3.1 重组DNA技术的基本工具课件-2024-2025学年高二下学期生物人教版选择性必修3

第1节 重组DNA技术的基本工具 SW生老师 SW生老师 1961年，尼伦伯格（M. W. Nirenberg, 1927-2010)和马太（J. H. Matthaei，1929一）破译了第一个编码氨基酸的密码子。截至1966年，64个密码子均被成功破译。 1967年，科学家发现，在细菌拟核DNA之外的质粒有自我复制能力，并可以在细菌细胞间转移。 1958年，梅塞尔森（M. Meselson, 1930-)和斯塔尔（F. W. Stahl,1929-) 用实验证明了DNA的半保留复制。随后不久，克里克提出中心法则。 1953年，沃森（J.D.Watson,1928-)和克里克（F.Crick,1916-2004)建立了DNA双螺旋结构模型并提出了遗传物质自我复制的假说。 1950年，埃德曼（P.V.Edman,1916-1977)发明了一种测定氨基酸序列的方法。2年后，桑格（F.Sanger,1918-2013)首次完成了对胰岛素氨基酸序列的测定。 1944年，艾弗里（O. Avery, 1877-1955)等人通过肺炎链球菌的转化实验，不仅证明了遗传物质是DNA，还证明了DNA可以在同种生物的不同个体之间转移。 科技探索之路 基因工程的诞生和发展 1953 1958 1944 1950 1961 1967 SW生老师 1977年，桑格等科学家发明了DNA序列分析的方法，为基因序列图的绘制提供了可能。此后，DNA合成仪的问世为体外合成DNA提供了方便。 1982年，第一个基因工程药物－重组人胰岛素被批准上市。基因工程药物成为世界各国研究和投资开发的热点。 1973年，科学家证明质粒可以作为基因工程的载体，构建重组DNA,导入受体细胞，使外源基因在原核细胞中成功表达，并实现物种间的基因交流。至此，基因工程正式问世。 1972年，伯格（P.Berg,1926-)首先在体外进行了DNA改造的研究，成功地构建了第一个体外重组DNA分子。 20世纪70年代初，多种限制酶、DNA连接酶和逆转录酶被相继发现。这些发现为DNA的切割、连接以及功能基因的获得创造了条件。 1970年，科学家在细菌中发现了第一个限制性内切核酸酶（简称限制酶） 1972 1973 1970 20世纪70年代初 1977 1982 科技探索之路 基因工程的诞生和发展 SW生老师 21世纪以来，科学家发明了多种高通量测序技术，可以实现低成本测定大量核酸序列，加速了人们对基因组序列的了解。 2013年，华人科学家张锋（1982-)及其团队首次报道利用最新的基因组编辑技术－CRISPR (成簇规律间隔短回文重复）技术编辑了哺乳动物基因组。该技术可以实现对特定基因的定点插入、敲除或替换。 1990年，人类基因组计划启动。2003年，该计划的测序任务顺利完成 1985年，穆里斯（K. Mullis, 1944-2019)等人发明PCR,为获取目的基因提供了有效手段。 1984年，我国科学家朱作言（1941-)领导的团队培育出世界上第一条转基因鱼。 1983年，科学家采用农杆菌转化法培育出世界上第一例转基因烟草。此后，基因工程进入了迅速发展的阶段。 1985 1990 1983 1984 21世纪以来 2013 科技探索之路 基因工程的诞生和发展 SW生老师 基因工程是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫作重组DNA技术。 一、基因工程的概念 基因重组 ②操作水平： ③操作原理： ①操作对象： 基因 DNA分子水平 ④操作结果： 符合人们需要的新的生物类型和生物产品 ⑤基因工程别名： 重组DNA技术 SW生老师 从社会中来 番木瓜容易受番木瓜环斑病毒的侵袭。当番木瓜被这种病毒感染后，产量会大大下降。科学家通过精心设计，用“分子工具”培育出了转基因番木瓜，它可以抵御番木瓜环斑病毒。