DN(种子较大)中的表达量高于品种TL(种子较小),然后克隆了该基因(两品种中基因S序列无差异)及其上游的启动子序列,并开展相关研究。 (1)基因S启动子的基本组成单位是　。  (2)通过基因工程方法,将DN克隆的“启动子D+基因S”序列导入无基因S的优质大豆品种YZ。根据题图所示信息(不考虑未标明序列)判断构建重组表达载体时,为保证目标序列的完整性,不宜使用的限制酶是　　　　　;此外,不宜同时选用酶Spe Ⅰ和Xba Ⅰ,原因是　  　。  (3)为验证“启动子D+基因S”是否连接在表达载体上,可用限制酶对重组表达载体酶切后进行电泳。电泳时,对照样品除指示分子大小的标准参照物外,还应有  　。  经验证的重组表达载体需转入农杆菌,检测转入是否成功的技术是　　　　　　　。  (4)用检测后的农杆菌转化品种YZ所得再生植株YZ-1的种子变大。同时将从TL克隆的“启动子T+基因S”序列成功导入YZ,所得再生植株YZ-2的种子也变大,但小于YZ-1。综合分析,大豆品种DN较TL种子大的原因是  　。  23.(2024·湖南,21,13分,难度★★★★★)百合具有观赏、食用和药用等多种价值,科研人员对其进行了多种育种技术研究。回答下列问题。 图a 图b 图c (1)体细胞杂交育种。进行不同种百合体细胞杂交前,先用　　　　　　　　去除细胞壁获得原生质体,使原生质体融合,得到杂种细胞后,继续培养,常用　　　　　　　　(填植物激素名称)诱导愈伤组织形成和分化,获得完整的杂种植株。  (2)单倍体育种。常用　　　　　　的方法来获得单倍体植株,鉴定百合单倍体植株的方法是　。  (3)基因工程育种。研究人员从野生百合中获得一个抵抗尖孢镰刀菌侵染的基因L,该基因及其上游的启动子pL和下游的终止子结构如图a。图b是一种Ti质粒的结构示意图,其中基因gus编码GUS酶,GUS酶活性可反映启动子活性。 ①研究病原微生物对L的启动子pL活性的影响。从图a所示结构中获取pL,首先选用　　　酶切,将其与相同限制酶酶切的Ti质粒连接,再导入烟草。随机选取3组转基因成功的烟草(P1、P2和P3)进行病原微生物胁迫,结果如图c。由此可知,三种病原微生物都能诱导pL的活性增强,其中　　　　　　的诱导作用最强。  ②现发现栽培种百合B中也有L,但其上游的启动子与野生百合不同,且抗病性弱。若要提高该百合中L的表达量,培育具有高抗病原微生物能力的百合新品种,简要写出实验思路:    　。  24.(2024·湖北,20,16分,难度★★★★)苏云金芽孢杆菌产生的Bt毒蛋白,被棉铃虫吞食后活化,再与肠道细胞表面受体结合,形成复合体插入细胞膜中,直接导致细胞膜穿孔,细胞内含物流出,直至细胞死亡。科学家将编码Bt毒蛋白的基因转入棉花植株,获得的转基因棉花能有效防控棉铃虫的危害。回答下列问题。 (1)Bt毒蛋白引起的细胞死亡属于　　　　(填“细胞坏死”或“细胞凋亡”)。  (2)如果转基因棉花植株中Bt毒蛋白含量偏低,取食后的棉铃虫可通过激活肠干细胞分裂和　　　　产生新的肠道细胞,修复损伤的肠道,由此导致杀虫效果下降。请据此提出一项可提高转基因棉花杀虫效果的改进思路:    　。  (3)在Bt毒蛋白的长期选择作用下,种群中具有抗性的棉铃虫存活的可能原因是:肠道细胞表面受体蛋白的　　　　或　　　　发生变化,导致棉铃虫对Bt毒蛋白产生抗性。  (4)将Bt毒蛋白转基因棉花与非转基因棉花混种,可以延缓棉铃虫对转基因棉花产生抗性,原因是  　。  25.(2024·贵州,21,12分,难度★★★★)研究者用以蔗糖为唯一碳源的液体培养基,培养真菌A的野生型(含NV基因)、突变体(NV基因突变)和转基因菌株(转入NV基因),检测三种菌株NV酶的生成与培养液中的葡萄糖含量,结果如表所示(表中“+”表示有,“-”表示无)。回答下列问题。 检测用菌株 蔗糖 NV酶 葡萄糖(培养液中) 野生型 + + + 野生型 - - - 突变体 + - - 转基因菌株 + + + (1)据表可推测　　　　诱导了NV基因表达。NV酶的作用是　。  检测NV酶活性时,需测定的指标是　　　　　　　　　　　　(答出1点即可)。  (2)表中突变体由T-DNA随机插入野生型菌株基因组DNA筛选获得。从野生型与突变体中分别提取基因组DNA作为模板,用与　　　　　　(选填“T-DNA”或“NV基因”)配对的引物进行PCR扩增。若突变体扩增片段长度　　　　(选填“>”“=”或“<”)野生型扩增片段长度,则表明突变体构建成功,从基因序列分析其原因是　  　。  (3)为进一步验证NV基因的功能,表中的转基因菌株是将NV基因导入　　　　细胞获得的。在构建NV基因表达载体时,需要添加新的标记基因,原因是　  　。  26.(2024·甘肃,21,11分,难度★★★★)源于细菌的纤维素酶是一种复合酶,能降解纤维素。为了提高纤维素酶的降解效率,某课题组通过筛选高产纤维素酶菌株,克隆表达降解纤维素的三种酶(如下图),研究了三种酶混合的协同降解作用,以提高生物质资源的利用效率。回答下列问题。 (1)过程①②采用以羧甲基纤维素钠为唯一碳源的培养基筛选菌株X,能起到筛选作用的原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。高产纤维素酶菌株筛选时,刚果红培养基上的菌落周围透明圈大小反映了  　。  (2)过程④扩增不同目的基因片段需要的关键酶是　　　　　　　　　　　　　　　　。  (3)过程⑤在基因工程中称为　　　　　　　　　　　　,该过程需要的主要酶有　  　。  (4)过程⑥大肠杆菌作为受体细胞的优点有　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。该过程用Ca2+处理细胞,使其处于一种　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　的生理状态。  (5)课题组用三种酶及酶混合物对不同生物质原料进行降解处理,结果如下表。表中协同系数存在差异的原因是  　(答出两点)。  生物质 原料 降解率/% 协同系数 酶A 酶B 酶C 混1 混2 混1 混2 小麦 秸秆 7.08 6.03 8.19 8.61 26.98 74.33 114.64 玉米 秸秆 2.62 1.48 3.76 3.92 9.88 24.98 77.02 玉米 芯 0.62 0.48 0.86 0.98 6.79 1.82 11.34 注混1和混2表示三种酶的混合物。 27.(2024·全国甲,38,15分,难度★★★★)某同学采用基因工程技术在大肠杆菌中表达蛋白E。回答下列问题。 (1)该同学利用PCR扩增目的基因。PCR的每次循环包括变性、复性、延伸3个阶段,其中DNA双链打开成为单链的阶段是　　　　　　　,引物与模板DNA链碱基之间的化学键是　　　　　　。  (2)质粒载体上有限制酶a、b、c的酶切位点,限制酶的切割位点如图所示。构建重组质粒时,与用酶a单酶切相比,用酶a和酶b双酶切的优点体现在　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　(答出两点即可);使用酶c单酶切构建重组质粒时宜选用的连接酶是　。  (3)将重组质粒转入大肠杆菌前,通常先将受体细胞处理成感受态,感受态细胞的特点是  　;  若要验证转化的大肠杆菌中含有重组质粒,简要的实验思路和预期结果是    　。  (4)蛋白E基因中的一段DNA编码序列(与模板链互补)是GGGCCCAAGCTGAGATGA,编码从GGG开始,部分密码子见表。若第一个核苷酸G缺失,则突变后相应肽链的序列是　　　　　　　　　　　　　　　　。  氨基酸 密码子 赖氨酸 AAG 精氨酸 AGA 丝氨酸 AGC 脯氨酸 CCA CCC 亮氨酸 CUG 甘氨酸 GGC GGG 终止 UGA 28.