第9单元 争分提升课(十) PCR技术的应用-（配套课件）【赢在微点·顶层设计】2027年高中生物学高考一轮总复习（多选版）

(十)PCR技术的应用 争分提升课 2 类型一　利用PCR技术获取目的基因及相关计算 1.PCR扩增过程中的循环图示与规律 高考复习顶层设计 生物 第 ‹#› 页 微在字里 赢在行间 2.PCR中的数量关系 循环次数 1 2 3 n DNA分子数 2 4 8 2n 含引物A(或B)的 DNA分子数 1 3 7 2n-1 同时含引物A、 B的DNA分子数 0=21-2 2=22-2 6=23-2 2n-2 高考复习顶层设计 生物 第 ‹#› 页 微在字里 赢在行间 共消耗的 引物数量 2=21+1-2 6=22+1-2 14=23+1-2 2n+1-2 等长DNA 分子数 0=21-2 0=22-4 2=23-6 2n-2n DNA分 子种类 2 4 5 5 高考复习顶层设计 生物 第 ‹#› 页 微在字里 赢在行间 1.“X基因”是DNA分子上一个有遗传效应的片段，若要用PCR技术特异性地拷贝“X基因”，需在PCR反应中加入两种引物，两种引物及其与模板链的结合位置如图1所示。下列叙述错误的是(　　) 高考复习顶层设计 生物 第 ‹#› 页 微在字里 赢在行间 A.第一轮复制得到2个DNA分子，即①②各1个 B.第二轮复制得到4个DNA分子，即①②③④各1个 C.第四轮复制得到16个DNA分子，其中有4个X基因 D.经五轮循环后产物中有五种不同的DNA分子 高考复习顶层设计 生物 第 ‹#› 页 微在字里 赢在行间 据题图分析可知，第一轮复制形成2个DNA分子，即①②各1个，A项正确；第二轮复制得到22=4(个)DNA分子，即①复制得①和 ③、②复制得②和④，即得到①②③④各1个，B项正确；第四轮复制得到16个DNA分子，其中有8个⑤(X基因)，C项错误；经五轮循环后共形成32个DNA分子，其中①②各1个，③④各4个，22个⑤，故产物中有五种不同的DNA分子，D项正确。 解析 高考复习顶层设计 生物 第 ‹#› 页 微在字里 赢在行间 2.如图表示利用PCR技术扩增目的基因的部分过程，下列叙述错误的是(　　) 高考复习顶层设计 生物 第 ‹#› 页 微在字里 赢在行间 A.从理论上推测，第二轮循环产物中含有引物A的DNA片段占3/4 B.在第二轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段 C.引物之间或引物自身发生碱基互补配对则不能扩增目的基因 D.耐高温的DNA聚合酶总将游离的脱氧核苷酸连接到3'端 高考复习顶层设计 生物 第 ‹#› 页 微在字里 赢在行间 基因扩增中引物通常是一小段DNA或RNA片段，从理论上推测，第二轮中含引物A的比例为3/4，A项正确；因为题图中的引物A和引物B均不在该片段的端点，因此第一轮循环后，得到的两DNA片段中两条脱氧核苷酸链都不等长；通过绘图可推知，第二轮中亦不会出现等长的引物，所以在第二轮循环产物中不会出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段，B项错误；如果引物之间或引物自身发生碱基互补配对则不能扩增目的基因，C项正确；因为复制过程中子链的合成方向是从子链的5'端向3'端延伸，所以耐高温的DNA聚合酶总将游离的脱氧核苷酸连接到3'端，D项正确。 解析 高考复习顶层设计 生物 第 ‹#› 页 微在字里 赢在行间 DNA复制时DNA聚合酶只能催化脱氧核糖核苷酸加至已有单链的游离3'—羟基上，而不能使脱氧核糖核苷酸自身发生聚合。引物是一小段单链DNA或RNA，它能与DNA母链的一段碱基互补配对。细胞内DNA复制以RNA作引物，它的合成是由一种特殊的RNA合成酶——引物酶所催化的，而PCR反应一般以DNA作引物(因为RNA易降解)。 类型二　引物选择原则 高考复习顶层设计 生物 第 ‹#› 页 微在字里 赢在行间 1.