3.2 基因工程的基本操作程序课件-2024-2025学年高二下学期生物人教版选择性必修3

第2节 基因工程的基本操作程序 SW生老师 SW生老师 1997年，我国政府首次批准商业化种植转基因抗虫棉。到2015年，我国已育成转基因抗虫棉新品种100多个，减少农药用量40万吨，增收节支社会经济效益450亿元。你知道转基因抗虫棉抗虫的机制是什么吗？培育转基因抗虫棉一般需要哪些步骤？ 从社会中来 SW生老师 抗虫棉的培育过程 2.基因表达载体的构建 1.目的基因的筛选与获取 3.将目的基因导入受体细胞 4.目的基因的检测与鉴定 Bt基因 Ti质粒 重组DNA分子 将目的基因插入染色体DNA中 从社会中来 SW生老师 基因工程的基本操作程序 目的基因的筛选与获取 基因表达载体的构建 将目的基因导入受体细胞 目的基因的检测与鉴定 构建表达载体 含目的基因的重组Ti质粒 表现出新性状的植株 导入植物 细胞 植物细胞 将目的基因插入染色体DNA中 目的基因 Ti 质粒 T-DNA 含重组Ti质粒的农杆菌 转入农杆菌 SW生老师 第一步：目的基因的筛选与获取 在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因就是目的基因。根据不同的需要，目的基因是不同的，它主要是指编码蛋白质的基因，如与生物抗逆性、生产药物、毒物降解、工业用酶等相关的基因。 目的基因 目的基因 SW生老师 基因通常是有遗传效应的DNA片段 但一段DNA片段不一定是基因 --ATGCATGCATCCATGCTAGCCATCCCTAAGGACAG--- --TACGTACGTAGGTACGATCGGTAGGGATTCCTGTC--- 基因1 基因2 非基因片段 请从DNA水平上给基因下一个定义，要求既能反映基因与DNA的关系，又能体现基因的作用。 回顾必修二 SW生老师 筛选Bt基因作为转基因抗虫棉的目的基因的原因： ⑴用苏云金杆菌制成的生物杀虫剂，广泛用于防治棉花虫害已有多年历史。 ⑵苏云金杆菌的杀虫作用与Bt基因有关。 ①掌握了Bt基因的序列信息。 ②对Bt基因的表达产物—Bt抗虫蛋白有了较为深入的了解。 SW生老师 筛选合适的目的基因 序列数据库（如GenBank） 序列比对工具（如BLAST） 公共生物医学数据库、分析分子及基因组数据的软件工具NCBI SW生老师 利用PCR获取和扩增目的基因 SW生老师 聚合酶链式反应PCR PCR是聚合酶链式反应的缩写。它是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术 PCR扩增仪 SW生老师 凯利·穆利斯（Kary Mullis） 聚合酶链式反应PCR 1985年发明，1993年获得诺贝尔化学奖。 SW生老师 解旋酶 高温和解旋酶都可以使双链螺旋的DNA打开氢键，解开成为两条单链。 DNA聚合酶 母链(模板链) 子链(新合成的链) 四种脱 氧核苷酸 3’ 3’ 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 体外用高温代替 聚合酶链式反应PCR SW生老师 聚合酶链式反应PCR 参与的组分 在DNA复制中的作用 解旋酶（体外用高温代替） 打开DNA双链 DNA母链 提供DNA复制的模板 4种脱氧核苷酸 合成DNA子链的原料 DNA 聚合酶 催化合成DNA子链 引物 使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸 SW生老师 3’ 在DNA复制时，DNA聚合酶不能直接从模板链的一端直接开始合成子链，必须由引物提供3’端之后才能开始连接脱氧核苷酸。 3’ 3’ 3’ 3’ 3’ 3’ 3’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 引物：是能与DNA母链互补配对的一小段短单链核酸序列。 RNA单链、DNA单链 由于DNA双链是反向平行的，所以需要两种引物。 5’ 5’ 3’ 3’ SW生老师 DNA的两条链是反向平行的，为了明确地表示DNA的方向，通常将DNA有羟基（-OH）的一端称为3’端，而没有羟基的一端称为5’端。DNA的合成方向总是从5’端到3’端延伸。 注意： 5’ 3’ 5’ 3’ SW生老师 扩增的过程： 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 加热至90℃使双链分开 冷却至50℃左右使引物与DNA结合 ①变性 ②复性 ③延伸 90℃以上 50℃左右，引物与模板结合 72℃左右，DNA 从5’到3’延伸 冷却 加热 3’ 5’ 3’ 5’ DNA合成 SW生老师 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ ①变性 ②复性 ③延伸 第一轮产物 循环 SW生老师 SW生老师 1、复性的过程一定是引物与DNA模板链结合吗？ 思考 复性时引物与DNA模板的结合是随机的，也存在解开的两条DNA单链的结合，但两条模板链重新结合的概率较低，原因是： ①模板链一般比较长，比引物复杂得多，重新结合的概率较低。 ②加入引物的量足够多，而模板链数量少，引物与模板之间的碰撞结合机会，远远高于模板互补链之间的碰撞机会。 2、用PCR可以扩增mRNA吗？ 不能！由于RNA不稳定，需要将RNA反转录为cDNA，然后再进行扩增。 