(2023·天津,17,10分,难度★★★★★)基因工程:制备新型酵母菌 (1)已知酵母菌不能吸收淀粉,若想使新型酵母菌可以直接利用淀粉发酵,则应导入多步分解淀粉所需的多种酶,推测这些酶生效的场所应该是　　　　　　　(填“细胞内”或“细胞外”)。  (2)同源切割是一种代替限制酶、DNA连接酶将目的基因导入基因表达载体的方法。当目的基因两侧的小段序列与基因表达载体上某序列相同时,就可以发生同源切割,将目的基因直接插入。研究人员运用同源切割的方式,在目的基因两端加上一组同源序列A.B,已知酵母菌体内DNA有许多A-B序列位点可以同源切割插入。构建完成的目的基因结构如图,则应选择图中的引物　　　　　　对目的基因进行PCR。  (3)已知酵母菌不能合成尿嘧啶,因此尿嘧啶合成基因(UGA)常用作标记基因,又知尿嘧啶可以使5-氟乳清酸转化为对酵母菌有毒物质。 (i)导入目的基因的酵母菌应在　　　　的培养基上筛选培养。由于需要导入多种酶基因,需要多次筛选,因此在导入一种目的基因后,要切除UGA基因,再重新导入。研究人员在UGA基因序列两端加上酵母菌DNA中不存在的同源C.C'序列,以便对UGA基因进行切除。C.C'的序列方向将影响切割时同源序列的配对方式,进而决定DNA片段在切割后是否可以顺利重连,如图,则应选择方式　　　　进行连接。  方式一 方式二 (ii)切去UGA基因的酵母菌应在　　　　　　的培养基上筛选培养。  (4)综上,目的基因、标记基因和同源序列在导入酵母菌的基因表达载体上的排列方式应该如图　　　　　。  图1 图2 图3 图4 29.(2023·山东,25,10分,难度★★★)科研人员构建了可表达J-V5融合蛋白的重组质粒并进行了检测,该质粒的部分结构如图甲所示,其中V5编码序列表达标签短肽V5。 图甲 图乙 (1)与图甲中启动子结合的酶是　　 　　　　。除图甲中标出的结构外,作为载体,质粒还需具备的结构有　  (答出2个结构即可)。 (2)构建重组质粒后,为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确,需进行PCR检测,若仅用一对引物,应选择图甲中的引物　　　　　　　　　。已知J基因转录的模板链位于b链,由此可知引物F1与图甲中J基因的　　　　(填“a链”或“b链”)相应部分的序列相同。  (3)重组质粒在受体细胞内正确表达后,用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表达水平,结果如图乙所示。其中,出现条带1证明细胞内表达了　　　　　　　　　,条带2所检出的蛋白　　　　(填“是”或“不是”)由重组质粒上的J基因表达的。  30.(2023·江苏,22,12分,难度★★★★)为了将某纳米抗体和绿色荧光蛋白基因融合表达,运用重组酶技术构建质粒,如图1所示。请回答下列问题。 图1 (1)分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时,配制的两个反应体系中不同的有　　　　　,扩增程序中最主要的不同是　　　　　　　　　　　　　。  (2)有关基因序列如图2。引物F2-F、F1-R应在下列选项中选用　　　　。  EGFP基因序列:5'ATGGTGAGCAAGGGC………GACGAGCTGTACAAG3' AnB1基因序列:5'CATGTCCAGCTGCAG………CCAAAACCACAACCA3' 图2 A.ATGGTG………CAACCA B.TGGTTG………CACCAT C.GACGAG………CTGCAG D.CTGCAG………CTCGTC (3)将PCR产物片段与线性质粒载体混合后,在重组酶作用下可形成环化质粒,直接用于转化细菌。这一过程与传统重组质粒构建过程相比,无需使用的酶主要有　　　　　　　。  (4)转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选,下列叙述错误的有　　　　。  A.稀释涂布平板需控制每个平板30~300个菌落 B.抗性平板上未长出菌落的原因一般是培养基温度太高 C.抗性平板上常常会出现大量杂菌形成的菌落 D.抗性平板上长出的单菌落无需进一步划线纯化 (5)为了验证平板上菌落中的质粒是否符合设计,用不同菌落的质粒为模板,用引物F1-F和F2-R进行了PCR扩增,质粒P1~P4的扩增产物电泳结果如图3。根据图中结果判断,可以舍弃的质粒有　　　　。  图3 (6)对于PCR产物电泳结果符合预期的质粒,通常需进一步通过基因测序确认,原因是            　。  31.(2023·广东,20,14分,难度★★★★)种子大小是作物重要的产量性状。研究者对野生型拟南芥(2n=10)进行诱变,筛选到一株种子增大的突变体。通过遗传分析和测序,发现野生型DA1基因发生一个碱基G到A的替换,突变后的基因为隐性基因,据此推测突变体的表型与其有关,开展相关实验。回答下列问题。 (1)拟采用农杆菌转化法将野生型DA1基因转入突变体植株,若突变体表型确实由该突变造成,则转基因植株的种子大小应与　　　　植株的种子大小相近。  (2)用PCR反应扩增DA1基因,用限制性内切核酸酶对PCR产物和　　　　　进行切割,用DNA连接酶将两者连接。为确保插入的DA1基因可以正常表达,其上下游序列需具备　　　　　　　。  (3)转化后,T-DNA(其内部基因在减数分裂时不发生交换)可在基因组单一位点插入也可以同时插入多个位点。在插入片段均遵循基因分离及自由组合定律的前提下,选出单一位点插入的植株,并进一步获得目的基因稳定遗传的植株(如图),用于后续验证突变基因与表型的关系。 ①农杆菌转化T0代植株并自交,将T1代种子播种在选择培养基上,能够萌发并生长的阳性个体即表示其基因组中插入了　　　　　　　　。  ②T1代阳性植株自交所得的T2代种子按单株收种并播种于选择培养基,选择阳性率约　　　　　%的培养基中幼苗继续培养。  ③将②中选出的T2代阳性植株　　　　　　　　(填“自交”“与野生型杂交”或“与突变体杂交”)所得的T3代种子按单株收种并播种于选择培养基,阳性率达到　　　%的培养基中的幼苗即为目标转基因植株。  为便于在后续研究中检测该突变,研究者利用PCR扩增野生型和突变型基因片段,再使用限制性内切核酸酶X切割产物,通过核酸电泳即可进行突变检测,相关信息见下图,在答题卡电泳图中将酶切结果对应位置的条带涂黑。 32.(2022·天津,15,10分,难度★★★)研究者拟构建高效筛选系统,将改进的苯丙氨酸合成关键酶基因P1导入谷氨酸棒杆菌,以提高苯丙氨酸产量。 (1)上图是该高效筛选系统载体的构建过程。载体1中含有KanR(卡那霉素抗性基因)和SacB两个标记基因,为去除筛选效率较低的SacB,应选择引物　　　　和　　　　,并在引物的　　　　(填“5'”或“3'”)端引入XhoⅠ酶识别序列,进行PCR扩增,产物经酶切、连接后环化成载体2。  (2)PCR扩增载体3中筛选效率较高的标记基因RpsL(链霉素敏感基因)时,引物应包含　　　　　　　(填“EcoRⅠ”“HindⅢ”或“XhoⅠ”)酶识别序列,产物经单酶切后连接到载体2构建高效筛选载体4。  (3)将改进的P1基因整合到载体4构建载体5。将载体5导入链霉素不敏感(由RpsL突变造成)、卡那霉素敏感的受体菌。为获得成功导入载体5的菌株,应采用含有　　　　的平板进行初步筛选。  (4)用一定的方法筛选出如下菌株:P1基因脱离载体5并整合到受体菌拟核DNA,且载体5上其他DNA片段全部丢失。该菌的表型为　　　　　　　。  A.卡那霉素不敏感、链霉素敏感 B.卡那霉素敏感、链霉素不敏感 C.卡那霉素和链霉素都敏感 D.卡那霉素和链霉素都不敏感 (5)可采用　　　　　　技术鉴定成功整合P1基因的菌株。之后以发酵法检测苯丙氨酸产量。  33.(2022·山东,25,12分,难度★★★★)某种类型的白血病由蛋白P引发,蛋白UBC可使P被蛋白酶识别并降解,药物A可通过影响这一过程对该病起到治疗作用。