第九单元 生物技术与工程-（教师用书）【赢在微点·顶层设计】2026年高中生物学高考一轮总复习（多选版）

选择性必修3生物技术与工程 第九单元 生物技术与工程 第37讲　传统发酵技术的应用与发酵工程 [课标内容]　1.举例说明日常生活中的某些食品是运用传统发酵技术生产的。2.阐明发酵工程利用现代工程技术及微生物的特定功能,工业化生产人类所需产品。3.举例说明发酵工程在食品、医药、农牧业及其他方面上有重要的应用价值。 微考点大突破 考点一　传统发酵技术的应用 　 1.发酵与传统发酵技术 (1)发酵:指人们利用微生物,在适宜的条件下,将原料通过微生物的代谢转化为人类所需要的产物的过程。 (2)传统发酵技术。 2.制作腐乳 (1)原理:蛋白质小分子的肽和氨基酸。 (2)腐乳制作过程中参与的微生物:多种微生物参与了豆腐的发酵,如酵母、曲霉和毛霉等,其中起主要作用的是毛霉。 3.制作泡菜 (1)菌种:制作传统泡菜是利用植物体表面天然的乳酸菌来进行发酵的。常见的乳酸菌有乳酸链球菌和乳酸杆菌。其中乳酸杆菌常用于生产酸奶。 (2)制作原理。 ①发酵实质:在无氧情况下,乳酸菌将葡萄糖分解成乳酸。 ②反应式:C6H12O62C3H6O3(乳酸)+能量。 (3)制作流程。 (4)注意事项。 要点 内容 材料 ①蔬菜应新鲜,若不新鲜,蔬菜中的硝酸盐易被还原成亚硝酸盐;②用清水和食盐配制质量分数为5%~20%的盐水,并煮沸冷却待用。盐水煮沸有两大作用,一是除去水中氧气,二是杀灭细菌 防止杂 菌污染 每次取样用具要洗净,取样后要迅速封口 氧气 需求 泡菜坛要选择透气性差的容器,坛盖边沿水槽注满水,发酵过程中要经常补充水槽中的水,以创造无氧环境 温度 室温即可。温度过高则易滋生细菌,过低则使发酵时间延长 4.制作果酒和果醋 (1)果酒、果醋制作的比较。 项目 果酒制作 果醋制作 种类 酵母菌 醋酸菌 结构 特点 有以核膜为界限的细胞核,有多种细胞器 无以核膜为界限的细胞核,只有核糖体一种细胞器 代谢 类型 异养兼性厌氧型 异养需氧型 发酵 原理 氧气充足时,酵母菌进行有氧呼吸,大量繁殖;无氧条件下,酵母菌进行无氧呼吸,产生酒精 氧气、糖源都充足时,醋酸菌将糖分解成乙酸;氧气充足,缺少糖源时,醋酸菌直接将乙醇转化为乙醛,再将乙醛转化为乙酸 反应 简式 C6H12O6+6O2+6H2O6CO2+12H2O+能量; C6H12O62C2H5OH+2CO2+能量 C6H12O6+2O22CH3COOH+2CO2+2H2O+能量; C2H5OH+O2CH3COOH+H2O+能量 温度 18~30 ℃ 30~35 ℃ 时间 10~12天 7~8天 氧气 前期需氧,后期不需氧 一直需要充足氧气 pH 酸性 酸性 结果 检测 酒精与酸性的重铬酸钾溶液反应呈现灰绿色 反应液pH下降 制作 流程 联系 醋酸发酵可以在酒精发酵的基础上进行,酒精发酵为醋酸发酵提供原料 (2)果酒、果醋制作成功的关键分析。 ①材料的选择与处理。选择新鲜的葡萄,榨汁前先冲洗,后去枝梗,以防杂菌污染。 ②防止发酵液被污染。将发酵瓶、榨汁机等器具用洗洁精清洗干净,并用体积分数为70%的酒精消毒,晾干备用;装入葡萄汁后要盖好瓶盖。 ③将葡萄汁装入发酵瓶时,要留约1/3的空间,目的是先让酵母菌进行有氧呼吸,快速繁殖,耗尽O2后再进行酒精发酵;防止发酵过程中产生的大量CO2造成发酵液溢出。 (1)传统发酵以混合菌种的固体发酵及半固体发酵为主,通常是家庭式或作坊式的。(源自选择性必修3 P5)(√) (2)乳酸菌是在有氧条件下能将葡萄糖分解成乳酸的一类细菌的总称。(源自选择性必修3 P5)(×) (3)酵母菌是厌氧微生物,在无氧条件下能进行酒精发酵。(源自选择性必修3 P6)(×) (4)膳食中的亚硝酸盐一般不会危害人体健康,但如果人体摄入过量,会发生中毒,甚至死亡。(选择性必修3 P6“探究·实践”)(√) (5)工业上大规模生产时,通常会先通过微生物培养技术获得单一菌种,再将它们接种到物料中进行发酵。(源自选择性必修3 P8)(√) (6)泡菜的制作前期需要通入氧气,后期应严格保持无氧条件,发酵微生物乳酸菌发酵产生了乳酸和CO2。(选择性必修3 P8“练习与应用”)(×) 黄酒是世界上最古老的酒类之一,与啤酒、葡萄酒并称世界三大古酒。古遗六法中描述道:“黍米必齐,曲蘖必时,水泉必香,陶器必良,湛炽必洁,火剂必得”。“曲蘖”主要指酒曲,“湛炽”是指浸泡和蒸煮,回答下列问题: (1)“陶器必良”和“火剂必得”的目的是什么? 答:控制发酵过程的氧气和温度等条件。 (2)黄酒发酵过程中,不需要对黍米和陶器装置进行严格灭菌,却可以防止其他杂菌对发酵产生影响,为什么? 答:在缺氧、呈酸性的发酵液中,酵母菌可以生长繁殖,而绝大多数其他微生物都因无法适应这一环境而受到抑制(且发酵产生的酒精对其他杂菌也有毒害作用)。 (3)“陈储”是指将榨出的黄酒放入储酒罐内存放待用,“陈储”要特别注意密封,为什么? 答:若密封不好,醋酸菌容易将酒精转化为乙酸,使黄酒变质(合理即可)。 (4)黄酒的酒精度数一般为15度左右,酒精度数无法继续提高可能的原因是什么? 答:酒精浓度升高导致酵母菌活性下降。 能力一　果酒和果醋制作的原理和过程分析(考查科学思维、科学探究) 1.(2021·山东卷,T12)葡萄酒的制作离不开酵母菌。下列说法错误的是(D) A.无氧条件下酵母菌能存活但不能大量繁殖 B.自然发酵制作葡萄酒时起主要作用的菌是野生酵母菌 C.葡萄酒的颜色是葡萄皮中的色素进入发酵液形成的 D.制作过程中随着发酵的进行发酵液中糖含量增加 解析　无氧条件下酵母菌进行无氧呼吸,产生酒精和二氧化碳及少量能量,繁殖能力弱,能存活但不能大量繁殖,A项正确;自然发酵制作葡萄酒时,起主要作用的是葡萄表面存留的野生酵母菌,B项正确;葡萄皮中含有丰富的色素,发酵过程中,这些色素释放出来使葡萄酒显示相应的颜色,C项正确;酿酒过程中,酵母菌进行呼吸作用的底物是葡萄糖,发酵液中的糖由于不断消耗而不断减少,D项错误。 2.(2024·湖北卷,T1)制醋、制饴、制酒是我国传统发酵技术。醋酸菌属于好氧型原核生物,常用于食用醋的发酵。下列叙述错误的是(D) A.食用醋的酸味主要来源于乙酸 B.醋酸菌不适宜在无氧条件下生存 C.醋酸菌含有催化乙醇氧化成乙酸的酶 D.葡萄糖在醋酸菌中的氧化分解发生在线粒体内 解析　当O2、糖源都充足时,醋酸菌能将葡萄糖分解成乙酸;当缺少糖源时,则醋酸菌在相关酶的作用下,直接将乙醇转化为乙醛,再将乙醛变为乙酸,食用醋的酸味主要来源于乙酸,A、C两项正确。醋酸菌属于好氧型原核生物,不适宜在无氧条件下生存,B项正确。醋酸菌是原核生物,不含线粒体,D项错误。 (1)果酒发酵初期先通入适量空气的目的是让酵母菌进行有氧呼吸,大量繁殖,果酒发酵之后进行果醋发酵,需要改变的条件包括菌种改为醋酸菌,发酵温度调整为30~35 ℃,通入空气等。  (2)在醋酸发酵阶段,醋酸菌在氧气和糖源都充足时,在其细胞的细胞质基质中将糖分解成醋酸。 (3)发酵过程用到的两种菌在结构上的本质区别:酵母菌有由核膜包被的细胞核。 能力二　泡菜的制作过程分析(考查科学思维) 3.(2023·山东卷,T12)以下是以泡菜坛为容器制作泡菜时的4个处理:①沸盐水冷却后再倒入坛中;②盐水需要浸没全部菜料;③盖好坛盖后,向坛盖边沿的水槽中注满水;④检测泡菜中亚硝酸盐的含量。下列说法正确的是(C) A.①主要是为了防止菜料表面的醋酸杆菌被杀死 B.②的主要目的是用盐水杀死菜料表面的杂菌 C.③是为了使气体只能从泡菜坛排出而不能进入 D.④可检测到完整发酵过程中亚硝酸盐含量逐渐降低 解析　①煮沸盐水是为了杀灭盐水中的微生物,去除水中的溶解氧,冷却主要是为了防止杀死菜料表面的乳酸菌,A项错误;②的主要目的是创造无氧环境,B项错误;③是为了使气体只能从泡菜坛排出而不能进入,给泡菜坛内创造无氧环境,C项正确;④检测到的亚硝酸盐含量变化是先增后减,D项错误。 在用质量分数为5%的食盐水制作泡菜时,在不同时间测定了泡菜中亚硝酸盐的含量,结果见曲线图: 据图可知,发酵过程中,亚硝酸盐的含量先增加后下降至相对稳定,10天后食用比较合适,因为此时亚硝酸盐含量低。 4.(多选)某团队为探究制作泡菜所用盐水的最佳质量分数,进行了探究实验。为方便测定泡菜中的亚硝酸盐浓度,先用配置好的已知浓度的亚硝酸盐溶液做了吸光度测试,结果如图甲。再分别以不同质量分数的盐溶液制作泡菜,从第三天开始,每两天测一次亚硝酸盐含量,结果如图乙,下列说法正确的是 (ABD) A.使用5%质量分数的盐水制作泡菜的第7天,取泡菜液测出的吸光度约为0.46A B.如用7%质量分数的盐水制作泡菜可能会导致“咸而不酸” C.5天时,亚硝酸盐的含量最高,此时乳酸菌成为优势菌种 D.适量加入“陈泡菜水”可缩短泡菜酿造周期 解析　使用5%质量分数的盐水制作泡菜的第7天,亚硝酸盐的浓度为0.4 mg/L,此时取泡菜液测出的吸光度约为0.98×0.4+0.07≈0.46(A),A项正确;如用7%质量分数的盐水制作泡菜可能会导致“咸而不酸”,因为盐浓度过高,抑制了乳酸菌的发酵,B项正确;5天时,亚硝酸盐的含量最高,此时乳酸菌和乳酸的量都比较少,乳酸菌还不是优势菌种,C项错误;适量加入“陈泡菜水”可增加乳酸菌的数量,可缩短泡菜酿造周期,D项正确。 考点二　发酵工程及其应用 　 1.发酵工程的概念 利用微生物的特定功能,规模化生产人类所需产品的综合性生物工程。 2.发酵工程的基本环节 提醒　传统发酵技术得到的产品一般不进行分离、提纯,而发酵工程得到的产品需根据发酵产品类型进行分离、提纯。 3.啤酒的工业化生产流程及操作目的 4.发酵工程的特点 5.发酵工程的应用 (1)性状优良的菌种可以从自然界中筛选出来,也可以通过杂交育种或基因工程育种获得。(选择性必修3 P22“图1-9”)(×) (2)发酵工程中一旦有杂菌污染,可能导致产量大大下降。因此培养基和发酵设备都必须经过严格的消毒。(选择性必修3 P23“图1-9”)(×) (3)分离、提纯产物是发酵工程的中心环节。(选择性必修3 P23“图1-9”)(×) (4)啤酒的发酵过程分为主发酵和后发酵两个阶段。酵母菌的繁殖、大部分糖的分解和代谢物的生成都在后发酵阶段完成。(选择性必修3 P24“思考·讨论”)(×) (5)柠檬酸是一种广泛应用的食品酸度调节剂,它可以通过黑曲霉的发酵制得;由谷氨酸棒状杆菌发酵得到谷氨酸,谷氨酸经过一系列处理就能制成味精。(源自选择性必修3 P25)(√) 为什么不能用含有抗生素的牛奶发酵制作酸奶? 答:抗生素能够杀死乳酸菌或抑制乳酸菌的生长,因此不能用含有抗生素的牛奶发酵制作酸奶。 能力　发酵工程及其应用(考查科学思维) 1.(2022·湖北卷,T14)废水、废料经加工可变废为宝。某工厂利用果糖生产废水和沼气池废料生产蛋白质的技术路线如图所示。下列叙述正确的是(A) A.该生产过程中,一定有气体生成 B.微生物生长所需碳源主要来源于沼气池废料 C.该生产工艺利用微生物厌氧发酵技术生产蛋白质 D.沼气池废料和果糖生产废水在加入反应器之前需要灭菌处理 解析　连续搅拌反应器是为了使菌体进行有氧呼吸,快速生长繁殖,即该生产过程一定有气体生成,A项正确;微生物生长所需碳源主要来源于果糖生产废水中的含碳有机物,B项错误;由题图中“连续搅拌反应器”可知,该生产工艺利用微生物有氧发酵技术生产蛋白质,C项错误;杂菌对利用酿酒酵母生产蛋白质的生产工艺过程无较大影响,故不需要对加入反应器的原料进行灭菌处理,D项错误。 2.(2021·广东卷,T21)中国科学家运用合成生物学方法构建了一株嗜盐单胞菌H,以糖蜜(甘蔗榨糖后的废弃液,含较多蔗糖)为原料,在实验室发酵生产PHA等新型高附加值可降解材料,期望提高甘蔗的整体利用价值。工艺流程如图。 回答下列问题: (1)为提高菌株H对蔗糖的耐受能力和利用效率,可在液体培养基中将蔗糖作为唯一碳源,并不断提高其浓度,经多次传代培养(指培养一段时间后,将部分培养物转入新配的培养基中继续培养)以获得目标菌株。培养过程中定期取样并用稀释涂布平板的方法进行菌落计数,评估菌株增殖状况。此外,选育优良菌株的方法还有诱变育种、基因工程育种(答出两种方法即可)等。 (2)基于菌株H嗜盐、酸碱耐受能力强等特性,研究人员设计了一种不需要灭菌的发酵系统,其培养基盐浓度设为60 g/L,pH为10,菌株H可正常持续发酵60 d以上。该系统不需要灭菌的原因是盐浓度为60 g/L的条件下,其他杂菌因失水过多而死亡;pH为10的条件下,其他杂菌的酶变性失活,生长繁殖受抑制(答出两点即可)。  (3)研究人员在工厂进行扩大培养,在适宜的营养物浓度、温度、pH条件下发酵,结果发现发酵液中菌株H细胞增殖和PHA产量均未达到预期,并产生了少量乙醇等物质,说明发酵条件中氧气(O2或溶解氧)可能是高密度培养的限制因素。 (4)菌株H还能通过分解餐厨垃圾(主要含蛋白质、淀粉、油脂等)来生产PHA,说明其能分泌蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等。 解析　(1)根据题意分析,该实验的目的是提高菌株H对蔗糖的耐受能力和利用效率,结合微生物的代谢需求,其液体培养基应该以蔗糖作为唯一碳源,并不断提高其浓度,经多次传代培养以获得目标菌株。培养过程中定期取样并用稀释涂布平板的方法进行菌落计数,评估菌株增殖状况。此外,选育优良菌株的方法还有诱变育种、基因工程育种等。(2)已知,菌株H具有嗜盐、酸碱耐受能力强等特性,因此当培养基盐浓度为60 g/L,pH为10时,菌株H可正常持续发酵60 d以上,而盐浓度为60 g/L的条件下,其他杂菌因失水过多而死亡;pH为10的条件下,其他杂菌的酶变性失活,生长繁殖受抑制,故该系统不需要灭菌。(3)分析题意,扩大培养时,营养物浓度、温度、pH等条件均适宜,而发酵液中菌株H细胞增殖和PHA产量均未达到预期,并产生了少量乙醇等物质,说明发酵条件中氧气不足,使菌种进行无氧呼吸产生乙醇,即氧气(O2或溶解氧)是限制高密度培养的重要因素。(4)根据酶的专一性可知,菌株H之所以能通过分解主要含蛋白质、淀粉、油脂等的餐厨垃圾来生产PHA,说明其能分泌蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等。 微真题重体悟 　 1.(2024·山东卷,T14)在发酵过程中,多个黑曲霉菌体常聚集成团形成菌球体,菌球体大小仅由菌体数量决定。黑曲霉利用糖类发酵产生柠檬酸时需要充足的氧。菌体内铵离子浓度升高时,可解除柠檬酸对其合成途径的反馈抑制。下列说法错误的是(D) A.相同菌体密度下,菌球体越大柠檬酸产生速率越慢 B.发酵中期添加一定量的硫酸铵可提高柠檬酸产量 C.发酵过程中pH下降可抑制大部分细菌的生长 D.发酵结束后,将过滤所得的固体物质进行干燥即可获得柠檬酸产品 解析　黑曲霉利用糖类发酵产生柠檬酸时需要充足的氧,相同菌体密度下,菌球体越大越不利于菌体与氧气接触,柠檬酸产生速率越慢,A项正确;菌体内铵离子浓度升高时,可解除柠檬酸对其合成途径的反馈抑制,发酵中期添加一定量的硫酸铵,提高铵离子浓度,菌体内可提高柠檬酸产量,B项正确;发酵过程中pH下降导致细菌生命活动所必需的酶失活,可抑制大部分细菌的生长,C项正确;发酵结束后,将过滤所得的固体物质进行分离、纯化、浓缩、干燥等一系列操作后才能获得柠檬酸产品,D项错误。 2.(2021·辽宁卷,T8)利用菠萝蜜制作果醋的大致流程为:先在灭菌的果肉匀浆中接种酵母菌,发酵6天后,再接入活化的醋酸杆菌,发酵5天。下列有关叙述错误的是(B) A.乙醇既是醋酸发酵的底物,又可以抑制杂菌繁殖 B.酵母菌和醋酸杆菌均以有丝分裂的方式进行增殖 C.酵母菌和醋酸杆菌发酵过程中控制通气的情况不同 D.接入醋酸杆菌后,应适当升高发酵温度 解析　当缺少糖源时,醋酸杆菌将乙醇转化为乙醛,再将乙醛转化为乙酸,同时乙醇还可以抑制杂菌繁殖,A项正确;酵母菌既可以进行无性繁殖又可以进行有性繁殖,醋酸杆菌以二分裂的方式进行增殖,B项错误;酵母菌发酵过程中先通气使其大量繁殖,再密闭发酵产乙醇,醋酸杆菌为好氧细菌,需持续通入无菌氧气,C项正确;酿酒酵母的最适生长温度约为28 ℃,多数醋酸杆菌的最适生长温度为30~35 ℃,D项正确。 3.(多选)(2024·河北卷,T18)中国传统白酒多以泥窖为发酵基础,素有“千年老窖万年糟”“以窖养糟,以糟养泥”之说。多年反复利用的老窖池内壁窖泥中含有大量与酿酒相关的微生物。下列叙述正确的是 (ABD) A.传统白酒的酿造是在以酿酒酵母为主的多种微生物共同作用下完成的 B.窖池内各种微生物形成了相对稳定的体系,使酿造过程不易污染杂菌 C.从窖泥中分离的酿酒酵母扩大培养时,需在CO2或N2环境中进行 D.从谷物原料发酵形成的酒糟中,可分离出产淀粉酶的微生物 解析　白酒的酿造主要菌种是酿酒酵母,由于窖泥中含有大量与酿酒相关的微生物,因此传统白酒的酿造是在以酿酒酵母为主的多种微生物共同作用下完成的,A项正确;窖池内各种微生物形成了相对稳定的体系,且酿造过程产生的酒精也会抑制杂菌的生长与繁殖,使酿造过程不易污染杂菌,B项正确;对分离的酿酒酵母扩大培养时需要在有氧的条件下进行,C项错误;谷物原料如高粱等富含淀粉,因此从谷物原料发酵形成的酒糟中可分离出产淀粉酶的微生物,D项正确。 4.(2021·湖北卷,T3)中国的许多传统美食制作过程蕴含了生物发酵技术。下列叙述正确的是(B) A.泡菜制作过程中,酵母菌将葡萄糖分解成乳酸 B.馒头制作过程中,酵母菌进行呼吸作用产生CO2 C.米酒制作过程中,将容器密封可以促进酵母菌生长 D.酸奶制作过程中,后期低温处理可产生大量乳酸菌 解析　在泡菜制作过程中,乳酸菌将葡萄糖分解成乳酸,A项错误;在馒头制作过程中,酵母菌进行细胞呼吸产生CO2,从而使馒头变得松软,B项正确;在米酒制作过程中,将容器密封的目的是让酵母菌进行无氧呼吸产生酒精,将容器密封不利于酵母菌生长,C项错误;在酸奶制作过程中,后期低温处理的目的是抑制微生物的生长,延长保质期,D项错误。 5.(2021·全国乙卷,T37)工业上所说的发酵是指微生物在有氧或无氧条件下通过分解与合成代谢将某些原料物质转化为特定产品的过程。利用微生物发酵制作酱油在我国具有悠久的历史。某企业通过发酵制作酱油的流程示意图如图。 回答下列问题: (1)米曲霉发酵过程中,加入大豆、小麦和麦麸可以为米曲霉的生长提供营养物质,大豆中的蛋白质可为米曲霉的生长提供氮源,小麦中的淀粉可为米曲霉的生长提供碳源。 (2)米曲霉发酵过程的主要目的是使米曲霉充分生长繁殖,大量分泌制作酱油过程所需的酶类,这些酶中的蛋白酶、脂肪酶能分别将发酵池中的蛋白质和脂肪分解成易于吸收、风味独特的成分,如将蛋白质分解为小分子的肽和氨基酸。米曲霉发酵过程需要提供营养物质、通入空气并搅拌,由此可以判断米曲霉属于异养好氧(填“自养厌氧”“异养厌氧”或“异养好氧”)微生物。 (3)在发酵池发酵阶段添加的乳酸菌属于原核生物(填“真核生物”或“原核生物”);添加的酵母菌在无氧条件下分解葡萄糖的产物是酒精和CO2。在该阶段抑制杂菌污染和繁殖是保证酱油质量的重要因素,据图分析该阶段中可以抑制杂菌生长的物质是食盐(答出1点即可)。 解析　(1)大豆中的蛋白质可为米曲霉的生长提供氮源。淀粉属于多糖,组成元素有C、H、O,可为米曲霉的生长提供碳源。(2)蛋白质和脂肪的分解分别需要蛋白酶和脂肪酶。蛋白酶可以将蛋白质水解为小分子的肽和氨基酸。据题意可知,米曲霉发酵过程中需要提供营养物质,且需要通入空气并搅拌,故米曲霉的代谢类型为异养好氧型。(3)乳酸菌为原核生物;酵母菌为兼性厌氧微生物,在无氧条件下可以通过无氧呼吸产生酒精和CO2。由题图可知,在发酵池发酵阶段添加的酵母菌和乳酸菌通过无氧呼吸产生的酒精、乳酸可以抑制杂菌的生长,加入的食盐也可抑制杂菌生长。 第38讲　微生物的培养技术及应用 [课标内容]　1.阐明在发酵工程中灭菌是获得纯净的微生物培养物的前提。2.阐明无菌技术是在操作过程中,防止无菌物品与无菌区域被微生物污染的技术。3.举例说明通过调整培养基的配方可有目的地培养某种微生物。4.概述平板划线法和稀释涂布平板法是实验室中进行微生物分离和纯化的常用方法。5.概述稀释涂布平板法和显微镜计数法是测定微生物数量的常用方法。 微考点大突破 考点一　微生物的基本培养技术 　 1.培养基的配制 提醒　几种微生物的营养和能量来源 2.无菌技术 (1)目的:获得纯净的微生物培养物。 (2)关键:防止杂菌污染。 (3)消毒与灭菌的比较。 项目 消毒 灭菌 作用 强度 较为温和的物理、化学或生物等方法 强烈的理化方法 作用 程度 杀死物体表面或内部一部分微生物 杀死物体内外所有的微生物 芽孢和 孢子 一般不能杀灭 能杀灭 适用 对象 实验操作的空间、操作者的衣着和双手 微生物培养的器皿、接种用具和培养基等 常用 方法 ①煮沸消毒法:一般物品,如家庭餐具等生活用品; ②巴氏消毒法:一些不耐高温的液体,如牛奶; ③化学药物消毒法:用酒精擦拭双手、用氯气消毒水源等; ④紫外线消毒法:接种室、接种箱、超净工作台 ①湿热灭菌:培养基及容器等; ②干热灭菌:玻璃器皿、金属用具等; ③灼烧灭菌:接种工具、其他金属用具等 (4)注意事项。 ①实验操作时,应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品接触。 ②为避免周围环境中微生物的污染,实验操作应在超净工作台上并在酒精灯火焰附近进行。 3.微生物的纯培养概念辨析 4.纯培养的过程(以酵母菌为例) (1)微生物就是难以用肉眼观察的细菌、真菌和病毒。(选择性必修3 P9“相关信息”)(×) (2)在培养霉菌时,一般需要将培养基调至中性或弱碱性。(源自选择性必修3 P10)(×) (3)牛肉膏和蛋白胨含有糖、维生素和有机氮等,既可以充当碳源又可以充当氮源。(选择性必修3 P10“相关信息”)(√) (4)生物消毒法是指利用生物或其代谢物除去环境中的部分微生物的方法。(选择性必修3 P10“相关信息”)(√) (5)倒平板过程中,应将打开的皿盖放到一边,以免培养基溅到皿盖上,将培养基倒入培养皿并盖上皿盖后,立即将培养皿倒置。(选择性必修3 P12“探究·实践”)(×) (6)培养酵母菌时,可将接种后的平板和一个未接种的平板倒置,放入适宜温度的恒温培养箱中培养24~48 h。(选择性必修3 P13“探究·实践”)(√) 如图是采用纯化微生物培养的两种接种方法接种后培养的效果图,请分析并回答下列问题: (1)获得图A效果和图B效果的接种方法分别是什么? 答:获得题图A效果的接种方法为稀释涂布平板法,获得题图B效果的接种方法为平板划线法。 (2)某同学在纯化土壤中的细菌时,发现培养基上的菌落连成了一片,最可能的原因是什么?应当怎样操作才可避免此种现象? 答:最可能的原因是菌液浓度过高或划线时在划下一区域前未将接种环灼烧灭菌;采取的措施是增大稀释倍数或每次划新区域前先将接种环灼烧灭菌。 (3)接种操作为什么一定要在火焰附近进行? 答:火焰附近存在着无菌区域。 1.倒平板的操作步骤 (1)培养基要冷却到50 ℃左右时开始倒平板。温度过高会烫手,过低培养基又会凝固。 (2)要使锥形瓶的瓶口通过酒精灯火焰。通过灼烧灭菌,防止瓶口的微生物污染培养基。 (3)倒平板时,要用左手的拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙,不要完全打开,以免杂菌污染培养基。 (4)平板冷凝后,要将平板倒置。因为平板冷凝后,皿盖上会凝结水珠,平板倒置后,既可避免培养基表面的水分过快地挥发,又可防止皿盖上的水珠落入培养基,造成污染。 2.平板划线法操作步骤 (1)实验成功关键点。 (2)平板划线法操作中几次灼烧接种环的目的。 能力一　培养基的制备和无菌技术(考查科学思维) 1.(2022·辽宁卷,T15)为避免航天器在执行载人航天任务时出现微生物污染风险,需要对航天器及洁净的组装车间进行环境微生物检测。下列叙述错误的是(C) A.航天器上存在适应营养物质匮乏等环境的极端微生物 B.细菌形成菌膜粘附于航天器设备表面产生生物腐蚀 C.在组装车间地面和设备表面采集环境微生物样品 D.采用平板划线法等分离培养微生物,观察菌落特征 解析　不同微生物对营养物质的需求不同,航天器上可能存在适应营养物质匮乏等环境的极端微生物,A项正确;航天器上的细菌可通过大量繁殖形成菌膜,并粘附于航天器设备表面产生生物腐蚀,B项正确;为规避微生物污染的风险,需对航天器内外及组装车间等都进行微生物采样,对样品进行检测,并不仅限于采样组装车间地面和设备表面,C项错误;平板划线法可将混杂在一起的微生物或同一微生物群体中的不同细胞,用接种环在平板表面上多次划线稀释而获得单个细胞,并让其成长为单菌落,进而通过观察菌落特征确定其类型,D项正确。 2.回答下列与细菌培养相关的问题。 (1)在细菌培养时,培养基中能同时提供碳源、氮源的成分是蛋白胨(填“蛋白胨”“葡萄糖”或“NaNO3”)。通常,制备培养基时要根据所培养细菌的不同来调节培养基的pH,其原因是不同细菌生长繁殖所需的最适pH不同。 硝化细菌在没有碳源的培养基上能够(填“能够”或“不能”)生长,原因是硝化细菌可以利用空气中的CO2作为碳源。 (2)用平板培养细菌时一般需要将平板倒置(填“倒置”或“正置”)。 (3)单个细菌在平板上会形成菌落,研究人员通常可根据菌落的形状、大小、颜色等特征来初步区分不同种的微生物,原因是在一定的培养条件下,不同种微生物表现出各自稳定的菌落特征。 (4)有些使用后的培养基在丢弃前需要经过灭菌处理,这种处理可以杀死丢弃物中所有的微生物。 解析　(1)细菌培养时常用牛肉膏蛋白胨培养基,牛肉膏能提供碳源、氮源、磷酸盐、维生素等,蛋白胨能提供碳源、氮源、维生素等,而葡萄糖不能提供氮源,NaNO3不能为微生物提供碳源。不同细菌生长繁殖所需要的最适pH是不同的,应该根据培养细菌的不同来调节培养基的pH。硝化细菌是化能自养型细菌,可以空气中的CO2为碳源,因此其在没有碳源的培养基上能够生长。(2)在平板培养基上培养细菌时,一般需将平板倒置,这样可以防止培养皿盖上的水珠落入培养基,造成污染。(3)不同种类的微生物所形成的菌落,在大小、形状和颜色等方面具有一定的特征,不同种微生物在一定培养条件下表现出各自稳定的菌落特征,可以作为菌种鉴定的重要依据。(4)使用后的培养基在丢弃前需进行灭菌处理,以免污染环境。 能力二　微生物的纯培养(考查科学探究) 3.为纯化菌种,在鉴别培养基上划线接种纤维素降解细菌,培养结果如图所示。下列叙述正确的是(B) A.倒平板后需间歇晃动,以保证表面平整 B.图中Ⅰ、Ⅱ区的细菌数量均太多,应从Ⅲ区挑取单菌落 C.