选必3 第11单元 第3讲 第一课时 系统主干知识，夯实备考基础（课件）-【新高考方案】2025版高考生物一轮总复习（江苏专版）

基因工程及生物技术的安全性与伦理问题 第3讲 学习目标 1.理解基因工程的概念；　2.阐明重组DNA技术三种基本工具的作用；　3.阐明基因工程的基本操作程序及各步骤的作用；　4.掌握DNA粗提取和鉴定的方法，尝试进行PCR的基本操作并用电泳鉴定PCR产物；　5.举例说明基因工程在农牧业、食品工业及医药卫生等行业的广泛应用；　6.概述人们根据基因工程原理，进行蛋白质设计和改造，可以获得性状和功能更符合人类需求的蛋白质；　7.举例说明依据人类需要对原有蛋白质结构进行基因改造、生产目标蛋白的过程；　8.认同生物技术在造福人类社会的同时也可能会带来安全性与伦理问题。 建构知识体系 系统主干知识，夯实备考基础 第一课时 内容索引 主题研习（一） 主题研习（二） 重组DNA技术的基本工具 (基础•自学型) 基因工程的操作程序与应用 (深化•提能型) 内容索引 主题研习（三） 蛋白质工程与DNA片段的扩增及 电泳鉴定(基础•自学型) 课时跟踪检测 主题研习（四） 生物技术的安全性与伦理问题 (基础•自学型) 主题研习(一)　重组DNA技术的基本工具 (基础•自学型) (一)基因工程的概念分析 (二)基因工程的基本工具 1．限制性内切核酸酶——“分子手术刀” 存在 主要存在于原核生物中 作用 识别双链DNA分子的特定______________，并使每一条链中特定部位的____________断开 特征 一种限制酶只能识别一种特定的脱氧核苷酸序列，并且能在特定的位点上切割DNA分子 结果 产生__________和平末端 核苷酸序列 磷酸二酯键 黏性末端 2．DNA连接酶——“分子缝合针” 种类 E.coli DNA连接酶 T4 DNA连接酶 来源 __________ T4噬菌体 特点 只连接_____末端 连接黏性末端和___末端 作用 恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的____________，连接两个DNA片段  大肠杆菌 黏性 平 磷酸二酯键 3．基因进入受体细胞的载体——“分子运输车” 类型 常用：______；其他：噬菌体、动植物病毒等 条件 ①能自我复制或整合到受体 DNA 上，使目的基因稳定存在且数量可扩增；②具有一个至多个________________，供外源DNA片段插入；③具有特殊的标记基因，便于重组DNA分子的筛选 作用 携带外源DNA片段进入受体细胞 质粒 限制酶切割位点 (三)DNA的粗提取与鉴定 1．实验原理 DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面存在差异，可以利用这些差异，选用适当的_____________方法对它们进行提取。 (1)DNA不溶于酒精，某些蛋白质溶于酒精。 物理或化学 (2)DNA在不同浓度的________中溶解度不同，它能溶于_______的NaCl溶液。 (3)在一定温度下，DNA遇________试剂会呈现蓝色。 NaCl溶液 2 mol/L 二苯胺 2．实验步骤 3．DNA的粗提取与鉴定实验的四点注意事项 (1)该实验不能用哺乳动物成熟的红细胞作实验材料，原因是哺乳动物成熟的红细胞无细胞核(无DNA)。可选用鸡血细胞作材料。 (2)加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA的断裂，导致DNA不能形成丝状物。 (3)二苯胺试剂要现配现用，否则会影响鉴定的效果。 (4)在DNA进一步提纯时，选用预冷的体积分数为95%的酒精溶液的作用是溶解杂质和析出DNA。 [微点判断] (1)重组DNA技术所需要的三种基本工具为限制酶、DNA连接酶和载体。( ) (2)切割质粒的限制性内切核酸酶均能特异性地识别6个核苷酸序列。( ) (3)E.coli DNA连接酶既可连接平末端，又可连接黏性末端。( ) √ × × (4)质粒是小型环状DNA分子，是基因工程常用的载体。( ) (5)DNA连接酶和DNA聚合酶作用方式相同。( ) (6)(2023·江苏卷)粗提取的DNA溶于2 mol/L NaCl溶液中，加入二苯胺试剂后显蓝色。( ) (7)(2022·湖北卷)动、植物细胞DNA的提取必须在无菌条件下进行。( ) (8)(2022·山东卷)“DNA的粗提取与鉴定”实验，过滤液沉淀过程在4 ℃冰箱中进行是为了防止DNA降解。( ) √ × × × √ 题点(一)　基因工程的操作工具 1．(2024·苏州检测)下列关于基因工程的叙述，不正确的是(　 ) A．基因工程的生物学原理是基因重组 B．通过基因工程技术能够定向改造生物的遗传性状 C．基因的“分子缝合针”是DNA连接酶 D．基因工程中常用的载体质粒中含有两个游离的磷酸基团 √ 解析：基因工程的核心是构建重组的DNA分子，因此基因工程的生物学原理是基因重组，A正确；基因工程能按照人们的意愿，定向创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品，B正确；基因工程的常用工具酶有限制酶、DNA连接酶，其中DNA连接酶是基因的“分子缝合针”，C正确；基因工程中常用的载体质粒是环状DNA分子，不含游离的磷酸基团，D错误。 2．(2024·徐州检测)某科学家从细菌中分离出耐高温淀粉酶(Amy)基因a，通过基因工程的方法，将基因a与载体结合后导入马铃薯植株中，经检测发现Amy在成熟块茎细胞中存在。下列有关这一过程的叙述错误的是(　 ) A．基因a的限制酶的作用部位是图中的① B．基因a进入马铃薯细胞后，可随马铃薯DNA分子的复制而复制，传给子代细胞 C．连接基因a与载体的DNA连接酶的作用部位是图中的② D．通过该技术人类实现了定向改造马铃薯的遗传性状 √ 解析：限制酶作用于磷酸二酯键，即作用部位是图中的①，A正确；目的基因进入受体细胞后，会随着马铃薯DNA分子的复制而复制，传给子代细胞，B正确；DNA连接酶用于连接目的基因和载体，形成磷酸二酯键，作用部位是图中的①，C错误；基因工程可以定向改造生物的遗传性状，D正确。 3．(2023·全国新课标卷)某同学拟用限制酶(酶 1、酶2、酶3和酶4)、DNA连接酶为工具，将目的 基因(两端含相应限制酶的识别序列和切割位点)和 质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。 下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是(　 ) A．质粒和目的基因都用酶3切割，用E.coli DNA连接酶连接 B．质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4 DNA连接酶连接 C．质粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4 DNA连接酶连接 D．质粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E.coli DNA连接酶连接 √ 解析：只用一种限制酶切割质粒和目的基因，会使质粒和目的基因发生自身环化或者使目的基因在质粒中反向连接，且E.coli DNA连接酶无法连接酶3切出的平末端，A不符合题意；用酶1切割目的基因，产生的是黏性末端，用酶3切割质粒，产生的是平末端，两者切割后无法相互连接，B不符合题意；质粒和目的基因都用酶1和酶2切割后，可使用T4 DNA连接酶连接，使目的基因定向插到质粒中，C符合题意；酶2和酶4切割后产生的黏性末端相同，易导致目的基因和质粒自身环化或者使目的基因在质粒中反向连接，并且用酶4切割会破坏标记基因，D不符合题意。 [反思·收获] 归纳比较与DNA有关的几种酶 (1)从作用底物上分析 限制酶、DNA水解酶、解旋酶、DNA连接酶的作用底物都是DNA分子；DNA聚合酶的作用底物是脱氧核苷酸。　　　　 (2)从作用部位上分析 限制酶、DNA连接酶、DNA聚合酶、DNA水解酶的作用部位都是磷酸二酯键，而解旋酶的作用部位是碱基对间的氢键。 (3)从作用结果上分析 限制酶是将DNA分子切成一个或多个片段，而DNA连接酶是将两个DNA片段连接为一个DNA分子；DNA聚合酶是将单个脱氧核苷酸依次连接成一条单链，而DNA水解酶是将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸；解旋酶是将双链DNA分子解旋为单链。 题点(二)　DNA的粗提取与鉴定 4．(2023·广东高考)“DNA粗提取与鉴定”实验的基本过程是：裂解→分离→沉淀→鉴定。下列叙述错误的是(　 ) A．裂解：使细胞破裂释放出DNA等物质 B．分离：可去除混合物中的多糖、蛋白质等 C．沉淀：可反复多次以提高DNA的纯度 D．鉴定：加入二苯胺试剂后即呈现蓝色 √ 解析：DNA主要存在于细胞核内，而裂解的目的是使细胞破裂，释放出DNA等物质，A正确；DNA、RNA、蛋白质和多糖等物质在物理和化学性质方面存在差异，可以利用这些差异，通过适当的分离方法去除混合物中的多糖、蛋白质等，B正确；DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，通过控制NaCl溶液的浓度使DNA溶解或析出，可反复多次以提高DNA的纯度，C正确；进行DNA鉴定时可以使用二苯胺试剂，但要进行沸水浴加热后才能观察到颜色变化，D错误。 5．(2024·扬州检测)某实验小组进行“DNA的粗提取与鉴定”实验，如下为实验流程：取材→破碎细胞→获得滤液→去除杂质→进一步提纯→DNA鉴定，相关叙述正确的是(　 ) A．取材时可选用猪血、洋葱、香蕉、菜花等富含DNA的材料进行实验 B．在液体培养液中培养的大肠杆菌也可作为实验材料 C．提纯时在滤液中加入2 mol/L的NaCl溶液后会出现白色丝状物DNA D．DNA鉴定时可通过是否加入二苯胺试剂设置对照实验来观察实验现象 √ 解析：哺乳动物成熟的红细胞中没有细胞核和细胞器，因此不能采用猪血来提取DNA，A错误；在液体培养液中培养的大肠杆菌也可作为实验材料，大肠杆菌是细菌，含有拟核和质粒，DNA含量也较多，适合提取DNA，B正确；DNA能溶于2 mol/L的NaCl溶液，在其中不会析出白色丝状物DNA，C错误；DNA鉴定时可通过是否加入DNA设置对照实验来观察实验现象，D错误。 主题研习(二)　基因工程的操作程序与应用 (深化•提能型) (一)基因工程的操作程序　 1．目的基因的筛选与获取 (1)筛选合适的目的基因 目的基因 在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。主要是指___________的基因 筛选方法 从相关的已知____________清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一 编码蛋白质 结构和功能 (2)利用PCR获取和扩增目的基因 ①原理：_______________。 ②条件：DNA模板、2种引物、_____________________和4种脱氧核苷酸。 DNA半保留复制 耐高温的DNA聚合酶 ③扩增过程 过程 说明 图解 变性 温度超过____ ℃，双链DNA解聚为单链 复性 温度下降到___ ℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合 90 50 延伸 温度上升到____ ℃左右，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链 72 续表 2．基因表达载体的构建 (1)构建基因表达载体的目的 ①使目的基因在____________中稳定存在，并且遗传给下一代。 ②使目的基因能够_____和发挥作用。 受体细胞 表达 (2)基因表达载体的组成 3．将目的基因导入受体细胞 项目 植物细胞 动物细胞 微生物细胞 常用方法 _____________法、花粉管通道法 ________技术 Ca2＋处理法 受体细胞 受精卵、体细胞 __________ 原核细胞 农杆菌转化 显微注射 受精卵 4．目的基因的检测与鉴定 检测水平 检测目的 检测方法 分子水平 目的基因是否插入到转基因生物染色体DNA上 ______ 目的基因是否转录出了mRNA 目的基因是否翻译出蛋白质 _______________ 个体水平 转基因生物是否表现出相应的特性 如抗虫、抗病的接种实验 PCR 抗原—抗体杂交  (二)基因工程的应用　 1．基因工程在农牧业方面的应用 (1)转基因______植物； (2)转基因_____植物； (3)转基因__________植物； 抗虫 抗病 抗除草剂 (4)改良植物的品质； (5)提高动物的___________； (6)改善畜产品的品质。 2．基因工程在医药卫生领域的应用 (1)对______________________进行基因改造，使它们生产药物。 (2)让哺乳动物批量生产_______。 (3)可能使建立___________工厂的设想成为现实。 生长速率 微生物或动植物的细胞 药物 移植器官 3．基因工程在食品工业方面的应用 利用基因工程菌生产食品工业用酶、氨基酸和维生素等。 (一)基因工程的操作步骤 [例1]　(2023·全国乙卷，节选)GFP是水母体内存在的能发绿色荧光的一种蛋白。科研人员以GFP基因为材料，利用基因工程技术获得了能发其他颜色荧光的蛋白。丰富了荧光蛋白的颜色种类。回答下列问题。 (1)构建突变基因文库。科研人员将GFP基因的不同突变基因分别插入载体，并转入大肠杆菌制备出GFP基因的突变基因文库。 (2)构建目的基因表达载体。科研人员从构建的GFP突变基因文库中提取目的基因(均为突变基因)构建表达载体，其模式图如下所示(箭头为GFP突变基因的转录方向)。图中①为______；②为________，其作用是_____________________________________；图中氨苄青霉素抗性基因是一种标记基因，其作用是____________________。 (3)目的基因的表达。科研人员将构建好的表达载体导入大肠杆菌中进行表达，发现大肠杆菌有的发绿色荧光，有的发黄色荧光，有的不发荧光。请从密码子特点的角度分析，发绿色荧光的可能原因是______________________________________(答出1点即可)。 (4)新蛋白与突变基因的关联性分析。将上述发黄色荧光的大肠杆菌分离纯化后，对其所含的GFP突变基因进行测序，发现其碱基序列与GFP基因的不同，将该GFP突变基因命名为YFP基因(黄色荧光蛋白基因)。