为探索药物A治疗该病的机理,需构建重组载体以获得融合蛋白FLAG-P和FLAG-P△。P△是缺失特定氨基酸序列的P,FLAG是一种短肽,连接在P或P△的氨基端,使融合蛋白能与含有FLAG抗体的介质结合,但不影响P或P△的功能。 (1)为构建重组载体,需先设计引物,通过PCR特异性扩增P基因。用于扩增P基因的引物需满足的条件是　。  为使PCR产物能被限制酶切割,需在引物上添加相应的限制酶识别序列,该限制酶识别序列应添加在引物的　　　　(填“3'端”或“5'端”)。  (2)PCR扩增得到的P基因经酶切连接插入载体后,与编码FLAG的序列形成一个融合基因,如图甲所示,其中“ATGTGCA”为P基因编码链起始序列。将该重组载体导入细胞后,融合基因转录出的mRNA序列正确,翻译出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正确,但P基因对应的氨基酸序列与P不同。据图甲分析,出现该问题的原因是              　。  修改扩增P基因时使用的带有EcoRⅠ识别序列的引物来解决该问题,具体修改方案是             　。  图甲 (3)融合蛋白表达成功后,将FLAG-P、FLAG-P△、药物A和UBC按照图乙中的组合方式分成5组。各组样品混匀后分别流经含FLAG抗体的介质,分离出与介质结合的物质并用UBC抗体检测,检测结果如图丙所示。已知FLAG-P和FLAG-P△不能降解UBC,由①②③组结果的差异推测,药物A的作用是　　　　　　　　　　　　　;由②④组或③⑤组的差异推测,P△中缺失的特定序列的作用是　    　。  图乙 图丙 (4)根据以上结果推测,药物A治疗该病的机理是        　。  34.(2022·重庆,26,15分,难度★★★)改良水稻的株高和产量性状是实现袁隆平先生“禾下乘凉梦”的一种可能途径。研究人员克隆了可显著增高和增产的eui基因,并开展了相关探索。 步骤Ⅰ: 步骤Ⅱ:含eui和抗生素抗性基因等的重组Ti质粒+农杆菌含重组Ti质粒的农杆菌 (1)花药培养能缩短育种年限,原因是  　　　　　　　　　　　。在步骤Ⅰ的花药培养过程中,可产生单倍体愈伤组织,将其培养于含　　　　　的培养基上,可促进产生二倍体愈伤组织。Ⅰ中能用于制造人工种子的材料是　　　　。  (2)步骤Ⅱ中,eui基因克隆于cDNA文库而不是基因组文库,原因是  　　　　　　　;在构建重组Ti质粒时使用的工具酶有　。  为筛选含重组Ti质粒的菌株,需在培养基中添加　　　　。获得的农杆菌菌株经鉴定后,应侵染Ⅰ中的　　　　,以获得转基因再生植株。鉴定再生植株是否含有eui基因的方法是　　　　　　　　　　,移栽后若发育为更高且丰产的稻株,则可望“禾下乘凉”。  35.(2022·河北,24,15分,难度★★★)蛋白酶抑制剂基因转化是作物抗虫育种的新途径。某研究团队将胰蛋白酶抑制剂(NaPI)和胰凝乳蛋白酶抑制剂(StPinlA)的基因单独或共同转化棉花,获得了转基因植株。回答下列问题。 (1)蛋白酶抑制剂的抗虫机制是  　。  (2)　　　　　　　　是实施基因工程的核心。  (3)利用农杆菌转化法时,必须将目的基因插入质粒的　　　　　上,此方法的不足之处是　　　　　　　　　　。  (4)为检测目的基因在受体细胞基因组中的整合及其转录和翻译,可采用的检测技术有　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　(答出两点即可)。  (5)确认抗虫基因在受体细胞中稳定表达后,还需进一步做抗虫的　　　　以鉴定其抗性程度。下图为三种不同遗传操作产生的转基因棉花抗虫实验结果,据结果分析　　　　(填“NaPI”或“StPinlA”或“NaPI+StPinlA”)转基因棉花的抗虫效果最佳,其依据是　  　　　　　　　　　。  (6)基因突变可产生新的等位基因,在自然选择的作用下,昆虫种群的基因频率会发生　　　　,导致昆虫朝着一定的方向不断进化。据此推测,胰蛋白酶抑制剂转基因作物长期选择后,某些昆虫具有了抗胰蛋白酶抑制剂的能力,其分子机制可能是　  　　　　　　　　　　(写出两点即可)。  36.(2021·天津,16,12分,难度★★★★)乳酸菌是乳酸的传统生产菌,但耐酸能力较差,影响产量。酿酒酵母耐酸能力较强,但不产生乳酸。研究者将乳酸菌的乳酸脱氢酶基因(LDH)导入酿酒酵母,获得能产生乳酸的工程菌株。下图1为乳酸和乙醇发酵途径示意图,图2为构建表达载体时所需的关键条件。 图1 图2 (1)乳酸脱氢酶在转基因酿酒酵母中参与厌氧发酵的场所应为　　　　　。  (2)获得转基因酿酒酵母菌株的过程如下: ①设计引物扩增乳酸脱氢酶编码序列。 为使扩增出的序列中编码起始密码子的序列由原核生物偏好的GTG转变为真核生物偏好的ATG,且能通过双酶切以正确方向插入质粒,需设计引物1和2。其中引物1的5'端序列应考虑　　　　　和　　　　　。  ②将上述PCR产物和质粒重组后,导入大肠杆菌,筛选、鉴定,扩增重组质粒。重组质粒上有　　　　　,所以能在大肠杆菌中扩增。启动子存在物种特异性,易被本物种的转录系统识别并启动转录,因此重组质粒上的乳酸脱氢酶编码序列　　　　　(填“能”或“不能”)在大肠杆菌中高效表达。  ③提取重组质粒并转入不能合成尿嘧啶的酿酒酵母菌株,在　　　　　的固体培养基上筛选出转基因酿酒酵母,并进行鉴定。  (3)以葡萄糖为碳源,利用该转基因酿酒酵母进行厌氧发酵,结果既产生乳酸,也产生乙醇。若想进一步提高其乳酸产量,下列措施中不合理的是　　　　　(单选)。  A.进一步优化发酵条件 B.使用乳酸菌LDH基因自身的启动子 C.敲除酿酒酵母的丙酮酸脱羧酶基因 D.对转基因酿酒酵母进行诱变育种 37.(2021·江苏,23,11分,难度★★★)某小组为研究真菌基因m的功能,构建了融合表达蛋白M和tag标签的质粒,请结合实验流程回答下列问题: (1)目的基因的扩增 ①提取真菌细胞　　　　　,经逆转录获得cDNA,进一步获得基因m片段。  ②为了获得融合tag标签的蛋白M,设计引物P2时,不能包含基因m终止密码子的编码序列,否则将导致　　　　　。  ③热启动PCR可提高扩增效率,方法之一是:先将除Taq DNA聚合酶(Taq酶)以外的各成分混合后,加热到80 ℃以上再混入酶,然后直接从94 ℃开始PCR扩增,下列叙述正确的有　　　　　。  A.Taq酶最适催化温度范围为50~60 ℃ B.与常规PCR相比,热启动PCR可减少反应起始时引物错配形成的产物 C.两条子链的合成一定都是从5'端向3'端延伸 D.PCR产物DNA碱基序列的特异性体现了Taq酶的特异性 (2)重组质粒的构建 ①将SmaⅠ切开的载体A与添加同源序列的m混合,用特定DNA酶处理形成黏性末端,然后降温以促进　　　　　,形成A-m结合体。将A-m结合体导入大肠杆菌,利用大肠杆菌中的DNA聚合酶及　　　　　酶等,完成质粒的环化。  ②若正确构建的重组质粒A—m仍能被SmaⅠ切开,则SmaⅠ的酶切位点可能在　　　　　。  (3)融合蛋白的表达 ①用含有尿嘧啶的培养基培养URA3基因缺失型酵母,将其作为受体菌,导入质粒A-m,然后涂布于无尿嘧啶的培养基上,筛选获得目的菌株,其机理是　　　　　。  ②若通过抗原—抗体杂交实验检测到酵母蛋白中含tag标签,说明　　　　　,后续实验可借助tag标签进行蛋白M的分离纯化。  38.(2021·海南,25,11分,难度★★★)CRISPR/Cas9是一种高效的基因编辑技术,Cas9基因表达的Cas9蛋白像一把“分子剪刀”,在单链向导RNA(sgRNA)引导下,切割DNA双链以敲除目标基因或插入新的基因。CRISPR/Cas9基因编辑技术的工作原理如图所示。 回答下列问题。 (1)过程①中,为构建CRISPR/Cas9重组质粒,需对含有特定sgRNA编码序列的DNA进行酶切处理,然后将其插入到经相同酶切处理过的质粒上,插入时所需要的酶是　　　　　。  (2)过程②中,将重组质粒导入大肠杆菌细胞的方法是　　　　　。  (3)过程③~⑤中,sgRNA与Cas9蛋白形成复合体,该复合体中的sgRNA可识别并与目标DNA序列特异性结合,二者结合所遵循的原则是　　　　　。随后,Cas9蛋白可切割　　　　　序列。  (4)利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除一个长度为1200bp的基因,在DNA水平上判断基因敲除是否成功所采用的方法是　　　　　,基因敲除成功的判断依据是　　　　　。  (5)某种蛋白酶可高效降解羽毛中的角蛋白。科研人员将该蛋白酶基因插入到CRISPR/Cas9质粒中获得重组质粒,随后将其导入到大肠杆菌细胞,通过基因编辑把该蛋白酶基因插入到基因组DNA中,构建得到能大量分泌该蛋白酶的工程菌。据图简述CRISPR/Cas9重组质粒在受体细胞内,将该蛋白酶基因插入到基因组DNA的编辑过程:        　。  39.(2021·重庆,26,15分,难度★★)为了研究PDCD4基因对小鼠子宫内膜基质细胞凋亡的影响,进行了相关实验。 (1)取小鼠子宫时,为避免细菌污染,手术器具应进行　　　　　处理;子宫取出剪碎后,用　　　　　　　　处理一定时间,可获得分散的子宫内膜组织细胞,再分离获得基质细胞用于培养。  (2)培养基中营养物质应有　　　　　　　　(填写两种);培养箱中CO2浓度为5%,其主要作用是　。  (3)在含PDCD4基因的表达载体中,启动子的作用是    　。  为了证明PDCD4基因对基质细胞凋亡的作用,以含PDCD4基因的表达载体和基质细胞的混合培养为实验组,还应设立两个对照组,分别为　。  经检测,实验组中PDCD4表达水平和细胞凋亡率显著高于对照组,说明该基因对基质细胞凋亡具有　　　　　(填“抑制”或“促进”)作用。  40.(2021·河北,24,15分,难度★★★)采矿污染和不当使用化肥导致重金属镉(Cd)在土壤中过量积累。利用植物修复技术将土壤中的Cd富集到植物体内,进行后续处理(例如,收集植物组织器官异地妥善储存),可降低土壤中Cd的含量。为提高植物对Cd污染土壤的修复能力,研究者将酵母液泡Cd转运蛋白(YCF1)基因导入受试植物,并检测了相关指标。回答下列问题。 (1)为获取YCF1基因,将酵母细胞的全部DNA提取、切割后与载体连接,导入受体菌的群体中储存,这个群体称为　。  (2)将DNA序列插入Ti质粒构建重组载体时,所需要的两种酶是　　　　　　　　　　。构建的重组基因表达载体中必须含有标记基因,其作用是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。  (3)进行前期研究时,将含有YCF1基因的重组载体导入受试双子叶植物印度芥菜,采用最多的方法是　　　　　　　　　　。研究者进一步获得了转YCF1基因的不育杨树株系,采用不育株系作为实验材料的目的是　　　　　　　　　　　。  (4)将长势一致的野生型和转基因杨树苗移栽到Cd污染的土壤中,半年后测定植株干重(图1)及不同器官中Cd含量(图2)。据图1可知,与野生型比,转基因植株对Cd具有更强的　　　　　　　　(填“耐性”或“富集能力”);据图2可知,对转基因植株的　　　　进行后续处理对于缓解土壤Cd污染最为方便有效。  (5)已知YCF1特异定位于转基因植物细胞的液泡膜上。据此分析,转基因杨树比野生型能更好地适应高Cd环境的原因是　　　　　　　　　　　　。相较于草本植物,采用杨树这种乔木作为Cd污染土壤修复植物的优势在于　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　(写出两点即可)。  考点73DNA的粗提取与鉴定及PCR技术　　答案P458　 1.(2024·山东,5,2分,难度★★★★)制备荧光标记的DNA探针时,需要模板、引物、DNA聚合酶等。在只含大肠杆菌DNA聚合酶、扩增缓冲液、H2O和4种脱氧核苷酸(dCTP、dTTP、dGTP和碱基被荧光标记的dATP)的反应管①~④中,分别加入如表所示的适量单链DNA。已知形成的双链DNA区遵循碱基互补配对原则,且在本实验的温度条件下不能产生小于9个连续碱基对的双链DNA区。能得到带有荧光标记的DNA探针的反应管有 (　　) 反应管 加入的单链DNA ① 5'-GCCGATCTTTATA-3' 3'-GACCGGCTAGAAA-5' ② 5'-AGAGCCAATTGGC-3' ③ 5'-ATTTCCCGATCCG-3' 3'-AGGGCTAGGCATA-5' ④ 5'-TTCACTGGCCAGT-3' A.①② B.②③ C.①④ D.③④ 2.(2024·山东,13,2分,难度★★)关于“DNA的粗提取与鉴定”实验,下列说法正确的是 (　　) A.整个提取过程中可以不使用离心机 B.研磨液在4 ℃冰箱中放置几分钟后,应充分摇匀再倒入烧杯中 C.鉴定过程中DNA双螺旋结构不发生改变 D.仅设置一个对照组不能排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰 阅读下列材料,完成下面3~4题。 疟疾是一种严重危害人类健康的红细胞寄生虫病,可用氯喹治疗。疟原虫pfcrt基因编码的蛋白,在第76位发生了赖氨酸到苏氨酸的改变,从而获得了对氯喹的抗性。对患者进行抗性筛查,区分氯喹敏感患者和氯喹抗性患者,以利于分类治疗。 研究人员根据pfcrt基因的序列,设计了F1、F2、R1和R2等4种备选引物,用于扩增目的片段,如图甲所示。为选出正确和有效的引物,以疟原虫基因组DNA为模板进行PCR,产物的电泳结果如图乙所示。 甲 乙 3.(2024·浙江,19,2分,难度★★★)下列关于引物F1、F2、R1和R2的叙述,错误的是 (　　) A.F1-R1引物可用于特异性地扩增目的片段 B.F1-R2引物不能用于特异性地扩增目的片段 C.F2为无效引物,没有扩增功能,无法使用 D.R2引物可用于特异性地扩增目的片段 4.(2024·浙江,20,2分,难度★★★)为了筛查疟原虫感染者,以及区分对氯喹的敏感性。现有6份血样,处理后进行PCR。产物用限制酶ApoⅠ消化,酶解产物的电泳结果如图所示。 1~6号血样中,来自氯喹抗性患者的是 (　　) A.1号和6号 B.2号和4号 C.3号和5号 D.1号、2号、4号和6号 5.(2024·广东,4,2分,难度★★)关于技术进步与科学发现之间的促进关系,下列叙述正确的是(　　) A.电子显微镜的发明促进细胞学说的提出 B.差速离心法的应用促进对细胞器的认识 C.光合作用的解析促进花期控制技术的成熟 D.RNA聚合酶的发现促进PCR技术的发明 6.(2024·河北,13,2分,难度★★)下列相关实验操作正确的是 (　　) A.配制PCR反应体系时,加入等量的4种核糖核苷酸溶液作为扩增原料 B.利用添加核酸染料的凝胶对PCR产物进行电泳后,在紫外灯下观察结果 C.将配制的酵母培养基煮沸并冷却后,在酒精灯火焰旁倒平板 D.将接种环烧红,迅速蘸取酵母菌液在培养基上划线培养,获得单菌落 7.(2024·湖南,15,4分,难度★★★)(多选)最早的双脱氧测序法是在PCR反应体系中,分别再加入一种少量的双脱氧核苷三磷酸(ddATP、ddCTP、ddGTP或ddTTP),子链延伸时,双脱氧核苷三磷酸也遵循碱基互补配对原则,以加入ddATP的体系为例:若配对的为ddATP,延伸终止;若配对的为脱氧腺苷三磷酸(dATP),继续延伸;PCR产物变性后电泳检测。通过该方法测序某疾病患者及对照个体的一段序列,结果如图所示。下列叙述正确的是 (　　) A.上述PCR反应体系中只加入一种引物 B.电泳时产物的片段越小,迁移速率越慢 C.5'-CTACCCGTGAT-3'为对照个体的一段序列 D.患者该段序列中某位点的碱基C突变为G 8.