该实验结果因单菌落太多,不能达到菌种纯化的目的 D.菌落周围的纤维素被降解后,可被刚果红染成红色 解析　倒平板后无需间歇晃动,A项错误;题图中Ⅰ区、Ⅱ区的细菌数量太多,Ⅲ区的细菌数量较少,可从Ⅲ区挑取单菌落,B项正确;Ⅲ区中存在单菌落,该实验结果能达到菌种纯化的目的,C项错误;刚果红能与纤维素形成红色复合物,但不能和纤维素水解后的产物形成红色复合物,因此菌落周围的纤维素被降解后,不能被刚果红染成红色,培养基中会出现透明圈,D项错误。 4.(2024·山东卷,T15)酵母菌在合成色氨酸时需要3种酶X、Y和Z,trpX、trpY和trpZ分别为相应酶的编码基因突变的色氨酸依赖型突变体。已知3种酶均不能进出细胞,而色氨酸合成途径的中间产物积累到一定程度时可分泌到胞外。将这3种突变体均匀划线接种到含有少量色氨酸的培养基上,生长情况如图。据图分析,3种酶在该合成途径中的作用顺序为(A) A.X→Y→Z B.Z→Y→X C.Y→X→Z D.Z→X→Y 解析　由题意可知,色氨酸的合成过程如图所示:。由题图可知,trpX靠近trpY和trpZ的两端生长加快,推测trpY和trpZ可为trpX提供合成色氨酸的中间产物①,trpX不能合成酶①;trpY在靠近trpZ的一端生长加快,说明trpZ可为trpY提供合成色氨酸所需要的中间产物②,说明trpY不能合成酶②;trpZ可为trpX和trpY提供中间产物①和②,自己却无法利用中间产物合成色氨酸,说明trpZ不能合成酶③;所以3种酶在该合成途径中的作用顺序为X→Y→Z,A项符合题意。 考点二　微生物的选择培养和计数 　 1.选择培养基 2.微生物的选择培养——稀释涂布平板法的操作步骤 (1)系列稀释操作:该操作常用在将细胞接种到培养基之前,通过液体稀释的方法分散细胞,随着稀释程度的增大,单位体积中的微生物细胞数量减少,细胞得以分散。 操作步骤: (2)涂布平板操作。 序号 名称 图示 操作 1 取菌液 取0.1 mL菌液,滴加到培养基表面 2 涂布 器消毒 将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中 3 涂布 器灭菌 将沾有少量酒精的涂布器放在火焰上灼烧,待酒精燃尽、涂布器冷却后进行涂布 4 涂布 平板 用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿,使菌液涂布均匀 (3)培养:待涂布的菌液被培养基吸收后,将平板倒置,放入30~37 ℃的恒温培养箱中培养1~2 d。 3.微生物的数量测定——两种计数方法的比较 项目 间接计数法(稀释涂布平板法) 直接计数法(显微镜直接计数法) 原理 当样品的稀释度足够高时,培养基表面生长的一个单菌落,来源于样品稀释液中的一个活菌,通过统计平板上的菌落数,就能推测出样品中大约含有多少活菌 利用特定的细菌计数板或血细胞计数板,在显微镜下观察、计数,然后再计算一定体积的样品中微生物的数量 公式 每克样品中的菌株数=(C÷V)×M,其中C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数,V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL),M代表稀释倍数 每毫升原液中所含的微生物数=每小格的平均微生物数×400×104×稀释倍数 缺点 当两个或多个细胞连在一起时,平板上观察到的只是一个菌落 不能区分死菌与活菌 结果 与实际值相比偏小 与实际值相比偏大 提醒　血细胞计数板比细菌计数板厚,常用于相对较大的酵母菌细胞、霉菌孢子等的计数。用细菌计数板可对细菌等较小的细胞进行观察和计数。 4.土壤中分解尿素的细菌的分离与计数的实验操作 (1)实验原理。 (2)操作步骤。 (3)实验结果分析与评价。 (1)选择培养基可以鉴定某种微生物的种类。(源自选择性必修3 P16)(×) (2)菌液的稀释度足够高时,培养基表面会获得单菌落。(源自选择性必修3 P18)(√) (3)对细菌进行计数能采用稀释涂布平板法,也能用平板划线法。(源自选择性必修3 P18)(×) (4)细菌计数板常用于相对较大的酵母菌细胞、霉菌孢子等的计数。(选择性必修3 P18“相关信息”)(×) (5)分解尿素的细菌在分解尿素时,可以将尿素转化为氨,使得培养基的碱性降低。(选择性必修3 P18“探究·实践”)(×) (6)用稀释涂布平板法计数时,平板上的一个菌落就是一个细菌。(选择性必修3 P20“概念检测”2)(×) (7)纤维素分解菌在刚果红培养基上形成的透明圈越大,说明该类纤维素分解菌分解纤维素的能力越强。(选择性必修3 P20“拓展应用”2)(√) 在发酵生产啤酒过程中,要随时检测培养液中的酵母菌数量、产物浓度等,以了解发酵进程。甲、乙、丙三位同学用稀释涂布平板法测定同一培养液的酵母菌数。在对应稀释倍数为106的培养基中,得到以下三种统计结果。 (1)甲同学在该浓度下涂布了一个平板,统计的菌落数为230,该同学的统计结果是否可靠?为什么? 答:不可靠;为增加实验的说服力与准确性,应设置重复实验,在同一稀释度下至少涂布3个平板,统计结果后计算平均值。 (2)乙同学在该浓度下涂布了3个平板,统计的菌落数分别为21、212、256,该同学将21舍去,然后取平均值。该同学对实验结果的处理是否合理?为什么? 答:不合理;微生物计数时,如果实验中出现重复实验的结果差别很大的情况,应分析实验过程中可能的影响因素,找出差异的原因,而不能简单地将结果舍弃后进行计数。 (3)在稀释涂布平板法中,为何需至少涂布3个平板? 答:作为重复实验,统计时取平均值,以减少偶然因素对实验结果的影响,增强实验结果的说服力。 (4)为什么要选取菌落数目稳定时的记录作为结果? 答:尽量缩小统计的菌落数与实际活菌数的差值,因为繁殖慢的菌体开始看不出明显的菌落特征。 (5)丙同学在稀释倍数为106的培养基中测得平板上菌落数的平均值为234个(涂布平板时所用稀释液的体积为0.1 mL),那么稀释倍数为106的试管中细菌的浓度是2.34×103个/mL。每克样品中的细菌数是2.34×109个。 能力一　微生物的选择培养(考查科学思维) 1.(2025·陕西调研)利用纤维素酶降解秸秆生产燃料乙醇,对缓解全球能源危机有重大意义。科研人员开展选育高产纤维素酶菌株的相关研究,过程如图1。鉴定高产纤维素酶菌株是否产生,可使用刚果红平板法。其原理是纤维素被分解,刚果红无法与纤维素的分解产物结合,培养基中的菌落周围会形成透明圈,如图2。下列叙述正确的是(D) 黑土壤CMC平板产纤维素霉菌株XZ-33 产纤维素霉菌株UV-10产纤维素霉菌株UV-co16 图1 图2 A.采集的黑土壤需经过高压蒸汽灭菌再进行富集培养 B.人工筛选可以使产纤维素菌株发生定向进化,诱变处理使每个细菌的产纤维素酶能力提高 C.配制CMC平板培养基需加入纤维素为唯一碳源和蛋白胨为唯一氮源 D.图2中两个透明圈内的微生物均能将分解纤维素的酶分泌到细胞外 解析　高压蒸汽灭菌会杀死黑土壤中的微生物,因此无法培养出产纤维素酶的菌株,A项错误;人工筛选可以决定产纤维素菌株进化的方向,但变异是不定向的,因此无法保证每个细菌的产纤维素酶的能力都能提高,B项错误;蛋白胨既是氮源也是碳源,C项错误;题图2中两处位置都出现透明圈,说明菌落周围的纤维素都已被分解,因此确定纤维素酶出现在细胞外,D项正确。 2.(多选)(2024·黑吉辽卷,T19)某些香蕉植株组织中存在的内生菌可防治香蕉枯萎病,其筛选流程及抗性检测如图。下列操作正确的是 (CD) A.在大量感染香蕉枯萎病的香蕉种植园内,从感病植株上采集样品 B.将采集的样品充分消毒后,用蒸馏水冲洗,收集冲洗液进行无菌检测 C.将无菌检测合格的样品研磨,经稀释涂布平板法分离得到内生菌的单菌落 D.判断内生菌的抗性效果需比较有无接种内生菌的平板上的病原菌菌斑大小 解析　内生菌可防治香蕉枯萎病,大量感染香蕉枯萎病的香蕉不含或仅含少量内生菌,样品采集应该在题述香蕉种植园内的未感染的植株上采集,A项错误;采集的样品充分消毒后,用无菌水冲洗,收集冲洗液进行无菌检测(当结果为无菌时说明样品表面无菌,从而可进行后续实验),B项错误;获得单菌落的方法有平板划线法和稀释涂布平板法,C项正确;通过比较有无接种内生菌的平板上的病原菌菌斑大小,可判断内生菌的抗性效果,D项正确。 能力二　微生物的分离与计数(考查科学探究) 3.(2023·辽宁卷,T9)细菌气溶胶是由悬浮于大气或附着于颗粒物表面的细菌形成的,利用空气微生物采样器对某市人员密集型公共场所采样并检测细菌气溶胶的浓度(菌落数/m3)。下列叙述错误的是(D) A.采样前需对空气微生物采样器进行无菌处理 B.细菌气溶胶样品恒温培养时需将平板倒置 C.同一稀释度下至少对3个平板计数并取平均值 D.稀释涂布平板法检测的细菌气溶胶浓度比实际值高 解析　对采样器进行无菌处理可以减小采样器上附着细菌引起的实验误差,A项正确;为防止皿盖上的冷凝水落入培养基,冲散菌落,造成污染,以及防止水分大量蒸发,恒温培养细菌气溶胶样品时需将平板倒置,B项正确;同一稀释度下,至少对3个平板进行重复计数并取平均值,可减少偶然误差,C项正确;当两个或多个细菌连在一起时,平板上观察到的只是一个菌落,故稀释涂布平板法计数的细菌菌落数往往比实际值低,D项错误。 两种纯化方法的比较 4.(2025·成都调研)耙耙柑是深受全国人民喜爱的一种水果。但是在贮运过程中白地霉侵染引起的酸腐病会导致耙耙柑腐烂,带来巨大经济损失。为了解决这一问题,科研人员研究了桔梅奇酵母对白地霉的抑菌效果,并且对其作用机制进行了探究。回答下列问题: (1)白地霉从耙耙柑中获得其生长繁殖所需的水、无机盐、碳源和氮源等基本营养物质。 (2)将桔梅奇酵母与白地霉菌种用平板划线(或稀释涂布平板)法分别接种到不同的平板上进行培养,得到纯培养物后,再挑取菌落,用无菌水分别制备菌种悬液,利用血细胞计数板在显微镜下计数,并稀释至实验所需浓度。 (3)为探究桔梅奇酵母对酸腐病的生物防治作用,研究人员在耙耙柑果实中部等距离刺两个孔,其中一孔接种0.1 mL桔梅奇酵母悬液和0.1 mL白地霉悬液。一段时间后统计果实发病率并测量白地霉菌丝生长情况,结果如图1、图2所示: 另一个孔作为对照组的处理是接种等量无菌水和白地霉悬液(或0.1 mL无菌水和0.1 mL白地霉悬液)。综合图1、图2结果,表明桔梅奇酵母对白地霉最可能的抑制机制为桔梅奇酵母通过抑制白地霉菌丝的生长来降低酸腐病害。  (4)铁是真菌生长的必需元素,是细胞内重要酶活性中心的组成部分。普切明酸是桔梅奇酵母产生的一种水溶性铁螯合剂,能快速在培养基中扩散并与其中的Fe3+结合形成稳定的红色复合物。研究者配制含有不同浓度FeCl3(单位:mg/L)的培养基,实验处理及结果如图3所示。 桔梅奇酵母菌落周围出现红色抑菌圈的原因是桔梅奇酵母产生的普切明酸与培养基中的Fe3+结合生成红色复合物,白地霉不能利用这种形式的Fe3+,从而生长受到抑制;随培养基中FeCl3浓度的增加,红色抑菌圈颜色加深但变窄,对白地霉的抑制效果减弱(填“增强”或“减弱”)。 解析　(1)白地霉引起的酸腐病会导致耙耙柑腐烂,从而为白地霉生长繁殖提供所需的碳源、氮源、水以及无机盐等营养物质。(2)微生物的接种方法有平板划线法和稀释涂布平板法,因此,可将桔梅奇酵母与白地霉菌种用平板划线法(或稀释涂布平板法)分别接种到不同的平板上进行培养,再用无菌水分别制备菌种悬液,利用血细胞计数板在显微镜下计数,并稀释至实验所需浓度。(3)分析题意可知,本实验的目的是探究桔梅奇酵母对酸腐病的生物防治作用,则实验的自变量是梅奇酵母的有无,因变量是酸腐病的发病情况,实验设计应遵循对照与单一变量原则,故在耙耙柑果实中部等距离刺两个孔,其中一孔接种白地霉和桔梅奇酵母悬液,另一孔应接种等量白地霉悬液。综合题图1、图2结果可知,与对照组相比,接种桔梅奇酵母后果实的发病率均有所降低,且菌丝长度保持在较低水平不再生长,表明桔梅奇酵母对白地霉的抑菌机制为桔梅奇酵母通过抑制白地霉菌丝的生长来显著降低酸腐病害。(4)普切明酸是桔梅奇酵母产生的一种水溶性铁螯合剂,能快速在培养基中扩散并与其中的Fe3+结合形成稳定红色复合物。桔梅奇酵母菌落周围出现红色抑菌圈的原因为桔梅奇酵母产生的普切明酸固定培养基中的Fe3+生成红色复合物,白地霉不能利用这种形式的Fe3+,从而生长受抑制。普切明酸与高浓度的Fe3+结合形成复合物增加(颜色加深),且由于供白地霉生长利用的Fe3+减少,导致对白地霉的抑制效果逐渐变弱(抑菌圈变窄)。 微真题重体悟 　 1.(2023·山东卷,T15)平板接种常用在微生物培养中。下列说法正确的是(D) A.不含氮源的平板不能用于微生物培养 B.平板涂布时涂布器使用前必须进行消毒 C.接种后未长出菌落的培养基可以直接丢弃 D.利用以尿素为唯一氮源的平板能分离出合成脲酶的微生物 解析　不含氮源的平板可用于固氮菌的培养,A项错误;平板涂布时涂布器使用前必须进行灭菌,B项错误;使用后的培养基即使未长出菌落也要在丢弃前进行灭菌处理,以免污染环境,C项错误;脲酶可以催化尿素分解,在以尿素为唯一氮源的平板上,能合成脲酶的微生物可以分解尿素获得氮源而进行生长繁殖,而不能合成脲酶的微生物因缺乏氮源无法生长,因此以尿素为唯一氮源的平板能分离出合成脲酶的微生物,D项正确。 2.(2023·河北卷,T12)为筛选能平衡肠道菌群和降解胆固醇的乳酸菌,下列相关实验设计错误的是(B) A.从酸奶和泡菜中采样分离乳酸菌 B.平板倒置培养为筛选乳酸菌创造无氧环境 C.对目的菌株进行胆固醇降解能力的测定 D.检测目的菌株对消化道环境的耐受力 解析　酸奶和泡菜都是利用乳酸菌的发酵原理制作的,内含大量乳酸菌,可从中采样分离获得乳酸菌,A项正确;平板倒置的目的是防止皿盖中的冷凝水落入培养基,避免培养基中的水分过快蒸发,B项错误;实验的目的是筛选获得能平衡肠道菌群和降解胆固醇的乳酸菌,故需对目的菌株进行消化道环境耐受力的检测和胆固醇降解能力的测定,C、D两项正确。 3.(2022·海南卷,T12)为探究校内植物园土壤中的细菌种类,某兴趣小组采集园内土壤样本并开展相关实验。下列有关叙述错误的是(C) A.采样时应随机采集植物园中多个不同地点的土壤样本 B.培养细菌时,可选用牛肉膏蛋白胨固体培养基 C.土壤溶液稀释倍数越低,越容易得到单菌落 D.鉴定细菌种类时,除形态学鉴定外,还可借助生物化学的方法 解析　采集植物园中土壤样本的原则之一是要随机采样,A项正确;牛肉膏蛋白胨固体培养基中含有细菌生长所需的碳源、氮源、水、无机盐等,可用于细菌的培养,B项正确;土壤溶液稀释倍数足够高时,才能将聚集的菌体分散开,有助于在培养基表面形成单菌落,C项错误;不同种类细菌的理化特性一般不同,鉴定细菌种类时,除根据菌落特征进行形态学鉴定外,还可以借助生物化学的方法进行鉴定,D项正确。 4.(2021·山东卷,T14)解脂菌能利用分泌的脂肪酶将脂肪分解成甘油和脂肪酸并吸收利用。脂肪酸会使醇溶青琼脂平板变为深蓝色。将不能直接吸收脂肪的甲、乙两种菌分别等量接种在醇溶青琼脂平板上培养。甲菌菌落周围呈现深蓝色,乙菌菌落周围不变色,下列说法错误的是(B) A.甲菌属于解脂菌 B.实验中所用培养基以脂肪为唯一碳源 C.可将两种菌分别接种在同一平板的不同区域进行对比 D.该平板可用来比较解脂菌分泌脂肪酶的能力 解析　根据题干信息“甲菌菌落周围呈现深蓝色”,说明甲菌可以分泌脂肪酶将脂肪分解成甘油和脂肪酸,脂肪酸会使醇溶青琼脂平板变为深蓝色,因此甲菌属于解脂菌,A项正确;乙菌菌落周围没有出现深蓝色,说明乙菌不能以脂肪作为碳源,但乙菌也可以在培养基上生存,说明该培养基不是以脂肪为唯一碳源,B项错误;可将两种菌分别接种在同一平板的不同区域进行对比,更加直观,C项正确;可以利用该平板来比较解脂菌分泌脂肪酶的能力,观察指标可以是菌落周围深蓝色圈的大小,菌落周围深蓝色圈的直径越大,说明解脂菌分泌脂肪酶的能力越强,D项正确。 5.(2023·北京卷,T16)自然界中不同微生物之间存在着复杂的相互作用。有些细菌具有溶菌特性,能够破坏其他细菌的结构使细胞内容物释出。科学家试图从某湖泊水样中分离出有溶菌特性的细菌。回答下列问题: (1)用于分离细菌的固体培养基包含水、葡萄糖、蛋白胨和琼脂等成分,其中蛋白胨主要为细菌提供氮源、碳源和维生素等。 (2)A菌通常被用作溶菌对象。研究者将含有一定浓度A菌的少量培养基倾倒在固体培养平板上,凝固形成薄层。培养一段时间后,薄层变浑浊(如图),表明A菌能在培养平板中生长繁殖。 (3)为分离出具有溶菌作用的细菌,需要合适的菌落密度,因此应将含菌量较高的湖泊水样稀释后,依次分别涂布于不同的浑浊薄层上。培养一段时间后,能溶解A菌的菌落周围会出现溶菌圈。采用这种方法,研究者分离、培养并鉴定出P菌。 (4)为探究P菌溶解破坏A菌的方式,请提出一个假设,该假设能用以下材料和设备加以验证(主要实验材料和设备:P菌、A菌、培养基、圆形滤纸小片、离心机和细菌培养箱):假设P菌通过分泌某种化学物质使A菌溶解破裂。 解析　(1)蛋白胨主要为细菌提供氮源、碳源和维生素等。(2)将含有一定浓度A菌的少量培养基倾倒在固体培养平板上,凝固形成薄层。培养一段时间后,薄层变浑浊,表明A菌能在培养平板中生长繁殖。(3)将含菌量较高的湖泊水样稀释后,依次分别涂布于不同的浑浊薄层上。培养一段时间后,能溶解A菌的菌落周围会出现溶菌圈。(4)根据实验材料和设备,圆形滤纸小片可用于吸收某种物质,离心机可用于分离菌体和细菌分泌物,为探究P菌溶解破坏A菌的方式,可假设P菌通过分泌某种化学物质使A菌溶解破裂。 第39讲　植物细胞工程 [课标内容]　1.阐明植物组织培养是在一定条件下,将离体植物器官、组织或细胞等在适宜的培养条件下诱导形成愈伤组织,并重新分化,最终形成完整植株的过程。2.概述植物体细胞杂交是将不同植物体细胞在一定条件下融合成杂种细胞,继而培育成新植物体的技术。3.举例说明植物细胞工程利用快速繁殖、脱毒、次生代谢物生产、育种方式等有效提高了生产效率。 微考点大突破 考点一　植物组织培养技术 　 1.细胞工程的概念 细胞工程是指应用细胞生物学、分子生物学和发育生物学等多学科的原理和方法,通过细胞器、细胞或组织水平上的操作,有目的地获得特定的细胞、组织、器官、个体或其产品的一门综合性的生物工程。 2.植物细胞的全能性 3.植物组织培养技术 (1)概念:将离体的植物器官、组织或细胞等,培养在人工配制的培养基上,给予适宜的培养条件,诱导其形成完整植株的技术。 (2)理论基础:植物细胞的全能性。 (3)基本过程。 ①脱分化:在一定的激素和营养等条件的诱导下,已经分化的细胞,失去其特有的结构和功能,转变成未分化的细胞的过程。 ②愈伤组织:未分化的细胞形成的不定形的薄壁组织团块。 ③再分化:愈伤组织重新分化形成芽、根等器官的过程。 提醒　①光照:在愈伤组织诱导阶段,对有些植物来说,避光培养有利于细胞脱分化形成愈伤组织。当愈伤组织再分化出芽和叶时,一定要有光照,有利于叶片内叶绿素的合成。 ②植物组织培养中所需的碳源一般为蔗糖,少数为葡萄糖和果糖,原因是蔗糖既可提供充足的碳源,又可维持相对适中的渗透压,而葡萄糖和果糖在与蔗糖提供相同数量碳源的前提下,其造成的渗透压可能过高。 (4)探究实践——菊花的组织培养。 (5)植物激素在植物组织培养中的作用。 生长素/细胞分裂素 植物细胞的发育方向 大于1 有利于根的分化、抑制芽的形成 小于1 有利于芽的分化,抑制根的形成 等于1 促进愈伤组织的生长 简记为:“高”根,“低”芽,“中”愈伤,如图所示: (1)将植物叶肉细胞中的叶绿体转移到动物细胞中,不属于细胞工程。(源自选择性必修3 P31)(×) (2)外植体用酒精消毒后,需要用流水冲洗后再用次氯酸钠溶液进行消毒处理。(选择性必修3 P36“探究·实践”)(×) (3)培养基添加生长素和细胞分裂素后,愈伤组织一定能发育成完整的植株。(选择性必修3 P37“探究·实践”)(×) 长春新碱(VCR)是夹竹桃科植物长春花中提取出来的一种生物碱,具有高抗肿瘤活性。如图是科研人员利用长春花的叶柄或嫩叶作为外植体得到再生植株的方法,分析并回答下列问题: (1)选用叶柄或嫩叶作为外植体,其原因是什么? 答:叶柄或嫩叶分化程度低,全能性高,容易诱导形成愈伤组织,进而培养成完整植株。 (2)为什么说从繁殖方式上看,植物组织培养的繁殖方式是无性繁殖? 答:植物组织培养是在细胞有丝分裂和细胞分化的基础上实现的,此过程并没有生殖细胞的产生,所以是无性繁殖。 (3)在植物组织培养的过程中,为什么要求无菌操作? 答:培养物一旦受到微生物的污染,这些微生物会和外植体争夺培养基中的营养物质,并且产生大量对外植体有害的物质,导致外植体死亡。 能力　植物组织培养的过程分析(考查科学探究) 1.(2024·黑吉辽卷,T6)迷迭香酸具有多种药理活性。进行工厂化生产时,先诱导外植体形成愈伤组织,再进行细胞悬浮培养获得迷迭香酸,加入诱导剂茉莉酸甲酯可大幅提高产量。下列叙述错误的是(B) A.迷迭香顶端幼嫩的茎段适合用作外植体 B.诱导愈伤组织时需加入NAA和脱落酸 C.悬浮培养时需将愈伤组织打散成单个细胞或较小的细胞团 D.茉莉酸甲酯改变了迷迭香次生代谢产物的合成速率 解析　迷迭香顶端幼嫩的茎段分裂旺盛,适合用作外植体,A项正确;诱导愈伤组织时需要加入适当比例的生长素和细胞分裂素,B项错误;植物细胞培养需在离体条件下,对单个植物细胞或细胞团进行培养使其增殖,C项正确;次生代谢不是生物生长所必需的,迷迭香酸是迷迭香的次生代谢产物,加入诱导剂茉莉酸甲酯可大幅提高产量,说明茉莉酸甲酯改变了迷迭香次生代谢产物的合成速率,D项正确。 2.(2025·长沙调研)红豆杉被称作“植物界的大熊猫”,紫杉醇是红豆杉合成的一种次生代谢物,虽然具有高抗癌活性,但在植物体中含量极低。 (1)为取代从天然植株中提取紫杉醇的方式,可通过植物组织培养和植物细胞培养技术来获取,其过程为:获取红豆杉外植体→消毒→诱导愈伤组织→细胞培养→提取紫杉醇。其中,获取的外植体消毒后诱导出愈伤组织的过程称为脱分化,在培养过程中主要添加生长素和细胞分裂素这两种植物激素并通过调整比例来调控其培育过程。 (2)灵芝诱导子可能通过介导植物的防御反应来促进紫杉醇合成,在最佳诱导条件下对红豆杉进行细胞悬浮培养,结果如图1。 PPO能催化酚类物质氧化,使其含量减少。PAL是紫杉醇形成途径中的关键酶。经灵芝诱导子处理后,PAL活性与对照相比明显上升。结合图1,在图2中的括号内填入“+”或“-”。 答: (3)过去普遍认为紫杉醇通过抑制有丝分裂来发挥抗癌作用。用标准剂量紫杉醇治疗后对患者的乳腺癌细胞进行研究,结果如图3。 [注]　有丝分裂指数代表细胞增殖的活跃程度。 以上实验结果不支持(填“支持”或“不支持”)传统认知的紫杉醇抗癌机理,并说明理由:紫杉醇处理后患者的有丝分裂指数高于对照组,说明紫杉醇并未抑制细胞的有丝分裂。 (4)新的研究发现只有染色体不稳定性(简称“CIN”,即细胞分裂发生错误导致染色体不稳定)水平高的乳腺癌患者才对紫杉醇敏感,推测紫杉醇可能通过提高这类患者体内含多极纺锤体癌细胞的比例诱导癌细胞死亡。选择一种药物,结合必需的实验材料和试剂,补充实验进行验证。 药物a:能提高CIN水平,且抑制有丝分裂 药物b:能提高CIN水平,但不能抑制有丝分裂 药物c:不能提高CIN水平,但能抑制有丝分裂 将CIN水平低的乳腺癌细胞分为两组。其中对照组的处理方式为适量的紫杉醇溶液,实验组的处理方式为药物b和等量紫杉醇溶液。培养一段时间,结果显示实验组多极纺锤体癌细胞比例、癌细胞死亡率均高于对照组。 [注]　正常纺锤体是指固定于细胞两极的纺锤体,多极纺锤体是指固定于细胞三、四或者更多个极的纺锤体。 解析　(1)获取的外植体消毒后诱导出愈伤组织的过程称为脱分化,在培养过程中主要添加生长素和细胞分裂素这两种植物激素并通过调整比例来调控其培育过程。(2)由题图可知,灵芝诱导子抑制PPO活性,PPO能催化酚类物质氧化使其含量减少,因而灵芝诱导子在一定范围内能使酚类总量增加。PAL是紫杉醇形成途径中的关键酶,经灵芝诱导子处理后,PAL活性与对照相比明显上升,因此关系见答案图。(3)由题图可知,紫杉醇处理后患者的有丝分裂指数高于对照组,有丝分裂指数代表细胞增殖的活跃程度,说明紫杉醇并未抑制细胞的有丝分裂,以上实验结果不支持紫杉醇通过抑制有丝分裂来发挥抗癌作用。(4)只有染色体不稳定性(CIN)水平高的乳腺癌患者才对紫杉醇敏感,推测紫杉醇可能通过提高这类患者体内含多极纺锤体癌细胞的比例诱导癌细胞死亡。紫杉醇不抑制有丝分裂,因此应选择能提高CIN水平,但不能抑制有丝分裂的药物b进行处理,对照组用适量的紫杉醇处理,实验组使用药物b和等量的紫杉醇处理,药物b能提高CIN水平,增加细胞对紫杉醇的敏感性,诱导癌细胞死亡,对照组细胞CIN水平较低,细胞对紫杉醇的敏感性较低,癌细胞死亡数量少,因此培养一段时间,结果显示实验组多极纺锤体癌细胞比例、癌细胞死亡率均高于对照组。 考点二　植物体细胞杂交技术及植物细胞工程的应用 　 1.植物体细胞杂交 (1)概念:将不同来源的植物体细胞,在一定条件下融合成杂种细胞,并把杂种细胞培育成新植物体的技术。 (2)操作流程。 ①去壁:对应图中a过程,即去除细胞壁,获得具有活力的原生质体,用到的酶是纤维素酶和果胶酶。 ②诱导融合:对应图中b过程。 ⅰ.原理:细胞膜的流动性。 ⅱ.方法:物理法包括离心法、电融合法等;化学法包括聚乙二醇(PEG)融合法、高Ca2+—高pH融合法等。 ⅲ.融合成功的标志:再生出细胞壁。 ③培养:过程d是植物组织培养,其原理是植物细胞的全能性。 (3)意义。 在打破生殖隔离,实现远缘杂交育种,培育植物新品种等方面展示出独特的优势。 2.植物细胞工程的应用 (1)植物繁殖的新途径。 (2)作物新品种的培育。 (3)细胞产物的工厂化生产。 提醒　①工厂化生产不一定要培养出植物体,一般培养到愈伤组织阶段,从培养愈伤组织细胞的培养液中就可提取细胞产物。 ②通过培养能够产生对人们有利产物的细胞,从而获得大量的细胞产物。目前获得的产物主要有蛋白质、脂肪、糖类、药物、香料、生物碱等。 (1)利用物理法或化学法,可以直接将两个植物细胞进行诱导融合。(源自选择性必修3 P37)(×) (2)植物体细胞杂交技术打破了生殖隔离,实现远缘杂交育种。(源自选择性必修3 P38)(√) (3)以茎尖为材料通过组织培养获得的脱毒苗具有抗病毒的特点。(源自选择性必修3 P40)(×) (4)单倍体育种和突变体培育的遗传学原理是一致的。(源自选择性必修3 P40)(×) (5)初生代谢和次生代谢在生物整个的生命过程中始终进行。