引物的设计原则 (1)引物长度要适宜：一般引物的长度为20~30 bp，过长会导致其延伸温度大于72 ℃，不适于与Taq酶进行反应，过短则特异性差。 (2)引物GC含量要适宜：①引物的GC含量一般为45%~55%，过高或过低都不利于引发反应；②上下游引物的GC含量不能相差太大。 (3)引物自身及引物之间不应存在互补序列，碱基要随机分布，且引物自身和引物之间不能有连续4个碱基的互补。否则引物自身会折叠成发夹结构(如图甲)或二聚体(如图乙)，从而影响引物与模板的复性结合。 高考复习顶层设计 生物 第 ‹#› 页 微在字里 赢在行间 (4)引物5'端可以修饰，3'端不可修饰。 ①引物的5'端决定着PCR产物的长度，它对扩增的特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5'端修饰：加酶切位点，加标记荧光，引入点突变、缺失突变序列，引入启动子序列等。 高考复习顶层设计 生物 第 ‹#› 页 微在字里 赢在行间 ②引物的延伸是从3'端开始的，不能进行任何修饰。 ③在引物的5'端连接一对限制酶的识别序列，这样便于目的基因连接到载体上。 高考复习顶层设计 生物 第 ‹#› 页 微在字里 赢在行间 2.引物的选择和互补链的判断 　　DNA聚合酶只能特异性地复制处于2个引物之间的DNA序列，引物5'端的碱基与DNA母链3'端的碱基进行碱基互补配对，可作为DNA复制的起始点，DNA子链的合成方向是从引物的5'端向3'端延伸。 高考复习顶层设计 生物 第 ‹#› 页 微在字里 赢在行间 3.(2025·南通模拟)合适的引物是利用PCR技术扩增目的基因的前 提。下列关于引物的叙述，错误的是(　　) A.引物设计的依据是目的基因两端部分脱氧核苷酸序列 B.引物过长或GC含量过高则所需的复性温度较高 C.引物之间或内部存在互补序列则会影响其与模板链的结合 D.引物的3'端添加限制酶识别序列有利于目的基因的酶切与连接 高考复习顶层设计 生物 第 ‹#› 页 微在字里 赢在行间 在扩增目的基因前，需要设计可与目的基因两端的部分碱基序列互补配对的两种单链引物，在复性时引物分别与目的基因的两条链结合形成双链，便于与Taq酶的结合并进行延伸，因此引物设计的依据是目的基因两端部分脱氧核苷酸序列，A项正确；引物过长或GC含量过高则所需的复性温度较高，B项正确；引物自身不应存在互补序列，否则会出现引物与自身配对、引物与引物配对情况，降低PCR的效率，C项正确；DNA聚合酶只能使新合成的DNA子链从5'→3'方向延伸，为了方便目的基因与质粒的连接，可在引物的5'端添加限制酶识别序列，D项错误。 解析 高考复习顶层设计 生物 第 ‹#› 页 微在字里 赢在行间 4.(2023·江苏卷，T22节选)为了将某纳米抗体和绿色荧光蛋白基因融合表达，运用重组酶技术构建质粒，如图1所示。请回答下列问题： 高考复习顶层设计 生物 第 ‹#› 页 微在字里 赢在行间 (1)分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时，配制的两个反应体系中不同的有__________________________，扩增程序中最主要的不同是______________。 (2)有关基因序列如图2。引物F2-F、F1-R应在下列选项中选用______ (多选，填选项字母)。 模板、PCR引物 引物的设计 CD 高考复习顶层设计 生物 第 ‹#› 页 微在字里 赢在行间 EGFP基因序列： 5'ATGGTGAGCAAGGGC GACGAGCTGTACAAG3' AnB1基因序列： 5'CATGTCCAGCTGCAG CCAAAACCACAACCA3' 图2 A.ATGGTG CAACCA B.TGGTTG CACCAT C.GACGAG CTGCAG D.CTGCAG CTCGTC 高考复习顶层设计 生物 第 ‹#› 页 微在字里 赢在行间 (3)将PCR产物片段与线性质粒载体混合后，在重组酶作用下可形成环化质粒，直接用于转化细菌。