SW生老师 3、获取目的基因时至少要经过几次循环才能分离出目的基因？ 至少要三次循环。 SW生老师 4、如何对产物进行鉴定？ 琼脂糖凝胶电泳 DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷，在电场的作用下，这些带电分子会向与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就叫电泳。 SW生老师 4、获得目的基因后直接转入受体吗？ 不是，游离的DNA片段进入受体细胞，一般会直接被分解，就算可以进行转录和翻译成蛋白质，游离的DNA片段也无法随着细胞分裂进行复制，导致子代细胞不再含有目的基因。 SW生老师 基因表达载体的作用： ①让目的基因在受体细胞中稳定存在，并遗传给下一代； ②使目的基因能够表达和发挥作用。 基因表达载体的构建是基因工程的核心工作。 启动子：一段特殊DNA序列，位于基因的上游，是RNA聚合酶的识别和结合位点，启动转录过程。 终止子：一段特殊DNA序列，位于基因的下游，终止转录。 第二步：基因表达载体的构建 SW生老师 “启动子与终止子”和“起始密码子与终止密码子” 启动子与终止子位于DNA分子中，作用：起始和终止转录过程。 起始密码子与终止密码子位于mRNA分子中，作用：起始和终止翻译过程。 SW生老师 基因表达载体构建的流程： ①用限制酶切割载体，使它出现一个缺口； ②用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段，获取目的基因； ③用DNA连接酶将目的基因片段拼接到载体缺口处，形成重组DNA分子。 目的基因 SW生老师 构建载体时，需要用同种限制酶切割载体和目的基因，以获得相同的黏性末端，便于两者顺利连接。但是由于被切割后的质粒本身也具备相同的黏性末端，所以会有一定概率的自身环化，你有办法解决这个问题吗？ 目的基因——载体连接物、 载体——载体连接物、 目的基因——目的基因连接物。 SW生老师 如何防止目的基因和质粒的自身环化以及目的基因的反向连接？ 双酶切（用两种不同末端的限制酶进行切割） -G -CTTAA -A -TCTAG SW生老师 注意： 1、目的基因应插到启动子与终止子之间的部位。 2、目的基因的插入不能破坏标记基因。 3、切割质粒和获取目的基因的限制酶必须产生相同的末端。（碱基互补，便于连接） SW生老师 第三步：将目的基因导入受体细胞 方 法 细胞种类： 植物细胞 常用方法： 受体细胞： 转化过程： 农杆菌转化法、花粉管通道法、基因枪法 体细胞 以农杆菌转化法为例： 将目的基因插入Ti质粒的T-DNA上→农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞的DNA上→表达 SW生老师 方 法 细胞种类： 动物细胞 常用方法： 受体细胞： 转化过程： 显微注射法 受精卵 将含有目的基因的表达载体提纯一取受精卵→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物 SW生老师 方 法 细胞种类： 微生物细胞 常用方法： 受体细胞： 转化过程： Ca2＋处理法 原核细胞 Ca2+处理细胞→能吸收周围环境中DNA分子的生理状态→重组表达载体与处理后的受体细胞混合→受体细胞吸收DNA分子 SW生老师 农杆菌 农杆菌是生活在土壤中的微生物，自然条件下可侵染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有侵染能力。农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T-DNA（可转移的DNA）转移到被侵染的细胞、并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。 SW生老师 根据受体细胞不同，转化方法不同 ①可以将新鲜的从叶片上取下的圆 形小片与农杆菌共培养，然后筛选转化细胞，并再生成植株； ②可以将花序直接浸没在含有农杆菌的溶液中一段时间，然后培养植株并获得种子，再进行筛选、鉴定等。 农杆菌转化法 SW生老师 花粉管通道法 ①可以用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中。 ②可以在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。 SW生老师 显微注射法 利用显微注射将目的基因注入动物受精卵中，这个受精卵将发育成具有新性状的动物。是将目的基因导入动物受精卵最有效的方法。 SW生老师 Ca2＋处理法 利用转基因大肠杆菌生产药物 SW生老师 目的基因转入是否成功还需要进一步的检验 第四步：目的基因的检验与鉴定 SW生老师 分子水平上的检测 检测是否插入目的基因 检测目的基因是否转录 检测mRNA是否翻译 DNA分子杂交 分子杂交 抗原-抗体杂交 SW生老师 DNA分子杂交法： 其基本原理是具有一定同源性的两条DNA单链，在一定条件下（适宜的温度等）可以按照碱基互补配对原则形成双链。杂交过程中，杂交的双方是待测的DNA和用放射性同位素标记的已知DNA片段（又称为基因探针）。 若待测DNA中有能与探针互补的特异性DNA片段，用于示踪的放射性同位素标记会指示出其所在的位置，表明目的基因已插入转基因生物染色体的DNA中。 