(选择性必修3 P41“相关信息”)(×) 1.脱毒苗和抗毒苗是一回事吗?为什么? 答:不是。脱毒苗是选择植物的顶端分生区(如茎尖)进行组织培养而获得的,属于细胞工程的范畴;抗毒苗是把某抗病毒基因导入受体细胞中,并通过一定的方法培养形成的,属于基因工程的范畴。 2.不同物种之间存在着天然的生殖隔离,利用传统的有性杂交的方法很难得到杂种后代。科学家采用体细胞杂交的方法得到了“番茄—马铃薯”杂种植株。以下为植物体细胞杂交技术流程图,其中甲和乙分别表示两种二倍体植物细胞,所含有的染色体组分别是AA和BB。 (1)将图中的甲和乙两种细胞去除细胞壁后诱导融合,若只考虑两两融合,可以形成哪几种融合细胞?符合要求的杂种细胞是哪种? 答:可以形成3种融合细胞:甲甲、甲乙、乙乙。符合要求的是甲乙。 (2)二倍体番茄和二倍体马铃薯体细胞杂交得到的“番茄—马铃薯”有多少个染色体组,是几倍体? 答:有四个染色体组,是四倍体。 (3)从结果上看杂种植株在遗传上有什么特点?从杂种植株的染色体组成上看属于哪种变异类型? 答:从结果上看,杂种植株的遗传物质来自两个亲本,具有双亲的遗传性状。从染色体组成上看属于染色体数目变异。 1.植物组织培养与植物体细胞杂交的比较 2.植物体细胞杂交和有性杂交的辨析 能力一　植物体细胞杂交过程分析(考查科学思维) 1.(2024·湖北卷,T11)植物甲抗旱、抗病性强,植物乙分蘖能力强、结实性好。科研人员通过植物体细胞杂交技术培育出兼有甲、乙优良性状的植物丙,过程如图所示。下列叙述错误的是(B) A.过程①中酶处理的时间差异,原因可能是两种亲本的细胞壁结构有差异 B.过程②中常采用灭活的仙台病毒或PEG诱导原生质体融合 C.过程④和⑤的培养基中均需要添加生长素和细胞分裂素 D.可通过分析植物丙的染色体,来鉴定其是否为杂种植株 解析　过程①为用纤维素酶和果胶酶去除细胞壁,过程①中酶处理的时间差异,原因可能是两种亲本的细胞壁结构有差异,A项正确;过程②中常采用聚乙二醇(PEG)融合法、高Ca2+—高pH融合法、离心法等诱导原生质体融合,灭活的仙台病毒常用于诱导动物细胞融合,B项错误;添加不同浓度的生长素和细胞分裂素能诱导愈伤组织的形成和分化,C项正确;可通过分析植物丙的染色体来鉴定其是否为杂种植株,D项正确。 2.(多选)(2025·泰安模拟)红豆杉能产生抗癌药物紫杉醇。为了培育产生紫杉醇的柴胡,科研人员将红豆杉(2n=24)与柴胡(2n=12)进行了不对称体细胞杂交。用一定剂量的紫外线照射红豆杉原生质体,破坏部分染色体,与未经紫外线照射的柴胡原生质体用化学诱导剂诱导融合,得到融合细胞。诱导融合后,科研人员只统计了7组染色体数目不大于24条的细胞,如表所示。红豆杉和柴胡的亲缘关系较远,两种植物细胞的染色体间排斥较为明显。下列叙述正确的是 (ABCD) 材料 融合细胞组号 1 2 3 4 5 6 7 染色体 数/条 9~11 12 12~14 12~16 13 14 24 A.将红豆杉愈伤组织和柴胡愈伤组织用纤维素酶和果胶酶分别处理,各自获得有活力的原生质体 B.筛选的目标细胞不包括染色体数目大于24条的细胞,因为柴胡细胞染色体数为12条,并且红豆杉细胞一个染色体组的染色体数为12条 C.判断组号为3、4、5、6、7的细胞可能为杂交细胞,并进一步采用PCR方法鉴定这几组细胞 D.应在能够高效合成紫杉醇的杂种细胞中选择红豆杉核基因含量较低的杂种细胞进行培养 解析　将红豆杉愈伤组织和柴胡愈伤组织用纤维素酶和果胶酶分别处理,去掉细胞壁,可以获得有活力的原生质体,A项正确;因为柴胡细胞染色体数为12条,并且红豆杉细胞一个染色体组的染色体数为12条,目标是筛选得到具有紫杉醇合成基因的柴胡,所以此杂种细胞理论应该包含全部柴胡染色体和一套红豆杉染色体(含有一个紫杉醇合成基因)即可,因此科研人员筛选的目标细胞不包括染色体数目大于24条的细胞,B项正确;柴胡细胞染色体数为12条,多余的染色体是其他细胞融合参与进去的,可判断组号为3、4、5、6、7的细胞可能为杂交细胞,C项正确;红豆杉和柴胡有远缘杂交不亲和障碍,两种植物细胞的染色体间排斥较为明显,应在能够高效合成紫杉醇的杂交细胞中选择红豆杉核基因含量较低的杂交细胞进行培养,D项正确。 能力二　植物细胞工程的应用(考查社会责任) 3.(2023·广东卷,T12)人参皂苷是人参的主要活性成分。科研人员分别诱导人参根与胡萝卜根产生愈伤组织并进行细胞融合,以提高人参皂苷的产率。下列叙述错误的是(C) A.细胞融合前应去除细胞壁 B.高Ca2+—高pH溶液可促进细胞融合 C.融合的细胞即为杂交细胞 D.杂交细胞可能具有生长快速的优势 解析　植物细胞的细胞壁会阻碍细胞的融合,故植物细胞融合前应去除细胞壁,A项正确;诱导植物细胞原生质体融合的方法有物理法、化学法,化学法包括PEG融合法、高Ca2+—高pH融合法等,B项正确;细胞融合时既有同种细胞的融合,也有不同种细胞的融合,后者才是所需要的杂交细胞,C项错误;杂交细胞具有双方的遗传物质,可能具有胡萝卜细胞生长快速的优势,D项正确。 4.(2025·厦门模拟)甲植物具有由核基因控制的多种优良性状,远缘植物乙的细胞质中存在抗除草剂基因。科研人员通过如图所示途径培育出具有抗除草剂性状的优良品质丙。图中字母表示过程、数字序号表示细胞。 下列相关叙述正确的是(D) A.过程A应置于高渗溶液中处理,再将①②诱导融合成③ B.过程B无需筛选鉴定,形成杂种细胞后即可接种到培养基中 C.过程C、D采用固体培养基,添加激素的种类和比例相同 D.杂种植物丙为二倍体,有的配子不含抗除草剂基因 解析　过程A为去除细胞壁的过程,该过程应置于等渗溶液中处理,而后再利用诱导融合的方法将①②诱导融合成③,再生出细胞壁为杂种细胞,A项错误;过程B获得的融合细胞未必都是由甲的细胞核和乙的细胞质融合形成的,因而需筛选鉴定,筛选出的杂种细胞即可接种到培养基中,B项错误;过程C、D分别为脱分化和再分化过程,这些过程需要在固体培养基中诱导产生,两过程中添加激素的种类和比例不同,C项错误;由于乙的细胞核失活,杂种植物丙为二倍体,形成配子时,细胞质中的抗除草剂基因随机分配,故有的配子不含抗除草剂基因,D项正确。 微真题重体悟 　 1.(2024·浙江1月选考,T8)山药在生长过程中易受病毒侵害导致品质和产量下降。采用组织培养技术得到脱毒苗,可恢复其原有的优质高产特性,流程如图。下列操作不可行的是(D) 外植体→愈伤组织→丛生芽→试管苗 A.选择芽尖作为外植体可减少病毒感染 B.培养基中加入抗生素可降低杂菌的污染 C.将丛生芽切割后进行继代培养可实现快速繁殖 D.提高生长素和细胞分裂素的比值可促进愈伤组织形成从生芽 解析　芽尖所含病毒少甚至不含病毒,利用芽尖组织培养可得到脱毒苗,A项正确;抗生素可以抑制杂菌生长,B项正确;将丛生芽切割后转移到新的培养基上继续进行扩大培养属于继代培养,使用此方法可以实现快速繁殖,C项正确;降低生长素和细胞分裂素的比值可促进丛生芽的形成,D项错误。 2.(2023·山东卷,T14)利用植物细胞培养技术在离体条件下对单个细胞或细胞团进行培养使其增殖,可获得植物细胞的某些次生代谢物。下列说法正确的是(A) A.利用该技术可获得某些无法通过化学合成途径得到的产物 B.植物细胞体积小,故不能通过该技术进行其产物的工厂化生产 C.次生代谢物是植物所必需的,但含量少,应选择产量高的细胞进行培养 D.该技术主要利用促进细胞生长的培养条件提高单个细胞中次生代谢物的含量 解析　某些次生代谢物合成过程很复杂,难以通过化学合成途径得到,而利用植物细胞培养技术可获得,A项正确;可以利用植物细胞培养技术大规模培养植物细胞,来大量获取次生代谢物,B项错误;次生代谢物不是植物生长所必需的,含量很低,C项错误;该技术主要通过促进细胞增殖,以提高次生代谢物的产量,D项错误。 3.(2021·北京卷,T7)研究者拟通过有性杂交的方法将簇毛麦(2n=14)的优良性状导入普通小麦(2n=42)中。用簇毛麦花粉给数以千计的小麦小花授粉,10天后只发现两个杂种幼胚,将其离体培养,产生愈伤组织,进而获得含28条染色体的大量杂种植株。下列叙述错误的是(C) A.簇毛麦与小麦之间存在生殖隔离 B.培养过程中幼胚细胞经过脱分化和再分化 C.杂种植株减数分裂时染色体能正常联会 D.杂种植株的染色体加倍后能产生可育植株 解析　簇毛麦与普通小麦是两个物种,存在生殖隔离,A项正确;在将杂种幼胚离体培养时,幼胚先脱分化形成愈伤组织,继而再分化出根、茎和叶,长成新植株,B项正确;形成的新植株含28条染色体,其中有7条染色体来自簇毛麦,有21条染色体来自普通小麦,在减数分裂过程中,染色体不能正常联会,C项错误;杂种植株的染色体加倍后,每一条染色体都有与其相同的染色体,在减数分裂过程中,染色体可以正常联会,进而产生可育后代,D项正确。 4.(2022·重庆卷,T15)植物体细胞通常被诱导为愈伤组织后才能表现全能性。研究发现,愈伤组织的中层细胞是根或芽再生的源头干细胞,其在不同条件下,通过基因的特异性表达调控生长素、细胞分裂素的作用,表现出不同的效应(如表)。已知生长素的生理作用大于细胞分裂素时有利于根的再生;反之,有利于芽的再生。下列推论不合理的是(C) 条件 基因表达产物和相互作用 效应 ① WOX5 维持未分化状态 ② WOX5+PLT 诱导出根 ③ WOX5+ARR2,抑制ARR5 诱导出芽 A.WOX5失活后,中层细胞会丧失干细胞特性 B.WOX5+PLT可能有利于愈伤组织中生长素的积累 C.ARR5促进细胞分裂素积累或提高细胞对细胞分裂素的敏感性 D.体细胞中生长素和细胞分裂素的作用可能相互抑制 解析　据题表可知,WOX5能维持未分化状态,若WOX5失活,中层细胞可能会丧失干细胞特性,A项不符合题意;由题干信息“已知生长素的生理作用大于细胞分裂素时有利于根的再生”,再结合题表可知,WOX5+PLT能诱导出根,推测WOX5+PLT可能有利于愈伤组织中生长素的积累,B项不符合题意;由题意可知,生长素的生理作用小于细胞分裂素时有利于芽的再生,再结合题表可知,抑制ARR5能诱导出芽,即ARR5被抑制时细胞分裂素的生理作用大于生长素的生理作用,故可推测ARR5抑制细胞分裂素积累或降低细胞对细胞分裂素的敏感性,C项符合题意;由题干信息可知,愈伤组织再生出芽或根取决于生长素与细胞分裂素的生理作用大小,推测体细胞中生长素和细胞分裂素的作用可能相互抑制,D项不符合题意。 5.(2023·浙江1月选考,T24)甲植物细胞核基因具有耐盐碱效应,乙植物细胞质基因具有高产效应。某研究小组用甲、乙两种植物细胞进行体细胞杂交相关研究,基本过程包括获取原生质体、诱导原生质体融合、筛选融合细胞、杂种植株再生和鉴定,最终获得高产耐盐碱再生植株。回答下列问题: (1)根据研究目标,在甲、乙两种植物细胞进行体细胞杂交前,应检验两种植物的原生质体是否具备形成再生植株的能力。为了便于观察细胞融合的状况,通常用不同颜色的原生质体进行融合,若甲植物原生质体来自幼苗的根,则乙植物原生质体来自幼苗的叶片。 (2)植物细胞壁的主要成分为纤维素和果胶,在获取原生质体时,常采用相应的酶进行去壁处理。在原生质体融合前,需对原生质体进行处理,分别使甲原生质体和乙原生质体的细胞质、细胞核失活。对处理后的原生质体在显微镜下用血细胞计数板计数,确定原生质体密度。两种原生质体1∶1混合后,通过添加适宜浓度的PEG进行融合;一定时间后,加入过量的培养基进行稀释,稀释的目的是终止原生质体融合。 (3)将融合原生质体悬浮液和液态的琼脂糖混合,在凝固前倒入培养皿,融合原生质体分散固定在平板中,并独立生长、分裂形成愈伤组织。同一块愈伤组织所有细胞源于一个融合原生质体。下列各项中能说明这些愈伤组织只能来自杂种细胞的理由是ABD(多选,填选项字母)。 A.甲、乙原生质体经处理后失活,无法正常生长、分裂 B.同种融合的原生质体因甲或乙原生质体失活而不能生长、分裂 C.培养基含有抑制物质,只有杂种细胞才能正常生长、分裂 D.杂种细胞由于结构和功能完整可以生长、分裂 (4)愈伤组织经再分化可形成胚状体或芽。胚状体能长出根和芽,直接发育形成再生植株。 (5)用PCR技术鉴定再生植株。已知甲植物细胞核具有特异性DNA序列a,乙植物细胞质具有特异性DNA序列b;M1、M2为序列a的特异性引物,N1、N2为序列b的特异性引物。完善实验思路: ①提取纯化再生植株的总DNA,作为PCR扩增的模板。 ②将DNA提取物加入PCR反应体系,M1、M2为特异性引物,扩增序列a;用同样的方法扩增序列b。 ③得到的2个PCR扩增产物经电泳后,若每个PCR扩增产物在凝胶中均出现了预期的1个条带,则可初步确定再生植株来自杂种细胞。 解析　(1)在甲、乙两种植物细胞进行体细胞杂交前,应检验两种植物的原生质体是否具备形成再生植株的能力。为了便于观察细胞融合的状况,通常用不同颜色的原生质体进行融合,若甲植物原生质体来自幼苗的根,则乙植物原生质体应来自幼苗的叶片(叶片细胞中含有叶绿体,叶片细胞的原生质体呈绿色)。(2)植物细胞壁的主要成分是纤维素和果胶。由于甲原生质体提供的是核基因,因此需使其细胞质失活;乙原生质体提供的是细胞质基因,因此需使其细胞核失活。可采用血细胞计数板对原生质体进行计数。加入过量的培养基可降低PEG浓度,终止原生质体融合。(3)由于融合原生质体分散固定在平板中,可独立生长、分裂形成愈伤组织,因此同一块愈伤组织所有细胞来源于一个融合原生质体。综合分析可知,甲原生质体的细胞质失活,乙原生质体的细胞核失活,因此,未发生融合的甲、乙原生质体,以及同种融合[甲(乙)原生质体与甲(乙)原生质体融合]的原生质体无法生长、分裂,A、B两项符合题意;杂种细胞的结构和功能完整,能够进行生长、分裂,D项符合题意。(4)愈伤组织经再分化能形成胚状体或芽。胚状体能长出根和芽,直接发育形成再生植株。(5)①提取纯化再生植株的总DNA,可作为PCR扩增的模板。②扩增序列a时所用的特异性引物是M1和M2。③PCR的扩增产物常用凝胶电泳进行鉴定。若在2个PCR扩增体系中能分别扩增出a序列和b序列,则将2个PCR扩增体系扩增的产物进行凝胶电泳后,可观察到1个凝胶中含a序列对应的1个条带,1个凝胶中含b序列对应的1个条带。 第40讲　动物细胞工程 [课标内容]　1.阐明动物细胞培养是从动物体获得相关组织,分散成单个细胞后,在适宜的培养条件下让细胞生长和增殖的过程。动物细胞培养是动物细胞工程的基础。2.阐明动物细胞核移植一般是将动物一个细胞的细胞核移入去核的卵母细胞中,并使重组细胞发育成新胚胎,继而发育成动物个体的过程。3.阐明动物细胞融合是指通过物理、化学或生物学等手段,使两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的过程。4.概述细胞融合技术是单克隆抗体制备的重要技术。5.简述干细胞在生物医学工程中有广泛的应用价值。 微考点大突破 考点一　动物细胞培养 　 1. 动物细胞培养 (1)概念:从动物体中取出相关的组织,将它分散成单个细胞,然后在适宜的培养条件下,让这些细胞生长和增殖的技术。 (2)培养条件。 (3)培养过程。 (4)辨析动物细胞培养相关的两组概念。 ①细胞贴壁与接触抑制。 a.细胞贴壁:悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上,这种现象称为细胞贴壁。 b.接触抑制:当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时,细胞通常会停止分裂增殖,这种现象称为接触抑制。 提醒　打破接触抑制现象的方法是将贴满瓶壁的细胞重新用胰蛋白酶等处理,然后分瓶继续培养。 ②原代培养与传代培养。 a.原代培养:分瓶之前的细胞培养,即动物组织经处理后的初次培养。 b.传代培养:分瓶后的细胞培养。 2.干细胞培养及其应用 (1)分布:存在于早期胚胎、骨髓和脐带血等多种组织和器官中。 (2)类型及比较。 项目 胚胎干细胞 (ES细胞) 成体干细胞 诱导多能干细 胞(iPS细胞) 早期胚胎 成体组织或器官中,包括造血干细胞、神经干细胞、精原干细胞等 最初通过体外诱导小鼠成纤维细胞获得,也可诱导已分化的B细胞、T细胞产生 特性 具有分化为成年动物体内的任何一种类型的细胞,并进一步形成机体的所有组织和器官甚至个体的潜能 具有组织特异性,只能分化成特定的细胞或组织,不具有发育成完整个体的能力 能诱导分化成类似胚胎干细胞的一种细胞,将它移植回病人体内后,理论上可以避免免疫排斥反应 分化 程度 胚胎干细胞<诱导多能干细胞<成体干细胞 (3)干细胞的应用。 ①用于治疗白血病及一些恶性肿瘤放疗或化疗后引起的造血系统、免疫系统功能障碍等疾病。 ②治疗神经组织损伤和神经系统退行性疾病,如帕金森病、阿尔茨海默病等。 (1)用烧伤病人自体健康皮肤的单个细胞培养出的皮肤进行自体移植可避免免疫排斥反应。(选择性必修3 P43“从社会中来”)(√) (2)体外培养的动物细胞一类能悬浮在培养液中生长增殖,另一类需要贴附于某些基质表面才能生长增殖。(源自选择性必修3 P44)(√) (3)进行动物细胞培养时常用胃蛋白酶分散成单个细胞。(选择性必修3 P44“旁栏思考”)(×) (4)人们通常将动物组织经处理后的初次培养称为原代培养,将分瓶后的细胞培养称为传代培养。(源自选择性必修3 P45)(√) (5)幼龄动物的细胞比老龄动物的细胞更容易进行动物细胞培养。(选择性必修3 P45“思考·讨论”)(√) (6)可借助载体将特定基因导入细胞中,直接将特定蛋白导入细胞中或者用小分子化合物等来诱导形成iPS细胞。(选择性必修3 P46“相关信息”)(√) 为什么说iPS细胞的应用前景要优于ES细胞? 答:ES细胞必须从胚胎中获取,涉及伦理问题,限制了其在医学上的应用。iPS细胞的诱导过程无须破坏胚胎,而且iPS细胞可以来自病人自身的体细胞,将它移植回病人体内后,理论上可以避免免疫排斥反应。 能力一　动物细胞培养的应用(考查科学思维) 1.(2022·湖北卷,T15)纳米氧化亚铜是一种纳米材料。为了探究纳米氧化亚铜对贴壁生长细胞活性的影响,研究者在培养基中添加一定量的纳米氧化亚铜,8小时后观察到细胞萎缩,体积变小,细胞核变大,细胞膜内侧出现纳米氧化亚铜富集现象,培养瓶中大量贴壁细胞脱落,出现细胞悬浮。根据该实验现象,能得出的正确结论是(A) A.纳米氧化亚铜改变了细胞的贴壁生长习性 B.纳米氧化亚铜对该细胞生长有抑制作用 C.纳米氧化亚铜能通过自由扩散进入细胞 D.纳米氧化亚铜不影响细胞的新陈代谢 解析　细胞贴壁生长会使细胞由于不断增殖产生接触抑制,而纳米氧化亚铜会使贴壁细胞脱落,出现细胞悬浮,因此纳米氧化亚铜改变了细胞的贴壁生长习性,A项正确;根据题意可知纳米氧化亚铜促进了细胞的衰老,B项错误;由题干信息“细胞膜内侧出现纳米氧化亚铜富集现象”,说明纳米氧化亚铜能进入细胞,但不能推断是通过自由扩散进入细胞的,C项错误;纳米氧化亚铜会促进细胞衰老,即影响了细胞的新陈代谢,D项错误。 动物细胞培养和植物组织培养的比较 2.(2024·黑吉辽卷,T14)从小鼠胚胎中分离获取胚胎成纤维细胞进行贴壁培养,在传代后的不同时间点检测细胞数目,结果如图。下列叙述正确的是(D) A.传代培养时,培养皿需密封防止污染 B.选取①的细胞进行传代培养比②更合理 C.直接用离心法收集细胞进行传代培养 D.细胞增长进入平台期可能与细胞密度过大有关 解析　传代培养小鼠的胚胎成纤维细胞,应该将细胞置于含有95%空气和5%CO2的混合气体的CO2培养箱中进行培养,A项错误;细胞通常在进入平台期之前的指数增长期进行传代,这样可以提高细胞增长速率(该阶段细胞代谢活性及酶活性高而稳定,生活力强)并避免延迟期,①太接近延迟期(细胞数目少,还处于适应环境阶段,未充分活化,不宜选),故选取②的细胞更合理,B项错误;贴壁生长的细胞需经胰蛋白酶等处理,使之分散成单个细胞,然后再用离心法收集,C项错误;题图中细胞增长进入平台期后,细胞数目比较稳定,可能受到细胞密度过大、营养物质有限等因素的制约,D项正确。 能力二　干细胞的培养和应用分析(考查社会责任) 3.(多选)(2020·江苏卷,T23)小鼠胚胎干细胞经定向诱导可获得多种功能细胞,制备流程如图所示。下列叙述错误的是 (ABC) A.为获得更多的囊胚,采用激素注射促进雄鼠产生更多的精子 B.细胞a和细胞b内含有的核基因不同,所以全能性高低不同 C.用胰蛋白酶将细胞a的膜蛋白消化后可获得分散的胚胎干细胞 D.胚胎干细胞和诱导出的各种细胞都需在CO2培养箱中进行培养 解析　为获得更多的囊胚,应采用激素注射促进雌鼠产生更多的卵细胞,A项错误。细胞a、b都是由同一个受精卵经有丝分裂而来的,遗传物质相同,两者全能性高低不同并不是由遗传物质不同导致的;细胞a为内细胞团细胞,分化程度较低,细胞全能性较高,将来发育成胎儿的各种组织,细胞b为滋养层细胞,分化程度较高,细胞全能性较低,将来发育成胎膜和胎盘,B项错误。胰蛋白酶可以催化细胞之间的蛋白质分解,进而可获得分散的胚胎干细胞,C项错误。胚胎干细胞和诱导出的各种细胞需置于含95%空气加5%CO2的混合气体的培养箱中进行培养,O2是细胞代谢所必需的,CO2的主要作用是维持培养液的pH,D项正确。 4.(2023·重庆卷,T16)妊娠与子宫内膜基质细胞的功能密切相关。某研究小组通过如图所示的实验流程获得了子宫内膜基质细胞,以期用于妊娠相关疾病的研究。 (1)手术获得的皮肤组织需在低温下运至实验室,低温对细胞中各种蛋白质的作用为抑制酶的活性(降低蛋白质或酶的活性),防止蛋白质变性(维持蛋白质的结构,抑制蛋白质变性)。 (2)过程①中,诱导形成iPS细胞时,需提高成纤维细胞中4个基因的表达量,可采用转基因(或显微注射、病毒介导、基因工程)技术将这些基因导入该细胞。这4个基因的主要作用为M基因促进增殖,S基因和C基因控制干细胞特性,K基因抑制凋亡和衰老。若成纤维细胞形成肿瘤细胞,最有可能的原因是M基因过量表达。 (3)培养iPS细胞时,应对所处环境定期消毒以降低细胞被污染风险。可用紫外线进行消毒的是CD(多选,填选项字母)。 A.培养基 B.培养瓶 C.细胞培养室 D.CO2培养箱 (4)过程②中,iPS细胞经历的生命历程为增殖分化(分裂分化)。PCR技术可用于检测子宫内膜基质细胞关键基因的mRNA水平,mRNA需经过逆转录才能作为PCR扩增的模板。 解析　(1)低温可以抑制酶的活性,防止蛋白质变性,皮肤组织在低温下运至实验室,可使细胞中的蛋白质维持正常的结构。(2)将外源基因导入iPS细胞(动物受体细胞)内,通常采用显微注射法,肿瘤细胞能无限增殖,根据题干“M基因促进增殖”推测,可能是M基因过量表达,造成成纤维细胞无限增殖形成肿瘤细胞。(3)根据无菌技术要求,对细胞培养室和CO2培养箱可以采用紫外线进行消毒,而对培养基和培养瓶需要进行灭菌处理,C、D两项正确。(4)由题图可知,过程②中,人iPS细胞形成了体腔上皮,该过程细胞数量增加,并且细胞的形态结构和功能发生了改变,所以该过程发生了细胞的增殖分化(或者分裂分化);PCR是一项根据DNA半保留复制的原理,在体外适宜条件下,对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术,其扩增的模板为DNA,若想利用PCR技术检测子宫内膜基质细胞关键基因的mRNA水平,mRNA需经过逆转录过程形成DNA后,才可作为PCR扩增的模板。 考点二　动物细胞融合技术与单克隆抗体 　 1.动物细胞融合技术 2.单克隆抗体及其应用 (1)制备原理。 ①B淋巴细胞的特点:B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体。 ②骨髓瘤细胞的特点:骨髓瘤细胞能在体外无限增殖。 ③杂交瘤细胞的特点:既能迅速大量增殖,又能产生抗体。 (2)制备过程。 ①用特定抗原对小鼠进行免疫的原因:B淋巴细胞要经过免疫过程,即接触抗原,增殖分化为有特异性免疫功能的B淋巴细胞,才能产生相应的抗体,所以,与骨髓瘤细胞融合的B淋巴细胞实际上是经过特定抗原免疫的B淋巴细胞。 ②单克隆抗体制备过程中两次筛选的方法及目的。 项目 第一次筛选 第二次筛选 筛选 原因 诱导融合后会得到多种杂交细胞,另外还有未融合的细胞 由于小鼠在生活中还受到其他抗原的刺激,所以经选择培养获得的杂交瘤细胞中有能产生其他抗体的细胞 筛选 方法 用特定的选择培养基筛选:在该培养基上,未融合的细胞和同种细胞融合后形成的细胞(“B—B”细胞、“瘤—瘤”细胞)都会死亡,只有融合的杂交瘤细胞(“B—瘤”细胞)才能生长 用96孔板培养和筛选:在每个孔只有一个杂交瘤细胞的情况下开始克隆化培养和专一抗体检测,经多次筛选得到能产生特异性抗体的细胞群 筛选 目的 得到杂交瘤细胞 得到能分泌所需抗体的杂交瘤细胞 (3)优点。 ①能准确地识别抗原的细微差异,与特定抗原发生特异性结合(特异性强、灵敏度高)。 ②可以大量制备。 (4)用途。 ①被广泛用作诊断试剂,在多种疾病的诊断和病原体鉴定中发挥重要的作用。 ②运载药物,形成抗体—药物偶联物,实现对肿瘤细胞的选择性杀伤。 ③用于治疗疾病。 (1)灭活的病毒能促进动物细胞融合,但不能促进植物细胞融合。(源自选择性必修3 P48)(√) (2)灭活是用极端的物理或化学手段杀灭细菌或病毒,使其各种结构都失去相应的功能。(选择性必修3 P48“相关信息”)(×) (3)在选择培养基上,未融合的亲本细胞会死亡,融合的三种细胞类型(只考虑两个细胞间融合)都能生长。(选择性必修3 P48“图2-16”)(×) (4)多种B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合筛选后,还需经克隆化培养和抗体检测,才能获得足够数量的能分泌所需抗体的杂交瘤细胞。(选择性必修3 P48、49“图2-16”)(√) (5)抗体—药物偶联物通常由抗体、接头、药物(如细胞毒素)三部分组成。(选择性必修3 P50“思考·讨论”)(√) (6)抗体—药物偶联物(ADC)通过将细胞毒素与能特异性识别肿瘤抗原的单克隆抗体结合,实现了对肿瘤细胞的选择性杀伤。(选择性必修3 P50“思考·讨论”)(√) 1.为什么诱导动物细胞融合时要用灭活的病毒,而不用活病毒?诱导细胞融合的原理是什么? 答:活病毒可能会感染细胞,而灭活的病毒不会感染细胞。诱导细胞融合的原理是病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能够与细胞膜上的糖蛋白发生作用,使细胞互相凝聚,细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布,细胞膜打开,细胞发生融合。 