若要通过基因工程的方法探究YFP基因能否在真核细胞中表达，实验思路是_____________________________________。 [解析]　(2)一个基因表达载体的组成，除了目的基因外，还必须有启动子、终止子以及标记基因等。启动子是一段有特殊序列结构的DNA片段，位于基因的上游，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需要的蛋白质。标记基因的作用是鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的受体细胞筛选出来(便于重组DNA分子的筛选)。 (3)结合题中信息可知，出现题述现象的原因可能是密码子具有简并性，GFP基因突变后编码的蛋白质与突变前相同。(4)欲通过基因工程的方法探究YFP基因能否在真核细胞中表达，可通过基因工程的方法将目的基因导入酵母菌，之后检测酵母菌是否发黄色荧光，如果发黄色荧光，则可证明YFP基因能在真核细胞中表达，实验思路见答案。 [答案]　(2)终止子　启动子　被RNA聚合酶识别并结合，驱动GFP突变基因的转录　鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的受体细胞筛选出来(便于重组DNA分子的筛选)　(3)密码子具有简并性，GFP基因突变后编码的蛋白质与突变前相同　(4)选择合适的载体，利用合适的限制酶和DNA连接酶将YFP基因和载体连接起来，构建基因表达载体，之后将基因表达载体导入酵母菌，检测其是否会发黄色荧光 1．目的基因的获取方法 (1)利用PCR获取和扩增目的基因。 (2)人工合成目的基因 |认|知|生|成| 逆转录法 主要用于相对分子质量较大而又不知其核苷酸序列的基因。它以目的基因的mRNA为模板，借助逆转录酶合成双链DNA，其过程如下： 化学合成法 依据某一蛋白质的氨基酸序列，推测出其基因序列，然后直接合成目的基因，其过程如下： (3)从基因文库中获取目的基因 根据目的基因的有关信息，例如，根据基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色体上的位置、基因的转录产物mRNA，以及基因的表达产物蛋白质等特性来获取目的基因。 2．基因表达载体的构建过程 3．目的基因的检测与鉴定方法 (1)载体上标记基因的标记原理：载体上的标记基因一般是一些抗生素的抗性基因。目的基因要转入的受体细胞没有抵抗相应抗生素的能力。当含有抗生素抗性基因的载体进入受体细胞后，抗性基因在受体细胞内表达，使受体细胞能够抵抗相应抗生素，所以在受体细胞的培养体系中加入该种抗生素就可以只保留转入载体并已表达的受体细胞，原理如图所示： (2)目的基因的检测 ①使用PCR等技术，检测目的基因是否插入转基因生物染色体DNA上及目的基因是否转录出特定mRNA。 ②采用抗原—抗体杂交技术，从转基因生物中提取蛋白质(作抗原)，与相应抗体杂交，依据是否出现杂交带确认目的基因是否“指导”特定蛋白质的合成。 ③采用抗虫、抗病毒等接种实验，进行目的基因成功表达的“个体生物学”水平的检测。 (二)PCR技术的操作原理和过程分析 [例2]　[多选](2024·扬州期中)聚合酶链式反应(PCR)是一种体外扩增DNA片段的技术。某DNA片段的PCR反应程序如图所示。下列叙述错误的是(　 ) A．预变性可促进模板DNA边解旋边复制 B．复性是让解旋状态模板DNA恢复双螺旋 C．延伸结束后，新片段中的引物将被切除 D．终延伸可使目的基因的扩增更加充分 √ √ √ [解析]　预变性的目的是破坏DNA中可能存在的较难破坏的复杂二级结构，使DNA充分变性，A错误；复性是让两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合，B错误；延伸结束后，新片段中不会切除引物，C错误；终延伸过程是为了让引物完全延伸并让单链产物完全复性形成双链结构，可使目的基因的扩增更加充分，D正确。 1．PCR技术和DNA复制的比较 |认|知|生|成| 项目 PCR技术 DNA复制 场所 体外(PCR扩增仪中) 细胞内(主要是细胞核内) 解旋方式 DNA在高温下变性解旋 解旋酶催化 酶 耐高温的DNA聚合酶 解旋酶、DNA聚合酶 温度条件 在较高温度下进行，需控制温度 细胞内温和条件 合成对象 DNA片段 DNA分子 相同点 均需要模板(DNA双链)、原料(四种脱氧核苷酸)、能量 2．PCR技术中的三个注意点 (1)在PCR过程中实际加入的为dNTP(即dATP、dGTP、dTTP、dCTP)，既可作为合成DNA子链的原料，又可为DNA的合成提供能量。 (2)引物既可以是DNA单链，也可以为RNA单链。细胞内的DNA进行复制时，也需要引物，一般为RNA片段。 (3)真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2＋激活。因此，PCR反应缓冲液中一般要添加Mg2＋。 3．PCR扩增过程中的循环图示与规律 循环次数 1 2 3 n DNA分子数 2 4 8 2n 含引物A(或B) 的DNA分子数 1 3 7 2n－1 同时含引物A、 B的DNA分子数 0＝21－2 2＝22－2 6＝23－2 2n－2 共消耗的 引物数量 2＝ 21＋1－2 6＝ 22＋1－2 14＝23＋1－2 2n＋1－2 (三)利用不同方式生产药物的区别 生产方式 乳腺生物反应器 工程菌 含义 指让外源基因在哺乳动物的乳腺中特异性表达，利用动物的乳腺组织生产药物蛋白 指用基因工程的方法，使外源基因得到高效表达的菌类细胞株系 受体与人类基因结构的差异 动物与人类的基因结构基本相同 细菌和酵母菌与人类的基因结构有较大差异 基因表达 合成的药物蛋白与天然蛋白质相同 细菌合成的药物蛋白可能没有活性 受体细胞 动物受精卵 微生物细胞 目的基因导入方式 显微注射法 Ca2＋处理法 生产条件 不需严格灭菌；温度等外界条件对其影响不大 需严格灭菌，严格控制工程菌所需的温度、pH、营养物质浓度等外界条件 药物提取 从动物乳汁中提取 从微生物细胞或其培养液中提取 续表 [例3]　(2024·常州检测)运用基因工程构建的生物反应器可实现药用蛋白的批量生产，目前常用的生物反应器有“乳腺生物反应器”和“膀胱生物反应器”，其构建过程如下：构建药用蛋白基因的表达载体，并将表达载体导入动物的受精卵中，然后从这个受精卵发育而成的个体的乳汁或者尿液中提取药用蛋白。下列相关说法错误的是(　 ) A．构建乳腺生物反应器时，需将药用蛋白基因和乳腺蛋白基因的启动子等重组在一起 B．在转基因动物的乳腺细胞或膀胱上皮细胞以外的细胞中不含有药用蛋白基因 C．与乳腺生物反应器相比，膀胱生物反应器不受性别和年龄的限制 D．将表达载体导入哺乳动物的受精卵时，常采用显微注射技术 √ [解析]　启动子是RNA聚合酶识别和结合的位点，可用于驱动基因的转录，构建乳腺生物反应器时，需将药用蛋白基因和乳腺蛋白基因的启动子等重组在一起，以保证目的基因在乳腺细胞中表达，A正确；受体细胞是动物的受精卵，所以在转基因动物的乳腺细胞或膀胱上皮细胞以外的其他细胞中也含有药用蛋白基因，只是没有表达，B错误；“乳腺生物反应器”只能从哺乳期雌性个体的乳汁中获取产物，与“乳腺生物反应器”相比，“膀胱生物反应器”的优点是雌雄个体的尿液中都可提取到产物，且不受年龄的限制，因而受体来源更广泛，C正确；将表达载体导入哺乳动物的受精卵(全能性最高)时，常采用显微注射技术，D正确。 