(2024·安徽,14,3分,难度★★)下列关于“DNA粗提取与鉴定”实验的叙述,错误的是 (　　) A.实验中如果将研磨液更换为蒸馏水,DNA提取的效率会降低 B.利用DNA和蛋白质在酒精中的溶解度差异,可初步分离DNA C.DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同,该原理可用于纯化DNA粗提物 D.将溶解的DNA粗提物与二苯胺试剂反应,可检测溶液中是否含有蛋白质杂质 9.(2023·浙江,19,3分,难度★★★★)某研究小组利用转基因技术,将绿色荧光蛋白基因(GFP)整合到野生型小鼠Gata3基因一端,如图甲所示。实验得到能正常表达两种蛋白质的杂合子雌雄小鼠各1只,交配以期获得Gata3-GFP基因纯合子小鼠。为了鉴定交配获得的4只新生小鼠的基因型,设计了引物1和引物2用于PCR扩增,PCR产物电泳结果如图乙所示。 甲 乙 下列叙述正确的是 (　　) A.Gata3基因的启动子无法控制GFP基因的表达 B.翻译时先合成Gata3蛋白,再合成GFP蛋白 C.2号条带的小鼠是野生型,4号条带的小鼠是Gata3-GFP基因纯合子 D.若用引物1和引物3进行PCR,能更好地区分杂合子和纯合子 10.(2022·山东,13,2分,难度★★)关于“DNA的粗提取与鉴定”实验,下列说法错误的是 (　　) A.过滤液沉淀过程在4 ℃冰箱中进行是为了防止DNA降解 B.离心研磨液是为了加速DNA的沉淀 C.在一定温度下,DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色 D.粗提取的DNA中可能含有蛋白质 11.(2021·山东,13,2分,难度★★)粗提取DNA时,向鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水并搅拌,过滤后所得滤液进行下列处理后再进行过滤,在得到的滤液中加入特定试剂后容易提取出DNA相对含量较高的白色丝状物的处理方式是 (　　) A.加入适量的木瓜蛋白酶 B.37~40℃的水浴箱中保温10~15分钟 C.加入与滤液体积相等的、体积分数为95%的冷却的酒精 D.加入NaCl调节浓度至2 mol/L→过滤→调节滤液中NaCl浓度至0.14 mol/L 12.(2025·北京,21,11分,难度★★★★)学习以下材料,回答(1)~(4)题。 野生动物个体识别的新方法 　　识别野生动物个体有助于野外生态学的研究。近年,人们发现可以从动物粪便中提取该动物的DNA,PCR扩增特定的DNA片段,测定产物的长度或序列,据此可识别个体,在此基础上可以获得野生动物的多种生态学信息。 　　微卫星DNA是一种常用于个体识别的DNA片段,广泛分布于核基因组中。每个微卫星DNA是一段串联重复序列,每个重复单位长度为2~6 bp(碱基对),重复数可以达到几十个(图1)。基因组中有很多个微卫星DNA,分布在不同位置。每个位置的微卫星DNA可视为一个“基因”,由于重复单位的数目不同,同一位置的微卫星“基因”可以有多个“等位基因”,能组成多种“基因型”。分析多个微卫星“基因”,可得到个体特异的“基因型”组合,由此区分开不同的个体。 　　依据微卫星“基因”两侧的旁邻序列(图1),设计并合成特异性引物,PCR扩增后,检测扩增片段长度,即可得知所测个体的“等位基因”(以片段长度命名),进而获得该个体的“基因型”。例如,图2是对某种哺乳动物个体A和B的一个微卫星“基因”进行扩增后电泳分析的结果示意图,个体A的“基因型”为177/183。 图1 图2 　　有一个远离大陆的孤岛,陆生哺乳动物几乎无法到达,人类活动将食肉动物貉带到该岛上。科学家在岛上采集貉的新鲜粪便,提取DNA,扩增并分析了10个微卫星“基因”,结果在30份样品中成功鉴定出个体(表1)。几个月后再次采集貉的新鲜粪便,进行同样的分析,在40份样品中成功鉴定出个体(表1)。据此,科学家估算出该岛上貉的种群数量。 表1　两次采样所鉴定出的貉的个体编号 第一次采集的30份粪便样品所对应的个体编号 N01 N02 N03 N04 N05 N06 N07 N08 N08 N09 N10 N11 N12 N12 N13 N14 N14 N15 N16 N17 N18 N18 N19 N20 N21 N22 N22 N23 N24 N24 第二次采集的40份粪便样品所对应的个体编号 N03 N04 N05 N08 N09 N09 N12 N14 N18 N23 N24 N25 N26 N26 N26 N27 N28 N29 N30 N30 N31 N32 N32 N33 N33 N33 N34 N35 N36 N37 N38 N39 N40 N41 N42 N43 N44 N44 N45 N46 (1)图2中个体B的“基因型”为　　　　　　。  (2)使用微卫星DNA鉴定个体时,能区分的个体数是由微卫星“基因”的数目和　　　　　　的数目决定的。  (3)科学家根据表1信息,使用了　　　　　法的原理来估算这个岛上貉的种群数量,计算过程及结果为　    　。  (4)在上述研究基础上,利用现有DNA样品,设计一个实验方案,了解该岛貉种群的性别比例。 13.(2025·江苏,23,14分,难度★★★★)川金丝猴是我国特有的珍稀濒危物种,为了更好地保护这一物种,研究者开展了以下研究。请回答下列问题。 (1)川金丝猴警戒行为具有监测捕食者和同种个体的功能,这说明生物之间的关系有　　　　　　。川金丝猴的警戒行为依赖于环境中获取的信息,信息类型有　　　　　　　　　　　。川金丝猴根据这些信息及时作出反应,一方面可以降低被捕食风险,另一方面为争夺　　　　　获得更多机会。  (2)川金丝猴以植食为主,消化道中部分微生物直接参与高纤维食物的消化,这些微生物与川金丝猴构成　　　　　　　　关系。  (3)研究者为了进一步研究川金丝猴的食性,采集其粪便样本,进行DNA提取、扩增,部分实验过程如下。请完成下表: 实验目的 简要操作步骤 释放DNA 在去杂后的样本中加入裂解液 析出DNA 离心后取①　　　　　　　　,加入乙醇  ②　　　　  在沉淀物中加入纯水 扩增DNA 将③　　　　　　　　　　　　　　、引物、样本DNA、含有Mg2+缓冲液、超纯水等加入PCR管中,进行PCR  (4)为分析川金丝猴摄食的植物种类,研究者设计一对引物F和R,能同时扩增出不同种植物叶绿体中的rbcL基因片段,是因为引物F和R的碱基能与rbcL基因的保守序列的碱基　　　　　　　。用引物F和R对4种植物样本甲~丁的叶绿体基因组DNA进行扩增测序,结果如图所示。若对4个样本的扩增产物进行DNA电泳条带分析,能检出的样本是　　　　　　　　　　。研究者用引物F和R对川金丝猴粪便DNA进行扩增并测序,得到的序列有图中的3种序列,据此可确定川金丝猴一定摄食的植物有　　　。若要更准确鉴定出川金丝猴摄食的植物,参照叶绿体基因库,还需选用　　　　的保守序列设计引物,对川金丝猴粪便DNA进行扩增、测序分析。  注“·”表示与植物甲对应位置上相同的碱基;“……”表示省略200个碱基。 (5)依据上述研究,保护川金丝猴可采取的措施有　　　　(填字母)。  a.建立川金丝猴生态廊道,促进种群间基因交流 b.保护川金丝猴栖息地的植被和它喜食的植物 c.需用标记重捕法定期重捕,以精确监测种群数量 d.主要依赖迁地保护,扩大川金丝猴种群数量 14.(2025·安徽,20,11分,难度★★★★)稻瘟病是一种真菌病害,水稻叶片某些内生放线菌对该致病菌有抑制作用。科研小组分离筛选出内生放线菌,并开展了相关研究。回答下列问题。 (1)采集有病斑的水稻叶片,经表面消毒、研磨处理,制备研磨液。此后,采用　　　　　　　(填方法)将研磨液接种于不同的选择培养基,分别置于不同温度下培养,目的是　  　。  (2)经筛选获得一株内生放线菌,该菌株高效合成铁载体小分子,能辅助内生放线菌吸收铁离子。R基因是合成铁载体的关键基因之一。