2.将VCR(一种抗癌药物)与抗人肝癌单克隆抗体HAb18通过接头连接形成抗体—药物偶联物(ADC),可实现对肝癌细胞的特异性杀伤,ADC的作用机制如图。据图分析,ADC的抗体和药物(VCR)各具有什么作用? 答:ADC的抗体主要发挥靶向运输作用,携带VCR与肝癌细胞特异性结合;药物(VCR)发挥治疗效应,通过抑制微管蛋白聚合妨碍纺锤体的形成,从而阻断肝癌细胞分裂,诱导肝癌细胞凋亡。 能力　动物细胞融合技术与单克隆抗体的应用(考查科学思维、科学探究) 1.(多选)(2024·江西卷,T16)某病毒颗粒表面有一特征性的大分子结构蛋白S(含有多个不同的抗原决定基,每一个抗原决定基能够刺激机体产生一种抗体)。为了建立一种灵敏、高效检测S蛋白的方法,研究人员采用杂交瘤技术制备了抗-S单克隆抗体(如图)。下列说法正确的是 (AD) A.利用胶原蛋白酶处理,可分散贴壁生长的骨髓瘤细胞 B.制备的单克隆抗体A和单克隆抗体B是相同的单克隆抗体 C.用于生产单克隆抗体的杂交瘤细胞可传代培养,但不能冻存 D.单克隆抗体A和单克隆抗体B都能够特异性识别S蛋白 解析　分散骨髓瘤细胞时,可用胰蛋白酶、胶原蛋白酶等处理,A项正确;由于蛋白S含有多个不同的抗原决定基,不同的抗原决定基能够刺激机体产生不同的抗体,故制备的单克隆机体A和单克隆抗体B不一定相同,B项错误;杂交瘤细胞可以传代培养,也可以冷冻保存,且在解冻后可以再进行细胞复苏和传代培养,C项错误;S蛋白上既有与单克隆抗体A特异性结合的抗原决定基,又有与单克隆抗体B特异性结合的抗原决定基,D项正确。 2.(2023·湖北卷,T22节选)某病毒对动物养殖业危害十分严重。我国学者拟以该病毒外壳蛋白A为抗原来制备单克隆抗体,以期快速检测该病毒,其主要技术路线如图所示。 回答下列问题: (1)与小鼠骨髓瘤细胞融合前,已免疫的脾细胞(含浆细胞)不需要(填“需要”或“不需要”)通过原代培养扩大细胞数量;添加脂溶性物质PEG可促进细胞融合,该过程中PEG对细胞膜的作用是使细胞接触处的磷脂分子重新排布,细胞膜打开,细胞发生融合。 (2)在杂交瘤细胞筛选过程中,常使用特定的选择培养基(如HAT培养基),该培养基对未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞生长具有抑制作用。 (3)单克隆抗体筛选中,将抗体与该病毒外壳蛋白进行杂交,其目的是通过抗体检测呈阳性来获得分泌所需抗体的杂交瘤细胞。 解析　(1)浆细胞是高度分化的细胞,不能增殖,所以不能通过原代培养扩大细胞数量。脂溶性物质PEG可使细胞接触处的磷脂分子重新排布,细胞膜打开,细胞发生融合。(2)在杂交瘤细胞筛选过程中,常用特定的选择培养基进行筛选,在该培养基上,未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡,只有融合的杂交瘤细胞才能生长。(3)单克隆抗体筛选中,将抗体与该病毒外壳蛋白进行杂交,是运用了抗原—抗体杂交技术,抗体检测呈阳性的细胞,即为所需的杂交瘤细胞。 考点三　动物体细胞核移植技术和克隆动物 　 1.动物细胞核移植技术 (1)概念分析。 ①供体:动物一个细胞的细胞核。 ②受体:去核的卵母细胞。 ③结果:重新组合的细胞发育成新胚胎,继而发育成动物个体。 ④原理:动物细胞核的全能性。 (2)哺乳动物核移植类型:胚胎细胞核移植和体细胞核移植。 2.体细胞核移植的过程 3.体细胞核移植技术的应用前景及存在的问题 (1)动物体细胞核移植的受体细胞必须是卵细胞。(源自选择性必修3 P52)(×) (2)减数分裂Ⅱ中期(MⅡ期)卵母细胞中的“核”其实是纺锤体—染色体复合物。(选择性必修3 P52“相关信息”)(√) (3)重构胚的激活可用Ca2+载体、蛋白酶合成抑制剂等方法。(选择性必修3 P53“图2-18”)(√) (4)重构胚是天然形成的胚胎,具有发育成完整个体的能力。(选择性必修3 P53“相关信息”)(×) (5)克隆动物具备两个亲本的遗传特性,因此克隆动物的制备属于有性繁殖。(源自选择性必修3 P53)(×) (6)动物细胞核移植技术中普遍使用的去核方法是显微操作法。(选择性必修3 P54“相关信息”)(√) 1.动物体细胞核移植过程中为什么选择MⅡ期的卵母细胞作为受体细胞? 答:①细胞大,易于操作;②卵黄多,营养丰富,为胚胎发育提供充足的营养;③此时具备受精能力,细胞质中含有促使细胞核表现全能性的物质。 2.(选择性必修3 P55“概念检测”2)某国批准了首例使用细胞核移植技术培育“三亲婴儿”的申请,其培育过程可选用如下技术路线。 (1)探究“三亲婴儿”的性状表现与三个亲本的关系并分析原因。 答:①因基因型与母亲(卵母细胞核供体)和父亲(精子细胞核供体)的核基因有关,大多数性状由母亲和父亲共同决定。②少数性状(受质基因控制的性状)与捐献者(卵母细胞细胞质供体)相同。 (2)所谓的“三亲婴儿”中遗传学上的母亲应是哪一个?该技术主要是为了避免什么疾病? 答:“三亲婴儿”中遗传学上的母亲应是提供卵母细胞核的个体。该技术主要是为了避免母亲的线粒体遗传病基因传递给后代。 (3)据图分析,该技术涉及了哪些技术操作? 答:该技术涉及动物细胞培养、体外受精、细胞核移植、胚胎移植等操作。 (4)动物细胞核移植技术的理论基础(原理)是什么? 答:动物细胞核的全能性。 能力　动物体细胞核移植技术和克隆动物(考查科学思维、社会责任) 1.(2021·辽宁卷,T13)如图是利用体细胞核移植技术克隆优质奶牛的简易流程图。下列有关叙述正确的是(B) A.后代丁的遗传性状由甲和丙的遗传物质共同决定 B.过程①需要提供95%空气和5%CO2的混合气体 C.过程②常使用显微操作去核法对受精卵进行处理 D.过程③将激活后的重组细胞培养至原肠胚后移植 解析　后代丁的遗传性状由提供核基因的甲和提供质基因的乙共同决定,A项错误;动物细胞培养过程需要提供95%空气和5%的CO2的混合气体,B项正确;过程②常通过显微操作去除卵母细胞中的核,而不是受精卵中的核,C项错误;一般将过程③激活的重组细胞培养至桑葚胚或囊胚阶段后移植,D项错误。 (1)体细胞核移植时,必须先对卵母细胞进行去核操作,其目的是使核移植后得到的胚胎或动物的遗传物质绝大部分来自有重要利用价值的动物提供的细胞核。 (2)哺乳动物的核移植可以分为胚胎细胞核移植和体细胞核移植,通过胚胎细胞核移植获得克隆动物的难度小于(填“大于”或“小于”)体细胞核移植,其原因是胚胎细胞分化程度相对较低,恢复全能性相对容易。 (3)核移植过程中用物理或化学方法(如电刺激、乙醇和蛋白酶合成抑制剂等)激活重构胚,其目的是使其完成细胞分裂和发育进程。 2.(2025·重庆模拟)2017年,世界上第一例、第二例体细胞克隆猴先后在中国诞生,标志着中国在非人灵长类疾病动物模型研究中处于国际领先地位。科学家为了提高胚胎发育率和妊娠率,将组蛋白去甲基化酶的mRNA注入重构胚,同时用组蛋白脱乙酰酶抑制剂(TSA)处理,简化过程如下。下列说法正确的是(B) A.“去核”指的是去除卵母细胞的细胞核 B.体细胞和去核卵母细胞的融合可以采用电融合、PEG融合等方法 C.胚胎移植前需要对代孕母猴进行同期发情和超数排卵处理 D.重构胚一般需要发育到囊胚或原肠胚后才进行胚胎移植 解析　将卵母细胞培养到MⅡ期后进行去核操作,此时细胞核退化,出现的是纺锤体—染色体复合物,故去核的实质是去除卵母细胞中的纺锤体—染色体复合物,而不是细胞核,A项错误;动物细胞融合可以采用电融合、PEG融合、灭活病毒诱导等方法,B项正确;代孕母猴不需要进行超数排卵处理,供体母猴才需要,C项错误;重构胚一般发育到囊胚或桑葚胚才进行细胞移植,而不是原肠胚,D项错误。 微真题重体悟 　 1.(2023·北京卷,T12)甲状旁腺激素(PTH)水平是人类多种疾病的重要诊断指标。研究者制备单克隆抗体用于快速检测PTH,有关制备过程的叙述不正确的是(D) A.需要使用动物细胞培养技术 B.需要制备用PTH免疫的小鼠 C.利用抗原—抗体结合的原理筛选杂交瘤细胞 D.筛选能分泌多种抗体的单个杂交瘤细胞 解析　制备单克隆抗体时,需要对杂交瘤细胞、骨髓瘤细胞等动物细胞进行动物细胞培养,A项正确;单克隆抗体制备过程中,给小鼠注射特定抗原(PTH),使其发生免疫反应,从而获得能产生特定抗体的B淋巴细胞,B项正确;单克隆抗体制备过程中,利用抗原—抗体结合的原理进行第二次筛选,可获得能分泌所需抗体的杂交瘤细胞,C项正确;筛选出的单个杂交瘤细胞具有特异性,通常只能分泌一种抗体,D项错误。 2.(2022·江苏卷,T14)航天员叶光富和王亚平在天宫课堂上展示了培养的心肌细胞跳动的视频。下列相关叙述正确的是(B) A.培养心肌细胞的器具和试剂都要先进行高压蒸汽灭菌 B.培养心肌细胞的时候既需要氧气也需要二氧化碳 C.心肌细胞在培养容器中通过有丝分裂不断增殖 D.心肌细胞在神经细胞发出的神经冲动的支配下跳动 解析　动物细胞培养液中的某些成分(如血清中的蛋白质)不耐高温,A项错误;O2是细胞代谢所必需的,CO2可维持培养液的pH,培养动物细胞的气体环境为95%空气和5% CO2,B项正确;心肌细胞高度分化,高度分化的细胞一般不具有分裂能力,C项错误;心肌细胞在神经细胞释放的神经递质的作用下跳动,D项错误。 3.(多选)(2022·江苏卷,T19)如图表示利用细胞融合技术进行基因定位的过程,在人—鼠杂种细胞中人的染色体会以随机方式丢失,通过分析基因产物进行基因定位。现检测细胞Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中人的4种酶活性,只有Ⅱ具有芳烃羟化酶活性,只有Ⅲ具有胸苷激酶活性,Ⅰ、Ⅲ都有磷酸甘油酸激酶活性,Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ均有乳酸脱氢酶活性。下列相关叙述正确的是 (ACD) A.加入灭活仙台病毒的作用是促进细胞融合 B.细胞Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ分别为人—人、人—鼠、鼠—鼠融合细胞 C.芳烃羟化酶基因位于2号染色体上,乳酸脱氢酶基因位于11号染色体上 D.胸苷激酶基因位于17号染色体上,磷酸甘油酸激酶基因位于X染色体上 解析　诱导动物细胞融合的方法有灭活病毒诱导法,故加入灭活仙台病毒的作用是促进动物细胞融合,A项正确;题述三种融合细胞为杂种细胞,都保留了人的部分染色体,即Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ细胞均为人—鼠融合细胞,B项错误;根据题干和题图可知,只有Ⅱ具有芳烃羟化酶活性,只有Ⅲ具有胸苷激酶活性,Ⅰ、Ⅲ都有磷酸甘油酸激酶活性,Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ均有乳酸脱氢酶活性,由三种融合细胞所保留的人类染色体可知,Ⅱ中特有的染色体为2号染色体,Ⅲ中特有的染色体为17号染色体,Ⅰ、Ⅲ中共有而Ⅱ中没有的染色体为X染色体,Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中共有的染色体为11号染色体,因此芳烃羟化酶基因位于2号染色体上,胸苷激酶基因位于17号染色体上,磷酸甘油酸激酶基因位于X染色体上,乳酸脱氢酶基因位于11号染色体上,C、D两项正确。 4.(2023·海南卷,T7)某团队通过多代细胞培养,将小鼠胚胎干细胞的Y染色体去除,获得XO胚胎干细胞,再经过一系列处理,使之转变为有功能的卵母细胞。下列有关叙述错误的是(A) A.营养供应充足时,传代培养的胚胎干细胞不会发生接触抑制 B.获得XO胚胎干细胞的过程发生了染色体数目变异 C.XO胚胎干细胞转变为有功能的卵母细胞的过程发生了细胞分化 D.若某濒危哺乳动物仅存雄性个体,可用该法获得有功能的卵母细胞用于繁育 解析　传代培养的胚胎干细胞增殖到贴满瓶壁时会发生接触抑制,A项错误;据题干“将小鼠胚胎干细胞的Y染色体去除,获得XO胚胎干细胞”可知,该过程中发生了染色体数目变异,B项正确;XO胚胎干细胞转变为有功能的卵母细胞过程中,细胞的形态、结构和生理功能发生了变化,即发生了细胞分化,C项正确;若某濒危哺乳动物仅存雄性个体,可以通过去除胚胎干细胞的Y染色体等一系列处理获得有功能的卵母细胞,用于繁殖后代,D项正确。 5.(2020·全国卷Ⅰ,T38)为研制抗病毒A的单克隆抗体,某同学以小鼠甲为实验材料设计了以下实验流程。 回答下列问题: (1)上述实验前必须给小鼠甲注射病毒A,该处理的目的是诱导小鼠甲产生能够分泌抗病毒A抗体的B淋巴细胞。 (2)写出以小鼠甲的脾脏为材料制备单细胞悬液的主要实验步骤:取小鼠甲脾脏剪碎,用胰蛋白酶处理使其分散成单个细胞,加入培养液制成单细胞悬液。 (3)为了得到能产生抗病毒A的单克隆抗体的杂交瘤细胞,需要进行筛选。图中筛选1所采用的培养基属于选择培养基,使用该培养基进行细胞培养的结果是只有杂交瘤细胞能够生存。图中筛选2含多次筛选,筛选所依据的基本原理是抗原与抗体的反应具有特异性。 (4)若要使能产生抗病毒A的单克隆抗体的杂交瘤细胞大量增殖,可采用的方法有将杂交瘤细胞注射到小鼠腹腔内增殖;将杂交瘤细胞在体外培养(答出2点即可)。 解析　(1)利用小鼠甲制备单克隆抗体时,先要给小鼠甲注射相应的抗原,目的是获得经免疫的、能产生相应抗体的B淋巴细胞。(2)利用小鼠甲的脾脏制备单细胞悬液的主要步骤是①取小鼠甲的脾脏并剪碎;②用胰蛋白酶处理使其分散成单个细胞;③利用培养液将分散的细胞制成细胞悬液。(3)为了得到所需要的杂交瘤细胞,在细胞培养过程中要进行筛选。第一次筛选(筛选1)是利用选择培养基进行筛选,在选择培养基上只有融合的杂种细胞才能生长,未融合的、同种细胞融合的细胞都不能存活。后续过程还需要利用抗原与抗体的反应具有特异性的原理进行多次筛选(筛选2),目的是得到既能迅速大量增殖,又能产生抗体的杂交瘤细胞。(4)若要将得到的杂交瘤细胞进行大量培养,可以在体外条件下进行大规模培养或将其注射到小鼠腹腔内增殖。 第41讲　胚胎工程　生物技术的安全性与伦理问题 [课标内容]　1.简述胚胎形成经过了受精及胚胎早期发育等过程。2.简述胚胎工程包括体外受精、胚胎移植和胚胎分割等技术。 微考点大突破 考点一　受精和胚胎早期发育 　 1.胚胎工程 2.受精 (1)概念:精子与卵子结合形成合子(即受精卵)的过程。 (2)场所:在自然条件下,哺乳动物的受精在输卵管内完成。 (3)过程。 提醒　①精子获能是指精子获得受精“能力”,而不是获得能量;排卵是指卵子从卵泡中排出,而不是卵泡从卵巢中排出。 ②卵子的减数分裂Ⅱ、受精作用和受精卵的早期细胞分裂都是在雌性动物的输卵管中进行的。 ③卵子减数分裂Ⅱ是在精子和卵子结合的过程中完成的。 3.胚胎早期发育 4.孵化 (1)概念:囊胚进一步扩大,会导致透明带破裂,胚胎从其中伸展出来的过程。 (2)意义:如果不能正常孵化,胚胎就无法继续发育。 (1)可以直接利用雌性动物的生殖道使精子获能,或者将精子培养在人工配制的获能液中使其获能,卵子必须发育到MⅡ期才具备与精子受精的能力。(选择性必修3 P56“相关信息”和P57“正文”)(√) (2)在精子触及卵细胞膜的瞬间,卵细胞膜内的透明带会迅速发生生理反应,阻止后来的精子进入透明带。(源自选择性必修3 P57)(×) (3)精子入卵后形成雄原核;精子入卵后被激活的卵子完成减数分裂Ⅱ,排出第二极体后,形成雌原核。(源自选择性必修3 P57)(√) (4)胚胎发育过程中,囊胚进一步扩大,会导致透明带破裂,胚胎从其中伸展出来,这一过程叫作孵化。(源自选择性必修3 P58)(√) (5)在胚胎工程操作中,常以观察到两个极体或者雌、雄原核作为受精的标志。(选择性必修3 P58“相关信息”)(√) 1.防止多精入卵受精的生理反应有哪些?有什么意义? 答:有两道屏障,一是透明带发生生理反应,二是卵细胞膜发生生理反应。防止多精入卵,保证受精卵中遗传物质与亲代体细胞一致,从而保证遗传的稳定性。 2.回答下列有关胚胎早期发育的问题。 (1)受精卵早期分裂时胚胎中有机物的总量和种类是如何变化的? 答:有机物的总量不断减少,但有机物的种类增加。 (2)胚胎早期发育过程中,具有全能性的时期有哪些? 答:桑葚胚期及之前的时期。 能力　胚胎工程的理论基础(考查科学思维) 1.(2024·湖北卷,T10)研究者探究不同浓度的雌激素甲对牛的卵母细胞和受精卵在体外发育的影响,实验结果如表所示。根据实验数据,下列叙述错误的是(A) 甲的浓度 (μg/mL) 卵母细 胞(个) 第一极体 排出(个) 成熟 率(%) 卵裂 数(个) 卵裂 率(%) 0 106 70 66.0 28 40.0 1 120 79 65.8 46 58.2 10 113 53 46.9 15 28.3 100 112 48 42.8 5 10.4 A.实验结果说明甲抑制卵裂过程 B.甲浓度过高抑制第一极体的排出 C.添加1 μg/mL的甲可提高受精后胚胎发育能力 D.本实验中,以第一极体的排出作为卵母细胞成熟的判断标准 解析　由题表可知,甲的浓度为1 μg/mL时,卵裂率高于对照组,说明此浓度的甲能促进卵裂过程,即提高受精后胚胎发育能力,A项错误,C项正确;当甲浓度为10 μg/mL和100 μg/mL时,卵母细胞的成熟率均低于对照组,故甲浓度过高时抑制第一极体的排出,B项正确;本实验中卵母细胞的成熟率=第一极体排出的个数/卵母细胞的个数,故以第一极体的排出作为卵母细胞成熟的判断标准,D项正确。 2.(2025·南京模拟)下列有关哺乳动物早期胚胎发育的叙述,错误的是(A) A.在桑葚胚阶段胚胎的内部开始出现含有液体的腔 B.胚胎干细胞是一类未分化的细胞,可以从早期胚胎中分离获得 C.桑葚胚之前细胞一般都具有全能性,囊胚的细胞逐渐分化 D.受精卵早期分裂时,胚胎中细胞数目不断增加,但胚胎的总体积并不增加 解析　在囊胚阶段,胚胎的内部出现了含有液体的腔,A项错误;胚胎干细胞是一类未分化的细胞,可以从早期胚胎或原始性腺中分离获得,B项正确;桑葚胚之前的细胞一般都具有全能性,囊胚的细胞逐渐分化,C项正确;受精卵早期分裂时,胚胎中细胞数目不断增加,但胚胎的总体积并不增加,D项正确。 考点二　胚胎工程技术及其应用 　 1.体外受精 (1)过程。 (2)意义。 ①提高动物繁殖能力的有效措施。 ②为胚胎移植提供可用的胚胎。 提醒　体外受精技术并非胚胎自始至终都在体外发育,而是胚胎发育的初期在培养皿或试管中,培养一段时间后需移植到母体内继续发育。 2.胚胎移植 (1)概念。 (2)基本程序。 提醒　 两次激 素使用 第一次:常用孕激素对供、受体进行同期发情处理;第二次:用外源促性腺激素处理使供体超数排卵 两次 检查 第一次:对收集的胚胎进行检查;第二次:对受体母畜是否妊娠进行检查 移植时 间不同 牛、羊要培养到囊胚阶段移植;小鼠、家兔培养到桑葚胚前移植;几乎所有动物都不能培养到原肠胚阶段才移植 繁殖 方式 胚胎由受精卵形成,属于有性生殖;胚胎由核移植或胚胎分割形成,属于无性生殖 (3)生理学基础。 (4)意义。 ①充分发挥雌性优良个体的繁殖潜力。 ②大大缩短了供体本身的繁殖周期。 ③对供体施行超数排卵处理后,增加后代数量。 3.胚胎分割 (1)概念:采用机械方法将早期胚胎切割成2等份、4等份或8等份等,经移植获得同卵双胎或多胎的技术。 (2)材料:应选择发育良好、形态正常的桑葚胚或囊胚。 (3)实质:胚胎分割可增加动物后代的数量,其实质是动物的无性繁殖(或克隆)。 (4)操作程序。 (5)要求:要注意将内细胞团均等分割,否则会影响分割后胚胎的恢复和进一步发育。 (6)意义。 ①促进优良动物品种的繁殖,产生的遗传性状相同的后代是进行遗传学研究的宝贵材料。 ②在胚胎移植前,进行性别鉴定、遗传病筛查等,对于人工控制动物性别、动物繁育健康后代具有重要意义。 (1)采集得到的卵母细胞和精子可直接用于体外受精操作。(源自选择性必修3 P60)(×) (2)在进行胚胎分割时,应选择发育良好、形态正常的桑葚胚、囊胚或原肠胚。分割囊胚时要注意将内细胞团均等分割。(源自选择性必修3 P62)(×) (3)为避免代孕绵羊对植入胚胎产生排斥反应,应注射免疫抑制剂。(选择性必修3 P62“思考·讨论”)(×) (4)胚胎分割过程中,可取滋养层细胞做DNA分析,鉴定性别。(选择性必修3 P63“图2-25”)(√) (5)胚胎分割技术得到的动物遗传物质相同,它们的性别、体重和性状也完全相同。(选择性必修3 P63“资料卡”)(×) 胚胎移植技术在畜牧生产中占有重要的位置,且胚胎移植技术是胚胎工程不可缺少的终端环节。回答下列问题: (1)为什么应对供体和受体母畜进行同期发情处理? 答:使它们的生理条件达到同步或一致,这样才能使供体的胚胎移入受体后有相似的生理环境。 (2)在胚胎移植过程中有两次使用激素、两次检查,其目的分别是什么? 答:第一次用孕激素对受、供体进行同期发情处理,第二次用外源促性腺激素处理使供体超数排卵。第一次是对收集的胚胎进行质量检查,第二次是对受体母畜是否妊娠进行检查。 (3)胚胎移植中的胚胎有哪些来源? 答:体外受精、转基因技术或者细胞核移植技术等方式获得的胚胎都可供胚胎移植。 1.比较自然受精、人工授精和体外受精 自然受精 人工授精 体外受精 过程 不同 雌雄动物交配完成 用人工的方法将公畜的精液注入母畜生殖道内,完成受精 人工获取精子、卵子,在体外培养液中完成受精过程 场所 不同 雌性动物输卵管中 雌性动物输卵管中 体外培养液中 相同点 ①精子获能、卵子成熟后才能完成受精过程; ②都是有性生殖 2.胚胎分割、核移植和胚胎移植的比较 胚胎分割 核移植 胚胎移植 胚胎 来源 雌性动物体内受精或体外受精形成的早期胚胎、其他方式得到的胚胎 经核移植得到的胚胎 雌性动物体内受精或体外受精形成的早期胚胎、其他方式得到的胚胎 生殖 类型 无性生殖 无性生殖 有性生殖或无性生殖 受体与 后代遗 传物质 不一定相同 不一定相同 不一定相同 能力一　体外受精过程分析(考查科学思维) 1.(2023·广东卷,T3)科学家采用体外受精技术获得紫羚羊胚胎,并将其移植到长角羚羊体内,使后者成功妊娠并产仔,该工作有助于恢复濒危紫羚羊的种群数量。此过程不涉及的操作是(C) A.超数排卵 B.精子获能处理 C.细胞核移植 D.胚胎培养 解析　哺乳动物的体外受精技术主要包括卵母细胞的采集、精子的获取和受精等步骤,采集到的卵母细胞和精子,要分别在体外进行成熟培养和获能处理,然后才能用于体外受精;科学家采用体外受精技术获得紫羚羊胚胎,为了获得足够多的卵细胞,通常需对供体母畜进行超数排卵处理;体外受精获得的胚胎需要经胚胎培养到一定阶段后才能移植到长角羚羊体内。因此题述过程不涉及的操作是细胞核移植,故选C。 2.(2025·临沂检测)子宫内膜异位症患者常伴有不孕症状,患者腹腔液中含有较高浓度的白细胞介素(IL)。为探明腹腔液中存在的IL对小鼠生殖活动的影响,科研人员利用三种重组人白细胞介素IL⁃1β、IL⁃5、IL⁃6配制培养液,将获能处理后的精子与成熟的卵母细胞在培养液中混合培养,一段时间后观察受精情况,实验结果如图所示。下列说法正确的是(B) A.给实验小鼠注射一定量的雌性激素可使其超数排卵,获得多枚卵子 B.成熟的卵母细胞是指MⅡ期卵母细胞,常用含肝素、Ca2+载体的获能液处理使精子获能 C.精子入卵后,卵细胞膜随即发生生理反应,即标志已受精 D.由实验结果可知,IL⁃6对小鼠受精的抑制作用最强 解析　在胚胎工程中,给实验小鼠注射一定量的促性腺激素可使其超数排卵,获得多枚卵子,A项错误;成熟的卵母细胞是指MⅡ期卵母细胞,此时的卵母细胞才具备受精能力,获能液常见的有效成分有肝素、Ca2+载体等,B项正确;精子入卵后形成雄原核,同时次级卵母细胞完成减数分裂Ⅱ,排出第二极体后形成雌原核,此时在透明带和卵细胞膜之间可看到两个极体和雌雄原核,即表明已受精,C项错误;实验结果显示,三种IL均能抑制小鼠受精,各浓度下,含IL⁃1β的培养液中受精率最低,因此IL⁃1β对小鼠受精的抑制作用最强,D项错误。 能力二　胚胎分割和胚胎移植(考查科学思维) 3.分析如图所示示意图,下列叙述正确的是(D) A.子代动物遗传性状和受体动物完全一致 B.过程1需要MⅡ期去核卵母细胞 C.过程2可以大幅改良动物性状 D.过程2为过程3提供了量产方式,过程3为过程1、2提供了改良性状的方式 解析　子代动物的遗传性状与细胞核供体基本一致,A项错误。核移植过程中需要处于MⅡ期的去核卵母细胞,而过程1是培育试管动物,需要培育到适宜时期(桑葚胚或囊胚时期)进行胚胎移植,B项错误。过程2得到的是克隆动物,是无性生殖的一种,不能大幅改良动物性状,C项错误。过程2克隆技术可得到大量同种个体,为过程3提供了量产方式;过程3是转基因技术,转基因可导入外源优良基因,为过程1、2提供了改良性状的方式,D项正确。 4.(2024·湖北卷,T5)波尔山羊享有“世界山羊之王”的美誉,具有生长速度快、肉质细嫩等优点。生产中常采用胚胎工程技术快速繁殖波尔山羊。下列叙述错误的是(D) A.选择遗传性状优良的健康波尔母山羊进行超数排卵处理 B.胚胎移植前可采集滋养层细胞进行遗传学检测 C.普通品质的健康杜泊母绵羊不适合作为受体 D.生产中对提供精子的波尔公山羊无需筛选 解析　选择遗传性状优良、生产能力强的健康波尔母山羊进行超数排卵处理,A项正确;胚胎移植前,可采集滋养层细胞进行遗传学检测,如做DNA分析,鉴定性别,B项正确;有健康的体质和正常繁殖能力的普通母山羊可适合作为受体,山羊和绵羊不属于同一物种,因此杜泊母绵羊不适合作为受体,C项正确;生产中需要筛选出优良的波尔公山羊提供精子,D项错误。 (选择性必修3 P63“图2-25”拓展)如图为利用胚胎工程快速繁殖紫羚羊时胚胎分割和性别鉴定的示意图。 (1)①过程分割出的少量胚胎细胞常用来做DNA分析,鉴定性别。 (2)②过程得到的两部分经过胚胎移植产生后代的生殖方式是无性生殖(填“有性生殖”或“无性生殖”)。 考点三　生物技术的安全性与伦理问题 　 1.转基因产品的安全性 2.关注生殖性克隆人 3.禁止生物武器 (1)为研究疾病的致病机制和开发治疗药物,科学家培育出转基因动物模型。(源自选择性必修3 P102)(√) (2)利用转基因技术显著抑制番茄中乙烯形成酶的活性和乙烯的生成量,从而育成了转基因耐储藏番茄。(源自选择性必修3 P102)(√) (3)为促进转基因食品的销售,我国对农业转基因生物实行了标识制度。