这一过程与传统重组质粒构建过程相比，无需使用的酶主要有_____________________。 限制酶、DNA连接酶 高考复习顶层设计 生物 第 ‹#› 页 微在字里 赢在行间 (1)分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时，配制的两个反应体系中不同的有：模板分别是片段F1、片段F2；引物分别是F1-R和F1- F、F2-R和F2-F，最主要的不同是引物的设计。(2)由题中信息，画出F1与F2片段相接的序列如图所示： 解析 高考复习顶层设计 生物 第 ‹#› 页 微在字里 赢在行间 F2-F和F1-R应与F1片段的下游和F2片段的上游序列(F1与F2片段相接处)相同或互补，C、D所给序列符合要求；而A项序列左右两端分别与F1片段上游序列和F2片段下游序列相同，B项序列左右两端分别与F2片段下游序列和F1片段上游序列互补，故A、B两项不符合要求。(3)重组酶可以依据PCR扩增序列和线性载体两端的同源序列进行同源重组，不需要使用限制酶和DNA连接酶构建基因表达载体。 解析 高考复习顶层设计 生物 第 ‹#› 页 微在字里 赢在行间 1.图解 类型三　利用PCR技术引导基因定点突变 高考复习顶层设计 生物 第 ‹#› 页 微在字里 赢在行间 2.四种引物 如图所用引物为引物1、2、3、4，其中引物2和3的突起处代表与模板链不能互补的突变位点，而这两条引物有部分碱基(包括突变位点)是可以互补的。 3.流程 (1)分别利用引物1和2、引物3和4进行PCR后，得到的DNA片段可以通过引物2和3互补的碱基杂交在一起。 (2)以得到的DNA片段为模板，用引物1和4再进行一次PCR，扩增得到含有突变位点的DNA片段。 (3)通过测序可以检验定点突变是否成功。 高考复习顶层设计 生物 第 ‹#› 页 微在字里 赢在行间 5.水蛭素是一种蛋白质，可用于预防和治疗血栓。某科研团队运用重叠延伸PCR技术在水蛭素基因中的特定位点引入特定突变，使水蛭素第47位的天冬酰胺(密码子为AAC、AAU)替换为赖氨酸(密码子为AAA、AAG)，从而提高水蛭素的抗凝血活性。原理如图。 高考复习顶层设计 生物 第 ‹#› 页 微在字里 赢在行间 [注]　图中的引物2和3的突起处代表与模板链不能互补的突变位点。 高考复习顶层设计 生物 第 ‹#› 页 微在字里 赢在行间 (1)由以上事例可知，要对蛋白质的结构进行改造，需要通过__________________________来完成。 (2)若拟突变位点的碱基对为A—T，则需要让其突变为____________ ________才能达到目的。引物2的突变位点(突起处)应设计为________(假设引物为单链DNA)。 改造基因(或基因定点突变) T—A或 C—G A或G 高考复习顶层设计 生物 第 ‹#› 页 微在字里 赢在行间 (3)在第一阶段获得2种具有重叠片段DNA的过程中，引物1、引物2组成的反应系统和引物3、引物4组成的反应系统中均进行一次复制，共产生________种DNA分子。该阶段必须将引物1、2和引物3、4置于不同反应系统中，这是因为_________________________________ __________________________________。 3 引物2和3中存在互补配对片段，置于同一反应系统时会结合而失去作用 高考复习顶层设计 生物 第 ‹#› 页 微在字里 赢在行间 (4)利用重叠延伸PCR技术还可以将两个不同来源的DNA片段拼接起来。有人想利用该技术把基因M和N拼接在一起，设计基因M的引物M1、M2，基因N的引物N1、N2。在设计这4种引物时，特别要注意的问题是_____________________________________________________ ________________。 M1、M2中的一种引物与N1、N2中的一种引物必须具有互补配对的片段 高考复习顶层设计 生物 第 ‹#› 页 微在字里 赢在行间 (2)若拟突变位点的碱基对为A—T，则需要让其突变为T—A或C—G才可使天冬酰胺替换为赖氨酸。