题点(一)　基因工程的操作步骤与PCR技术 1．有关基因工程的操作步骤如下： ①目的基因与载体相结合；②将目的基因导入受体细胞；③检测目的基因的表达是否符合特定的性状要求；④获得目的基因；⑤筛选含有目的基因的受体细胞。正确的操作顺序是(　 ) A．③②④⑤① B．②④①⑤③ C．④①②⑤③ D．③⑤④①② √ 解析：基因工程的基本操作步骤主要包括：目的基因的筛选与获取，即④获得目的基因；基因表达载体的构建，即①目的基因与载体相结合；将目的基因导入受体细胞，即②；筛选含有目的基因的受体细胞，即⑤；目的基因的检测与鉴定，即③检测目的基因的表达是否符合特定性状要求，C符合题意。 2．如图a、b、c均为PCR扩增的DNA片段，下列有关说法正确的是(　 ) A．片段a、b、c的长度均相同 B．片段a、b只是第一次循环的产物 C．片段c最早出现在第二次循环的产物中 D．经过30次循环后，片段c的数量为230 √ 解析：图中片段a、b只有一种引物，是以原始DNA链为模板复制而来，其长度可能比片段c长，A错误。由于原始模板在每次循环中均可作为模板，则每次循环都能产生图中片段a、b，B错误。由于第一次循环的产物只有一种引物，而图中片段c有两种引物，则片段c最早出现在第二次循环的产物中，C正确。经过30次循环后，得到的DNA片段总数为230，其中包括图中的片段a、b，D错误。 3．(2024·连云港检测)数字PCR技术通过将一个样本分成几十到几万份，分配到不同的反应单元，每个反应单元最多包含一个拷贝的目标分子(DNA模板)，在每个反应单元中分别对目标分子进行PCR扩增，扩增结束后对各个反应单元的荧光信号进行统计学分析，如下图所示。下列相关叙述错误的是(　 ) A．PCR每一循环包括变性、复性和延伸三步 B．数字PCR可以在常温下进行，降低了检测成本 C．每个反应单元有无荧光取决于是否含有目标分子 D．数字PCR可实现对样品中目标分子的绝对定量分析 √ 解析：选B　PCR过程：目的基因DNA受热变性后解为单链(变性)，降温后引物与单链相应互补序列结合(复性)，然后以单链DNA为模板，在DNA聚合酶作用下进行延伸(延伸)，直到完成一次复制。此后每一循环都包括这三步，A正确。数字PCR也是体外DNA复制，需要高温使DNA变性，提供单链作模板，所以数字PCR在高温下进行，B错误。 每个反应单元最多包含一个拷贝的目标分子，如果反应单元中有目标分子，经PCR可以扩增大量目标分子，利用荧光检测时出现荧光信号；如果反应单元中没有分配到目标分子，反应单元不进行DNA复制，没有产物，利用荧光检测时不出现荧光信号，C正确。起始待测样品分配时，待分析PCR反应体系每个反应单元中最多分配有1个DNA分子，所以检测时，有多少单元有荧光信号，待测样品中起始就有多少DNA分子，所以数字PCR可实现对样品中目标分子的绝对定量分析，D正确。 4．[多选]干扰素是由淋巴细胞产生的一种细胞因子，在临床上常用于治疗病毒感染性疾病，科研人员通过构建基因工程菌来生产干扰素。下图为构建工程菌的流程图，图中质粒A上m、n分别是启动子和终止子，目的基因的b链为模板链。下列叙述错误的是(　 ) A．②过程需在b链5′端加接Nco Ⅰ的识别序列 B．①过程需要逆转录酶，RNA可从淋巴细胞中获得 C．③过程在酶的催化下有氢键形成 D．④过程常用方法为Ca2＋处理法 √ √ 解析：b链是模板链，转录只能从模板链的3′端开始，结合图中质粒上启动子和终止子的方向分析可知，应在a链5′端加接Nco Ⅰ的识别序列，b链5′端加接BamH Ⅰ的识别序列，才能保证目的基因正向插入质粒，A错误；①过程为逆转录，该过程需要逆转录酶，干扰素由淋巴细胞产生，因此可从淋巴细胞中获得控制干扰素合成的mRNA，B正确；③过程通过DNA连接酶将目的基因与质粒连接，该过程有氢键形成，但氢键形成无需酶的催化，C错误；④过程是将构建的基因表达载体导入大肠杆菌(微生物)，常用方法为Ca2＋处理法，D正确。 5．(2023·无锡锡山中学模拟)雪花莲凝集素基因(GNA)和尾穗苋凝集素基因(ACA)是两种抗蚜虫基因，其上的限制酶酶切位点如图1所示。研究人员将GNA和ACA连接成融合基因后与pBI121质粒载体结合，然后导入玉米细胞，最终获得13株玉米植株，并对其细胞中的总DNA进行提取后，用特定的引物扩增融合基因后进行电泳，结果如图2所示。 (1)①②过程均需要使用________________酶进行连接；与只用KpnⅠ处理相比，同时用KpnⅠ和XhoⅠ处理融合基因和pBI121质粒载体的优点是_____________________________________。 (2)通过分析图2可知，最终获得的13株玉米植株中，未能成功导入融合基因的植株是__________，成功导入融合基因的玉米植株________(填“一定”或“不一定”)能抗蚜虫，原因是____________。 (3)由转基因的玉米细胞培育成植株的过程所利用的技术是________________，其原理是______________________________________ ____________________________。 (4)在个体水平上鉴定转基因抗蚜虫玉米培育是否成功的方法是______________________________________________________________ ______________________________________________________________。 解析：(1)分析图1可知，①②过程包括目的基因连接及基因表达载体的构建，两个过程均需要DNA连接酶进行DNA片段的连接；与只用KpnⅠ处理相比，同时用KpnⅠ和XhoⅠ处理融合基因和pBI121质粒载体的优点是避免了融合基因、载体的自身环化以及二者的反向连接，保证目的基因转录方向正确。 (2)由图2可知，M为标准DNA,15为阳性对照，14为未转基因植株，对比可知，测验结果是阳性的证明已成功导入融合基因，而在最终获得的13株玉米植株中，不显示阳性条带的是6、12、13；由于导入的融合基因不一定能够成功表达，即不一定能够正常的转录和翻译，故成功导入融合基因的玉米植株不一定能抗蚜虫。 (3)由转基因的玉米细胞培育成植株的过程所利用的技术是植物组织培养技术，其原理是植物细胞具有全能性，即每个植物细胞都具有该植物生长发育所需的全部遗传信息。(4)在个体水平上鉴定转基因抗蚜虫玉米培育是否成功的方法是在获得的转基因植株上接种适量蚜虫，观察蚜虫的生长和繁殖情况，若蚜虫不能正常生长和繁殖，则转基因抗蚜虫玉米培育成功。 答案：(1)DNA连接　避免了融合基因、载体的自身环化以及二者的反向连接，保证目的基因转录方向正确　(2)6、12、13　不一定　导入的融合基因不一定能够成功表达　(3)植物组织培养技术　植物细胞具有全能性　(4)在获得的转基因植株上接种适量蚜虫，观察蚜虫的生长和繁殖情况 题点(二)　基因工程的应用 6．(2024·盐城检测)基因工程自20世纪70年代兴起后，在农牧业、医药卫生和食品工业等方面得到了飞速的发展。下列关于基因工程应用的叙述，正确的是(　 ) A．喷施除草剂后，杂草被杀死而抗除草剂玉米不会受到损伤 B．将肠乳糖酶基因导入奶牛基因组，可增加乳汁中乳糖含量 C．作为乳腺生物反应器的动物体内只有乳腺细胞含目的基因 D．