DNA双螺旋的直径只有2nm,对如此微小的分子进行操作，是一项非常精细的工作，更需要专门的“分子工具”。 限制性内切核酸酶：准确切割DNA分子，得到所需要的目的基因。 DNA连接酶的特征：能将目的基因连接到载体上。 载体的特征：能将目的基因导入受体细胞中。 转基因番木瓜（左）与非转基因番木瓜（右） 限制性内切核酸酶、DNA连接酶，载体。 科学家究竟用到了哪些“分子工具”？ 这些“分子工具”各具有什么特征呢？ SW生老师 理论基础 DNA的基本组成单位相同(都是四种脱氧核苷酸) 都遵循碱基互补配对原则 DNA分子的空间结构都是规则的双螺旋结构 理论基础 基因是控制生物性状的结构与功能单位 遗传信息传递都遵循中心法则 所有生物几乎共用一套遗传密码 二、基因工程的理论基础 复制 SW生老师 培育抗番木瓜环斑病毒的木瓜 抗番木瓜环斑病毒基因提取 抗番木瓜环斑病毒基因与载体DNA连接 抗番木瓜环斑病毒基因导入受体细胞 “分子手术刀” “分子缝合针” “分子运输车” 三、基因工程的基本工具 SW生老师 （1）来源：主要从原核生物中分离出来。 （2）种类：约4000种。 （3）作用： 磷酸二酯键 限制酶识别序列的长度一般为4-8个或其他数量的核苷酸，最常见的为6个核苷酸。 1.限制性内切核酸酶——“分子手术刀” 识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。 SW生老师 EcoR Ⅰ + 1.限制性内切核酸酶——“分子手术刀” SW生老师 （4）识别序列的特点：呈现碱基互补对称，无论是奇数个碱基还是偶数个碱基，都可以找到一条中心轴线，中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的。 1.限制性内切核酸酶——“分子手术刀” SW生老师 常见的限制酶剪切示意图 （5）结果： 产生黏性末端或平末端 SW生老师 (1)作用：将 “缝合”起来，恢复被 切开的两个核苷酸之间的______________。 双链DNA片段 限制酶 磷酸二酯键 DNA连接酶 + 2.DNA连接酶——“分子缝合针” SW生老师 2.DNA连接酶——“分子缝合针” SW生老师 类型 E.coli DNA连接酶 T4 DNA连接酶 来源 ____________ ____________ 功能 缝合____________和____________，但E.coli DNA连接酶缝合平末端的 效率远低于T4DNA连接酶 结果 恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的_________________ 大肠杆菌 T4噬菌体 黏性末端 平末端 磷酸二酯键 2.DNA连接酶——“分子缝合针” SW生老师 与DNA相关的五种酶的比较 名称 作用部位 作用结果 限制酶 磷酸二酯键 将DNA切成两个片段 DNA连接酶 磷酸二酯键 将两个DNA片段连接为一个DNA分子 DNA聚合酶 磷酸二酯键 将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端 DNA(水解)酶 磷酸二酯键 将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸 解旋酶 碱基对之间的氢键 将双链DNA分子局部解旋为单链，形成两条长链 2.DNA连接酶——“分子缝合针” SW生老师 载体的作用 最常用载体：质粒 将外源基因送入受体细胞。 裸露、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA外，具有自我复制能力的环状双链DNA。 在基因工程操作中，真正被用作载体的质粒都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。 大肠杆菌及质粒结构模式图 3.