由于A—T突变成了C—G或T—A，则原本A碱基(突变后的C或T碱基)所对应的引物2突起处应为G或A。(3)若两个反应系统均进行一次复制，则会产生3种不同的DNA分子，因为引物1和4产生的DNA分子是一样的。(4)重叠互补引物的设计是重叠延伸PCR技术成功的关键。拼接基因M和N时，设计引物时需要找到两种基因的重叠部分，即M1、M2中的一种引物与N1、N2中的一种引物必须具有互补配对的片段。 解析 高考复习顶层设计 生物 第 ‹#› 页 微在字里 赢在行间 　　利用PCR技术进行基因扩增时，为了便于设计引物，要求目的基因两侧的序列是已知的。当DNA的某些序列已知，而需要扩增已知序列两端的未知序列时，可采用反向PCR技术。 类型四　利用PCR技术扩增未知基因序列 高考复习顶层设计 生物 第 ‹#› 页 微在字里 赢在行间 6.(2020·江苏卷，T33节选)如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR的方法，简捷地分析出已知序列两侧的序列，具体流程如图(以EcoR Ⅰ酶切为例)： 请据图回答下列问题： 高考复习顶层设计 生物 第 ‹#› 页 微在字里 赢在行间 (1)步骤Ⅰ用的EcoR Ⅰ是一种__________________________酶，它通过识别特定的______________切割特定位点。 (2)步骤Ⅱ用的DNA连接酶催化相邻核苷酸之间的3'-羟基与5'-磷酸间形成__________________；PCR循环中，升温到95 ℃是为了获得____________；Taq DNA聚合酶的作用是催化____________________ ________________。 (3)若如表所列为已知的DNA序列和设计的一些PCR引物，步骤Ⅲ选用的PCR引物必须是________(从引物①②③④中选择，填序号)。 限制性内切核酸(或限制) 核苷酸序列 磷酸二酯键 DNA单链 以DNA为模板的DNA链的延伸 ②④ 高考复习顶层设计 生物 第 ‹#› 页 微在字里 赢在行间   DNA序列(虚线处省略了部分核苷酸序列) 已知 序列   PCR 引物 ①5'—AACTATGCGCTCATGA—3' ②5'—GCAATGCGTAGCCTCT—3' ③5'—AGAGGCTACGCATTGC—3' ④5'—TCATGAGCGCATAGTT—3' 高考复习顶层设计 生物 第 ‹#› 页 微在字里 赢在行间 (1)EcoRⅠ是一种限制性内切核酸酶，它通过识别特定的核苷酸序列切割特定位点，使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。(2)DNA连接酶催化相邻核苷酸之间的3'—羟基与5'—磷酸间形成磷酸二酯键。在PCR循环中，升温到95 ℃是为了使DNA变性，DNA双链解旋为DNA单链，以作为DNA扩增的模板链。Taq DNA聚合酶以DNA单链为模板，以结合在特定DNA模板上的引物为出发点，将4种游离的脱氧核苷酸沿5'→3'方向按模板链顺序合成新 解析 高考复习顶层设计 生物 第 ‹#› 页 微在字里 赢在行间 的DNA子链，故其作用是催化以DNA为模板的DNA链的延伸。(3)片段F中，已知的DNA序列为 ， 要通过设计引物进行反向PCR，从而得到已知序列在两端、未知序列在中间段的PCR产物，则需要反向的引物来扩增已知序列以外的DNA片段，因此要选择5'—GCAATGCGTAGCCTCT—3'和5'—TCATGAGCGCATAGTT—3'这对引物。 解析 高考复习顶层设计 生物 第 ‹#› 页 微在字里 赢在行间 　　检测目的基因在受体细胞内是否稳定存在是基因工程操作的重要步骤，可以借助载体上的标记基因、PCR技术和核酸分子杂交技术等方法鉴定受体细胞中是否转入了目的基因。