将牛凝乳酶导入黑曲霉中，再通过工业发酵可生产凝乳酶 √ 解析：抗除草剂玉米含有抗性基因，则喷施除草剂后，杂草被杀死而抗除草剂玉米不会受到损伤，A正确；将肠乳糖酶基因导入奶牛基因组，乳糖酶可降解乳糖，可降低乳汁中乳糖含量，B错误；作为乳腺生物反应器的动物体内所有细胞都含有目的基因，但是只有乳腺细胞才能表达目的基因，C错误；将牛凝乳酶基因导入黑曲霉中，再通过工业发酵可生产凝乳酶，D错误。 7．研究者将含有乳铁蛋白肽基因和人干扰素基因的DNA片段分别制成探针，与从转基因奶牛的乳腺细胞、口腔上皮细胞、蹄部细胞中提取的mRNA分别进行杂交，结果如表所示。下列叙述正确的是(　 ) 探针 乳腺细胞 口腔上皮细胞 蹄部细胞 乳铁蛋白 肽基因探针 出现 杂交带 未现杂交带 未现杂交带 人干扰素 基因探针 出现 杂交带 出现杂交带 出现杂交带 A.乳铁蛋白肽基因可在转基因奶牛的多种体细胞中表达 B．人干扰素基因可在转基因奶牛的多种体细胞中表达 C．表中两种基因探针所含的脱氧核苷酸的序列相同 D．乳铁蛋白肽基因和人干扰素基因都是mRNA片段 √ 解析：分析表格数据，乳铁蛋白肽基因探针只在乳腺细胞中出现杂交带，说明乳铁蛋白肽基因只在转基因奶牛的乳腺细胞中表达，A错误；人干扰素基因探针在多种细胞中出现杂交带，说明其可在转基因奶牛的多种体细胞中表达，B正确；两种基因探针所含的脱氧核苷酸的种类可能相同，但核苷酸的数量和排列顺序不一定相同，C错误；乳铁蛋白肽基因和人干扰素基因都是有遗传效应的DNA片段，D错误。 8．血凝素基因(HA)编码的血凝素是构成流感病毒包膜纤突的主要成分。成熟的血凝素包含HA1和HA2两个亚单位，其中HA1含有病毒与受体相互作用的位点。人IgG抗体中的一段小肽，常作为融合蛋白标签，由IgGFc基因的片段(长度为717 bp)编码。蛋白质分泌依赖于信号肽的引导，本研究中用信号肽IL-­2SS代替HA自身信号肽，科研人员尝试构建IL-­2SS/HA1/IgGFc融合蛋白表达载体，并导入大肠杆菌进行表达和分泌。请回答下列问题： (1)流感病毒包膜主要由____________组成，包膜上血凝素的合成场所在______________。 (2)本实验用信号肽IL-2SS代替HA自身信号肽有利于融合蛋白分泌到大肠杆菌细胞外，PCR扩增目的基因时应该选择图中引物________。设计引物时，不能包含基因HA1的终止密码子的编码序列，原因是______________________________________________________ _______________________________________________。 (3)应选择限制酶________来切割质粒A，然后直接将PCR产物与质粒A混合，同时加入______DNA连接酶，使得目的基因与质粒A相连。若目的基因与质粒A正向连接，用BamHⅠ和SacⅠ同时切割重组质粒，完全酶切后的产物中短片段的长度约为________bp。 (4)有时为了满足应用需要，会在载体中人工构建诱导型启动子，当诱导物存在时，可以__________________________。 (5)图示中的限制酶有的来自大肠杆菌，但限制酶不能切割大肠杆菌本身的DNA分子，原因是________________________(答一点)。 解析：(1)流感病毒包膜来源于宿主细胞的细胞膜，主要由蛋白质和磷脂组成，病毒没有细胞结构及各种细胞器，包膜上血凝素的合成场所在宿主细胞的核糖体。(2)由图可知，引物b、c可与HA1两端的碱基序列结合，故PCR扩增目的基因应选择图中引物b和c。若设计引物时含有HA1的终止密码子的编码序列，则IL-­2SS/HA1/IgGFc融合蛋白表达载体转录后形成mRNA，核糖体读到终止密码子时就停止翻译，导致HA1基因之后的IgGFc基因的mRNA序列不能正常翻译，产生的HA1上不含IgGFc标签。 (3)由图可知，限制酶EcoRⅤ切割可产生平末端，其识别切割位点恰巧处于IL­-2SS和IgGFc中间，可选择该酶对质粒进行切割，然后直接将PCR产物与质粒A混合，同时加入T4 DNA连接酶，使得目的基因与质粒A相连。由图可知HA1基因片段长度为1 038－51＝987(bp)，重组质粒长度为5 554＋987＝6 541(bp)，IgGFc基因片段长度为717 bp，二者正向相连时BamHⅠ作用于HA1中，SacⅠ作用于IgGFc末端，完全酶切后的产物的长度约为717＋1 038－694＝1 061(bp)、5 554＋987－1 061＝5 480(bp)。 (4)载体中人工构建诱导型启动子可激活或者抑制目的基因的表达。(5)大肠杆菌本身的DNA分子不具备该酶的识别序列(或识别序列已经发生了甲基化等修饰)，所以限制酶不能切割大肠杆菌本身的DNA分子。 答案：(1)蛋白质和磷脂　宿主细胞的核糖体　(2)b、c　防止产生的HA1上不含IgGFc标签(或防止IgGFc基因不表达)　(3)EcoRⅤ　T4　1 061　(4)激活或者抑制目的基因的表达　 (5)本身不具备该酶的识别序列(或识别序列已经发生了甲基化等修饰) 主题研习(三)　蛋白质工程与DNA片段的扩增 及电泳鉴定(基础•自学型) (一)蛋白质工程的原理和应用 1．蛋白质工程的概念 2．蛋白质工程的基本原理 3．蛋白质工程的应用 医药工业 研发药物，如延长干扰素的保存时间；降低小鼠单克隆抗体诱发免疫反应的强度 其他工业 改进____的性能或开发新的工业用酶 农业 通过改造某些参与调控光合作用的酶，增加粮食产量；改造微生物____________，设计优良微生物农药，增强防治病虫害的效果 酶 蛋白质的结构 4．蛋白质工程与基因工程的区别和联系 (1)二者的实质不同：蛋白质工程是定向改造或生产人类所需的蛋白质；基因工程是定向改造生物的遗传特性，以获得人类所需的类型或生物产品。 (2)二者的过程不同(参见本书P608“基因工程的操作程序”和本页“蛋白质工程的基本原理”)。 (3)二者的结果不同：蛋白质工程可生产自然界没有的蛋白质；基因工程只能生产自然界已有的蛋白质。 (4)二者的联系 ①蛋白质工程是在基因工程基础上延伸出来的第二代基因工程； ②基因工程中所利用的某些酶需要通过蛋白质工程进行修饰、改造。 (二)DNA片段的扩增及电泳鉴定 1．实验基础 PCR原理 利用了_____________原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合 电泳 DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷_____的电极移动，这个过程就是电泳 DNA的热变性 相反 产物鉴定 PCR的产物一般通过________________来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的___________等有关。凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为_____ nm的紫外灯下被检测出来。 琼脂糖凝胶电泳 大小和构象 300 续表 2.PCR实验操作步骤和电泳鉴定 3．DNA片段琼脂糖凝胶电泳图谱分析 (1)线状双链DNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与DNA分子大小呈反比，分子越大则所受阻力越大，也越难在凝胶孔隙中移动，因而迁移得越慢，随着时间的推移，不同大小的DNA分子就会在凝胶中呈现出一个一个的条带。 (2)将待测样品电泳条带与Marker(已知长度的DNA片段)进行对比，即可知道待测样品中DNA片段的长度，其中条带的宽度反映了DNA含量的多少。如下图所示：几个待测样品中DNA片段长度基本一致，约为750 bp，其中F2样品中DNA含量最少。 [微点判断] (1)将人胰岛素A链上1个天冬氨酸替换为甘氨酸，B链末端增加2个精氨酸，可制备出一种人工长效胰岛素。该胰岛素可通过蛋白质工程方法生产。( ) (2)利用蛋白质工程技术在N0的α和β亚基之间加入一段连接肽，可获得热稳定的融合型腈水合酶(N1)。加入连接肽需要通过改造基因实现。( ) √ √ (3)某实验利用PCR技术获取目的基因，实验结果显示除目的基因条带(引物与模板完全配对)外，还有2条非特异条带(引物和模板不完全配对)。提高复性的温度可减少反应非特异条带的产生。( ) (4)PCR反应延伸过程无需引物参与即可完成半保留复制。( ) (5)进行DNA片段的扩增及电泳鉴定实验所需的缓冲液和酶应分装成小份，并在20 ℃条件下储存。( ) (6)在凝胶中DNA分子的迁移速率只与DNA分子的大小相关。( ) √ × × × 题点(一)　蛋白质工程的原理和应用 1．(2024·南通检测)蛋白质工程为改造蛋白质的结构和功能提供了新的途径。下列有关蛋白质工程及其应用的叙述错误的是(　 ) A．蛋白质工程的实质是通过改变氨基酸的结构改变蛋白质的功能 B．蛋白质工程是以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系为基础 √ C．蛋白质工程可对药用蛋白进行改造，使其更好地用于人类疾病的治疗 D．当前限制蛋白质工程发展的关键因素是对蛋白质高级结构的认知不足 解析：蛋白质工程的实质是通过改变基因的结构达到改变蛋白质功能的目的，A错误；蛋白质工程的基础是蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行基因改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需要，B正确；蛋白质工程可对药用蛋白进行改造，使其更适合人类医疗需要，更好地用于人类疾病的治疗，C正确；蛋白质功能的发挥依赖于其复杂的空间结构，当前限制蛋白质工程发展的关键因素是人们对蛋白质的高级结构了解太少，D正确。 2．(2024·扬州检测)人体内的蛋白TPA能降解由血纤维蛋白凝聚而成的血栓，但为心梗患者注射大剂量的TPA会诱发颅内出血。研究证实，通过蛋白质工程，将TPA第84位的半胱氨酸换成丝氨酸，可制造出性能优异的改良TPA，进而显著降低出血副作用。下列关于该蛋白质工程的叙述正确的是(　 ) A．制造改良TPA的过程不遵循中心法则 B．可利用X射线衍射技术分析TPA的晶体结构 C．该实例中TPA蛋白的基因增添碱基时可使用基因定点突变技术 D．需要在分子水平上直接对TPA进行定向改造 √ 解析：制造改良TPA的过程属于蛋白质工程，蛋白质工程修饰或合成的基因在复制和表达时仍然遵循中心法则，A错误；X射线衍射技术是对物质进行内部原子在空间分布状况的结构分析方法，X射线衍射技术可分析蛋白质的晶体结构，B正确；该实例中TPA蛋白的基因不是增添碱基，而是替换碱基，C错误；该技术不是在分子水平上直接对TPA进行改造，而是对TPA的基因进行改造，D错误。 题点(二)　DNA片段的扩增及电泳鉴定 3．(2024·无锡模拟)大肠杆菌经溶菌酶和洗涤剂处理后，拟核DNA就会缠绕在细胞壁碎片上，静置一段时间，质粒分布在上清液中，利用上述原理可初步获得质粒DNA。用三种限制酶处理提取的产物，电泳结果如图所示。下列关于质粒的粗提取和鉴定的叙述不正确的是(　 ) A．提取DNA时可加入酒精，使溶于酒精的蛋白质等物质溶解 B．将提取的DNA溶于2 mol/L NaCl溶液后，可用二苯胺试剂进行鉴定 C．电泳鉴定DNA利用了DNA在电场中会向着与它所带电荷相反的电极移动的原理 D．根据电泳结果，质粒上一定没有限制酶Ⅰ和Ⅱ的切割位点，而有限制酶Ⅲ的切割位点 √ 解析：DNA不溶于酒精，某些蛋白质溶于酒精，提取DNA时加入酒精，是为了让DNA析出，使溶于酒精的蛋白质等物质溶解，A正确；将提取的DNA溶于2 mol/L NaCl溶液后，可用二苯胺试剂在沸水浴条件下进行鉴定，DNA遇二苯胺试剂在沸水浴条件下会呈现蓝色，B正确；DNA分子具有可解离的基团，这些基团可以带上正电荷或负电荷，电泳鉴定DNA利用了DNA在电场中会向着与它所带电荷相反的电极移动的原理，C正确；因为质粒的本质是环状的DNA，限制酶Ⅰ和Ⅱ处理后电泳只有一条条带，所以该质粒上可能有一个切割位点，也可能没有切割位点，D错误。 4．[多选](2024·如皋中学模拟)下列关于DNA片段扩增及其鉴定的说法正确的有(　 ) A．凝胶中DNA分子通过染色，可以在紫外灯下被检测出来 B．－20 ℃储存的缓冲液和酶，使用前为加快融化速度，从冰箱取出直接水浴加热 C．在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小、构象等有关 D．为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头、蒸馏水等在使用前须进行高压灭菌处理 √ √ √ 解析：缓冲液和酶应分装成小份，并在－20 ℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化，B错误。 主题研习(四)　生物技术的安全性与伦理问题 (基础•自学型) 1．转基因产品的安全性 2．关注生殖性克隆人 (1)治疗性克隆和生殖性克隆的比较 项目 治疗性克隆 生殖性克隆 概念 利用克隆技术产生_______________ __________，用它们来修复或替代受损的细胞、组织和器官，从而达到___________的目的 通过克隆技术产生独立生存的新个体 特定的细胞、组 织和器官 治疗疾病 目的 用于医学研究或治疗疾病 用于生育，产生新个体 水平 _______水平 个体水平 联系 都属于无性生殖，产生的新个体或新组织的核遗传物质均不发生变化 细胞 续表 (2)生殖性克隆人面临的伦理问题 ①生殖性克隆人“有违人类尊严”。 ②生殖性克隆人是人为地制造在心理上和社会地位上都不健全的人。 ③克隆技术还不成熟，生殖性克隆人会面临流产、死胎和畸形儿等问题。 (3)生殖性克隆与治疗性克隆的主要过程 3．试管婴儿与设计试管婴儿的异同点 不同点 技术手段 设计试管婴儿在胚胎移植前需进行遗传学诊断(如诊断血型、诊断性别、诊断HLA的类型等)，试管婴儿不需进行遗传学诊断。 如下图，设计试管婴儿比试管婴儿多了d过程： 应用 试管婴儿主要是解决不孕夫妇的生育问题，设计试管婴儿用于白血病、贫血症等疾病的治疗 相同点 都是体外受精，并进行体外早期胚胎培养，都要经过胚胎移植，都是有性生殖 续表 4．生物武器 种类 ①致病菌类：炭疽杆菌、霍乱弧菌等 ②病毒类：天花病毒，某些动物的痘病毒、通过基因工程改造的流感病毒等 ③___________类：肉毒杆菌毒素等 特点 致病能力____，攻击范围____ 散布途径 可以直接或者通过食物、生活必需品和带菌昆虫等散布，经由呼吸道、消化道和皮肤等侵入人、畜体内，造成大规模伤亡，也能大量损害植物 生化毒剂 强 广 [微点判断] (1)(2020·北京卷)收集我国公民及生物资源的遗传信息不会给我国带来生物安全风险。