2025届高三生物二轮复习课件PCR技术模块复习

PCR技术专题复习 目的基因的获取 生物材料 人工合成 获取目的基因 DNA cDNA 一定大小范围的DNA PCR mRNA 基因组文库 cDNA文库 基因文库 包括 限制酶切割 逆转录 导入受体菌中保存 体外快速扩增DNA的技术 PCR技术 DNA模板 4种脱氧核苷酸 引物 耐高温的DNA聚合酶 缓冲液 一、PCR反应体系 移液器 PCR管 PCR仪 PCR板 PCR技术 DNA模板 4种脱氧核苷酸 引物 耐高温的DNA聚合酶 步骤1变性（高温）：DNA解旋为单链 步骤2复性（降温）：引物与单链DNA结合 步骤3延伸：耐高温的DNA聚合酶从引物3’进行子链的合成 缓冲液 二、PCR反应过程 4种脱氧核苷酸 4种脱氧核苷酸 引物 复性 PCR 反应需要在高温条件下进行变性 ，耐高温的 DNA 聚合酶能在高温环境中保持活性，保证 PCR 反应的正常进行。     延伸 所有的DNA聚合酶都有一个共同的特点即不能自主的进行DNA复制,只能利用已有的核苷酸3’端合成DNA的子链. 引物的作用 问题1：DNA复制为什么需要引物？ 是DNA聚合酶识别和结合的位点，使DNA聚合酶从3’端连接脱氧核糖核苷酸。 引物的方向：5’ 3’ 需要1对引物（2种），且方向相对 F2、F4 人的血清白蛋白(HSA)在临床上需求量很大，通常从人血中提取。但由于艾滋病病毒(HIV)等人类感染性病原体造成的威胁与日俱增,使人们对血液制品顾虑重重。图一是以基因工程技术获取HSA的两条途径，其中报告基因表达的产物能催化无色物质K呈现蓝色。图二为HSA基因两侧的核苷酸序列。图三为相关限制酶的识别序列和切割位点。据图回答下列问题: (2)采用PCR技术扩增HSA基因，根据其两端序列，则需要选择的一对引物序列是                         。 3’ 5’ 3’-TAAGAG-5’引物 引物5’-AATGGA-3’ 5’-GAGAAT-3’ 5’-AATGGA-3’ （2024·T8联考）  (16分)马铃薯是粮食、蔬菜和食品工业的原料,是世界上许多国家重要的食品之一,其地位仅次于水稻、玉米和小麦。2023年,我国马铃薯种植面积达3300至3400万亩，产量达5000至5200万吨。西北地区是我国马铃薯的重要产区,但干旱严重影响其产量。某科研机构拟把某种细菌体内的抗旱基因(SILOB40)转移到马铃薯细胞中,提高马铃薯的抗旱能力。回答下列问题。 (1)从基因文库中得知,SILOB40编码区从首端到尾端的序列为3'-TACGAG...(588个碱基)...TAGATT-5'。为了能从该细菌基因组中扩增出SILOB40,需要人工合成相应的引物。已合成引物I的序列是5'-ATGCTC-3' ,则引物Ⅱ的序列是5'-              -3'。 引物的作用是使DNA聚合酶从引物的         端开始连接脱氧核苷酸,扩增引物对之间的DNA片段。 3'-TACGAG...(588个碱基)...TAGATT-5' 5’ 3’ 3’-TAGATT-5’引物Ⅱ 引物I5’-ATGCTC-3’ TTAGAT 3' （2023·江苏·高考真题）为了将某纳米抗体和绿色荧光蛋白基因融合表达，运用重组酶技术构建质粒，如图1所示。请回答下列问题：  (1)分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时，配制的两个反应体系中不同的有      ，扩增程序中最主要的不同是      。（考点：PCR技术） (2)有关基因序列如图2．引物F2-F、F1-R应在下列选项中选用______。（考点：引物设计） A．ATGGTG------CAACCA   B．TGGTTG------CACCAT  C．GACGAG------CTGCAG     D．