(选择性必修3 P104“资料卡”)(×) (4)生殖性克隆人破坏了人类基因多样性的天然属性,不利于人类的生存和进化。(源自选择性必修3 P108)(√) (5)利用体外受精、体细胞核移植等技术获得的人的囊胚可以植入人或任何动物的生殖系统。(选择性必修3 P108“相关信息”)(×) (6)生物武器相对容易获得,也便于携带和施放,但不会引起公众恐慌。(源自选择性必修3 P112)(×) (7)利用转基因技术制造的新型致病菌因为人类从没有接触过,可能让感染者突然发病又无药可治。(选择性必修3 P113“概念检测”2)(√) (选择性必修3 P102“相关信息”)将玉米的α⁃淀粉酶基因与目的基因一起转入植物可防止转基因花粉的传播,为什么? 答:α⁃淀粉酶基因可以阻断淀粉储藏,使花粉失去活性,因而可以防止转基因花粉的传播。 1.比较试管婴儿和设计试管婴儿 项目 试管婴儿 设计试管婴儿 技术 手段 无须进行遗传学诊断 进行遗传学诊断 应用 主要解决不孕夫妇的生育问题 主要用于白血病、致命血液病等遗传疾病的治疗 相同点 二者都是体外受精在体外进行早期胚胎培养,再进行胚胎移植,在生殖方式上都为有性生殖 2.治疗性克隆和生殖性克隆的比较 能力一　转基因产品的安全性问题分析(考查社会责任) 1.(2025·盐城模拟)下列有关转基因生物的叙述,正确的是(C) A.转基因作物的长期、大规模种植不利于侵染力更强的害虫的出现 B.转基因生物不会对生物多样性构成威胁,也不会影响生态系统的稳定性 C.严格选择种植区域可减少转基因作物发生外源基因扩散的可能性 D.只要有证据表明某种转基因食品有害,就应全面禁止转基因技术在食品上的应用 解析　转基因作物长期、大规模种植有利于侵染力更强的害虫出现,因为转基因生物能起到选择作用,A项错误;转基因生物可能会对生物多样性构成威胁,也可能会影响生态系统的稳定性,B项错误;有证据表明某种转基因食品有害,应该马上停止实验,并销毁该重组生物,而不应全面禁止转基因技术在食品上的应用,D项错误。 2.(2025·南通模拟)普通番茄细胞中多聚半乳糖醛酸酶基因(PG基因)控制合成的多聚半乳糖醛酸酶,能使番茄细胞壁破坏而不耐储藏。科学家将抗PG基因导入番茄细胞,使抗PG基因合成的mRNA与PG基因合成的mRNA相结合,从而培育出抗软化的转基因番茄。下列叙述错误的是(C) A.PG基因与抗PG基因的区别是基因中的碱基序列不同 B.抗PG基因能阻止PG基因表达的翻译过程,使细胞不能合成PG C.常用显微注射法将抗PG基因表达载体导入番茄体细胞 D.为了避免转基因植物花粉污染周围植物,可将抗PG基因整合到叶绿体DNA上 解析　真核细胞中的基因是有遗传效应的DNA片段,其碱基的排列顺序决定了遗传信息,故PG基因与抗PG基因的区别是基因中的碱基序列不同,A项正确;翻译是以mRNA为模板合成蛋白质的过程,抗PG基因合成的mRNA与PG基因合成的mRNA相结合,从而阻止了PG基因的翻译过程,使细胞不能合成PG,B项正确;将目的基因导入植物细胞的常用方法是农杆菌转化法,C项错误;由于叶绿体DNA不会随花粉扩散,因此为了避免转基因植物花粉污染周围植物,可将抗PG基因整合到叶绿体DNA上,D项正确。 能力二　生物技术引起的伦理问题分析(考查社会责任) 3.(2023·浙江1月选考,T2)以哺乳动物为研究对象的生物技术已获得了长足的进步。对生物技术应用于人类,在安全与伦理方面有不同的观点,下列叙述正确的是(D) A.试管婴儿技术应全面禁止 B.治疗性克隆不需要监控和审查 C.生殖性克隆不存在伦理道德方面的风险 D.我国不赞成、不允许、不支持、不接受任何生殖性克隆人实验 解析　试管婴儿技术可以帮助不孕夫妇解决生育问题,不应全面禁止,A项错误;治疗性克隆也需要监控和审查,B项错误;生殖性克隆存在伦理道德方面的风险,C项错误;我国政府一再重申四不原则:不赞成、不允许、不支持、不接受任何生殖性克隆人实验,D项正确。 4.生殖性克隆与治疗性克隆的最大区别是目的不同。下列关于生殖性克隆和治疗性克隆的叙述,错误的是(D) A.生殖性克隆是为了获得能独立生存的新个体,而治疗性克隆是为了获得特定的细胞、组织或器官并用于治疗疾病 B.我国政府不赞成、不允许、不支持、不接受任何生殖性克隆人实验 C.生殖性克隆人冲击了现有的一些有关婚姻、家庭和两性关系的伦理道德观念 D.生殖性克隆技术目前已经非常成熟,不会面临流产、死胎和畸形儿等严重问题 解析　生殖性克隆的目的是产生独立生存的新个体,治疗性克隆是为了获得特定的细胞、组织或器官,用于治疗疾病,A项正确;由于生殖性克隆会对人类现有的有关婚姻、家庭和两性关系的伦理道德观念产生冲击,克隆技术的不成熟会导致有生理缺陷或心理缺陷的克隆人出现,并且会面临流产、死胎和畸形儿等严重问题,我国政府不赞成、不允许、不支持、不接受任何生殖性克隆人实验,B、C两项正确,D项错误。 微真题重体悟 　 1.(2022·江苏卷,T4)下列关于动物细胞工程和胚胎工程的叙述正确的是(C) A.通常采用培养法或化学诱导法使精子获得能量后进行体外受精 B.哺乳动物体外受精后的早期胚胎培养不需要额外提供营养物质 C.克隆牛技术涉及体细胞核移植、动物细胞培养、胚胎移植等过程 D.将小鼠桑葚胚分割成2等份获得同卵双胎的过程属于有性生殖 解析　精子获能指的是精子获得与卵细胞受精的能力,不是获得能量,A项错误;哺乳动物体外受精后的早期胚胎培养需要额外提供血清等一些天然成分,B项错误;克隆牛技术涉及体细胞核移植、动物细胞培养、早期胚胎培养、胚胎移植等过程,C项正确;胚胎分割的过程属于无性生殖,D项错误。 2.(2024·北京卷,T11)我国科学家体外诱导食蟹猴胚胎干细胞,形成了类似囊胚的结构(类囊胚),为研究灵长类胚胎发育机制提供了实验体系(如图)。下列相关叙述错误的是(C) A.实验证实食蟹猴胚胎干细胞具有分化潜能 B.实验过程中使用的培养基含有糖类 C.类囊胚的获得利用了核移植技术 D.可借助胚胎移植技术研究类囊胚的后续发育 解析　据题图可知,食蟹猴胚胎干细胞经体外诱导可以形成类囊胚,说明其胚胎干细胞具有分化潜能,A项正确;培养基中需要添加细胞生长必需的营养物质,包括糖类,B项正确;类囊胚是胚胎干细胞经诱导形成的,没有用到核移植技术,C项错误;如果要研究类囊胚的后续发育,可将该类囊胚移植到雌性动物的子宫中进行后续发育,D项正确。 3.(2024·甘肃卷,T16)甘加藏羊是甘肃高寒牧区的优良品种,是季节性发情动物,每年产羔一次,每胎一羔,繁殖率较低。为促进畜牧业发展,研究人员通过体外受精、胚胎移植等胚胎工程技术提高藏羊的繁殖率,流程如图。下列叙述错误的是(B) A.藏羊甲需用促性腺激素处理使其卵巢卵泡发育和超数排卵 B.藏羊乙的获能精子能与刚采集到的藏羊甲的卵母细胞受精 C.受体藏羊丙需和藏羊甲进行同期发情处理 D.后代丁的遗传物质来源于藏羊甲和藏羊乙 解析　促性腺激素能作用于卵巢,藏羊甲需用促性腺激素处理使其卵巢卵泡发育和超数排卵,A项正确;从卵巢中刚采集的卵母细胞需培养成熟(减数第二次分裂中期)后才可与获能的精子进行体外受精,B项错误;在胚胎移植前要对接受胚胎的受体和供体进行同期发情处理,使受体的生理状况相同,因此受体藏羊丙需和藏羊甲进行同期发情处理,C项正确;后代丁是由藏羊甲的卵细胞和藏羊乙的精子结合形成的受精卵发育而来的,因此后代丁的遗传物质来源于藏羊甲和藏羊乙,D项正确。 4.(2020·山东卷,T14)经遗传改造的小鼠胚胎干细胞注入囊胚,通过胚胎工程的相关技术可以获得具有不同遗传特性的实验小鼠。下列说法错误的是(C) A.用促性腺激素处理雌鼠可以获得更多的卵子 B.体外受精前要对小鼠的精子进行获能处理 C.胚胎移植前要检查胚胎质量并在囊胚或原肠胚阶段移植 D.遗传改造的小鼠胚胎干细胞可以通过转基因等技术获得 解析　为获得更多卵子,需要用促性腺激素对雌性个体进行超数排卵处理,A项正确;刚排出的精子不能与卵子受精,必须进行获能处理后才具备受精能力,B项正确;胚胎移植前要检查胚胎质量,牛、羊等一般要培养到桑葚胚或囊胚阶段才进行移植,小鼠等可在更早的阶段移植,C项错误;可通过转基因等技术获得遗传改造的小鼠胚胎干细胞,D项正确。 5.(2022·全国甲卷,T38)某牧场引进一只产肉性能优异的良种公羊,为了在短时间内获得具有该公羊优良性状的大量后代,该牧场利用胚胎工程技术进行了相关操作。回答下列问题: (1)为了实现体外受精需要采集良种公羊的精液,精液保存的方法是冷冻保存。在体外受精前要对精子进行获能处理,其原因是刚排出的精子必须在雌性生殖道内发生相应生理变化后才能获得受精能力;精子体外获能可采用化学诱导法,诱导精子获能的药物是肝素(或Ca2+载体)(答出1点即可)。利用该公羊的精子进行体外受精需要发育到一定时期的卵母细胞,因为卵母细胞达到MⅡ期时才具备与精子受精的能力。 (2)体外受精获得的受精卵发育成囊胚需要在特定的培养液中进行,该培养液的成分除无机盐、激素、血清外,还含的营养成分有维生素、氨基酸、核苷酸(答出3点即可)等。将培养好的良种囊胚保存备用。 (3)请以保存的囊胚和相应数量的非繁殖期受体母羊为材料进行操作,以获得具有该公羊优良性状的后代。主要的操作步骤是对受体母羊进行同期发情处理,在合适的时间,将保存的囊胚移植入受体母羊的子宫。 解析　(1)精液可以冷冻保存,使用前再将精液解冻离心分离。刚排出的精子必须在雌性生殖道内发生相应生理变化后才能获得受精能力,故在体外受精前要对精子进行获能处理。通常采用的体外获能方法有培养法和化学诱导法,化学诱导法是将精子放在一定浓度的肝素或Ca2+载体溶液中,用化学药物诱导精子获能。卵母细胞需要培养到MⅡ期才具备与精子受精的能力。(2)进行早期胚胎培养的培养液中,除了无机盐、激素、血清外,还含有维生素、氨基酸、核苷酸等。(3)要利用保存的囊胚和相应数量的非繁殖期受体母羊为材料,获得具有该公羊优良性状的后代,主要是利用胚胎移植技术,即对受体母羊进行同期发情处理,将保存的囊胚进行胚胎移植,对受体母羊进行是否妊娠的检查,一段时间后受体母羊产下具有该公羊优良性状的后代。 第42讲　基因工程的基本工具和基本操作程序 [课标内容]　1.阐明DNA重组技术的实现需要利用限制性内切核酸酶、DNA连接酶和载体三种基本工具。2.阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定等步骤。3.DNA的粗提取与鉴定实验。4.利用聚合酶链式反应(PCR)扩增DNA片段并完成电泳鉴定,或运用软件进行虚拟PCR实验。 微考点大突破 考点一　重组DNA技术的基本工具 　 1.基因工程的概念 (1)手段:基因工程是指按照人们的愿望,通过转基因等技术,赋予生物新的遗传特性。 (2)目的:创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。 (3)水平:DNA分子水平。 (4)基础:生物化学、分子生物学和微生物学等学科。 (5)意义:克服远缘杂交不亲和的障碍,定向改造生物的遗传性状。 提醒　基因工程的理论基础 2.基因工程的基本工具 (1)限制性内切核酸酶——“分子手术刀”。 提醒　①限制酶的识别序列一般由6个核苷酸组成,少数由4个、8个或其他数量的核苷酸组成。 ②限制酶作用的化学键只能是磷酸二酯键。 ③在切割含目的基因的DNA分子时,需用限制酶切割两次此DNA分子,产生4个末端。只有这样才能使目的基因的两端都有可连接的黏性末端或平末端。 (2)DNA连接酶——“分子缝合针”。 (3)基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”。 (1)基因工程中用到的工具酶有限制酶、DNA连接酶、载体。(源自选择性必修3 P70)(×) (2)限制酶能够识别双链DNA分子中特定核苷酸序列,并且使每一条链中特定部位的氢键断开。(源自选择性必修3 P71)(×) (3)限制酶在识别序列中心轴线两侧切开形成的是黏性末端,在识别序列中心轴线处切开形成的是平末端。(源自选择性必修3 P71)(√) (4)DNA连接酶可以连接目的基因与载体的氢键,形成重组DNA。(源自选择性必修3 P72)(×) (5)载体质粒通常以抗生素合成基因作为筛选的标记基因。(源自选择性必修3 P72)(×) 将从苏云金杆菌中获取的Bt基因转入棉花细胞内培育转基因抗虫棉的过程中,需借助多种分子工具且经历多个操作步骤。实验人员使用限制酶EcoR Ⅰ和Nhe Ⅰ切割质粒。如图表示常用的限制酶识别序列和切割位点以及质粒上的限制酶切割位点。请回答下列问题: (1)请用图示法写出限制酶Nhe Ⅰ和EcoR Ⅰ切割后形成黏性末端的过程。 答:限制酶Nhe Ⅰ: 限制酶EcoR Ⅰ: (2)切割图示中的目的基因应选用哪类限制酶?请说明理由。 答:用限制酶Mun Ⅰ和Spe Ⅰ切割目的基因。限制酶Mun Ⅰ和EcoR Ⅰ切割后形成的黏性末端相同,限制酶Nhe Ⅰ和Spe Ⅰ切割后形成的黏性末端相同,实验人员使用限制酶EcoR Ⅰ和Nhe Ⅰ切割质粒,应选用Mun Ⅰ和Spe Ⅰ切割目的基因。  限制酶的选择 (1)不破坏目的基因原则:如图中可选择PstⅠ,而不选择SmaⅠ。 (2)保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则,如图所示。 (3)善用“双酶切”,注意方向性:目的基因所在序列和载体上存在多种酶切位点时,一般需要选择在目的基因所在序列和载体上都存在切割位点的两种不同的限制酶,对目的基因所在序列和载体进行剪切,即“双酶切法”。其优点和作用是①防止目的基因环化;②避免目的基因与载体反向连接,即用DNA连接酶连接后形成的重组DNA分子上,目的基因和载体启动子的方向(或描述为“RNA聚合酶的移动方向”)必须是相同的,否则目的基因导入后无法正常表达。如图甲、乙也可选择Pst Ⅰ和EcoR Ⅰ两种限制酶。 (4)巧用“同尾酶”:“同尾酶”指来源不同,但能产生相同黏性末端的限制酶。当不适合选择某种限制酶时,可用其“同尾酶”替换,以获得相同的黏性末端。 (5)根据Ti质粒的T⁃DNA片段选择限制酶,图中甲、乙、丁Ti质粒均不宜选取,而丙Ti质粒宜选取(设切割目的基因的限制酶为Xba Ⅰ和Sac Ⅰ)。 能力　辨析基因工程的基本工具(考查科学思维) 1.(2025·连云港模拟)质粒是基因工程中最常用的载体,质粒有标记基因(如图所示),通过标记基因可以推知外源基因(目的基因)是否转移成功。质粒上箭头表示三种限制酶的酶切位点。外源基因插入的位置不同,细菌在培养基上的生长情况不同。如表是外源基因插入(插入点有a、b、c)后细菌的生长情况。下列有关叙述正确的是(C) 项目 细菌在含氨苄青霉素的培养基上生长情况 细菌在含四环素的培养基上生长情况 ① 能生长 不能生长 ② 能生长 能生长 ③ 不能生长 能生长 A.质粒的复制原点上有RNA聚合酶的结合位点 B.①②③三种重组后细菌的外源基因插入点①是a,②是c,③是b C.质粒被一种限制酶切开时,被水解的磷酸二酯键有2个 D.将外源基因与质粒连接时需用DNA聚合酶 解析　质粒的复制原点上有DNA聚合酶的结合位点,A项错误;①②③三种重组后细菌的外源基因插入点①是b,②是c,③是a,B项错误;将外源基因与质粒连接时需用DNA连接酶,D项错误。 2.用DNA重组技术可以赋予生物以新的遗传特性,创造出更符合人类需要的生物产品。在此过程中需要使用多种工具酶,其中4种限制性内切核酸酶的切割位点如图所示。 回答下列问题: (1)常用的DNA连接酶有E.coli DNA连接酶和T4 DNA连接酶。图中EcoRⅠ、SmaⅠ、PstⅠ、EcoRⅤ酶切割后的DNA片段可以用T4 DNA连接酶连接。 (2)DNA连接酶催化目的基因片段与质粒载体片段之间形成的化学键是磷酸二酯键。 (3)DNA重组技术中所用的质粒载体具有一些特征。如质粒DNA分子上有复制原点,可以保证质粒在受体细胞中能自我复制;质粒DNA分子上有限制酶切割位点,便于外源DNA插入;质粒DNA分子上有标记基因(如某种抗生素抗性基因),利用抗生素可筛选出含质粒载体的宿主细胞,方法是将待筛选的宿主细胞接种到含该抗生素的培养基中,能够生长的是含有质粒载体的宿主细胞。 (4)表达载体含有启动子,启动子是指RNA聚合酶识别、结合并启动转录的DNA片段。 解析　(1)T4 DNA连接酶既可以“缝合”双链DNA片段互补的黏性末端,又可以“缝合”双链DNA片段的平末端,题图中四种限制酶切割后的DNA片段都可以用T4 DNA连接酶进行连接。(2)DNA连接酶是通过催化两个核苷酸之间形成磷酸二酯键,将双链DNA片段“缝合”起来的。(3)作为载体,质粒DNA分子上必须有复制原点,才能使质粒在受体细胞中能进行自我复制;且质粒DNA分子上应具有一个至多个限制酶切割位点,便于外源DNA插入;质粒DNA分子上有标记基因,可以用添加特定抗生素的选择培养基培养经转化处理的宿主细胞,以达到筛选目的。(4)启动子是指RNA聚合酶识别、结合并启动转录的DNA片段。 与DNA有关的几种酶的比较 考点二　基因工程的基本操作程序 　 1.目的基因的筛选与获取 (1)筛选合适的目的基因。 ①目的基因:在基因工程的设计和操作中,用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因,主要是指编码蛋白质的基因。 ②筛选目的基因的方法。 a.从已知结构和功能清晰的基因中进行筛选。 b.利用序列数据库和序列比对工具进行筛选。 (2)利用PCR获取和扩增目的基因。 ①原理:DNA半保留复制。 ②条件:基本条件。 参与的组分 在DNA复制中的作用 解旋酶 (体外用高温代替) 打开DNA双链 DNA母链 提供DNA复制的模板 4种脱氧核苷酸 合成DNA子链的原料 耐高温的DNA聚合酶 催化合成DNA子链 引物 使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸 ③过程。 ④结果:每次循环后目的基因的量增加一倍,即成指数形式扩增(约为2n,其中n为扩增循环的次数)。 ⑤PCR产物的鉴定:常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定。 提醒　①在PCR过程中实际加入的原料为dNTP(即dATP、dGTP、dTTP、dCTP),既可作为合成DNA子链的原料,又可为DNA的合成提供能量。 ②引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸,作为新子链的合成起点,只能结合在母链的3'端,使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸。 ③复性温度过高,则引物难以与模板链结合,温度过低则易使两条母链配对结合,均无法获得PCR产物。 ④真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2+激活。因此,PCR反应缓冲液中一般要添加Mg2+。 2.基因表达载体的构建——基因工程的核心 (1)目的。 ①使目的基因在受体细胞中稳定存在,并且可以遗传给下一代。 ②使目的基因能够表达和发挥作用。 (2)基因表达载体的组成及作用。 (3)基因表达载体的构建过程。 提醒　启动子、终止子、起始密码子、终止密码子对比 项目 本质 位置 功能 启动子 DNA片段 目的基 因上游 RNA聚合酶识别和结合的部位,驱动基因转录出mRNA 终止子 DNA片段 目的基 因下游 使转录在所需要的地方停下来 起始 密码子 mRNA上三个相邻的碱基 mRNA 首端 翻译的起始信号(编码氨基酸) 终止 密码子 mRNA上三个相邻的碱基 mRNA 尾端 翻译的结束信号(不编码氨基酸) 3.将目的基因导入受体细胞 受体 细胞 导入 方法 内容 植物 细胞 花粉管 通道法 用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中等 农杆菌 转化法 农杆菌细胞内的Ti质粒上的T⁃DNA可携带目的基因整合到受体细胞的染色体DNA上 动物 细胞 显微注 射技术 常用受体细胞:受精卵 原核 细胞 Ca2+处 理法 用Ca2+处理细胞,使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态 提醒　①农杆菌转化法中的两次拼接和两次导入:第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T⁃DNA上,第二次拼接(非人工操作)是指插入目的基因的T⁃DNA拼接到受体细胞的染色体DNA上。第一次导入是将含目的基因的Ti质粒导入农杆菌。第二次导入(非人工操作)是指将含目的基因的T⁃DNA导入受体细胞。 ②导入的目的基因,可能存在于细胞质中,也可能整合到染色体DNA上。存在于染色体DNA上的目的基因有可能通过花粉传播进入杂草或其他作物中,造成“基因污染”。 4.目的基因的检测与鉴定 (1)引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。(选择性必修3 P77“相关信息”)(√) (2)PCR技术扩增目的基因时不必知道基因的全部序列,该技术既可以扩增DNA又可以直接扩增mRNA。(选择性必修3 P79“旁栏思考”)(×) (3)构建基因表达载体是转基因工程的核心工作,唯一不需要进行碱基互补配对的过程是将目的基因导入受体细胞。(源自选择性必修3 P80)(√) (4)启动子是一段有特殊序列结构的DNA片段,它是RNA聚合酶识别和结合的部分,有了它才能驱动DNA的复制过程。(源自选择性必修3 P80)(×) (5)可以将生物的所有DNA通过注射或花粉管通道法转入植物细胞中,就可获得具有理想性状的转基因植物。(选择性必修3 P80“旁栏思考”)(×) (6)转化是指目的基因进入受体细胞内,并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。(选择性必修3 P81“资料卡”)(√) (7)应用PCR技术,可以检测转基因抗冻番茄植株中目的基因是否存在及其是否表达。(源自选择性必修3 P82)(×) Bt抗虫蛋白基因(简称Bt基因)是培育转基因抗虫棉较为合适的目的基因,筛选Bt基因后可以利用PCR技术对其进行大量扩增。回答下列问题: (1)什么是引物?DNA复制时为什么需要引物? 答:引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。在DNA扩增时,DNA聚合酶不能从头开始合成DNA,只能从引物的3'端延伸DNA链,因此复制DNA时应加入两种引物。 (2)PCR扩增Bt基因需要知道Bt基因的全部核苷酸序列吗? 答:不需要,只要知道Bt基因两端的部分核苷酸序列即可(以便根据这部分序列合成两种引物)。 (3)为检测Bt基因在转基因抗虫棉细胞中是否转录,科研人员提取棉花细胞中的总RNA,经逆转录过程获得总cDNA,通过PCR技术可在总cDNA中专一性地扩增出Bt基因的cDNA,原因是什么? 答:引物是依据Bt抗虫蛋白基因的一段已知序列设计合成的(或引物能与Bt基因的cDNA特异性结合)。 (4)PCR扩增过程中的循环图示与规律如图所示,若一个Bt抗虫蛋白基因在PCR中经过n轮循环,理论上得到多少个DNA分子?含引物的DNA分子多少个?含引物A(或B)的DNA分子多少个?同时含两种引物的DNA分子多少个?共需要消耗多少个引物?含不等长脱氧核苷酸链的DNA分子多少个?含等长脱氧核苷酸链的DNA分子多少个? 答:经过n轮循环,得到2n个DNA分子,含引物的DNA分子2n个,含引物A(或B)的DNA分子数(2n-1)个,同时含两种引物的DNA分子(2n-2)个,共需要消耗(2n+1-2)个引物。含不等长脱氧核苷酸链的DNA分子2n个,含等长脱氧核苷酸链的DNA分子(2n-2n)个。 1.体内DNA复制与PCR技术的比较 PCR技术 体内DNA复制 原则 碱基互补配对 条件 DNA母链作为模板、引物(体内引物RNA、体外引物DNA)、4种脱氧核苷酸为原料 延伸方向 新链都是从5'端向3'端延伸 解旋方式 90℃以上高温解旋 解旋酶催化 场所 PCR扩增仪 主要在细胞核 延伸用酶 耐高温的DNA聚合酶 DNA聚合酶 温度 控制温度,需要在不同温度下进行 细胞内温和条件 过程 结果 大量的DNA片段(或目的基因) 形成完整的子代DNA 2.引物设计应注意的问题 (1)设计引物的依据:目的基因两端的核苷酸序列。 (2)引物设计时既要考虑目的基因序列,又要考虑载体序列,原因:为了便于扩增的DNA片段与表达载体连接,需在引物的5'端加上限制酶的酶切位点。 (3)使用的一对引物的序列不相同,因为目的基因两端具有不同的核苷酸序列。 (4)引物设计的要求(或引物失效的原因):每种引物内部不能发生局部碱基互补配对;两种引物之间不能在局部发生碱基互补配对。 ①每种引物内部不能发生局部碱基互补配对的原因:防止引物自身折叠。 ②两种引物之间不能在局部发生碱基互补配对的原因:防止引物之间配对,导致引物不能同模板链结合。 (5)两种引物都结合在DNA模板链的3'端;脱氧核苷酸连接在引物的3'端进行延伸。 3.农杆菌转化法分析 (1)构建基因表达载体需要两种工具酶:限制酶和DNA连接酶。 (2)基因表达载体(重组质粒)导入农杆菌细胞时,要用Ca2+处理农杆菌细胞,使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态,有利于重组质粒的导入。 (3)将导入目的基因的受体细胞培育成完整的植株要用到植物组织培养技术。 4.如何筛选出含有目的基因的受体细胞 (1)原理:将目的基因插入含有两种抗生素抗性基因的载体时,如果目的基因插入某种抗生素抗性基因内部,则会导致该抗生素抗性基因失活。如图,目的基因插入了四环素抗性基因内部,则四环素抗性基因失活。 (2)被转化的细菌有三种:含目的基因的细菌、含重组质粒的细菌、含质粒的细菌。 (3)筛选方法:将细菌先放在含氨苄青霉素的培养基上培养,能生长的是含重组质粒的细菌和含质粒的细菌,如图中1、2、3、4、5菌落,再利用灭菌的绒布影印到含有四环素的培养基上,如图能生长的菌落为2、3、4,则在含四环素培养基上不生长的即含有重组质粒的菌落,如图中1、5菌落。最后,可在含氨苄青霉素的培养基上挑取1、5菌落进行培养。 能力一　PCR的过程和应用分析(考查科学思维) 1.(2024·黑吉辽卷,T7)关于采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物的实验,下列叙述正确的是(A) A.