( ) (2)(2021·北京卷)转基因抗虫棉能杀死害虫就一定对人有毒。( ) (3)(2022·辽宁卷)转基因品种经检测含有目的基因后即可上市。( ) (4)(2021·天津卷)提高Bt毒蛋白基因的表达量，可降低抗虫棉种植区的棉铃虫种群密度。( ) × × × √ (5)生殖性克隆和治疗性克隆两者有着本质的区别。( ) (6)“设计试管婴儿”与“试管婴儿”相比，前者在胚胎移植前需要对胚胎进行遗传学诊断。( ) (7)我国反对生物武器，但在特殊情况下可以生产生物武器。( ) √ √ × 1．(2023·北京高考)抗虫作物对害虫的生存产生压力，会使害虫种群抗性基因频率迅速提高，导致作物的抗虫效果逐渐减弱。为使转基因抗虫棉保持抗虫效果，农业生产上会采取一系列措施。以下措施不能实现上述目标的是(　 ) A．在转基因抗虫棉种子中混入少量常规种子 B．大面积种植转基因抗虫棉，并施用杀虫剂 C．转基因抗虫棉与小面积的常规棉间隔种植 D．转基因抗虫棉大田周围设置常规棉隔离带 √ 解析：大面积种植转基因作物并使用杀虫剂会导致不含抗性基因的害虫大量死亡，抗性基因频率会越来越高，B符合题意。在转基因抗虫棉种子中混入少量常规种子；转基因抗虫棉与小面积的常规棉间隔种植；转基因抗虫棉大田周围设置常规棉隔离带等措施均会减少对害虫的杀伤力，会使一部分害虫体内的非抗性基因保留下来，有利于保持抗性基因与非抗性基因的基因频率相对稳定，使转基因抗虫棉保持抗虫效果，A、C、D不符合题意。 2．(2023·浙江1月选考)以哺乳动物为研究对象的生物技术已获得了长足的进步。对生物技术应用于人类，在安全与伦理方面有不同的观点，下列叙述正确的是(　 ) A．试管婴儿技术应全面禁止 B．治疗性克隆不需要监控和审查 C．生殖性克隆不存在伦理道德方面的风险 D．我国不赞成、不允许、不支持、不接受任何生殖性克隆人实验 √ 解析：试管婴儿属于有性生殖，合理范围内，试管婴儿技术是可以使用的，A错误；治疗性克隆要在严格监管下进行，B错误；生殖性克隆会引起严重的道德、伦理、社会和法律问题，C错误。 3．(2024·南通检测)生物技术安全性和伦理问题是社会关注的热点。下列叙述正确的是(　 ) A．鉴于转基因食品安全的不确定性，应该禁止转基因食品上市 B．我国禁止克隆人的实验，对治疗性克隆实验也进行严格审查 C．设计试管婴儿能使后代更优秀，应该大力提倡使用该技术 D．生物武器是用微生物、毒素、干扰素及重组致病菌等来形成杀伤力 √ 解析：严格选择转基因产品的目的基因，可避免产生对人类有害的物质，减少人们对转基因食物安全的担忧，同时严格把关转基因食品上市的每一道程序，在确保安全的基础上慎重上市，A错误；当今社会的普遍观点是禁止克隆人的实验，特别是生殖性克隆，但不反对治疗性克隆，应对治疗性克隆实验也进行严格审查，B正确；设计试管婴儿只是在特定背景下的一种应急措施，需要经过国家有关部门的严格审批，不宜推广，并且要严防滥用，C错误；干扰素为细胞因子，并非生物武器，D错误。 |考|教|衔|接|——教材隐性命题点发掘 (一)教材素材“深加工” 1．(苏教版选择性必修3 P88“知识链接”素材挖掘)下表所示为常用的限制酶及其识别序列和切割位点。下列说法错误的是(　 ) 限制酶 名称 识别序列 和切割位点 限制酶 名称 识别序列 和切割位点 注：Y＝C或T，R＝A或C BglⅡ A↓GATCT KpnⅠ GGTAC↓C EcoRⅠ G↓AATTC MbooⅠ ↓GATC HindⅠ GTY↓RAC SmaⅠ CCC↓GGG A．限制酶的作用底物都是双链DNA，都能切开磷酸二酯键 B．BglⅡ和MbooⅠ两种限制酶切割后可形成相同的黏性末端 C．SmaⅠ切割DNA后形成的末端可用Ecoli DNA连接酶连接 D．一种限制酶可能识别多种核苷酸序列 √ 解析：限制酶能识别双链DNA分子中特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂，A正确；BglⅡ和MbooⅠ两种限制酶切割后可形成相同的黏性末端，均为GATC—，B正确；SmaⅠ切割DNA后成的末端为平末端，而Ecoli DNA连接酶只能连接黏性末端，C错误；HindⅠ的识别序列为GTY↓RAC，其中Y＝C或T，R＝A或G，说明其识别序列不只一种，则一种限制酶可能识别多种核苷酸序列，D正确。 2．(人教版选择性必修3 P77“相关信息”拓展分析)循环阈值(Ct值)是指通过PCR等技术手段，使病毒的核酸扩增产物达到可检测水平所需的循环次数。下列说法错误的是(　 ) A．Ct值为40和Ct值为35的核酸扩增产物的量可能相等 B．Ct值越高，则表示所检测的样本中病毒浓度越高，检测所需的时间越长 C．PCR反应过程中每次循环都要消耗两种引物 D．PCR反应缓冲液中添加的Mg2＋可以激活耐高温的DNA聚合酶 √ 解析：由于样品中的核酸含量不同，则Ct值为40和Ct值为35的核酸扩增产物的量可能相等，A正确；Ct值越高，则表示所检测的样本中病毒浓度越低，检测所需的时间越长，B错误；PCR产生的DNA分子是双链的，每条链扩增都需要一种引物，则PCR反应过程中每次循环都要消耗两种引物，C正确；用PCR扩增目的基因时，反应缓冲液中一般要添加Mg2＋来激活耐高温的DNA聚合酶，D正确。 3．(人教版选择性必修3 P96“拓展应用”变式训练)T4溶菌酶在温度较高时易失去活性，科学家通过相关研究，最终使T4溶菌酶的第3位异亮氨酸变为半胱氨酸。该半胱氨酸与第97位的半胱氨酸之间形成了一个二硫键，提高了T4溶菌酶的耐热性。下列叙述正确的是(　 ) A．T4溶菌酶耐热性提高的原因是组成该酶的氨基酸种类和数量发生了改变 B．T4溶菌酶的改造属于蛋白质工程的范畴，可利用抗原—抗体杂交的方法对该酶进行检测 √ C．蛋白质工程与中心法则中遗传信息的流动方向一致，即DNA→mRNA→蛋白质 D．根据设计的T4溶菌酶的氨基酸序列只能推测出一种脱氧核苷酸序列 解析：根据题意可知，T4溶菌酶耐热性提高的原因是组成该酶的氨基酸种类和排列顺序发生了改变，而氨基酸的数量没变，A错误；该实例将蛋白质进行了改造，属于蛋白质工程的范畴，T4溶菌酶的化学本质为蛋白质，可利用抗原—抗体特异性结合的特点对该酶进行检测，B正确；蛋白质工程与中心法则中遗传信息的流动方向相反，C错误；由于密码子的简并性，一种氨基酸可能对应多种密码子，因此根据设计的T4溶菌酶的氨基酸序列可能推测出多种脱氧核苷酸序列，D错误。 (二)科学思维“融会通” 4．(人教版选择性必修3 P178、79“图3-­5”建模解读) 根据PCR反应过程示意图分析下列问题： (1)PCR技术的原理是_________________________________。 (2)由图分析可知，在PCR反应过程中需要两种引物，原因是____________________________________________________________________________________________。 DNA半保留复制(体外DNA双链复制) DNA由两条反向平行的脱氧核苷酸链组成，DNA聚合酶不能从头合成DNA，而只能从3′端延伸DNA链 5．(人教版选择性必修3 P81“资料卡”原理分析) 在用土壤农杆菌转化法将目的基因导入植物细胞的过程中，需要将目的基因插入到Ti质粒的T-­DNA上，原因是________________________ ____________________________________________________________。 