CTGCAG------CTCGTC’ DNA模版、引物 扩增的时间 3’ 5’ 5’ 3’ 引物F2-F5’-GACGAG................................CTGCAG3’ 3’-CTGCTC................................GACGTC-5’引物F1-R C、D 问题2：如果目的基因两侧没有限制酶酶切位点，如何通过引物去解决？ 限制酶识别序列 限制酶识别序列 影响DNA迁移速率的因素 a.凝胶的浓度 b.DNA分子大小和构像 c.电压大小 在碱性缓冲溶液中，DNA分子带负电，电泳时DNA从负极向正极迁移。 电源 + 电泳槽 琼脂糖凝胶 样品孔 缓冲液 — 常采用琼脂糖凝胶电泳技术。 三、PCR扩增产物的鉴定 电泳结果的显示 在同一浓度的凝胶中，片段越小，迁移速率越快。 三、PCR扩增产物的鉴定 通过已知序列设计引物，从而扩增已知序列两侧的未知序列。 1.反向PCR 操作步骤： ①利用限制酶剪切两端 ②DNA连接酶将DNA片段环化。 ③再利用已知序列的两个末端设计一对引物。 注意：因为是环形DNA，引物1和引物2相对于已知序列是反向配置的，但相对于两侧的未知序列，却是相向配置的。 ④对引物做PCR扩增，那么它将会以未知序列为模板，将未知序列和已知序列（部分）都扩增出来。 四、PCR的类型和应用 （2025年山东卷） 25．（12分）种子休眠是抵御穗发芽的一种机制。通过对Ti质粒的改造，利用农杆菌转化法将Ti质粒上的T-DNA随机整合到小麦基因组中，筛选到2个种子休眠相关基因的插入失活纯合突变体。与野生型相比，突变体种子的萌发率降低。小麦基因组序列信息已知。 （2）为证明这两个突变体是由于T-DNA插入到小麦基因组中同一基因导致的，提取基因组DNA，经酶切后产生含有T-DNA的基因组片段（图乙）。在此酶切过程中，限于后续PCR难以扩增大片段DNA，最好使用识别序列为___________（填“4”“6”或“8”）个碱基对的限制酶，且T-DNA中应不含该酶的酶切位点。需首先将图乙的片段_____，才能利用引物P1和P2成功扩增未知序列。PCR扩增出未知序列后，进行了一系列操作，其中可以判断出2条片段的未知序列是否属于同一个基因的操作为___________（填“琼脂糖凝胶电泳”或“测序和序列比对”）。 4 环化 测序和序列比对 （2025年1月浙江卷）24.(12分)3-磷酸甘油脱氢酶(GPD)是酵母细胞中甘油合成的关键酶。利用某假丝酵母习菌株为材料，克隆具有高效催化效率的3-磷酸甘油脱氢酶的基因(Gpd)。采用的方案是:先通过第1次PCR扩增出该基因的中间部分，再通过第2次PCR分别扩增出该基因的两侧，经拼接获得完整基因的序列，如图所示: (3)为获得完整的Gpd基因，分别用限制性核酸内切酶Pst和Sall单酶切基因组DNA后，各自用DNA连接酶连接形成环形DNA，再用苯酚-氯仿抽提除去杂质，最后加入冷的95%酒精沉淀环形DNA.根据第一次 PCR产物测定获得的序列，重新设计一对引物，以环形DNA为模板进行第二次PCR，最后进行测序。用于第二次PCR的一对引物，其序列应是DNA链上的 (A.P1 和P2 B.P3和P4 C.P1和P4 D.P2和P3) D （2020年江苏高考题）如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR的方法，简捷地分析出已知序列两侧的序列，具体流程如图(以EcoR I 酶切为例): (3)若如表所列为已知的DNA序列和设计的-些PCR引物，步骤Ⅲ选用的PCR引物必须是 (从引物①②③④中选择，填编号)。 5’ 3’ 5’-GCAATGCGTAGCCTCT-3’ 3’-TTGATACGCGAGTACT-5’ ②④ 农杆菌Ti质粒上的 T-DNA 可以转移并随机插入到被侵染植物的 DNA 中。研究者将图 1中被侵染植物的 DNA 片段连接成环，并以此环为模板进行 PCR，扩增出 T-DNA 插入位置两侧的未知序列，以此可确定 T-DNA 插入的具体位置。