在实际操作中，PCR技术不仅可以精准地鉴定受体细胞是否转入目的基因，还可以通过引物的巧妙设计鉴定目的基因的连接方式。 类型五　利用PCR技术鉴定目的基因的连接方式 高考复习顶层设计 生物 第 ‹#› 页 微在字里 赢在行间 7.为鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，拟设计引物进行PCR鉴定。图示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置，PCR鉴定时应选择的一对引物是________。某学生尝试用图中另外一对引物从某一菌落的质粒中扩增出了400 bp片段，原因是________ ________________。 乙、丙 目的基 因反向连接 高考复习顶层设计 生物 第 ‹#› 页 微在字里 赢在行间 分析题图可知，理论上可以选择的引物组合有甲和丙、乙和丙两种情况。如果选择甲和丙这对引物，则无论目的基因是否正确插入，扩增的片段都是50+300+100=450(bp)，不符合要求；如果选择乙和丙这对引物，正向连接和反向连接后所得结果不同，所以应选择乙和丙这对引物进行PCR鉴定。如果目的基因和质粒反向连接，则引物乙会出现在重组质粒的外侧，此时若加入引物甲和乙，则可以扩增出300+100=400(bp)的片段。 解析 高考复习顶层设计 生物 第 ‹#› 页 微在字里 赢在行间 1.检测DNA病原体：PCR技术是一种基于DNA扩增原理的快速病原体检测方法，它能够在几小时内扩增和检测极小量的病原体DNA，并且具备高度的特异性和敏感性。 2.检测RNA病毒：提取组织或细胞中的总RNA，以RNA为模板，首先利用逆转录酶反转录成cDNA，再以cDNA链为模板进行PCR扩 增，从而获得大量拷贝。逆转录PCR的出现使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级，并广泛应用于遗传病的诊断，还可以用于定量检测某种RNA的含量。 类型六　利用PCR技术快速检测病原体 高考复习顶层设计 生物 第 ‹#› 页 微在字里 赢在行间 8.猴痘是由猴痘病毒(一种RNA病毒)感染所致的一种病毒性人畜共患病，临床上表现为发热、皮疹、淋巴结肿大等。猴痘病毒感染的常规检测方法是通过实时荧光PCR鉴定。 (1)首先，从样本中提取病毒RNA，经________酶作用生成cDNA；然后以cDNA为模板进行实时荧光PCR扩增，测定样品中病毒核酸量。 逆转录 高考复习顶层设计 生物 第 ‹#› 页 微在字里 赢在行间 (2)通过实时荧光PCR扩增目的基因，需额外添加荧光标记探针(一小段单链DNA，可与目的基因中部序列特异性结合)。当探针完整时，不产生荧光。在PCR过程中，与目的基因结合的探针被Taq DNA聚合酶水解，R与Q分离后，R发出的荧光可被检测到(如图1)。 高考复习顶层设计 生物 第 ‹#› 页 微在字里 赢在行间 ①当样本中有目的基因时，引物和探针与目的基因复性时，通过________________原则特异性结合。 ②在PCR循环的延伸阶段，Taq DNA聚合酶催化子链的合成并水解探针。检测到的荧光强度与反应体系中DNA分子数呈________(填“正相关”或“负相关”)。 碱基互补配对 正相关 高考复习顶层设计 生物 第 ‹#› 页 微在字里 赢在行间 (3)通过实时荧光PCR检测猴痘病毒感染时，检测到的荧光强度变化如图2所示。 高考复习顶层设计 生物 第 ‹#› 页 微在字里 赢在行间 ①与指数增长期相比，线性增长期目的基因数量的增长率下降，原因可能有___________________________________________________ ____________。 ②Ct值的含义：在PCR扩增过程中，每个反应管内的荧光信号达到设定的荧光阈值时所经历的扩增循环数。因此，当样本中初始模板越多时，Ct值就________。 ③某新猴痘病毒核酸检测说明书标明，Ct≤37判定为阳性，Ct>40或无Ct值判定为阴性。