科研小组构建R基因敲除株,探究铁载体的功能。主要步骤如下:首先克隆R基因的上游片段R-U和下游片段R-D;然后构建重组质粒;最后利用重组质粒和内生放线菌DNA片段中同源区段可发生交换的原理,对目标基因进行敲除。如图1所示。 图1 图2 说明:用图1中的引物1和2进行PCR扩增。 采用PCR技术鉴定R基因的敲除结果。PCR通过变性、复性和延伸三步,反复循环,可实现基因片段的　　　　　。R基因敲除过程中,可发生多种形式的同源区段交换,PCR检测结果如图2所示,其中R基因敲除株为菌落　　　　　　(填序号),出现菌落④的可能原因是　。  (3)内生放线菌和稻瘟病致病菌的生长均需要铁元素。科研小组推测该内生放线菌通过对铁离子的竞争性利用,从而抑制稻瘟病致病菌生长。设计实验验证该推测,简要写出实验思路。 15.(2022·江苏,24,12分,难度★★★)纤毛是广泛存在的细胞表面结构,功能异常可引起多种疾病。因此,研究纤毛形成的作用机制具有重要意义。请回答下列问题。 (1)纤毛结构如图Ⅰ所示,由细胞膜延伸形成的纤毛膜主要由　　　　组成。基体由中心体转变而来,中心体在有丝分裂中的功能是　  　。  图Ⅰ (2)某病人肾小管上皮细胞纤毛异常,为了分析纤毛相关基因X是否发生了变异,对基因X进行了PCR扩增与产物测序。从细胞样品中分离DNA时,可通过交替调节盐浓度将与核蛋白结合的DNA分离出来,溶液中添加NaCl至2.0 mol/L的目的是  　。  PCR扩增时,需在　　　　　催化下,在引物　　　　　端进行DNA链的延伸,获得扩增产物用于测序。  (3)为研究蛋白质X在细胞中的定位,构建绿色荧光蛋白GFP与X的融合蛋白,融合蛋白具有绿色荧光,可示其在细胞内位置。将X-GFP基因融合片段M导入如图Ⅱ所示载体质粒Y,构建Y-M重组质粒(在EcoRⅤ位点插入片段)。请完成下表。 图Ⅱ 图Ⅲ 分步实验目标 简易操作、结果、分析 PCR鉴定正向重组质粒Y-M(图Ⅱ中融合片段M中有白色的箭头,代表方向) ①选择图Ⅱ引物　　　　;  ②PCR目的产物约为　　　　bp。  确保M及连接处序列正确,Y-M的连接处上游含有Hind Ⅲ+EcoR Ⅴ的识别序列,下游含有EcoR Ⅴ+BamH Ⅰ的识别序列 ③质粒测序,图Ⅲ中正确的是　　　　(选填序列编号)  检测融合蛋白定位 ④对照质粒Y-GFP(仅表达GFP)与实验质粒Y-M分别导入细胞,发现对照组整个细胞均有绿色荧光,而实验组荧光集中在纤毛基部,说明  　。  (4)为研究另一纤毛病相关基因Z表达的变化,采用荧光定量PCR法检测健康人与病人基因Z的转录水平。采集样本、提取总RNA,经　　　　形成cDNA作为模板,PCR扩增结果显示,在总cDNA模板量相等的条件下,健康人Ct值为15,而病人Ct值为20(Ct值是产物荧光强度达到设定阈值时的PCR循环数)。从理论上估算,在PCR扩增20个循环的产物中,健康人样品的目的产物大约是病人的　　　　倍。  考点74基因工程的应用及蛋白质工程答案P461　 1.(2024·天津,5,4分,难度★★)胰岛素的研发走过了:动物提取—化学合成—重组胰岛素—生产胰岛素类似物生产等历程。有关叙述错误的是 (　　) A.动物体内胰岛素由胰岛B细胞合成并通过胞吐运出细胞 B.氨基酸是化学合成胰岛素的原料 C.用大肠杆菌和乳腺生物反应器生产胰岛素需相同的启动子 D.利用蛋白质工程可生产速效胰岛素等胰岛素类似物 2.(2022·江苏,6,2分,难度★★★)采用基因工程技术调控植物激素代谢,可实现作物改良。下列相关叙述不合理的是 (　　) A.用特异启动子诱导表达iaaM(生长素合成基因)可获得无子果实 B.大量表达ipt(细胞分裂素合成关键基因)可抑制芽的分化 C.提高ga2ox(氧化赤霉素的酶基因)的表达水平可获得矮化品种 D.在果实中表达acs(乙烯合成关键酶基因)的反义基因可延迟果实成熟 3.(2021·辽宁,14,2分,难度★★)腈水合酶(N0)广泛应用于环境保护和医药原料生产等领域,但不耐高温。利用蛋白质工程技术在N0的α和β亚基之间加入一段连接肽,可获得热稳定的融合型腈水合酶(N1)。下列有关叙述错误的是 (　　) A.N1与N0氨基酸序列的差异是影响其热稳定性的原因之一 B.加入连接肽需要通过改造基因实现 C.获得N1的过程需要进行转录和翻译 D.检测N1的活性时先将N1与底物充分混合,再置于高温环境 4.(2025·黑吉辽内蒙古,25,11分,难度★★★)香树脂醇具有抗炎等功效,从植物中提取难度大、产率低。通过在酵母菌中表达外源香树脂醇合酶基因N,可高效生产香树脂醇。回答下列问题。 (1)可从　　　　　　中查询基因N的编码序列,设计特定引物。如图1所示,a链为转录模板链,为保证基因N与质粒pYL正确连接,需在引物1和引物2的5'端分别引入　　　　和　　　　限制酶识别序列。PCR扩增基因N,特异性酶切后,利用　　　　　　连接DNA片段,构建重组质粒,大小约9.5 kb(kb为千碱基对),假设构建重组质粒前后,质粒pYL对应部分大小基本不变。  图1 注M为指示分子大小的标准参照物,1~4为菌株号。 图2 (2)进一步筛选构建的质粒,以1~4号菌株中提取的质粒为模板,使用引物1和引物2进行PCR扩增,电泳PCR产物,结果如图2。在第5组的PCR反应中,使用无菌水代替实验组的模板DNA,目的是检验PCR反应中是否有　　　　的污染。初步判断实验组　　　　(从“1~4”中选填)的质粒中成功插入了基因N,理由是　  　。  (3)为提高香树脂醇合酶催化效率,将编码第240位脯氨酸或第243位苯丙氨酸的碱基序列替换为编码丙氨酸的碱基序列,丙氨酸的密码子有GCA等。a是诱变第240位脯氨酸编码序列的引物(GCA为诱变序列),b、c、d其中一条是诱变第243位苯丙氨酸的引物,其配对模板与a的配对模板相同。据此分析,丙氨酸的密码子除GCA外,还有　　　　。  a:5'…GCA/CCC/GAG/TTC/TGG/CTG/TTT/CCC/TCT/TTC/TTC…3' b:5'…GAA/CTG/TGG/GAC/ACC/CTG/AAC/TAC/TTC/TCT/GAG…3' c:5'…GCC/TGG/CTG/TTT/CCC/TCT/TTC/TTC/CCC/TAC/CAC…3' d:5'…GAT/AAT/AAG/ATC/CGA/GAG/AAG/GCC/ATG/CGA/AAG…3' (4)进一步检测转基因酵母菌发酵得到的　　　含量并进行比较,可以选出最优的香树脂醇合酶基因的改造方案。   5.(2024·北京,20,10分,难度★★★★)学习以下材料,回答(1)~(4)题。 筛选组织特异表达的基因 筛选组织特异表达的基因,对研究细胞分化和组织、器官的形成机制非常重要。“增强子捕获”是筛选组织特异表达基因的一种有效方法。 真核生物的基本启动子位于基因5'端附近,没有组织特异性,本身不足以启动基因表达。增强子位于基因上游或下游,与基本启动子共同组成基因表达的调控序列。基因工程所用表达载体中的启动子,实际上包含增强子和基本启动子。 很多增强子具有组织特异的活性,它们与特定蛋白结合后激活基本启动子,驱动相应基因在特定组织中表达(图A)。基于上述调控机理,研究者构建了由基本启动子和报告基因组成的“增强子捕获载体”(图B),并转入受精卵。捕获载体会随机插入基因组中,如果插入位点附近存在有活性的增强子,则会激活报告基因的表达(图C)。 获得了一系列分别在不同组织中特异表达报告基因的个体后,研究者提取每个个体的基因组DNA,通过PCR扩增含有捕获载体序列的DNA片段。对PCR产物进行测序后,与相应的基因组序列比对,即可确定载体的插入位点,进而鉴定出相应的基因。 研究者利用各种遗传学手段,对筛选得到的基因进行突变、干扰或过表达,检测个体表型的改变,研究其在细胞分化和个体发育中的作用,从而揭示组织和器官形成的机理。 (1)在个体发育中,来源相同的细胞在形态、结构和功能上发生　　　　　　的过程称为细胞分化,分化是基因　　　　　　的结果。  (2)对文中“增强子”的理解,错误的是　　　　(单选)。  A.增强子是含有特定碱基序列的DNA片段 B.增强子、基本启动子和它们调控的基因位于同一条染色体上 C.一个增强子只能作用于一个基本启动子 D.很多增强子在不同组织中的活性不同 (3)研究者将增强子捕获技术应用于斑马鱼,观察到报告基因在某幼体的心脏中特异表达。鉴定出捕获载体的插入位点后,发现位点附近有两个基因G和H,为了确定这两个基因是否为心脏特异表达的基因,应检测　。  (4)真核生物编码蛋白的序列只占基因组的很少部分,因而在绝大多数表达报告基因的个体中,增强子捕获载体的插入位点位于基因外部,不会造成基因突变。研究者对图B所示载体进行了改造,期望改造后的载体随机插入基因组后,在“捕获”增强子的同时,也造成该增强子所调控的基因发生突变,以研究基因功能。请画图表示改造后的载体,并标出各部分名称。 6.(2024·黑吉辽,25,12分,难度★★★★★)将天然Ti质粒改造成含有Vir基因的辅助质粒(辅助T-DNA转移)和不含有Vir基因、含有T-DNA的穿梭质粒,共同转入农杆菌,可提高转化效率。细菌和棉花对密码子偏好不同,为提高翻译效率,增强棉花抗病虫害能力,进行如下操作。回答下列问题。 注F1—F3,R1—R3表示引物;T-DNA-LB表示左边界;T-DNA-RB表示右边界;Ori表示复制原点;KanR表示卡那霉素抗性基因;HygBR表示潮霉素B抗性基因。 (1)从苏云金杆菌提取DNA时,需加入蛋白酶,其作用是  　。  提取过程中加入体积分数为95%的预冷酒精,其目的是　。  (2)本操作中获取目的基因的方法是　　　　　和　　　　　。  (3)穿梭质粒中p35s为启动子,其作用是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　,驱动目的基因转录;插入两个p35s启动子,其目的可能是　。  (4)根据图中穿梭质粒上的KanR和HygBR两个标记基因的位置,用　　　　　基因对应的抗生素初步筛选转化的棉花愈伤组织。  (5)为检测棉花植株是否导入目的基因,提取棉花植株染色体DNA作模板,进行PCR,应选用的引物是　　　　　和　　　　　。  (6)本研究采用的部分生物技术属于蛋白质工程,理由是　　　　　。  A.通过含有双质粒的农杆菌转化棉花细胞 B.将苏云金杆菌Bt基因导入棉花细胞中表达 C.将1—1 362基因序列改变为棉花细胞偏好密码子的基因序列 D.用1—1 362合成基因序列和1 363—1 848天然基因序列获得改造的抗虫蛋白 7.(2024·广东,21,13分,难度★★★★)驹形杆菌可合成细菌纤维素(BC)并将其分泌到胞外组装成膜。作为一种性能优异的生物材料,BC膜应用广泛。研究者设计了酪氨酸酶(可催化酪氨酸形成黑色素)的光控表达载体,将其转入驹形杆菌后构建出一株能合成BC膜并可实现光控染色的工程菌株,为新型纺织原料的绿色制造及印染工艺升级提供了新思路(图一)。 图一 回答下列问题。 (1)研究者优化了培养基的　　　　　　　(答两点)等营养条件,并控制环境条件,大规模培养工程菌株后可在气液界面处获得BC菌膜(菌体和BC膜的复合物)。  (2)研究者利用T7噬菌体来源的RNA聚合酶(T7RNAP)及蓝光光敏蛋白标签,构建了一种可被蓝光调控的基因表达载体(光控原理见图二a,载体的部分结构见图二b)。构建载体时,选用了通用型启动子PBAD(被工程菌RNA聚合酶识别)和特异型启动子PT7(仅被T7RNAP识别)。为实现蓝光控制染色,启动子①②及③依次为　　　　　　　　　,理由是　  　。  图二 (3)光控表达载体携带大观霉素(抗生素)抗性基因。长时间培养时在培养液中加入大观霉素,其作用为　　　　　　　　　　　　　　　(答两点)。  (4)根据预设的图案用蓝光照射已长出的BC菌膜并继续培养一段时间,随后将其转至染色池处理,发现只有经蓝光照射的区域被染成黑色,其原因是    　。  (5)有企业希望生产其他颜色图案的BC膜。按照上述菌株的构建模式提出一个简单思路。    　。  8.(2024·河北,22,14分,难度★★★★)新城疫病毒可引起家禽急性败血性传染病,我国科学家将该病毒相关基因改造为r2HN,使其在水稻胚乳特异表达,制备获得r2HN疫苗,并对其免疫效果进行了检测。回答下列问题。 (1)实验所用载体的部分结构及其限制酶识别位点如图1所示。其中GtP为启动子,若使r2HN仅在水稻胚乳表达,GtP应为　　　　　　　　　　　　　　　　启动子。Nos为终止子,其作用为　　　　　　　　　　　。r2HN基因内部不含载体的限制酶识别位点。因此,可选择限制酶　　　　和　　　　　对r2HN基因与载体进行酶切,用于表达载体的构建。  图1 (2)利用　　　　　　　　　　　　方法将r2HN基因导入水稻愈伤组织。为检测r2HN表达情况,可通过PCR技术检测　　　　　　　　　　　　　　　　　　　,通过　　　　　　　　　　　　技术检测是否翻译出r2HN蛋白。  (3)获得转基因植株后,通常选择单一位点插入目的基因的植株进行研究。此类植株自交一代后,r2HN纯合体植株的占比为　　　。选择纯合体进行后续研究的原因是　　　　　　　　　　　　　。  (4)制备r2HN疫苗后,为研究其免疫效果,对实验组鸡进行接种,对照组注射疫苗溶剂。检测两组鸡体内抗新城疫病毒抗体水平和特异应答的CD8+T细胞(细胞毒性T细胞)水平,结果如图2所示。据此分析,获得的r2HN疫苗能够成功激活鸡的　　　　免疫和　　　　免疫。  图2 (5)利用水稻作为生物反应器生产r2HN疫苗的优点是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。(答出两点即可)  9.(2023·辽宁,25,11分,难度★★★★)天然β淀粉酶大多耐热性差,不利于工业化应用。我国学者借助PCR改造β-淀粉酶基因,并将改造的基因与pLN23质粒重组后导入大肠杆菌,最终获得耐高温的β-淀粉酶。回答下列问题。 (1)上述过程属于　　　　工程。  (2)PCR中使用的聚合酶属于　　　(填写编号)。  ①以DNA为模板的RNA聚合酶 ②以RNA为模板的RNA聚合酶 ③以DNA为模板的DNA聚合酶 ④以RNA为模板的DNA聚合酶 (3)某天然β-淀粉酶由484个氨基酸构成,研究发现,将该酶第476位天冬氨酸替换为天冬酰胺,耐热性明显提升。在图1所示的β-淀粉酶基因改造方案中,含已替换碱基的引物是　　　　(填写编号)。  图1 (4)为了使上述改造后的基因能在大肠杆菌中高效表达,由图2所示的pLN23质粒构建得到基因表达载体。除图示信息外,基因表达载体中还应该有目的基因(即改造后的基因)和　　　　。  图2 (5)目的基因(不含EcoR Ⅰ酶切位点)全长为1.5 kb,将其插入BamH Ⅰ位点。用EcoR Ⅰ酶切来自于不同大肠杆菌菌落的质粒DNA,经琼脂糖凝胶电泳确定DNA片段长度,这一操作的目的是　。  正确连接的基因表达载体被EcoR Ⅰ酶切后长度为　　　　kb。  (6)采用PCR还能在分子水平上确定目的基因是否转录,根据中心法则,可通过　　　　反应获得PCR的模板。  10.(2023·浙江,23,14分,难度★★★★)赖氨酸是人体不能合成的必需氨基酸,而人类主要食物中的赖氨酸含量很低,利用生物技术可提高食物中赖氨酸含量。回答下列问题。 (1)植物细胞合成的赖氨酸达到一定浓度时,能抑制合成过程中两种关键酶的活性,导致赖氨酸含量维持在一定浓度水平,这种调节方式属于　　　　　　　　　　。根据这种调节方式,在培养基中添加　,  用于筛选经人工诱变的植物悬浮细胞,可得到抗赖氨酸类似物的细胞突变体,通过培养获得再生植株。 (2)随着转基因技术与动物细胞工程结合和发展,2011年我国首次利用转基因和体细胞核移植技术成功培育了高产赖氨酸转基因克隆奶牛。其基本流程为: ①构建乳腺专一表达载体。