下列说法不正确的是（　　） A.PCR 扩增依据的是 DNA 分子双链复制的原理 B.进行PCR扩增需要热稳定DNA聚合酶 C.利用图中的引物②、③组合可扩增出两侧的未知序列 D.通过与受体细胞的基因组序列比对，可确定T-DNA的插入位置 5’ 3’ 5’ 3’ C ①④ （台州模拟试题）反向PCR是一种通过已知序列设计引物对未知序列进行扩增的技术，其过程如下图所示。下列叙述正确的是（   ） A．应选择引物1和引物4进行PCR扩增 B．设计的引物中GC碱基含量越高，退火的温度越低 C．PCR产物是包含所有已知序列和未知序列的环状DNA分子 D．整个过程需用到限制酶、DNA连接酶、耐高温DNA聚合酶及逆转录酶 5’ 3’ GC含量高（含有3个氢键），稳定性强，退火温度越高 X 剪切 连接环化 PCR扩增 X 部分已知序列 A 已知序列 四、PCR的类型和应用 2.大引物PCR 3.重叠延伸PCR 应用 实现基因定点突变 方法1：大引物PCR 方法1：大引物PCR IKK激酶参与动物体内免疫细胞的分化。临床上发现某重症联合免疫缺陷(SCID)患儿IKK基因编码区第1183位碱基T突变为C,导致IKK上第395位酪氨酸被组氨酸代替。为研究该患儿发病机制,研究人员利用纯合野生鼠应用大引物PCR定点诱变技术培育出SCID模型小鼠(纯合),主要过程如图甲、乙。分析回答下列问题:  (1)在PCR反应体系中，除需加入引物、IKK基因、缓冲液、Mg2+等外，还需加入 。 (2)在图甲获取突变基因过程中，需要以下3种引物: . 则PCR1中使用的引物有 ， PCR2中使用的引物有 。和图中大引物的_ (填“①” 或“②" )链。 耐高温的DNA聚合酶、4种脱氧核糖核苷酸 IKK激酶参与动物体内免疫细胞的分化。临床上发现某重症联合免疫缺陷(SCID)患儿IKK基因编码区第1183位碱基T突变为C,导致IKK上第395位酪氨酸被组氨酸代替。为研究该患儿发病机制,研究人员利用纯合野生鼠应用大引物PCR定点诱变技术培育出SCID模型小鼠(纯合),主要过程如图甲、乙。分析回答下列问题:  (2)在图甲获取突变基因过程中，需要以下3种引物: . 则PCR1中使用的引物有 ， PCR2中使用的引物有 和图中大引物的_ (填“①” 或“②" )链。 引物A 引物C 5’ 5’ 5’ 3’ 5’ 大引物② 引物B 引物A、引物B 引物C ② 方法2：重叠延伸PCR 水蛭素是一种蛋白质，可用于预防和治疗血栓。某科研团队运用重叠延伸PCR技术在水蛭素基因中的特定位点引入特定突变，使水蛭素第47位的天冬酰胺(密码子为AAC、AAU)替换为赖氨酸(密码子为AAA、AAG)，从而提高水蛭素的抗凝血活性。原理见下图。 (1)若拟突变位点的碱基对为A—T，则需要让其突变为__________才能达到目的。引物2的突变位点(突起处)应设计为_________(假设引物为单链DNA)。 T—A或C—G A或G　 拟突变位点:A—T AAU AAA 或AAU AAG 基因: 密码子: A T 基因: A C A T或C 水蛭素是一种蛋白质，可用于预防和治疗血栓。某科研团队运用重叠延伸PCR技术在水蛭素基因中的特定位点引入特定突变，使水蛭素第47位的天冬酰胺(密码子为AAC、AAU)替换为赖氨酸(密码子为AAA、AAG)，从而提高水蛭素的抗凝血活性。原理见下图。 (1)若拟突变位点的碱基对为A—T，则需要让其突变为__________才能达到目的。引物2的突变位点(突起处)应设计为_________(假设引物为单链DNA)。 (2)在第一阶段获得两种具有重叠片段DNA的过程中，引物1、引物2组成的反应系统和引物3、引物4组成的反应系统中均进行一次复制，共产生____种DNA分子。该阶段必须将引物1、2和引物3、4置于不同反应系统中，这是因为__________________。 T—A或C—G 　引物2和3中存在互补配对片段，置于同一反应系统时会发生碱基互补配对，导致引物失去作用　 3 A或G　 产生的DNA分子相同 $$