琼脂糖凝胶浓度的选择需考虑待分离DNA片段的大小 B.凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示DNA分子的具体位置 C.在同一电场作用下,DNA片段越长,向负极迁移速率越快 D.琼脂糖凝胶中的DNA分子可在紫光灯下被检测出来 解析　琼脂糖凝胶浓度太高会影响DNA片段的迁移,浓度太低则会导致分辨率降低,因此琼脂糖凝胶浓度的选择需考虑待分离DNA片段的大小,A项正确;凝胶载样缓冲液中的指示剂可避免DNA分子迁移出凝胶,起到指示电泳进程的作用,不能指示DNA分子的具体位置,B项错误;DNA分子具有可解离的基团,在一定的pH下,这些基团可以带上正电荷或负电荷,在同一电场作用下,DNA片段不一定向负极迁移,一般情况下,DNA片段越长移动速率越慢,C项错误;凝胶中的DNA分子通过染色后,可在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来,D项错误。 2.(2024·浙江1月选考,T22)锌转运蛋白在某种植物根部细胞特异性表达并定位于细胞质膜,具有吸收和转运环境中Zn2+的功能。为研究该植物2种锌转运蛋白M和N与吸收Zn2+相关的生物学功能,在克隆M、N基因基础上,转化锌吸收缺陷型酵母,进行细胞学鉴定。 回答下列问题: (1)锌转运蛋白基因M、N克隆。以该植物根为材料提取并纯化mRNA,反转录合成cDNA。根据序列信息设计引物进行PCR扩增,PCR每个循环第一步是进行热变性处理,该处理的效果类似于生物体内解旋酶的作用效果。对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳时,DNA分子因为含磷酸基团而带负电荷,凝胶点样孔端应靠近电泳槽负极接口;当2个PCR产物相对分子质量接近时,若延长电泳时间,凝胶中这2个条带之间的距离会变长。回收DNA片段,连接至克隆载体,转化大肠杆菌,测序验证。 (2)重组表达载体构建。分别将含M、N基因的重组质粒和酵母表达载体同时进行双酶切处理,然后利用DNA连接酶连接,将得到的重组表达载体转化大肠杆菌,用PCR快速验证转化是否成功,此反应可以用大肠杆菌悬液当模板的原因是热变性使大肠杆菌细胞破裂,DNA流出。 (3)酵母菌转化。取冻存的锌吸收缺陷型酵母菌株,直接在固体培养基进行划线培养,活化后接种至液体培养基,采用振荡培养以扩大菌体数量,用重组表达载体转化酵母菌。检测M、N基因在受体细胞中的表达水平,无显著差异。 (4)转基因酵母功能鉴定。分别将转化了M、N基因的酵母菌株于液体培养基中培养至OD600为0.6,将菌液用梯度稀释法逐级稀释至OD600为0.06、0.006和0.000 6,然后各取10 μL菌液用涂布器均匀涂布在固体培养基上,培养2天,菌落生长情况如图。该实验中阴性对照为锌吸收缺陷型酵母+空载体。由实验结果可初步推测:转运蛋白M和N中,转运Zn2+能力更强的是N,依据是转入N基因的这组酵母菌数量多。 [注]　OD600为波长600 nm下的吸光值,该值越大,菌液浓度越高;空载体为未插入M、N基因的表达载体。 解析　(1)锌转运蛋白在某种植物根部细胞特异性表达,说明锌转运蛋白基因在该种植物根部细胞可转录出mRNA,再以mRNA为模板翻译出锌转运蛋白,所以进行锌转运蛋白基因M、N克隆时,可以该植物根为材料提取并纯化mRNA,反转录合成cDNA。PCR中热变性处理时温度超过了90 ℃,双链DNA解旋为2条单链,该处理的效果类似于生物体内解旋酶的作用效果。DNA分子含磷酸基团,故带负电荷。在凝胶中DNA分子的迁移速率与DNA分子的大小等有关,当2个PCR产物相对分子质量接近时,电泳时间过短会导致2个PCR产物分离不完全,而延长电泳时间可使2个PCR产物即凝胶中相应2个条带之间的距离变长。(2)构建重组表达载体时,先分别将含M、N基因的重组质粒和酵母表达载体同时进行双酶切处理,以得到相同的黏性末端或平末端,再利用DNA连接酶连接,将得到的重组表达载体转化大肠杆菌,用PCR快速验证重组转化是否成功,此反应可以用大肠杆菌悬液当模板的原因是若转化成功,则大肠杆菌的DNA中含有M、N基因,热变性会使大肠杆菌细胞破裂,DNA流出。(3)菌株一般低温保存于固体培养基上,故取冻存的锌吸收缺陷型酵母菌株,可直接在固体培养基上进行划线培养。有氧条件下,酵母菌可以大量繁殖,故活化后接种至液体培养基,可采用振荡培养以扩大菌体数量。(4)可采用梯度稀释法对菌液逐级稀释。该实验中阴性对照为锌吸收缺陷型酵母+空载体,其不含M、N基因。由“OD600为波长600 nm下的吸光值,该值越大,菌液浓度越高”及题图中相同吸光值下(OD0.006和OD0.000 6),锌吸收缺陷型酵母+N基因表达载体组酵母菌数量明显多于锌吸收缺陷型酵母+M基因表达载体组,可知,转运蛋白M和N中,转运Zn2+能力更强的是N。 能力二　基因工程的基本操作程序分析(考查科学思维、科学探究) 3.(2023·全国乙卷,T38节选)GFP是水母体内存在的能发绿色荧光的一种蛋白。科研人员以GFP基因为材料,利用基因工程技术获得了能发其他颜色荧光的蛋白,丰富了荧光蛋白的颜色种类。回答下列问题: (1)构建目的基因表达载体。科研人员从构建的GFP突变基因文库中提取目的基因(均为突变基因)构建表达载体,其模式图如图所示(箭头为GFP突变基因的转录方向)。图中①为终止子;②为启动子,其作用是被RNA聚合酶识别并结合,驱动GFP突变基因的转录。 (2)目的基因的表达。科研人员将构建好的表达载体导入大肠杆菌中进行表达,发现大肠杆菌有的发绿色荧光,有的发黄色荧光,有的不发荧光。请从密码子特点的角度分析,发绿色荧光的可能原因是密码子的简并性使GFP基因突变后编码的蛋白质与突变前相同(答出1点即可)。 (3)新蛋白与突变基因的关联性分析。将上述发黄色荧光的大肠杆菌分离纯化后,对其所含的GFP突变基因进行测序,发现其碱基序列与GFP基因的不同,将该GFP突变基因命名为YFP基因(黄色荧光蛋白基因)。若要通过基因工程的方法探究YFP基因能否在真核细胞中表达,实验思路是选择合适的运载体,利用合适的限制酶和DNA连接酶将YFP基因和运载体连接起来,构建基因表达载体,之后将基因表达载体导入酵母菌,检测酵母菌是否会发黄色荧光。 解析　(1)一个基因表达载体的组成,除了目的基因,还必须有启动子、终止子以及标记基因等。启动子是一段有特殊序列结构的DNA片段,位于基因的上游,它是RNA聚合酶识别和结合的部位,有了它才能驱动基因转录出mRNA,最终表达出人类需要的蛋白质。终止子相当于一盏红色信号灯,使转录在所需要的地方停下来,位于基因的下游,也是一段有特殊序列结构的DNA片段。(2)结合题中信息可知,将构建好的表达载体导入大肠杆菌中进行表达,发现有的大肠杆菌发绿色荧光,即GFP蛋白的荧光颜色,推测发绿色荧光的可能原因是密码子的简并性使GFP基因突变后编码的蛋白质与突变前的相同。(3)欲通过基因工程的方法探究YFP基因能否在真核细胞中表达,可通过基因工程的方法将目的基因导入酵母菌,之后检测酵母菌是否发黄色荧光,如果发黄色荧光,则可证明YFP基因能在真核细胞中表达,否则,不能证明YFP基因能在真核细胞中表达。 4.(2024·湖南卷,T21)百合具有观赏、食用和药用等多种价值,科研人员对其进行了多种育种技术研究。回答下列问题: (1)体细胞杂交育种。进行不同种百合体细胞杂交前,先用纤维素酶和果胶酶去除细胞壁获得原生质体,使原生质体融合,得到杂种细胞后,继续培养,常用生长素和细胞分裂素(填植物激素名称)诱导愈伤组织形成和分化,获得完整的杂种植株。 (2)单倍体育种。常用花药离体培养的方法来获得单倍体植株,鉴定百合单倍体植株的方法是利用显微镜观察根尖有丝分裂中期细胞中染色体的数目。 (3)基因工程育种。研究人员从野生百合中获得一个抵抗尖孢镰刀菌侵染的基因L,该基因及其上游的启动子pL和下游的终止子结构如图a。图b是一种Ti质粒的结构示意图,其中基因gus编码GUS酶,GUS酶活性可反映启动子活性。 ①研究病原微生物对L的启动子pL活性的影响。从图a所示结构中获取L,首先选用HindⅢ和BamHⅠ酶切,将其与相同限制酶酶切的Ti质粒连接,再导入烟草。随机选取3组转基因成功的烟草(P1、P2和P3)进行病原微生物胁迫,结果如图c。由此可知:三种病原微生物都能诱导pL的活性增强,其中交链格孢的诱导作用最强。 ②现发现栽培种百合B中也有L,但其上游的启动子与野生百合不同,且抗病性弱。若要提高该百合中L的表达量,培育具有高抗病原微生物能力的百合新品种,简要写出实验思路:利用转基因技术将百合B中L基因的启动子替换为野生百合中L基因的启动子pL。 解析　(1)植物细胞细胞壁的主要成分是纤维素和果胶,因此获得原生质体的方法是用纤维素酶和果胶酶对植物细胞进行处理。原生质体融合后形成杂种细胞,给予适宜的条件培养杂种细胞,并添加生长素和细胞分裂素诱导愈伤组织形成和分化,从而获得完整的杂种植株。(2)获得单倍体植株的常用方法是花药(花粉)离体培养;鉴定百合单倍体植株的方法是利用显微镜观察根尖有丝分裂中期细胞中染色体的数目,如果染色体数目为百合植株根尖有丝分裂中期的一半,则获得的植株为单倍体植株。(3)①根据目的片段以及质粒上限制酶的识别位点,若要获得pL并将其连接到质粒上,可选用限制酶HindⅢ、BamHⅠ进行酶切,以替换Ti质粒中的启动子,从而达到根据GUS酶活性反映病原微生物对启动子pL活性的影响的目的。根据题图c的结果可知,交链格孢处理的每一组转基因烟草中的GUS酶活性都最高,可确定其诱导作用最强。②欲提高百合B中L基因的表达量,培育具有高抗病原微生物能力的百合新品种,可利用转基因技术将百合B中L基因的启动子替换为野生百合中L基因的启动子pL。 考点三　DNA的粗提取与鉴定、DNA片段的扩增及电泳鉴定 　 1.DNA的粗提取与鉴定 (1)实验原理。 (2)方法步骤(以洋葱为例)。 提醒　加入酒精和用玻璃棒搅拌时,动作要轻缓,以免加剧DNA分子的断裂,导致DNA分子不能形成絮状沉淀。 2.DNA片段的扩增 (1)原理:DNA的热变性原理。 (2)PCR实验的操作步骤。 提醒　①为避免外源DNA等因素的污染,PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。 ②每吸取一种试剂后,移液器上的枪头都必须更换。 3.DNA片段的电泳鉴定 (1)原理。 ①电泳的原理:DNA分子具有可解离的基团,在一定的pH下,这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下,这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动。 ②鉴定的原理:PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定,在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关;凝胶中的DNA分子通过染色,可以在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来。 (2)过程。 (3)结果分析与评价。 ①成功扩增出DNA片段的判断依据是可以在波长为300 nm的紫外灯下直接观察到DNA条带。  ②进行电泳鉴定的结果应该是一条条带。如图所示,该片段大小约为750 bp。 提醒　电泳时,DNA的相对分子质量越大,迁移速率越慢;DNA的相对分子质量越小,迁移速率越快。 能力一　DNA的粗提取与鉴定(考查科学探究) 1.(2023·广东卷,T11)“DNA的粗提取与鉴定”实验的基本过程是裂解→分离→沉淀→鉴定。下列叙述错误的是(D) A.裂解:使细胞破裂释放出DNA等物质 B.分离:可去除混合物中的多糖、蛋白质等 C.沉淀:可反复多次以提高DNA的纯度 D.鉴定:加入二苯胺试剂后即呈现蓝色 解析　裂解的目的是使细胞破裂释放出DNA等物质,A项正确;DNA不溶于酒精,但某些蛋白质溶于酒精,利用这一原理,可以初步分离DNA与蛋白质等,DNA分离过程中混合物中的多糖、蛋白质等可被去除,B项正确;DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同,通过控制NaCl溶液的浓度去除杂质,可反复多次以提高DNA的纯度,C项正确;将DNA溶于NaCl溶液中,加入二苯胺试剂,沸水浴五分钟,待冷却后,溶液能呈现蓝色,D项错误。 2.(2024·山东卷,T13)关于“DNA的粗提取与鉴定”实验,下列说法正确的是(A) A.整个提取过程中可以不使用离心机 B.研磨液在4 ℃冰箱中放置几分钟后,应充分摇匀再倒入烧杯中 C.鉴定过程中DNA双螺旋结构不发生改变 D.仅设置一个对照组不能排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰 解析　DNA的提取过程中可以不使用离心机,可将过滤好的研磨液在4 ℃冰箱中放置几分钟后,直接取上清液放入烧杯中,A项正确,B项错误;鉴定过程需要沸水浴加热,DNA分子在高温下会解螺旋,双螺旋结构会发生改变,C项错误;加热是唯一变量,设置一个加二苯胺不加DNA的对照组可以排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰,D项错误。 能力二　DNA片段的扩增及电泳鉴定(考查科学探究) 3.(2023·福建卷,T4)关于“DNA片段的扩增及电泳鉴定”(实验Ⅰ)和“DNA的粗提取与鉴定”(实验Ⅱ)的实验操作,下列相关叙述正确的是(C) A.实验Ⅰ中,PCR实验所需的移液器、枪头、蒸馏水等必须进行高压灭菌处理 B.实验Ⅰ中,将扩增得到的PCR产物进行凝胶电泳,加样前应先接通电源 C.实验Ⅱ中,取洋葱研磨液的上清液,加入等体积冷酒精后析出粗提取的DNA D.实验Ⅱ中,将白色丝状物直接加入二苯胺试剂中并进行沸水浴,用于鉴定DNA 解析　为避免外源DNA等因素的污染,PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理,但移液器不需要,A项错误;在将扩增得到的PCR产物进行凝胶电泳时,应先加样,然后接通电源,B项错误;由于DNA不溶于酒精,但某些蛋白质溶于酒精,因此取洋葱研磨液的上清液,加入等体积冷酒精后,析出的白色丝状物即粗提取的DNA,C项正确;鉴定DNA时,需要把白色丝状物溶解在2 mol·L-1的NaCl溶液中,再加入二苯胺试剂进行沸水浴,D项错误。 4.(2023·浙江6月选考,T19)某研究小组利用转基因技术,将绿色荧光蛋白基因(GFP)整合到野生型小鼠Gata3基因一端,如图甲所示。实验得到能正常表达两种蛋白质的杂合子雌雄小鼠各1只,交配以期获得Gata3⁃GFP基因纯合子小鼠。为了鉴定交配获得的4只新生小鼠的基因型,设计了引物1和引物2用于PCR扩增,PCR产物电泳结果如图乙所示。 下列叙述正确的是(B) A.Gata3基因的启动子无法控制GFP基因表达 B.翻译时先合成Gata3蛋白,再合成GFP蛋白 C.2号条带的小鼠是野生型,4号条带的小鼠是Gata3⁃GFP基因纯合子 D.若用引物1和引物3进行PCR,能更好地区分杂合子和纯合子 解析　由题图甲可知,Gata3基因与GFP基因共用一个启动子,且由题干可知两基因能正常表达出相关蛋白质,A项错误;由于启动子在左侧,基因在右侧,转录基因时,先转录Gata3基因,再转录GFP基因,且翻译的方向是沿mRNA的5'→3',因此翻译时先合成Gata3蛋白,再合成GFP蛋白,B项正确;由题图乙可知,大片段包含GFP基因编码区片段,小片段不包含GFP基因编码区片段,则2号小鼠是Gata3⁃GFP基因纯合子,4号小鼠是野生型,C项错误;若用引物1和引物3进行PCR,杂合子和Gata3⁃GFP基因纯合子均能扩增出条带,仅有Gata3基因时无法扩增出条带,不利于区分杂合子和纯合子,D项错误。 微真题重体悟 　 1.(2024·湖南卷,T5)某同学将质粒DNA进行限制酶酶切时,发现DNA完全没有被酶切,分析可能的原因并提出解决方法。下列叙述错误的是(B) A.限制酶失活,更换新的限制酶 B.酶切条件不合适,调整反应条件如温度和酶的用量等 C.质粒DNA突变导致酶识别位点缺失,更换正常质粒DNA D.酶切位点被甲基化修饰,换用对DNA甲基化不敏感的限制酶 解析　限制酶失活会使DNA完全不被酶切,此时应更换新的限制酶,A项正确;酶切条件不合适通常会使切割效果下降,此时应有部分DNA被酶切,B项错误;质粒DNA突变导致限制酶识别位点缺失,会造成限制酶无法进行切割,因此应更换为正常质粒DNA,C项正确;质粒DNA上酶切位点被甲基化修饰,会导致对DNA甲基化敏感的限制酶无法进行酶切,此时应换用对DNA甲基化不敏感的限制酶,D项正确。 2.(2024·江西卷,T12)γ⁃氨基丁酸在医药等领域有重要的应用价值。利用L⁃谷氨酸脱羧酶(GadB)催化L⁃谷氨酸脱羧是高效生产γ⁃氨基丁酸的重要途径之一。研究人员采用如图方法将酿酒酵母S的L⁃谷氨酸脱羧酶基因(gadB)导入生产菌株E.coliA,构建了以L⁃谷氨酸钠为底物高效生产γ⁃氨基丁酸的菌株E.coliB。下列叙述正确的是(A) A.图中表明,可以从酿酒酵母S中分离得到目的基因gadB B.E.coliB发酵生产γ⁃氨基丁酸时,L⁃谷氨酸钠的作用是供能 C.E.coliA和E.coliB都能高效降解γ⁃氨基丁酸 D.可以用其他酶替代NcoⅠ和KpnⅠ构建重组质粒 解析　分析题图可知,可以从酿酒酵母S中筛选、分离出目的基因gadB,A项正确;由题意知,L⁃谷氨酸钠是生产γ⁃氨基丁酸的底物,不能用来供能,B项错误;将目的基因(gadB)导入菌株E.coliA构建高效生产γ⁃氨基丁酸的菌株E.coliB,E.coliA和E.coliB均不能高效降解γ⁃氨基丁酸,C项错误;选择限制酶时需考虑多种条件,如确保目的基因不被限制酶破坏、切割位点应精准位于启动子和终止子之间、避免对启动子和终止子造成任何损害等,同时在设计特异性引物时,还需要在其5'端设计限制酶酶切位点,以便构建重组质粒,根据题干提供的信息,无法推断出是否有其他酶能够替代NcoⅠ和KpnⅠ,D项错误。 3.(2024·山东卷,T5)制备荧光标记的DNA探针时,需要模板、引物、DNA聚合酶等。在只含大肠杆菌DNA聚合酶、扩增缓冲液、H2O和4种脱氧核苷酸(dCTP、dTTP、dGTP和碱基被荧光标记的dATP)的反应管①~④中,分别加入如表所示的适量单链DNA。已知形成的双链DNA区遵循碱基互补配对原则,且在本实验的温度条件下不能产生小于9个连续碱基对的双链DNA区。能得到带有荧光标记的DNA探针的反应管有(D) 反应管 加入的单链DNA ① 5'—G C C G A T C T T T A T A—3' 3'—G A C C G G C T A G A A A—5' ② 5'—A G A G C C A A T T G G C—3' ③ 5'—A T T T C C C G A T C C G—3' 3'—A G G G C T A G G C A T A—5' ④ 5'—T T C A C T G G C C A G T—3' A.①② B.②③ C.①④ D.③④ 解析　反应管②和④虽然只有一种单链,但是单链含回文序列,可以同种单链之间发生互补,四个反应管中单链DNA互补配对情况如图所示: 由图分析可知,D项正确。 4.(2024·贵州卷,T21)研究者用以蔗糖为唯一碳源的液体培养基,培养真菌A的野生型(含NV基因)、突变体(NV基因突变)和转基因菌株(转入NV基因),检测三种菌株NV酶的生成与培养液中的葡萄糖含量,结果如表所示(表中“+”表示有,“-”表示无)。 检测用菌株 蔗糖 NV酶 葡萄糖(培养液中) 野生型 + + + 野生型 - - - 突变体 + - - 转基因菌株 + + + 回答下列问题: (1)据表可推测蔗糖诱导了NV基因表达。NV酶的作用是催化蔗糖转化成葡萄糖。检测NV酶活性时,需测定的指标是单位时间单位体积的培养液中葡萄糖的增加量(或蔗糖的减少量)(答出1点即可)。 (2)表中突变体由T⁃DNA随机插入野生型菌株基因组DNA筛选获得。从野生型与突变体中分别提取基因组DNA作为模板,用与NV基因(填“T⁃DNA”或“NV基因”)配对的引物进行PCR扩增。若突变体扩增片段长度>(填“>”“=”或“<”)野生型扩增片段长度,则表明突变体构建成功,从基因序列分析其原因是与野生型相比,突变体是由T⁃DNA插入NV基因中,使NV基因发生了碱基对的增添而引起的,因此突变体相应基因的序列更长。 (3)为进一步验证NV基因的功能,表中的转基因菌株是将NV基因导入突变体细胞获得的。在构建NV基因表达载体时,需要添加新的标记基因,原因是突变体的T⁃DNA上会存在相应的标记基因,干扰NV基因表达载体导入成功与否的检测。 解析　(1)据题表中野生型菌株的两组结果对比分析可知,如果培养液中添加了蔗糖,NV基因就会表达形成NV酶,否则没有NV酶的形成,由此推测蔗糖诱导了NV基因表达。分析题表可知,当蔗糖和NV酶同时存在时,培养液中就会出现葡萄糖,由此说明NV酶的作用是催化蔗糖转化成葡萄糖。酶的活性可以用单位时间单位体积反应物的减少量或生成物的增加量表示,因此NV酶的活性可以用单位时间单位体积的培养液中葡萄糖的增加量(或蔗糖的减少量)表示。(2)根据题意,突变体是由T⁃DNA随机插入野生型菌株,使NV基因发生了突变产生的,说明T⁃DNA插入了NV基因中,使NV基因发生了碱基对的增添,即突变体中NV基因突变后的序列比野生型的NV基因序列更长,所以用与NV基因配对的引物进行扩增,扩增的结果是突变体扩增片段的长度更长。(3)为了进一步验证NV基因的功能,在突变体(NV基因突变)细胞中,转入NV基因,以便将转基因植株与突变体(NV基因突变)的结果进行对比。由于突变体的T⁃DNA上会存在原有的标记基因,干扰NV基因表达载体导入成功与否的检测,因此在构建NV基因表达载体时,需要添加新的标记基因。 5.(2024·广东卷,T21)驹形杆菌可合成细菌纤维素(BC)并将其分泌到胞外组装成膜。作为一种性能优异的生物材料,BC膜应用广泛。研究者设计了酪氨酸酶(可催化酪氨酸形成黑色素)的光控表达载体,将其转入驹形杆菌后构建出一株能合成BC膜并可实现光控染色的工程菌株,为新型纺织原料的绿色制造及印染工艺升级提供了新思路(图1)。 回答下列问题: (1)研究者优化了培养基的碳源、氮源(答出两点)等营养条件,并控制环境条件,大规模培养工程菌株后可在气液界面处获得BC菌膜(菌体和BC膜的复合物)。 (2)研究者利用T7噬菌体来源的RNA聚合酶(T7RNAP)及蓝光光敏蛋白标签,构建了一种可被蓝光调控的基因表达载体(光控原理见图2,载体的部分结构见图3)。构建载体时,选用了通用型启动子PBAD(被工程菌RNA聚合酶识别)和特异型启动子PT7(仅被T7RNAP识别)。为实现蓝光控制染色,启动子①②及③依次为PT7、PBAD、PBAD,理由是基因2、3可正常表达出无活性产物,蓝光照射时再激活基因1(或酪氨酸酶基因或目的基因)的表达。 注:基因1编码酪氨酸酶,基因2编码T7RNAP N端-nMag,基因3编码pMag-T7RNAP C端。 图3 (3)光控表达载体携带大观霉素(抗生素)抗性基因。长时间培养时在培养液中加入大观霉素,其作用为选择含有重组质粒的驹形杆菌,杀死其他杂菌避免污染(答出两点)。 (4)根据预设的图案用蓝光照射已长出的BC菌膜并继续培养一段时间,随后将其转至染色池处理,发现只有经蓝光照射的区域被染成黑色,其原因是蓝光照射诱导nMag和pMag结合,激活T7RNAP,从而与特异型启动子PT7结合,酪氨酸酶基因表达合成酪氨酸酶,酪氨酸酶催化酪氨酸形成黑色素。 (5)有企业希望生产其他颜色图案的BC膜。按照上述菌株的构建模式提出一个简单思路:将酪氨酸酶基因换成合成其他色素酶的基因,催化产生不同的色素。 解析　(1)培养基的营养物质包括水、无机盐、碳源、氮源等,研究者培养工程菌,需要优化培养基的碳源、氮源等营养条件,并控制环境条件。(2)依据题图2及题干信息可知,为实现蓝光控制染色,应该先合成无活性的T7RNAP,故基因2、3的上游应连接通用型启动子。在蓝光诱导下合成酪氨酸酶,酪氨酸酶催化酪氨酸形成黑色素,实现蓝光控制染色。此过程中酪氨酸酶需要特异性合成,因此基因1上游应连接仅被T7RNAP识别的PT7启动子。(3)将携带大观霉素抗性基因的光控表达载体导入驹形杆菌,会获得未成功导入的菌株和成功导入的工程菌株,长时间培养时也可能感染其他杂菌,在培养液中加入大观霉素(抗生素)可以筛选出工程菌株,同时也能抑制其他杂菌的生长,提高工程菌的生产效率。(4)详见答案。(5)为获得不同颜色图案的BC膜,可以利用题述光控基因表达载体,将酪氨酸酶基因换成控制合成其他色素酶的基因,催化产生不同的色素。 争分提升课(十)　PCR技术的应用 　 类型一　利用PCR技术获取目的基因及相关计算 1.PCR扩增过程中的循环图示与规律 2.PCR中的数量关系 循环次数 1 2 3 n DNA分子数 2 4 8 2n 含引物A (或B)的 DNA分子数 1 3 7 2n-1 同时含引 物A、B的 DNA分子数 0=21-2 2=22-2 6=23-2 2n-2 共消耗的 引物数量 2=21+1-2 6=22+1-2 14=23+1-2 2n+1-2 等长DNA 分子数 0=21-2 0=22-4 2=23-6 2n-2n DNA分 子种类 2 4 5 5 1.“X基因”是DNA分子上一个有遗传效应的片段,若要用PCR技术特异性地拷贝“X基因”,需在PCR反应中加入两种引物,两种引物及其与模板链的结合位置如图1所示。下列叙述错误的是(C) A.第一轮复制得到2个DNA分子,即①②各1个 B.第二轮复制得到4个DNA分子,即①②③④各1个 C.第四轮复制得到16个DNA分子,其中有4个X基因 D.经五轮循环后产物中有五种不同的DNA分子 解析　据题图分析可知,第一轮复制形成2个DNA分子,即①②各1个,A项正确;第二轮复制得到22=4(个)DNA分子,即①复制得①和③、②复制得②和④,即得到①②③④各1个,B项正确;第四轮复制得到16个DNA分子,其中有8个⑤(X基因),C项错误;经五轮循环后共形成32个DNA分子,其中①②各1个,③④各4个,22个⑤,故产物中有五种不同的DNA分子,D项正确。 2.