随着测序技术的发展,为获取富含赖氨酸的酪蛋白基因(目的基因),可通过检索　　　　　　　　　　　获取其编码序列,用化学合成法制备得到。再将获得的目的基因与含有乳腺特异性启动子的相应载体连接,构建出乳腺专一表达载体。  ②表达载体转入牛胚胎成纤维细胞(BEF)。将表达载体包裹到磷脂等构成的脂质体内,与BEF膜发生　　　　　　,表达载体最终进入细胞核,发生转化。  ③核移植。将转基因的BEF作为核供体细胞,从牛卵巢获取卵母细胞,经体外培养及去核后作为　　　　　　　。将两种细胞进行电融合,电融合的作用除了促进细胞融合,同时起到了　　　　　　重组细胞发育的作用。  ④重组细胞的体外培养及胚胎移植。重组细胞体外培养至　　　　　　　,植入代孕母牛子宫角,直至小牛出生。  ⑤检测。DNA水平检测:利用PCR技术,以非转基因牛耳组织细胞作为阴性对照,以　　　　　　为阳性对照,检测到转基因牛耳组织细胞中存在目的基因。RNA水平检测:从非转基因牛乳汁中的脱落细胞、转基因牛乳汁中的脱落细胞和转基因牛耳组织细胞,提取总RNA,对总RNA进行　　　　　　　　处理,以去除DNA污染,再经逆转录形成cDNA,并以此为　　　　　　　,利用特定引物扩增目的基因片段。结果显示目的基因在转基因牛乳汁中的脱落细胞内表达,而不在牛耳组织细胞内表达,原因是什么?      　。  11.(2022·北京,21,11分,难度★★★★★)生态文明建设已成为我国的基本国策。水中雌激素类物质(E物质)污染会导致鱼类雌性化等异常,并通过食物链影响人体健康和生态安全。原产南亚的斑马鱼,其肌细胞、生殖细胞等存在E物质受体,且幼体透明。科学家将绿色荧光蛋白(GFP)等基因转入斑马鱼,建立了一种经济且快速的水体E物质监测方法。 (1)将表达载体导入斑马鱼受精卵的最佳方式是   　。  (2)为监测E物质,研究者设计了下图所示的两种方案制备转基因斑马鱼,其中ERE和酵母来源的UAS是两种诱导型启动子,分别被E物质—受体复合物和酵母来源的Gal4蛋白特异性激活,启动下游基因表达。与方案1相比,方案2的主要优势是　,  因而被用于制备监测鱼(MO)。 方案1 方案2 (3)现拟制备一种不育的监测鱼SM,用于实际监测。SM需经MO和另一亲本(X)杂交获得。欲获得X,需从以下选项中选择启动子和基因,构建表达载体并转入野生型斑马鱼受精卵,经培育后进行筛选。请将选项的序号填入相应的方框中。 Ⅰ.启动子:　　　　。  ①ERE　②UAS　③使基因仅在生殖细胞表达的启动子(P生)　④使基因仅在肌细胞表达的启动子(P肌) Ⅱ.基因:　　　  A.GFP B.Gal4 C.雌激素受体基因(ER) D.仅导致生殖细胞凋亡的基因(dg) (4)SM不育的原因是:成体SM自身产生雌激素,与受体结合后  　造成不育。  (5)使拟用于实际监测的SM不育的目的是  　。  12.(2022·广东,22,12分,难度★★)“绿水逶迤去,青山相向开”,大力发展低碳经济已成为全社会的共识。基于某些梭菌的特殊代谢能力,有研究者以某些工业废气(含CO2等一碳温室气体,多来自高污染排放企业)为原料,通过厌氧发酵生产丙酮,构建一种生产高附加值化工产品的新技术。 回答下列问题。 (1)研究者针对每个需要扩增的酶基因(如图)设计一对　　　　　,利用PCR技术,在优化反应条件后扩增得到目标酶基因。  (2)研究者构建了一种表达载体pMTL80k,用于在梭菌中建立多基因组合表达库,经筛选后提高丙酮的合成量。该载体包括了启动子、终止子及抗生素抗性基因等,其中抗生素抗性基因的作用是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　,终止子的作用是　　　　　　　　　　　　。  (3)培养过程中发现重组梭菌大量表达上述酶蛋白时,出现了生长迟缓的现象,推测其原因可能是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　,此外丙酮的积累会伤害细胞,需要进一步优化菌株和工艺才能扩大应用规模。  (4)这种生产高附加值化工产品的新技术,实现了　　　　　　　　　,体现了循环经济特点。从“碳中和”的角度看,该技术的优势在于　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　,具有广泛的应用前景和良好的社会效益。  13.(2022·湖南,22,15分,难度★★★)水蛭是我国的传统中药材,主要药理成分水蛭素为水蛭蛋白中重要成分之一,具有良好的抗凝血作用。拟通过蛋白质工程改造水蛭素结构,提高其抗凝血活性。回答下列问题。 (1)蛋白质工程流程如图所示,物质a是　　　　　,物质b是　　　　　。在生产过程中,物质b可能不同,合成的蛋白质空间构象却相同,原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　　。  (2)蛋白质工程是基因工程的延伸,基因工程中获取目的基因的常用方法有　　　　　　、　　　　　　和利用PCR技术扩增。PCR技术遵循的基本原理是　　　　　　　　　　　　　　　　。  (3)将提取的水蛭蛋白经甲、乙两种蛋白酶水解后,分析水解产物中的肽含量及其抗凝血活性,结果如图所示。推测两种处理后酶解产物的抗凝血活性差异主要与肽的　　　　(填“种类”或“含量”)有关,导致其活性不同的原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。  (4)若要比较蛋白质工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素的抗凝血活性差异,简要写出实验设计思路:    　。  14.(2021·北京,16,12分,难度★★★)新冠病毒(SARS-CoV-2)引起的疫情仍在一些国家和地区肆虐,接种疫苗是控制全球疫情的最有效手段。新冠病毒疫苗有多种,其中我国科学家已研发出的腺病毒载体重组新冠病毒疫苗(重组疫苗)是一种基因工程疫苗,其基本制备步骤是:将新冠病毒的S基因连接到位于载体上的腺病毒基因组DNA中,重组载体经扩增后转入特定动物细胞,进而获得重组腺病毒并制成疫苗。 (1)新冠病毒是RNA病毒,一般先通过　　　　　得到cDNA,经　　　　　获取S基因,酶切后再连接到载体。  (2)重组疫苗中的S基因应编码　　　　　。  A.病毒与细胞识别的蛋白 B.与病毒核酸结合的蛋白 C.催化病毒核酸复制的酶 D.帮助病毒组装的蛋白 (3)为保证安全性,制备重组疫苗时删除了腺病毒的某些基因,使其在人体中无法增殖,但重组疫苗仍然可以诱发人体产生针对新冠病毒的特异性免疫应答。该疫苗发挥作用的过程是:接种疫苗→　　　　　→　　　　　→诱发特异性免疫反应。  (4)重组疫苗只需注射一针即可完成接种。数周后,接种者体内仍然能检测到重组腺病毒DNA,但其DNA不会整合到人的基因组中。请由此推测只需注射一针即可起到免疫保护作用的原因:  　。  考点75生物技术的安全性与伦理问题答案P464　 1.(2023·北京,6,2分,难度★★)抗虫作物对害虫的生存产生压力,会使害虫种群抗性基因频率迅速提高,导致作物的抗虫效果逐渐减弱。为使转基因抗虫棉保持抗虫效果,农业生产上会采取一系列措施。以下措施不能实现上述目标的是 (　　) A.在转基因抗虫棉种子中混入少量常规种子 B.大面积种植转基因抗虫棉,并施用杀虫剂 C.转基因抗虫棉与小面积的常规棉间隔种植 D.转基因抗虫棉大田周围设置常规棉隔离带 2.(2021·北京,14,2分,难度★★)社会上流传着一些与生物有关的说法,有些有一定的科学依据,有些违反生物学原理。以下说法中有科学依据的是 (　　) A.长时间炖煮会破坏食物中的一些维生素 B.转基因抗虫棉能杀死害虫就一定对人有毒 C.消毒液能杀菌,可用来清除人体内新冠病毒 D.如果孩子的血型和父母都不一样,肯定不是亲生的 学科网（北京）股份有限公司 $$