SW生老师 个体水平上的检测 抗虫鉴定 棉铃虫 棉铃虫（死亡） SW生老师 探究•实践 DNA片段的扩增及电泳鉴定 1、实验原理 利用PCR可以在体外进行DNA片段的扩增。PCR利用了DNA的热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器。一次PCR一般要经历30次循环。 （1）利用PCR扩增DNA片段的原理 SW生老师 1、实验原理 DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来。 （2）DNA片段电泳鉴定的原理 SW生老师 2、目的要求 了解PCR和电泳鉴定的基本原理。 尝试进行PCR的基本操作并用电泳鉴定PCR的产物。 3、材料用具 PCR仪、微量离心管、微量移液器、一次性吸液枪头、电泳装置（包括电泳仪、电泳槽等）、4种脱氧核苷酸的等量混合液、2种引物、TaqDNA聚合酶、模板DNA、扩增缓冲液、无菌水、电泳缓冲液、凝胶载样缓冲液、琼脂糖和核酸染料等。 SW生老师 微量移液枪 PCR仪 电泳装置 SW生老师 PCR反应体系的配方 10倍浓缩的扩增缓冲液（含Mg2+） 5μL 20mmol/L的4种脱氧核苷酸的等量混合液（实为dNTP） 1μL 20μmol/L的引物Ⅰ 2.5μL 20μmol/L的引物Ⅱ 2.5μL H2O 28～33μL 1-5U/μL的Taq DNA聚合酶（即耐高温的DNA聚合酶） 1～2U 模板DNA （用量为1pg-1μg） 5～10μL 总体积 50μL SW生老师 4、方法步骤 DNA片段的扩增 （1）移液：用微量移液器按照配方或PCR试剂盒的说明书，在微量离心管中依次加入各组分。 （2）离心：待所有的组分都加入后，盖严离心管的盖子。将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在管的底部。 （3）反应：参照书中P85表格的参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。 SW生老师 4、方法步骤 DNA片段的电泳鉴定 （1）配制琼脂糖溶液：根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量分数为0.8%～1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀。 （2）制备凝胶： ①将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。 ②待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。 ③将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜。 SW生老师 （3）加样：将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物。 （4）电泳：接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1~5V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳。 （5）观察记录：取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。 SW生老师 注意 1.为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。 2.该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在-20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。 3.在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。 4.在进行操作时，一定要戴好一次性手套。 SW生老师 结果 SW生老师 5、结果分析与评价 （1）你是否成功扩增出DNA片段？判断的依据是什么？ （2）你进行电泳鉴定的结果是几条条带？如果不止一条条带，请分析产生这个结果的可能原因。 可以通过在紫外灯下直接观察DNA条带的分布及粗细程度来评价扩增的结果。 如果扩增不成功，可能的原因有：漏加了PCR的反应成分；各反应成分的用量不当；PCR程序设置不当等。 如果扩增结果不止一条条带，可能的原因有：引物设计不合理；退火温度过低；DNA聚合酶的质量不好等。 SW生老师 课堂总结 SW生老师 1.研究人员将一种海鱼的抗冻蛋白基因afp整合到土壤农杆菌的Ti质粒上，然后用它侵染番茄细胞，获得了抗冻的番茄品种。判断下列相关表述是否正确。 (1)afp基因是培育抗冻番茄用到的目的基因。( ) (2)构建含有afp基因的Ti质粒需要限制酶、DNA连接酶和核酸酶。( ) (3)只要检测出番茄细胞中含有afp基因，就代表抗冻番茄培育成功。( ) 2.利用PCR既可以快速扩增特定基因，也可以检测基因的表达。下列有关PCR的叙述错误的是( ) A.PCR用的DNA聚合酶是一种耐高温酶 B.变性过程中双链DNA的解开不需要解旋酶 C.复性过程中引物与模板链的结合遵循碱基互补配对原则 D.延伸过程中需要DNA聚合酶、ATP和4种核糖核苷酸 课堂练习 √ × × D SW生老师 $$