基因进入受体细胞的载体——“分子运输车” SW生老师 目的基因是一个DNA片段，不含有复制原点、不含有启动子和终止子。 为什么需要载体 思考：形成一个重组质粒会形成几个磷酸二酯键？ 四 3.基因进入受体细胞的载体——“分子运输车” SW生老师 种类：质粒、噬菌体、动植物病毒等。 它们的来源不同，在大小、结构、复制方式以及可以插入外源DNA片段的大小上也有很大差别。 载体必须具备的条件 ①具一个至多个限制酶切割位点，供外源DNA片段（基因）插入其中。 ②能够在宿主细胞中自我复制或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制。 ③具有某些标记基因，便于重组DNA分子的筛选。 标记基因通常有 抗生素的抗性基因，如：抗氨苄青霉素基因(ampr)、抗四环素基因(tetr)。 荧光蛋白基因，如：绿色荧光蛋白基因(GFP)、红色荧光蛋白基因(RFP)。 3.基因进入受体细胞的载体——“分子运输车” SW生老师 DNA的粗提取与鉴定 实践·探究 DNA含量相对较高的生物组织，如新鲜洋葱、香蕉、菠菜、菜花和猪肝等。 （注意：不能选择哺乳动物成熟的红细胞，因为哺乳动物成熟的红细胞中没有细胞核和线粒体，几乎不含DNA。） 材料用具 1.选材： 2.试剂： ①研磨液 ②体积分数为95%的酒精 ③2mol/L 的NaCl溶液 ④二苯胺试剂 ⑤蒸馏水 ——溶解并提取DNA ——析出DNA ——溶解DNA ——鉴定DNA，要现配现用 SW生老师 称取 ，切碎，放入研钵，倒入 ，充分研磨。 在漏斗中垫上纱布过滤研磨液，4℃冰箱中静置后取 ；或将研磨液倒入塑料离心管中离心，取 。 在上清液中加入体积相等的、 溶液, 静置2~3min，溶液中出现的 就是粗提取的DNA 。 2.去除杂质—— 3.DNA的析出—— 1.破碎细胞—— 洋葱 研磨液 上清液 上清液 预冷的酒精 白色丝状物 方法步骤 思考：如何评价结果？ ——看提取物颜色 ——看与二苯胺反应颜色的深浅 DNA纯度 DNA的量 用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物；或将溶液倒入塑料离心管中离心，取沉淀物晾干。 SW生老师 将丝状物或沉淀物溶于 溶液中，加入 试剂，混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min 4.DNA的鉴定—— 对照组：如何设置？ 二苯胺 阴性对照： 在等体积的NaCl溶液中加入二苯胺试剂，将试管置于同等沸水浴中加热5min 2mol/L的NaCl 方法步骤 SW生老师 （1）选什么样的材料实验更易成功？用洋葱做材料，为什么要充分研磨？ （2）猪血和鸡血，哪个适合用作提取DNA的材料？操作时如何防止血液凝固？ （3）如果用鸡血动物细胞做材料，也需要研磨裂解释放细胞中的DNA吗？ 猪血（哺乳动物的成熟红细胞）无细胞核，不适合； 鸡血中红细胞有核DNA，且核DNA的量较多，适合。 含DNA的生物材料都可以，选取DNA含量相对较高的生物组织，成功率更大。 充分研磨，可以破坏细胞壁，裂解细胞，释放DNA。 加入清水，让细胞吸水胀破，释放DNA。 思考与讨论： 如果是猪肝呢？ 鸡血中加入柠檬酸钠，可防止血液凝固。 SW生老师 课堂总结 SW生老师 1.DNA连接酶是重组DNA技术常用的一种工具酶。下列相关叙述正确的是（ ） A.能连接DNA分子双链碱基对之间的氢键 B.能将单个脱氧核苷酸加到DNA片段的末端，形成磷酸二酯键 C.能连接用同种限制酶切开的两条DNA片段，重新形成磷酸二酯键 D.只能连接双链DNA片段互补的黏性末端，不能连接双链DNA片段的平末端 2.在重组DNA技术中，将外源基因送入受体细胞的载体可以是( ) A.大肠杆菌的质粒 B.切割DNA分子的酶 C.DNA片段的黏性末端 D.用来识别特定基因的DNA探针 课堂练习 C A SW生老师 $$