图2所示猴痘病毒核酸检测结果应判定为________。 Taq DNA聚合酶活性下降、引物浓度下降、原料dNTP浓度下降 越小 阳性 高考复习顶层设计 生物 第 ‹#› 页 微在字里 赢在行间 (4)阴性结果也不能排除猴痘病毒感染，可能产生假阴性的因素有______(多选，填选项字母)。 a.取样太早，样本中病毒量少，达不到实时荧光PCR检测阈值 b.样本被污染，RNA酶将病毒RNA降解 c.病毒发生变异 abc 高考复习顶层设计 生物 第 ‹#› 页 微在字里 赢在行间 (1)由病毒RNA生成cDNA的过程属于逆转录，需要逆转录酶的催化。(2)①当样本中有目的基因时，引物和探针与目的基因复性 时，通过碱基互补配对形成氢键而特异性结合。②在PCR循环的延伸阶段，Taq DNA聚合酶催化子链的合成并水解探针。检测到的荧光强度与反应体系中DNA分子数呈正相关。(3)①与指数增长期相比，线性增长期目的基因数量的增长率下降，有可能是底物浓度降低导致的，也有可能是酶的活性下降导致的。②样本中初 解析 高考复习顶层设计 生物 第 ‹#› 页 微在字里 赢在行间 始模板越多，达到设定的荧光阈值所经历的扩增循环数就越少，Ct值就越小。③Ct≤37判定为阳性，Ct>40或无Ct值判定为阴性。题图2中Ct值大概是24，猴痘病毒核酸检测结果应判定为阳性。(4)阴性结果也不能排除猴痘病毒感染，可能产生假阴性的因素有取样太早，样本中病毒量少，达不到实验时荧光PCR检测阈值；样本被污染，RNA酶将病毒RNA降解，从而导致样本中病毒量少；病毒发生变异，检测不出来，从而出现假阴性。 解析 高考复习顶层设计 生物 第 ‹#› 页 微在字里 赢在行间 9.(2021·全国甲卷，T38)PCR技术可用于临床的病原菌检测。为检测病人是否感染了某种病原菌，医生进行了相关操作：①分析PCR扩增结果；②从病人组织样本中提取DNA；③利用PCR扩增DNA片段；④采集病人组织样本。回答下列问题： (1)若要得到正确的检测结果，正确的操作顺序应该是____________ (用序号表示)。 (2)操作③中使用的酶是________________________。PCR反应中的每次循环可分为变性、复性、________三步，其中复性的结果是_____________________________________。 ④②③① (耐高温的)DNA聚合酶 延伸 引物通过碱基互补配对与单链DNA结合 高考复习顶层设计 生物 第 ‹#› 页 微在字里 赢在行间 (3)为了做出正确的诊断，PCR反应所用的引物应该能与___________ 特异性结合。 (4)PCR(聚合酶链式反应)技术是指______________________________ ____________________。该技术目前被广泛地应用于疾病诊断等方面。 病原菌DNA 在生物体外大量快速扩增特定DNA片段的技术 高考复习顶层设计 生物 第 ‹#› 页 微在字里 赢在行间 (1)根据题干中给出的信息分析，若要检测病人是否感染了某种病原菌，需要从病人体内获取组织样本，提取样本中的DNA，进行PCR扩增，再分析PCR扩增的结果。由此可知若要得到正确的检测结果，正确的操作顺序应该是④②③①。(2)操作③利用PCR扩增DNA片段时需要使用的酶是(耐高温的)DNA聚合酶。PCR反应中的每次循环可分为变性、复性、延伸三步，其中复性是指温度下降到55 ℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结 解析 高考复习顶层设计 生物 第 ‹#› 页 微在字里 赢在行间 合。(3)为了做出正确的诊断，应检测病原菌的遗传物质，所以PCR反应所用的引物应该能与病原菌DNA特异性结合。(4)PCR(聚合酶链式反应)技术是指在生物体外大量快速扩增特定DNA片段的技术，它能以极少量的DNA为模板，在短时间内大量扩增目的基因。 解析 高考复习顶层设计 生物 第 ‹#› 页 微在字里 赢在行间 $$