如图表示利用PCR技术扩增目的基因的部分过程,下列叙述错误的是(B) A.从理论上推测,第二轮循环产物中含有引物A的DNA片段占3/4 B.在第二轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段 C.引物之间或引物自身发生碱基互补配对则不能扩增目的基因 D.耐高温的DNA聚合酶总将游离的脱氧核苷酸连接到3'端 解析　基因扩增中引物通常是一小段DNA或RNA片段,从理论上推测,第二轮中含引物A的比例为3/4,A项正确;因为题图中的引物A和引物B均不在该片段的端点,因此第一轮循环后,得到的两DNA片段中两条脱氧核苷酸链都不等长;通过绘图可推知,第二轮中亦不会出现等长的引物,所以在第二轮循环产物中不会出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段,B项错误;如果引物之间或引物自身发生碱基互补配对则不能扩增目的基因,C项正确;因为复制过程中子链的合成方向是从子链的5'端向3'端延伸,所以耐高温的DNA聚合酶总将游离的脱氧核苷酸连接到3'端,D项正确。 类型二　引物选择原则 　　DNA复制时DNA聚合酶只能催化脱氧核糖核苷酸加至已有单链的游离3'—羟基上,而不能使脱氧核糖核苷酸自身发生聚合。引物是一小段单链DNA或RNA,它能与DNA母链的一段碱基互补配对。细胞内DNA复制以RNA作引物,它的合成是由一种特殊的RNA合成酶——引物酶所催化的,而PCR反应一般以DNA作引物(因为RNA易降解)。 1.引物的设计原则 (1)引物长度要适宜:一般引物的长度为20~30 bp,过长会导致其延伸温度大于72 ℃,不适于与Taq酶进行反应,过短则特异性差。 (2)引物GC含量要适宜:①引物的GC含量一般为45%~55%,过高或过低都不利于引发反应;②上下游引物的GC含量不能相差太大。 (3)引物自身及引物之间不应存在互补序列,碱基要随机分布,且引物自身和引物之间不能有连续4个碱基的互补。否则引物自身会折叠成发夹结构(如图甲)或二聚体(如图乙),从而影响引物与模板的复性结合。 (4)引物5'端可以修饰,3'端不可修饰。 ①引物的5'端决定着PCR产物的长度,它对扩增的特异性影响不大。因此,可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5'端修饰:加酶切位点,加标记荧光,引入点突变、缺失突变序列,引入启动子序列等。 ②引物的延伸是从3'端开始的,不能进行任何修饰。 ③在引物的5'端连接一对限制酶的识别序列,这样便于目的基因连接到载体上。 2.引物的选择和互补链的判断 　　DNA聚合酶只能特异性地复制处于2个引物之间的DNA序列,引物5'端的碱基与DNA母链3'端的碱基进行碱基互补配对,可作为DNA复制的起始点,DNA子链的合成方向是从引物的5'端向3'端延伸。 3.(2025·南通模拟)合适的引物是利用PCR技术扩增目的基因的前提。下列关于引物的叙述,错误的是(D) A.引物设计的依据是目的基因两端部分脱氧核苷酸序列 B.引物过长或GC含量过高则所需的复性温度较高 C.引物之间或内部存在互补序列则会影响其与模板链的结合 D.引物的3'端添加限制酶识别序列有利于目的基因的酶切与连接 解析　在扩增目的基因前,需要设计可与目的基因两端的部分碱基序列互补配对的两种单链引物,在复性时引物分别与目的基因的两条链结合形成双链,便于与Taq酶的结合并进行延伸,因此引物设计的依据是目的基因两端部分脱氧核苷酸序列,A项正确;引物过长或GC含量过高则所需的复性温度较高,B项正确;引物自身不应存在互补序列,否则会出现引物与自身配对、引物与引物配对情况,降低PCR的效率,C项正确;DNA聚合酶只能使新合成的DNA子链从5'→3'方向延伸,为了方便目的基因与质粒的连接,可在引物的5'端添加限制酶识别序列,D项错误。 4.(2023·江苏卷,T22节选)为了将某纳米抗体和绿色荧光蛋白基因融合表达,运用重组酶技术构建质粒,如图1所示。请回答下列问题: (1)分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时,配制的两个反应体系中不同的有模板、PCR引物,扩增程序中最主要的不同是引物的设计。 (2)有关基因序列如图2。引物F2⁃F、F1⁃R应在下列选项中选用CD(多选,填选项字母)。 EGFP基因序列: 5'ATGGTGAGCAAGGGCGACGAGCTGTACAAG3' AnB1基因序列: 5'CATGTCCAGCTGCAGCCAAAACCACAACCA3' 图2 A.ATGGTGCAACCA B.TGGTTGCACCAT C.GACGAGCTGCAG D.CTGCAGCTCGTC (3)将PCR产物片段与线性质粒载体混合后,在重组酶作用下可形成环化质粒,直接用于转化细菌。这一过程与传统重组质粒构建过程相比,无需使用的酶主要有限制酶、DNA连接酶。 解析　(1)分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时,配制的两个反应体系中不同的有:模板分别是片段F1、片段F2;引物分别是F1-R和F1-F、F2-R和F2-F,最主要的不同是引物的设计。(2)由题中信息,画出F1与F2片段相接的序列如图所示: F2-F和F1-R应与F1片段的下游和F2片段的上游序列(F1与F2片段相接处)相同或互补,C、D所给序列符合要求;而A项序列左右两端分别与F1片段上游序列和F2片段下游序列相同,B项序列左右两端分别与F2片段下游序列和F1片段上游序列互补,故A、B两项不符合要求。(3)重组酶可以依据PCR扩增序列和线性载体两端的同源序列进行同源重组,不需要使用限制酶和DNA连接酶构建基因表达载体。 类型三　利用PCR技术引导基因定点突变 1.图解 2.四种引物 如图所用引物为引物1、2、3、4,其中引物2和3的突起处代表与模板链不能互补的突变位点,而这两条引物有部分碱基(包括突变位点)是可以互补的。 3.流程 (1)分别利用引物1和2、引物3和4进行PCR后,得到的DNA片段可以通过引物2和3互补的碱基杂交在一起。 (2)以得到的DNA片段为模板,用引物1和4再进行一次PCR,扩增得到含有突变位点的DNA片段。 (3)通过测序可以检验定点突变是否成功。 5.水蛭素是一种蛋白质,可用于预防和治疗血栓。某科研团队运用重叠延伸PCR技术在水蛭素基因中的特定位点引入特定突变,使水蛭素第47位的天冬酰胺(密码子为AAC、AAU)替换为赖氨酸(密码子为AAA、AAG),从而提高水蛭素的抗凝血活性。原理如图。 [注]　图中的引物2和3的突起处代表与模板链不能互补的突变位点。 (1)由以上事例可知,要对蛋白质的结构进行改造,需要通过改造基因(或基因定点突变)来完成。 (2)若拟突变位点的碱基对为A—T,则需要让其突变为T—A或C—G才能达到目的。引物2的突变位点(突起处)应设计为A或G(假设引物为单链DNA)。 (3)在第一阶段获得2种具有重叠片段DNA的过程中,引物1、引物2组成的反应系统和引物3、引物4组成的反应系统中均进行一次复制,共产生3种DNA分子。该阶段必须将引物1、2和引物3、4置于不同反应系统中,这是因为引物2和3中存在互补配对片段,置于同一反应系统时会结合而失去作用。 (4)利用重叠延伸PCR技术还可以将两个不同来源的DNA片段拼接起来。有人想利用该技术把基因M和N拼接在一起,设计基因M的引物M1、M2,基因N的引物N1、N2。在设计这4种引物时,特别要注意的问题是M1、M2中的一种引物与N1、N2中的一种引物必须具有互补配对的片段。 解析　(2)若拟突变位点的碱基对为A—T,则需要让其突变为T—A或C—G才可使天冬酰胺替换为赖氨酸。由于A—T突变成了C—G或T—A,则原本A碱基(突变后的C或T碱基)所对应的引物2突起处应为G或A。(3)若两个反应系统均进行一次复制,则会产生3种不同的DNA分子,因为引物1和4产生的DNA分子是一样的。(4)重叠互补引物的设计是重叠延伸PCR技术成功的关键。拼接基因M和N时,设计引物时需要找到两种基因的重叠部分,即M1、M2中的一种引物与N1、N2中的一种引物必须具有互补配对的片段。 类型四　利用PCR技术扩增未知基因序列 　　利用PCR技术进行基因扩增时,为了便于设计引物,要求目的基因两侧的序列是已知的。当DNA的某些序列已知,而需要扩增已知序列两端的未知序列时,可采用反向PCR技术。 6.(2020·江苏卷,T33节选)如果已知一小段DNA的序列,可采用PCR的方法,简捷地分析出已知序列两侧的序列,具体流程如图(以EcoR Ⅰ酶切为例): 请据图回答下列问题: (1)步骤Ⅰ用的EcoR Ⅰ是一种限制性内切核酸(或限制)酶,它通过识别特定的核苷酸序列切割特定位点。 (2)步骤Ⅱ用的DNA连接酶催化相邻核苷酸之间的3'-羟基与5'-磷酸间形成磷酸二酯键;PCR循环中,升温到95 ℃是为了获得DNA单链;Taq DNA聚合酶的作用是催化以DNA为模板的DNA链的延伸。 (3)若如表所列为已知的DNA序列和设计的一些PCR引物,步骤Ⅲ选用的PCR引物必须是②④(从引物①②③④中选择,填序号)。 DNA序列(虚线处省略了部分核苷酸序列) 已知 序列 PCR 引物 ①5'—AACTATGCGCTCATGA—3' ②5'—GCAATGCGTAGCCTCT—3' ③5'—AGAGGCTACGCATTGC—3' ④5'—TCATGAGCGCATAGTT—3' 解析　(1)EcoRⅠ是一种限制性内切核酸酶,它通过识别特定的核苷酸序列切割特定位点,使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。(2)DNA连接酶催化相邻核苷酸之间的3'—羟基与5'—磷酸间形成磷酸二酯键。在PCR循环中,升温到95 ℃是为了使DNA变性,DNA双链解旋为DNA单链,以作为DNA扩增的模板链。Taq DNA聚合酶以DNA单链为模板,以结合在特定DNA模板上的引物为出发点,将4种游离的脱氧核苷酸沿5'→3'方向按模板链顺序合成新的DNA子链,故其作用是催化以DNA为模板的DNA链的延伸。(3)片段F中,已知的DNA序列为 ,要通过设计引物进行反向PCR,从而得到已知序列在两端、未知序列在中间段的PCR产物,则需要反向的引物来扩增已知序列以外的DNA片段,因此要选择5'—GCAATGCGTAGCCTCT—3'和5'—TCATGAGCGCATAGTT—3'这对引物。 类型五　利用PCR技术鉴定目的基因的连接方式 　　检测目的基因在受体细胞内是否稳定存在是基因工程操作的重要步骤,可以借助载体上的标记基因、PCR技术和核酸分子杂交技术等方法鉴定受体细胞中是否转入了目的基因。在实际操作中,PCR技术不仅可以精准地鉴定受体细胞是否转入目的基因,还可以通过引物的巧妙设计鉴定目的基因的连接方式。 7.为鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒,拟设计引物进行PCR鉴定。图示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置,PCR鉴定时应选择的一对引物是乙、丙。某学生尝试用图中另外一对引物从某一菌落的质粒中扩增出了400 bp片段,原因是目的基因反向连接。 解析　分析题图可知,理论上可以选择的引物组合有甲和丙、乙和丙两种情况。如果选择甲和丙这对引物,则无论目的基因是否正确插入,扩增的片段都是50+300+100=450(bp),不符合要求;如果选择乙和丙这对引物,正向连接和反向连接后所得结果不同,所以应选择乙和丙这对引物进行PCR鉴定。如果目的基因和质粒反向连接,则引物乙会出现在重组质粒的外侧,此时若加入引物甲和乙,则可以扩增出300+100=400(bp)的片段。 类型六　利用PCR技术快速检测病原体 1.检测DNA病原体:PCR技术是一种基于DNA扩增原理的快速病原体检测方法,它能够在几小时内扩增和检测极小量的病原体DNA,并且具备高度的特异性和敏感性。 2.检测RNA病毒:提取组织或细胞中的总RNA,以RNA为模板,首先利用逆转录酶反转录成cDNA,再以cDNA链为模板进行PCR扩增,从而获得大量拷贝。逆转录PCR的出现使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级,并广泛应用于遗传病的诊断,还可以用于定量检测某种RNA的含量。 8.猴痘是由猴痘病毒(一种RNA病毒)感染所致的一种病毒性人畜共患病,临床上表现为发热、皮疹、淋巴结肿大等。猴痘病毒感染的常规检测方法是通过实时荧光PCR鉴定。 (1)首先,从样本中提取病毒RNA,经逆转录酶作用生成cDNA;然后以cDNA为模板进行实时荧光PCR扩增,测定样品中病毒核酸量。 (2)通过实时荧光PCR扩增目的基因,需额外添加荧光标记探针(一小段单链DNA,可与目的基因中部序列特异性结合)。当探针完整时,不产生荧光。在PCR过程中,与目的基因结合的探针被Taq DNA聚合酶水解,R与Q分离后,R发出的荧光可被检测到(如图1)。 ①当样本中有目的基因时,引物和探针与目的基因复性时,通过碱基互补配对原则特异性结合。 ②在PCR循环的延伸阶段,Taq DNA聚合酶催化子链的合成并水解探针。检测到的荧光强度与反应体系中DNA分子数呈正相关(填“正相关”或“负相关”)。 (3)通过实时荧光PCR检测猴痘病毒感染时,检测到的荧光强度变化如图2所示。 ①与指数增长期相比,线性增长期目的基因数量的增长率下降,原因可能有Taq DNA聚合酶活性下降、引物浓度下降、原料dNTP浓度下降。  ②Ct值的含义:在PCR扩增过程中,每个反应管内的荧光信号达到设定的荧光阈值时所经历的扩增循环数。因此,当样本中初始模板越多时,Ct值就越小。 ③某新猴痘病毒核酸检测说明书标明,Ct≤37判定为阳性,Ct>40或无Ct值判定为阴性。图2所示猴痘病毒核酸检测结果应判定为阳性。 (4)阴性结果也不能排除猴痘病毒感染,可能产生假阴性的因素有abc(多选,填选项字母)。 a.取样太早,样本中病毒量少,达不到实时荧光PCR检测阈值 b.样本被污染,RNA酶将病毒RNA降解 c.病毒发生变异 解析　(1)由病毒RNA生成cDNA的过程属于逆转录,需要逆转录酶的催化。(2)①当样本中有目的基因时,引物和探针与目的基因复性时,通过碱基互补配对形成氢键而特异性结合。②在PCR循环的延伸阶段,Taq DNA聚合酶催化子链的合成并水解探针。检测到的荧光强度与反应体系中DNA分子数呈正相关。(3)①与指数增长期相比,线性增长期目的基因数量的增长率下降,有可能是底物浓度降低导致的,也有可能是酶的活性下降导致的。②样本中初始模板越多,达到设定的荧光阈值所经历的扩增循环数就越少,Ct值就越小。③Ct≤37判定为阳性,Ct>40或无Ct值判定为阴性。题图2中Ct值大概是24,猴痘病毒核酸检测结果应判定为阳性。(4)阴性结果也不能排除猴痘病毒感染,可能产生假阴性的因素有取样太早,样本中病毒量少,达不到实验时荧光PCR检测阈值;样本被污染,RNA酶将病毒RNA降解,从而导致样本中病毒量少;病毒发生变异,检测不出来,从而出现假阴性。 9.(2021·全国甲卷,T38)PCR技术可用于临床的病原菌检测。为检测病人是否感染了某种病原菌,医生进行了相关操作:①分析PCR扩增结果;②从病人组织样本中提取DNA;③利用PCR扩增DNA片段;④采集病人组织样本。回答下列问题: (1)若要得到正确的检测结果,正确的操作顺序应该是④②③①(用序号表示)。 (2)操作③中使用的酶是(耐高温的)DNA聚合酶。PCR反应中的每次循环可分为变性、复性、延伸三步,其中复性的结果是引物通过碱基互补配对与单链DNA结合。 (3)为了做出正确的诊断,PCR反应所用的引物应该能与病原菌DNA特异性结合。 (4)PCR(聚合酶链式反应)技术是指在生物体外大量快速扩增特定DNA片段的技术。该技术目前被广泛地应用于疾病诊断等方面。 解析　(1)根据题干中给出的信息分析,若要检测病人是否感染了某种病原菌,需要从病人体内获取组织样本,提取样本中的DNA,进行PCR扩增,再分析PCR扩增的结果。由此可知若要得到正确的检测结果,正确的操作顺序应该是④②③①。 (2)操作③利用PCR扩增DNA片段时需要使用的酶是(耐高温的)DNA聚合酶。PCR反应中的每次循环可分为变性、复性、延伸三步,其中复性是指温度下降到55 ℃左右,两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。(3)为了做出正确的诊断,应检测病原菌的遗传物质,所以PCR反应所用的引物应该能与病原菌DNA特异性结合。(4)PCR(聚合酶链式反应)技术是指在生物体外大量快速扩增特定DNA片段的技术,它能以极少量的DNA为模板,在短时间内大量扩增目的基因。 第43讲　基因工程的应用和蛋白质工程 [课标内容]　1.举例说明基因工程在农牧、食品及医药等行业的广泛应用改善了人类的生活品质。2.举例说明依据人类需要对原蛋白质结构进行基因改造、生产目标蛋白的过程。 微考点大突破 考点一　基因工程的应用 　 1.基因工程在农牧业方面的应用 2.基因工程在医药卫生领域的应用 提醒　乳腺生物反应器与膀胱生物反应器 ①乳腺生物反应器是利用转基因动物的乳汁生产药用蛋白,具体过程如下。 ②膀胱生物反应器是利用转基因动物的尿液生产药用蛋白,其优点是不受动物的性别、生长发育时期的限制,提取简单高效。 3.基因工程在食品工业方面的应用 (1)外源生长激素基因的表达可以使转基因动物生长得更快。(源自选择性必修3 P89)(√) (2)干扰素是一种具有干扰病毒复制作用的糖蛋白,在临床上被广泛应用。(选择性必修3 P90“资料卡”)(√) (3)将人的干扰素基因重组到质粒后导入大肠杆菌,获得能产生人干扰素的菌株。(选择性必修3 P90“资料卡”)(√) (4)利用乳腺生物反应器能够获得一些重要的医药产品,如人的血清白蛋白,这是因为将人的血清白蛋白基因导入了动物的乳腺细胞中。(源自选择性必修3 P90)(×) (5)用基因工程的方法,使外源基因得到高效表达的菌类一般称为基因工程菌。(选择性必修3 P91“相关信息”)(√) 1.(选择性必修3 P89“正文”)为提高动物的生长速度,需要将外源生长激素基因导入动物体内,应该选择的受体细胞是什么?并说明理由。 答:应该选择的受体细胞是受精卵。受精卵体积较大,操作较容易,营养物质含量丰富,也能保障发育成的个体所有细胞都含有外源生长激素基因,全能性较高。 2.(选择性必修3 P90“资料卡”)利用转基因细菌能否直接生产干扰素等化学本质为糖蛋白的药物?为什么? 答:不能。因为细菌中只有核糖体,没有内质网和高尔基体等其他细胞器。 3.(选择性必修3 P90“正文”)生产乳腺生物反应器构建基因表达载体时有什么特别要求?为什么? 答:必须把药用蛋白基因与乳腺蛋白基因的启动子等调控元件重组在一起。因为只有连接了乳腺蛋白基因的启动子,才能保证相应的目的基因在乳腺细胞内特异表达。 4.人的胰岛素基因导入大肠杆菌后不能正确表达出胰岛素,其原因是真核细胞的基因结构不同于原核细胞,其转录出的mRNA需加工后才能作为翻译的模板,细菌中不存在此机制。 能力　基因工程的应用(考查科学思维、社会责任) 1.(2021·辽宁卷,T14)腈水合酶(N0)广泛应用于环境保护和医药原料生产等领域,但不耐高温,利用蛋白质工程技术在N0的α和β亚基之间加入一段连接肽,可获得热稳定的融合型腈水合酶(N1)。下列有关叙述错误的是(D) A.N1与N0氨基酸序列的差异是影响其热稳定性的原因之一 B.加入连接肽需要通过改造基因实现 C.获得N1的过程需要进行转录和翻译 D.检测N1的活性时先将N1与底物充分混合,再置于高温环境 解析　根据题意可知,与不耐高温的N0相比,热稳定的融合型腈水合酶N1多了一段连接肽,二者氨基酸序列的差异是影响其热稳定性的原因之一,A项正确;利用蛋白质工程改造蛋白质时需对相关基因进行修饰或合成,在N0的结构中加入连接肽需要通过改造相关基因来实现,B项正确;获得N1的过程需要进行转录和翻译,C项正确;检测N1的活性时,需要先将N1与底物置于高温环境下,再将N1与底物充分混合,D项错误。 2.(2022·河北卷,T24)蛋白酶抑制剂基因转化是作物抗虫育种的新途径。某研究团队将胰蛋白酶抑制剂(NaPI)和胰凝乳蛋白酶抑制剂(StPin1A)的基因单独或共同转化棉花,获得了转基因植株。回答下列问题: (1)蛋白酶抑制剂的抗虫机制是阻断或减弱昆虫消化酶的作用,从而使昆虫不能正常消化食物使其发育异常或死亡。 (2)基因表达载体的构建是实施基因工程的核心。 (3)利用农杆菌转化法时,必须将目的基因插入到质粒的T⁃DNA上,此方法的不足之处是该方法一般不适用于大多数单子叶植物。 (4)为检测目的基因在受体细胞基因组中的整合及其转录和翻译,可采用的检测技术有PCR技术、抗原—抗体杂交技术(答出两点即可)。 (5)确认抗虫基因在受体细胞中稳定表达后,还需进一步做抗虫的接种实验以鉴定其抗性程度。图为三种不同遗传操作产生的转基因棉花抗虫实验结果,据结果分析NaPI+StPin1A(填“NaPI”或“StPin1A”或“NaPI+StPin1A”)转基因棉花的抗虫效果最佳,其原因是饲喂NaPI+StPin1A转基因棉花的虫体质量最低且每株棉铃数最多。 (6)基因突变可产生新的等位基因,在自然选择的作用下,昆虫种群的基因频率会发生定向改变,导致昆虫朝着一定的方向不断进化。据此推测,被蛋白酶抑制剂转基因作物长期选择后,某些昆虫具有了抗蛋白酶抑制剂的能力,其分子机制可能是昆虫发生基因突变后,产生了抗蛋白酶抑制剂的基因,在蛋白酶抑制剂的选择下,抗性基因频率逐渐提高,从而增强了其抗蛋白酶抑制剂的能力;蛋白酶抑制剂基因发生突变后不能编码出蛋白酶抑制剂(答出两点即可)。 解析　(1)蛋白酶抑制剂的抗虫机制是阻断或减弱昆虫消化酶的作用,从而使昆虫不能正常消化食物,达到抗虫的目的。(2)基因工程的核心是基因表达载体的构建。(3)农杆菌细胞内含有Ti质粒,当它侵染植物细胞后,可将Ti质粒上的T⁃DNA转移至被侵染的细胞,并将其整合到该细胞的染色体DNA上。故利用农杆菌转化法时,必须将目的基因插入Ti质粒的T⁃DNA上。但农杆菌一般只感染双子叶植物和裸子植物,故其不足之处是该方法一般不适用于大多数单子叶植物。(4)在分子水平上可通过PCR技术检测目的基因是否导入受体细胞染色体DNA上或检测目的基因是否转录出了mRNA;检测是否翻译出相应的蛋白质则需要使用抗原—抗体杂交技术。(5)抗虫基因导入植物细胞后,要鉴定其是否赋予植物抗虫特性,需要做抗虫接种实验。题图中,饲喂NaPI+StPin1A转基因棉花的虫体质量最低,每株棉铃数最多,故其抗虫效果最佳。(6)基因突变可产生新的等位基因,在自然选择的作用下,昆虫种群的基因频率会发生定向改变,导致昆虫朝着一定的方向不断进化。被蛋白酶抑制剂转基因作物长期选择后,某些昆虫具有了抗蛋白酶抑制剂的能力,其分子机制可能是昆虫发生基因突变后,产生了抗蛋白酶抑制剂的基因,在蛋白酶抑制剂的选择下,抗性基因频率逐渐提高,从而增强了其抗蛋白酶抑制剂的能力;蛋白酶抑制剂基因发生突变后不能编码出蛋白酶抑制剂。 考点二　蛋白质工程的原理和应用 　 1.概念 (1)基础:蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系。 (2)手段:通过改造或合成基因。 (3)结果:对现有蛋白质进行改造或制造一种新的蛋白质。 2.蛋白质工程的基本思路 从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列(基因)或合成新的基因→获得所需要的蛋白质。 3.蛋白质工程的应用 (1)医药工业方面:研发药物,如延长干扰素的保存时间;降低小鼠单克隆抗体诱发免疫反应的强度。 (2)其他工业方面:改进酶的性能或开发新的工业用酶。 (3)农业方面:通过改造某些参与调控光合作用的酶,增加粮食产量;改造微生物蛋白质的结构,设计优良微生物农药,防治病虫害。 4.蛋白质工程与基因工程的区别和联系 (1)蛋白质工程的目的是改造或合成人类需要的蛋白质。(源自选择性必修3 P93)(√) (2)蛋白质工程是在基因工程的基础上,延伸出来的第二代基因工程,是涉及多学科的综合科技工程。(源自选择性必修3 P93)(√) (3)蛋白质工程可以合成自然界中不存在的蛋白质。(源自选择性必修3 P93)(√) (4)蛋白质工程的应用为酶制剂产业的发展提供了强大助力。(选择性必修3 P96“到社会中去”)(√) 1.为什么蛋白质工程的操作对象是基因而不是蛋白质? 答:因为任何一种天然蛋白质都是由基因编码的,基因是遗传信息结构与功能的基本单位,改造了基因就可以通过基因的信息传递进而改造蛋白质。如果直接对蛋白质进行改造,即使改造成功,被改造的蛋白质也无法遗传。 2.通过对Bt抗虫蛋白三维结构图及氨基酸序列进行分析,发现该蛋白质结构中一段由14个氨基酸组成的螺旋结构缺失,结构变化后的Bt抗虫蛋白能使棉铃虫具有更高的致死率。若要根据蛋白质工程的原理设计实验对Bt抗虫蛋白进行改造,以提高其致死率,请写出实验设计思路。 答:参照密码子表,找到合成该14个氨基酸的碱基序列所在的基因位置,将这些碱基序列进行缺失处理。 能力　蛋白质工程的原理和应用分析(考查科学思维、社会责任) 1.(2023·辽宁卷,T8)CD163蛋白是PRRSV(病毒)感染家畜的受体。为实时监控CD163蛋白的表达和转运过程,将红色荧光蛋白RFP基因与CD163基因拼接在一起(如图),使其表达成一条多肽。该拼接过程的关键步骤是除去(B) A.CD163基因中编码起始密码子的序列 B.CD163基因中编码终止密码子的序列 C.RFP基因中编码起始密码子的序列 D.RFP基因中编码终止密码子的序列 解析　根据题干信息,将红色荧光蛋白RFP基因与CD163基因拼接在一起,如果两个基因中编码起始密码子和终止密码子的序列完整,将得到两条多肽,若想只表达出一条多肽,结合题图可知,CD163基因编码起始密码子的序列需保留,编码终止密码子的序列需除去,使得CD163基因翻译结束后不停止,继续合成红色荧光蛋白RFP,即可得到一条多肽,B项正确。 2.(2022·湖南卷,T22)水蛭是我国的传统中药材,主要药理成分水蛭素为水蛭蛋白中重要成分之一,具有良好的抗凝血作用。拟通过蛋白质工程改造水蛭素结构,提高其抗凝血活性。回答下列问题: (1)蛋白质工程流程如图甲所示,物质a是多肽链,物质b是mRNA。在生产过程中,物质b可能不同,合成的蛋白质空间构象却相同,原因是mRNA上决定氨基酸的密码子具有简并性。 (2)蛋白质工程是基因工程的延伸,基因工程中获取目的基因的常用方法有从基因文库中获取、用化学方法人工合成和利用PCR技术扩增。PCR技术遵循的基本原理是DNA半保留复制。 (3)将提取的水蛭蛋白经甲、乙两种蛋白酶水解后,分析水解产物中的肽含量及其抗凝血活性,结果如图乙、丙所示。推测两种处理后酶解产物的抗凝血活性差异主要与肽的种类(填“种类”或“含量”)有关,其活性不同的原因是酶处理后形成的肽中氨基酸的种类、数目和排列顺序不同。 (4)若要比较蛋白质工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素的抗凝血活性差异,简要写出实验设计思路:在相同条件下,将等量的生理盐水、蛋白质工程改造后的水蛭素、水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素分别进行抗凝血实验,比较四组血液凝固所需时间长短。 解析　(1)蛋白质工程的基本思路:从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列(基因)或合成新的基因→获得所需要的蛋白质。由于mRNA上决定氨基酸的密码子具有简并性,因此mRNA不同,翻译形成的多肽链中氨基酸序列有可能是相同的,再盘曲、折叠形成相同结构的蛋白质。(2)基因工程中获取目的基因的常用方法有从基因文库中获取、用化学方法人工合成和利用PCR技术扩增。PCR技术遵循的基本原理是DNA半保留复制。(3)由题图可知,水蛭蛋白经两种蛋白酶处理后,酶解产物的肽含量差别不大,但是抗凝血活性有所差异,所以推测该差异主要与肽的种类有关,两种处理后酶解产物中氨基酸的种类、数目和排列顺序不同,从而导致两种处理后酶解产物的抗凝血活性有差异。(4)在相同条件下,将等量的生理盐水、蛋白质工程改造后的水蛭素、水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素分别进行抗凝血实验,比较四组血液凝固所需时间长短,所需时间越长说明其抗凝血活性越大。 微真题重体悟 　 1.(2023·湖南卷,T8)盐碱胁迫下植物应激反应产生的H2O2对细胞有毒害作用。禾本科农作物AT1蛋白通过调节细胞膜上PIP2s蛋白磷酸化水平,影响H2O2的跨膜转运,如图所示。下列叙述错误的是(B) A.细胞膜上PIP2s蛋白高磷酸化水平是其提高H2O2外排能力所必需的 B.PIP2s蛋白磷酸化被抑制,促进H2O2外排,从而减轻其对细胞的毒害 C.敲除AT1基因或降低其表达可提高禾本科农作物的耐盐碱能力 D.从特殊物种中发掘逆境胁迫相关基因是改良农作物抗逆性的有效途径 解析　分析题图可知,AT1蛋白存在时,AT1蛋白可与Gβ结合,抑制PIP2s蛋白磷酸化,H2O2外排能力弱;AT1蛋白缺陷时,AT1蛋白不能与Gβ结合,PIP2s蛋白磷酸化,H2O2外排能力强。因此,细胞膜上PIP2s蛋白保持高磷酸化水平是其提高H2O2外排能力所必需的,A项正确。PIP2s蛋白磷酸化被抑制时,会抑制H2O2外排,从而增强其对细胞的毒害,B项错误。敲除AT1基因或降低其表达可使PIP2s蛋白保持高磷酸化水平,H2O2外排能力较强,可提高禾本科农作物的耐盐碱能力,C项正确。可以从特殊物种中发掘逆境胁迫相关基因,通过基因工程技术改良农作物的抗逆性,D项正确。 2.(2022·江苏卷,T6)采用基因工程技术调控植物激素代谢,可实现作物改良。下列相关叙述不合理的是(B) A.用特异启动子诱导表达iaaM(生长素合成基因)可获得无子果实 B.大量表达ipt(细胞分裂素合成关键基因)可抑制芽的分化 C.提高ga2ox(氧化赤霉素的酶基因)的表达水平可获得矮化品种 D.在果实中表达acs(乙烯合成关键酶基因)的反义基因可延迟果实成熟 解析　生长素可促进果实发育,用特异启动子诱导表达iaaM(生长素合成基因)可获得无子果实,A项不符合题意;大量表达ipt(细胞分裂素合成关键基因)可使细胞分裂素含量升高,细胞分裂素含量升高,有利于芽的分化,B项符合题意;赤霉素能促进细胞伸长,从而引起植株增高,提高ga2ox(氧化赤霉素的酶基因)的表达水平可促进赤霉素被氧化分解,使赤霉素含量降低,从而获得矮化品种,C项不符合题意;乙烯有催熟作用,在果实中表达acs(乙烯合成关键酶基因)的反义基因可抑制乙烯的合成,果实成熟会延迟,D项不符合题意。 3.(2020·浙江7月选考,T24)下列关于基因工程的叙述,正确的是(D) A.若受体大肠杆菌含有构建重组质粒时用到的限制性内切核酸酶,则一定有利于该重组质粒进入受体并保持结构稳定 B.抗除草剂基因转入某抗盐植物获得2个稳定遗传转基因品系,抗性鉴定为抗除草剂抗盐和抗除草剂不抗盐。表明一定是抗盐性的改变与抗除草剂基因的转入无关 C.抗除草剂基因转入某植物获得转基因植株,其DNA检测均含目的基因,抗性鉴定为抗除草剂和不抗除草剂。表明一定是前者表达了抗性蛋白而后者只表达抗性基因RNA D.已知不同分子量DNA可分开成不同条带,相同分子量的为一条带。用某种限制性内切核酸酶完全酶切环状质粒后,出现3条带。表明该质粒上一定至少有3个被该酶切开的位置 解析　若受体大肠杆菌含有构建重组质粒时用到的限制酶,该酶可能会破坏重组质粒的结构,不利于重组质粒在受体中保持结构稳定,A项错误;抗除草剂基因转入某抗盐植物获得的2个稳定遗传转基因品系中有抗除草剂不抗盐的品系,可推测抗盐性的改变可能与抗除草剂基因的转入有关,B项错误;在DNA检测均含目的基因的条件下,抗性鉴定为抗除草剂说明目的基因完成了表达,抗性鉴定为不抗除草剂说明目的基因可能完成了转录而没有翻译成蛋白质,还有可能是目的基因无法转录,C项错误;用某限制酶完全酶切后出现3条带,说明酶切后的产物中有3种不同分子量的DNA,可推测出质粒上至少有3个位置被该酶切开,D项正确。 4.(2021·广东卷,T22改编)非细胞合成技术是一种运用合成生物学方法,在细胞外构建多酶催化体系,获得目标产物的新技术,其核心是各种酶基因的挖掘、表达等。中国科学家设计了4步酶促反应的非细胞合成路线(如图),可直接用淀粉生产肌醇(重要的医药食品原料),以期解决高温强酸水解方法造成的严重污染问题,并可以提高产率。 回答下列问题: (1)研究人员采用PCR技术从土壤微生物基因组中扩增得到目标酶基因。此外,获得酶基因的方法还有从基因文库中获取、用化学方法人工合成(答出两种即可)。 (2)高质量的DNA模板是成功扩增出目的基因的前提条件之一。在制备高质量DNA模板时必须除去蛋白,方法有蛋白酶水解法、盐析法或高温变性法等(答出两种即可)。 (3)研究人员使用大肠杆菌BL21作为受体细胞、pET20b为表达载体分别进行4种酶的表达。表达载体转化大肠杆菌时,首先应用Ca2+处理大肠杆菌细胞,使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。为了检测目的基因是否成功表达出酶蛋白,需要采用的方法有抗原—抗体杂交法。 (4)依图所示流程,在一定的温度、pH等条件下,将4种酶与可溶性淀粉溶液混合组成一个反应体系。若这些酶最适反应条件不同,可能导致的结果是部分酶失活,无法获得肌醇。在分子水平上,可以通过改变基因结构,从而改变蛋白质的结构,实现对酶特性的改造和优化。 解析　(1)获取目的基因常用的方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增、用化学方法人工合成等。(2)制备高质量DNA模板时,可直接在滤液中加入蛋白酶分解蛋白质,而不破坏DNA。中性盐对蛋白质的溶解度有显著影响,当盐浓度较高时,蛋白质的溶解度下降并析出,这种现象称为盐析。利用DNA对高温的耐受性,严格控制温度范围,使蛋白质变性沉淀而DNA分子不发生变性,可将DNA与蛋白质分离。(3)为了检测目的基因是否表达出相关的酶蛋白,可以从转基因生物中提取蛋白质,采用抗原—抗体杂交法,若有杂交带出现,表明目的基因已表达出蛋白质产品。(4)酶在温度过高、过酸、过碱的环境中会失活,不同酶的最适温度、最适pH一般不同,将4种酶与可溶性淀粉溶液混合组成一个反应体系,在一定的温度、pH等条件下,部分酶可能会因温度或者pH不适宜而失活,不能达到实验目的,即无法获得肌醇。基因指导蛋白质的合成,可以通过改变酶基因的结构,从而改变蛋白质的结构,进而实现对酶特性的改造和优化。 5.(2023·全国甲卷,T38)接种疫苗是预防传染病的一项重要措施,乙肝疫苗的使用可有效阻止乙肝病毒的传播,降低乙型肝炎发病率。乙肝病毒是一种DNA病毒。重组乙肝疫苗的主要成分是利用基因工程技术获得的乙肝病毒表面抗原(一种病毒蛋白)。回答下列问题: (1)接种上述重组乙肝疫苗不会在人体中产生乙肝病毒,原因是该疫苗不含乙肝病毒DNA,不会在人体细胞内增殖产生乙肝病毒。 (2)制备重组乙肝疫苗时,需要利用重组表达载体将乙肝病毒表面抗原基因(目的基因)导入酵母细胞中表达。重组表达载体中通常含有抗生素抗性基因,抗生素抗性基因的作用是作为标记基因筛选出转化成功的酵母细胞。能识别载体中的启动子并驱动目的基因转录的酶是RNA聚合酶。 (3)目的基因导入酵母细胞后,若要检测目的基因是否插入染色体中,需要从酵母细胞中提取基因组DNA进行DNA分子杂交,DNA分子杂交时应使用的探针是放射性同位素等标记的含有目的基因的DNA片段。 (4)若要通过实验检测目的基因在酵母细胞中是否表达出目的蛋白,请简要写出实验思路。 答:从酵母细胞中提取蛋白质,用乙肝病毒表面抗原的特异性抗体进行抗原—抗体杂交,观察是否有杂交带出现。若有杂交带出现,说明酵母细胞中表达出目的蛋白。 解析　(1)重组乙肝疫苗的主要成分是乙肝病毒表面抗原,不含乙肝病毒DNA分子,不会在人体细胞内产生乙肝病毒。(2)载体上的抗生素抗性基因常作为标记基因,用于将成功导入重组基因表达载体的细胞筛选出来。细胞中的RNA聚合酶可识别载体中的启动子,并以目的基因的一条链为模板进行转录。(3)由于不能确定目的基因是否插入染色体中,需提取酵母细胞的基因组DNA,用基因探针进行检测。该探针中需要含有目的基因中的特异性片段,且带有放射性同位素等标记。若受体细胞的染色体中含有目的基因,该探针就会与目的基因通过碱基互补配对结合在一起,从而在放射性等检测中观察到杂交带。(4)抗乙肝病毒表面抗原的抗体可与乙肝病毒表面抗原特异性结合,故可用该抗体与酵母细胞中提取出来的蛋白质进行抗原—抗体杂交,若出现杂交带,则可证明酵母细胞中表达出目的蛋白。 大题加油站(五)　生物技术与工程高频考点与能力培养 　 高频考点1　微生物培养 　　该命题点常见考查形式有两种,一是直接考查培养基成分、培养基制备方法、无菌技术操作等基础知识的识记;二是考查特定情境下对某一微生物的培养、鉴别和筛选能力,即实验探究能力。 　 (2024·全国甲卷,T37)(本题共15分,除说明外,每空2分)合理使用消毒液有助于减少传染病的传播。某同学比较了3款消毒液A、B、C杀灭细菌的效果,结果如图所示。回答下列问题: (1)该同学采用显微镜直接计数法和菌落计数法分别测定同一样品的细菌数量,发现测得的细菌数量前者大于后者,其原因是显微镜直接计数法统计细菌总数,菌落计数法只统计活细菌数。 (2)该同学从100 mL细菌原液中取1 mL加入无菌水中得到10 mL稀释菌液,再从稀释菌液中取200 μL涂布平板,菌落计数的结果为100,据此推算细菌原液中细菌浓度为5 000个/mL。  (3)菌落计数过程中,涂布器应先在酒精灯上灼烧,冷却后再涂布。灼烧的目的是灭菌,冷却的目的是避免温度过高杀死菌种。 (4)据图可知杀菌效果最好的消毒液是A,判断依据是相同处理时间下,使用A后活细菌减少量最大;使用A达到活细菌减少量最大时所用时间最短(3分)(答出两点即可)。 (5)鉴别培养基可用于反映消毒液杀灭大肠杆菌的效果。大肠杆菌在伊红—亚甲蓝培养基上生长的菌落呈深紫色。 [命题立意]　本题以“探究3款消毒液A、B、C杀灭细菌的效果”的科学实验和探究为学科情境,考查学生对微生物培养、无菌操作、微生物计数、鉴别培养基的使用等必备知识的理解与应用。 解析　(1)显微镜直接计数法把死菌和活菌一起计数。菌落计数法只统计活菌数,还可能存在两个或多个活菌形成一个菌落的情况,故测得的细菌数量前者大于后者。(2)从100 mL细菌原液中取1 mL加入无菌水中得到10 mL稀释菌液,即稀释了10倍,200 μL=0.2 mL,1 mL细菌原液中细菌浓度=(菌落数÷菌液体积)×稀释倍数=(100÷0.2)×10=5 000(个/mL)。 (3)菌落计数过程中,涂布器应先在酒精灯上灼烧,冷却后再涂布。灼烧的目的是灭菌,冷却的目的是防止温度过高杀死菌种。(4)A消毒液活细菌减少量最大且减少得最快,效率最高,因此A消毒液杀菌效果最好。(5)大肠杆菌在伊红—亚甲蓝培养基上生长的菌落呈深紫色。 【解题能力】　(1)信息获取与加工、逻辑推理与论证 (2)建构数学模型 由题意可知,菌液稀释倍数为10倍,故细菌原液中细菌浓度为100÷0.2×10=5 000(个/mL)。[第(2)小问] (3)实验探究能力 ①实验目的:比较3款消毒液A、B、C杀灭细菌的效果。 ②实验原理:3款消毒液A、B、C杀灭细菌的效果具有差异性,处理一段时间后,用菌落计数法测定不同处理组别样品中的活菌数量,具体方法一般用稀释涂布平板法。 ③实验分析:实验必须遵循单一变量原则,因此在使用数据时必须在相同处理时间的活细菌减少量或减少活细菌量最大时所用时间的条件下去比较。在同一计数条件下,经过相同处理时间,3组中活细菌数减少量越大,说明消毒液杀灭细菌的效果越好,据曲线图可得出结论:3款消毒液A、B、C杀灭细菌的效果为A>B>C。[第(4)小问] 高频考点2　细胞工程与胚胎工程 　　该命题点主要包括动植物细胞的体外培养技术、细胞融合技术、单克隆抗体、核移植、体外受精、胚胎移植、胚胎分割移植、胚胎干细胞培养等技术,是对所学细胞的结构与功能、全能性、免疫等内容的综合应用。 　 (2023·新课标卷,T35)(本题共12分)根瘤菌与豆科植物之间是互利共生关系,根瘤菌侵入豆科植物根内可引起根瘤的形成,根瘤中的根瘤菌具有固氮能力。为了寻找抗逆性强的根瘤菌,某研究小组做了如下实验:从盐碱地生长的野生草本豆科植物中分离根瘤菌;选取该植物的茎尖为材料,通过组织培养获得试管苗(生根试管苗);在实验室中探究试管苗根瘤中所含根瘤菌的固氮能力。回答下列问题: (1)从豆科植物的根瘤中分离根瘤菌进行培养,可以获得纯培养物,此实验中的纯培养物是由一个根瘤菌繁殖所获得的根瘤菌菌群(2分)。 (2)取豆科植物的茎尖作为外植体,通过植物组织培养可以获得豆科植物的试管苗。外植体经诱导形成试管苗的流程是外植体愈伤组织试管苗。其中①表示的过程是脱分化(1分),②表示的过程是再分化(1分)。由外植体最终获得完整的植株,这一过程说明植物细胞具有全能性。细胞的全能性是指细胞经分裂和分化后,仍然具有产生完整生物体或分化成其他各种细胞的潜能(3分)。 (3)研究小组用上述获得的纯培养物和试管苗为材料,研究接种到试管苗上的根瘤菌是否具有固氮能力,其做法是将生长在培养液中的试管苗分成甲、乙两组,甲组中滴加根瘤菌菌液,让试管苗长出根瘤。然后将甲、乙两组的试管苗分别转入不含氮源(1分)的培养液中培养,观察两组试管苗的生长状况,若甲组的生长状况好于乙组,则说明滴加的根瘤菌具有固氮能力(2分)。 (4)若实验获得一种具有良好固氮能力的根瘤菌,可通过发酵工程获得大量根瘤菌,用于生产根瘤菌肥。根瘤菌肥是一种微生物肥料,在农业生产中使用微生物肥料的作用是增加土壤肥力,改良土壤结构(2分)(答出2点即可)。 [命题立意]　本题考查“结构与功能观”学科核心素养,涉及发酵工程的应用、微生物培养、植物组织培养、实验设计等必备知识。 解析　(1)根据题干信息“分离根瘤菌进行培养,可以获得纯培养物”可知,纯培养物是由一个根瘤菌繁殖所获得的根瘤菌菌群。(2)已经分化的细胞可以经过脱分化,即失去其特有的结构和功能,转变成未分化的细胞,进而形成不定形的薄壁组织团块,即愈伤组织。愈伤组织经再分化形成芽、根等器官,发育成试管苗。细胞全能性的概念见答案。(3)具有固氮能力的固氮菌可以固定空气中的氮气,为植物的生长提供氮元素,故应将甲、乙两组的试管苗分别转入不含氮源的培养液中培养,若甲组的生长状况更好,则说明甲组中滴加的根瘤菌具有固氮能力。(4)见答案。 【解题能力】　实验探究能力 实验目的:探究试管苗根瘤中所含根瘤菌的固氮能力。 实验原理:根瘤菌与豆科植物之间是互利共生关系,根瘤菌侵入豆科植物根内可引起根瘤的形成,根瘤中的根瘤菌具有固氮能力,可促进豆科植物的生长。 实验分析 对照实验 自变量 因变量 结果和结论 试管苗甲 滴加根瘤菌菌液 试管苗生长状况 甲组的生长状况好于乙组,说明接种到试管苗上的根瘤菌具有固氮能力[第(3)小问第二空] 试管苗乙 等量无菌水 高频考点3　基因工程 　　该命题点是对遗传学、细胞工程、发酵工程等知识点的综合考查。主要包括PCR技术、基因编辑技术、目的基因检测等。在高考命题中,主要考查在特定情境下,通过设计合适的引物、利用特定限制酶剪切,进行基因编辑或基因拼接,达到改变特定基因、实现基因重组、获得融合蛋白等目的,操作过程复杂,所涉及的内容为当前最前沿的技术成果等。 　 (2023·广东卷,T20)(本题共14分,除说明外,每空2分)种子大小是作物重要的产量性状。研究者对野生型拟南芥(2n=10)进行诱变,筛选到一株种子增大的突变体。通过遗传分析和测序,发现野生型DA1基因发生一个碱基G到A的替换,突变后的基因为隐性基因,据此推测突变体的表型与其有关,开展相关实验。回答下列问题: (1)拟采用农杆菌转化法将野生型DA1基因转入突变体植株,若突变体表型确由该突变造成,则转基因植株的种子大小应与野生型(1分)植株的种子大小相近。 (2)用PCR反应扩增DA1基因,用限制性内切核酸酶对PCR产物和载体(1分)进行切割,用DNA连接酶将两者连接。为确保插入的DA1基因可以正常表达,其上下游序列需具备启动子和终止子。 (3)转化后,T⁃DNA(其内部基因在减数分裂时不发生交换)可在基因组单一位点插入,也可以同时插入多个位点。在插入片段均遵循基因分离及自由组合定律的前提下,选出单一位点插入的植株,并进一步获得目的基因稳定遗传的植株(如图甲),用于后续验证突变基因与表型的关系。 ①农杆菌转化T0代植株并自交,将T1代种子播种在选择培养基上,能够萌发并生长的阳性个体即表示其基因组中插入了DA1基因和卡那霉素抗性基因。 ②T1代阳性植株自交所得的T2代种子按单株收种并播种于选择培养基,选择阳性率约75%的培养基中幼苗继续培养。 ③将②中选出的T2代阳性植株自交(填“自交”“与野生型杂交”或“与突变体杂交”)所得的T3代种子按单株收种并播种于选择培养基,阳性率达到100%的培养基中的幼苗即为目标转基因植株。 为便于在后续研究中检测该突变,研究者利用PCR扩增野生型和突变型基因片段,再使用限制性内切核酸酶X切割产物,通过核酸电泳即可进行突变检测,相关信息如图乙,在核酸电泳图中将酶切结果对应位置的条带涂黑。 答: [命题立意]　本题以“用农杆菌转化法研究DA1基因功能”的科学实验和探究为学科情境,考查学生对演绎推理、模型与建模等科学思维能力和生物学学科核心素养中“结构与功能观”的认同,涉及基因的结构、基因表达载体的构建、PCR和电泳等必备知识。 解析　(1)根据题干信息可知,突变后的基因为隐性基因,则野生型DA1基因为显性基因,因此采用农杆菌转化法将野生型DA1基因转入突变体植株,若突变体表型确由该突变造成,则转基因植株的种子大小应与野生型植株的种子大小相近。(2)利用PCR技术扩增DA1基因后,应该用同种限制性内切核酸酶对DA1基因和载体进行切割,再用DNA连接酶将两者连接起来;在基因表达载体中,启动子位于目的基因的上游,终止子位于目的基因的下游,因此为确保插入的DA1基因可以正常表达,其上下游序列需具备启动子和终止子。(3)①根据题干信息和题图分析,将T0代植株的花序浸没在农杆菌(T⁃DNA上含有DA1基因和卡那霉素抗性基因)菌液中转化,再将获得的T1代种子播种在选择培养基(含有卡那霉素)上,若在选择培养基上有能够萌发并生长的阳性个体,则说明含有卡那霉素抗性基因,即表示其基因组中插入了DA1基因和卡那霉素抗性基因。②T1代阳性植株都含有DA1基因,由于T⁃DNA(其内部基因在减数分裂时不发生交换)可在基因组单一位点插入,也可以同时插入多个位点,所以不确定是单一位点插入还是多位点插入,若是单一位点插入,相当于一对等位基因的杂合子,其自交后代应该出现3∶1的性状分离比,而题干要求选出单一位点插入的植株,因此应该选择阳性率约75%的培养基中幼苗继续培养。③将以上获得的T2代阳性植株自交,再将得到的T3代种子按单株收种并播种于选择培养基,若某培养基上全部为具有卡那霉素抗性的植株即为目标植株,即阳性率达到100%的培养基中的幼苗即为目标转基因植株。根据题图分析,野生型和突变型基因片段的长度都是150 bp,野生型基因没有限制酶X的切割位点,而突变型的基因有限制酶X的切割位点,结合题图中的数据分析可知,核酸电泳图中,野生型只有150 bp一条条带,突变型有50 bp和100 bp两条条带,图见答案。 【解题能力】　类题通法 第(3)小问 第一步:知原理。农杆菌转化法原理:带有目的基因的Ti质粒会随着农杆菌侵染双子叶植物,进入植物细胞中,Ti质粒上的T⁃DNA携带目的基因整合到该细胞的染色体DNA上,则能在卡那霉素选择培养基上萌发并生长的阳性个体,其基因组插入了DA1基因与卡那霉素抗性基因。 第二步:解过程。得到目标转基因植株的过程:T0代花序浸没于农杆菌菌液,自交得T1代种子,T1代种子用卡那霉素选择培养基筛选,能够萌发并生长的阳性个体表示其基因组插入了DA1基因,假设DA1基因用A表示,则T1代阳性个体基因型为Aa或AA或多位点插入。 第三步:画条带。通过对比野生型与突变型基因序列,发现野生型序列无限制性内切核酸酶X的识别位点,而突变型有限制性内切核酸酶X的识别位点,且识别位点在50 bp左右,所以突变型基因片段被切割后形成50 bp与100 bp大小的条带,而野生型基因片段不被切割,为全长的150 bp。在核酸电泳图中找到对应的条带涂黑即可。 (2024·河北卷,T22)(本题共14分,除说明外,每空1分)新城疫病毒可引起家禽急性败血性传染病,我国科学家将该病毒相关基因改造为r2HN,使其在水稻胚乳特异表达,制备获得r2HN疫苗,并对其免疫效果进行了检测。回答下列问题: (1)实验所用载体的部分结构及其限制酶识别位点如图1所示。其中GtP为启动子,若使r2HN仅在水稻胚乳表达,GtP应为水稻胚乳中特异性表达的基因的启动子。Nos为终止子,其作用为终止转录过程。r2HN基因内部不含载体的限制酶识别位点。因此,可选择限制酶HindⅢ和EcoRⅠ对r2HN基因与载体进行酶切,用于表达载体的构建。 (2)利用农杆菌转化方法将r2HN基因导入水稻愈伤组织。为检测r2HN表达情况,可通过PCR技术检测r2HN基因是否转录出了mRNA,通过抗原—抗体杂交技术检测是否翻译出r2HN蛋白。 (3)获得转基因植株后,通常选择单一位点插入目的基因的植株进行研究。此类植株自交一代后,r2HN纯合体植株的占比为1/4(2分)。选择纯合体进行后续研究的原因是遗传性状稳定。 (4)制备r2HN疫苗后,为研究其免疫效果,对实验组鸡进行接种,对照组注射疫苗溶剂。检测两组鸡体内抗新城疫病毒抗体水平和特异应答的CD8+T细胞(细胞毒性T细胞)水平,结果如图2所示。据此分析,获得的r2HN疫苗能够成功激活鸡的体液免疫和细胞免疫。 (5)利用水稻作为生物反应器生产r2HN疫苗的优点是成本低、生物安全性较高、提取和处理目标产物容易(2分)(答出两点即可)。 [命题立意]　本题以“利用基因工程技术制备r2HN疫苗”的科学实验和探究为学科情境,考查学生理解、应用、分析及推理的能力,涉及基因工程的应用及特异性免疫等必备知识。 解析　(1)利用水稻细胞培育能表达出r2HN的水稻胚乳细胞生物反应器,GtP应为在水稻胚乳细胞中特异性表达的基因的启动子,其仅在水稻胚乳细胞中被RNA聚合酶识别和结合而驱动转录。Nos为终止子,可以终止转录,使转录在所需要的地方停下来。r2HN基因内部不含载体的限制酶识别位点,据题图1分析可知,为了将目的基因插入载体的启动子和终止子之间,则需要用限制酶HindⅢ和EcoRⅠ对r2HN基因与载体进行酶切。(2)将目的基因导入植物细胞常用农杆菌转化法。为检测r2HN表达情况,可通过PCR技术检测是否转录出r2HN mRNA。通过抗原—抗体杂交技术检测是否翻译出r2HN蛋白。(3)获得转基因植株后,通常选择单一位点插入目的基因的植株(相当于杂合子)进行研究。杂合子自交,r2HN纯合体植株的占比为1/4。由于纯合体自交后代不发生性状分离,具有遗传的稳定性,因此选择纯合体进行后续研究。(4)据题图2可知,实验组的抗体水平和CD8+T细胞水平都比对照组高,说明r2HN疫苗能够成功激活鸡的体液免疫和细胞免疫。(5)见答案。 【解题能力】　(1)信息获取与加工 关键信息 隐含前提 信息加工 启动子、终止子 基因表达载体的构建 启动子是一段有特殊序列结构的DNA片段,位于基因的上游,紧挨转录的起始位点,它是RNA聚合酶识别和结合的部位,有了它才能驱动基因转录出mRNA,最终表达出人类需要的蛋白质。有时为了满足应用需要,会在载体中人工构建诱导型启动子,当诱导物存在时,可以激活或抑制目的基因的表达。终止子相当于一盏红色信号灯,使转录在所需要的地方停下来,它位于基因的下游,也是一段有特殊序列结构的DNA片段。在胚乳中特异性表达的基因的启动子在水稻胚乳细胞中更容易被RNA聚合酶识别和结合而驱动转录。Nos为终止子,终止子可以终止转录[第(1)小问第一、二空] 将r2HN基因导入水稻愈伤组织、检测是否翻译出r2HN蛋白 将目的基因导入受体细胞,目的基因的检测与鉴定 水稻为植物细胞,在获得水稻愈伤组织后,通过农杆菌的侵染,使目的基因进入水稻细胞并完成转化。为检测r2HN表达情况,可通过PCR技术检测r2HN基因是否转录出了mRNA,可从转基因水稻中提取蛋白质,用抗原—抗体杂交技术检测是否翻译出r2HN蛋白[第(2)小问] 利用水稻作为生物反应器生产r2HN疫苗的优点 与制备传统疫苗对比明确其优点 通过水稻作为生物反应器生产r2HN疫苗具有不受性别的限制、可大量种植、成本低、安全性高等优点[第(5)小问] (2)逻辑推理与论证 学科网（北京）股份有限公司 $$