Ti质粒上的T-­DNA也称为可 转移的DNA，可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体DNA上 |应|用|创|新|——新情境问题的建模训练 1．(2024·盐城调研)转座子(又称跳跃基因)是染色体上一段可以移动的基因，其分子本质是一段能够插入到宿主基因组新位点的特异的DNA，广泛分布在原核生物和部分真核生物中。科学家针对转座子引起的5～10种常见的肿瘤蛋白，设想研制针对多种肿瘤的疫苗。下列分析错误的是(　 ) A．转座子的基本组成单位是脱氧核苷酸 B．转座子是具有遗传效应的DNA片段 C．转座过程中，原来位置的转座子消失，出现在新的位置上 D．这种肿瘤疫苗应能使机体产生抑制多种肿瘤的多种抗体 √ 解析：转座子又称跳跃基因，基因通常是具有遗传效应的DNA片段，DNA的基本组成单位是脱氧核苷酸，A、B正确；转座过程中，原来位置的转座子并未消失，发生转移的只是转座子的拷贝，C错误；转座子能引起5～10种常见的肿瘤蛋白，抗原抗体具有特异性，故这种肿瘤疫苗应能使机体产生抑制多种肿瘤的多种抗体，D正确。 2．组织型纤溶酶原激活物(t­-PA)能激活纤溶酶原转化为纤溶酶，将沉积在血管内外的纤维蛋白溶解，从而保持血管畅通。t-­PA进入血浆后大部分与纤溶酶原激活剂抑制物形成复合物，并迅速失去活性。科学家对其进行改造，增加溶栓效能、减少药用剂量和降低副作用等。下列叙述错误的是(　 ) A．改造t­-PA可通过改造基因或合成基因来实现 B．改造t­-PA的过程不需要构建基因表达载体 C．需根据t­-PA氨基酸序列改造或合成目的基因 D．利用蛋白质工程生产的改造t­-PA在自然界中不存在 √ 解析：改造蛋白质可通过改造相关基因或合成相关基因来实现，A正确；通过蛋白质工程改造t­-PA的过程仍需要构建基因表达载体，改造后的蛋白质的性状可以稳定的遗传给后代，B错误；根据蛋白质工程的基本思路可知，需要根据目的蛋白的氨基酸序列改造或合成相应DNA，C正确；利用蛋白质工程生产的蛋白质是自然界中不存在的蛋白质，D正确。 3．某科研团队将小麦抗锈病基因Tr导入高产但不抗锈病的玉米品种的细胞中培育出了高产抗锈病的品种。该玉米高产基因型为GGCC，G和C同时存在才高产，g和c不高产，两对基因独立遗传；导入基因Tr随机插入染色体上，但G、C基因内插入了基因Tr后G、C就失去功能，其他基因不考虑插入后的影响，下列选项正确的是(　 ) A．一般用花粉管通道法、显微注射法、农杆菌转化法将含基因Tr的表达载体导入玉米细胞 B．若只导入一个基因Tr，就能组织培育出高产抗锈病玉米纯种 C．若一个Tr基因插入到G基因内，则该玉米组织培养苗自交F1中，高产植株中抗锈病植株占2/3 D．该育种原理为染色体变异，转基因苗再自交可培育出纯种 √ 解析：将目的基因导入动物细胞一般用显微注射法，A错误。若只导入一个Tr基因且插在G基因内，G基因失去功能，而另一个G基因不受影响，该转基因玉米的基因型可看作TrGCC，无法培育出高产抗锈的纯种，B错误。该转基因玉米基因型为TrGCC，自交后代基因型为GGCC∶GTrCC∶TrTrCC＝1∶2∶1，子代高产必须同时要有G和C，因此高产植株中抗锈病玉米占2/3，C正确。该育种方法为基因工程育种，育种原理为基因重组；若Tr基因没有插入G/g基因和C/c基因内，则通过自交和筛选可能获得高产又抗锈病纯种，D错误。 课时跟踪检测 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 一、选择题 1．(2024·南京师大附中检测)模型构建是生命科学教学、科研的一种重要方法。右图是生物概念模型，相关分析错误的是(　 ) A．若图示为基因工程，则C为重组质粒，D为受体细胞 B．若图示为食物网，则D可能是次级消费者、第二营养级 C．若图示为核移植技术，则B可能为去核卵母细胞 D．若图示为试管婴儿技术，C→D中可能需要用到胚胎移植技术 √ 6 7 8 9 10 11 解析：若图示为基因工程，则C为重组质粒，是目的基因和载体相连形成的，D为受体细胞，为重组质粒的表达提供条件，A正确；若图示为食物网，则D可能是次级消费者、第三营养级，B错误；动物核移植，经常移植到去核卵母细胞中，若图示为核移植技术，则B可能为去核卵母细胞，此时A可能是细胞核供体细胞，C正确；若图示为试管婴儿技术，C可为早期胚胎，D可为母体，C→D中可能需要用到胚胎移植技术，D正确。 1 2 3 4 5 1 5 6 7 8 9 10 11 2．下列关于“DNA 的粗提取与鉴定”“DNA片段的扩增与电泳鉴定”实验的叙述，错误的是(　 ) A．选取细胞分裂旺盛的菜花表层花进行研磨是因为DNA含量高 B．研磨时需加入缓冲液，防止 DNA 在pH发生变化时降解或变性 C．在凝胶中，DNA分子的迁移速率与DNA分子的大小、构象等有关 D．PCR产物出现拖尾可能是非特异性扩增过多，可适当降低复性温度 2 3 4 √ 1 5 6 7 8 9 10 11 解析：新鲜的菜花DNA含量丰富，易获取，选取细胞分裂旺盛的菜花表层花进行研磨是因为DNA含量高，A正确；研磨时需加入缓冲液，稳定溶液pH，防止 DNA 在pH发生变化时降解或变性，B正确；电泳鉴定DNA利用了DNA在电场的作用下，会向着与它所带电荷相反方向的电极移动，在凝胶中，DNA分子的迁移速率与凝胶浓度、DNA分子的大小、构象等有关，C正确；复性温度越低，引物和底物越容易结合，错配情况增多，造成PCR特异性降低，故PCR产物出现拖尾可能是非特异性扩增过多，可适当提高复性温度，D错误。 2 3 4 1 5 6 7 8 9 10 11 3．(2024年1月·甘肃高考适应性演练)胰岛素可用于治疗糖尿病，我国科学家打破国外技术垄断，研发了拥有自主知识产权的重组人胰岛素药物，下列叙述错误的是(　 ) A．用PCR技术扩增人胰岛素基因时，每次循环包括变性、复性、延伸三步 B．构建人胰岛素基因表达载体时，需使用限制性内切核酸酶和DNA连接酶 2 3 4 1 5 6 7 8 9 10 11 C．大肠杆菌细胞经Ca2＋处理后，更容易吸收重组的人胰岛素基因表达载体 D．抗原—抗体杂交法不能检测人胰岛素基因表达载体是否导入大肠杆菌细胞 2 3 4 √ 1 5 6 7 8 9 10 11 解析：用PCR技术扩增人胰岛素基因时，每次循环可以分为变性、复性和延伸三步，A正确；在构建人胰岛素基因表达载体时，需使用限制性内切核酸酶切割含有目的基因的DNA片段和载体，再利用DNA连接酶将目的基因片段拼接到载体的切口处，形成重组DNA分子，B正确；大肠杆菌细胞经Ca2＋处理后，细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，更容易吸收重组的人胰岛素基因表达载体，C正确； 2 3 4 1 5 6 7 8 9 10 11 抗原—抗体杂交法可以检测人胰岛素基因是否在大肠杆菌中翻译成人胰岛素，若抗原—抗体杂交结果为阳性，说明人胰岛素基因在大肠杆菌中成功表达，则可以说明人胰岛素基因表达载体导入了大肠杆菌细胞中，D错误。 2 3 4 1 5 6 7 8 9 10 11 4．生物技术是把双刃剑，造福人类的同时也带来了安全性和伦理问题，人们必须高度重视。下列相关叙述错误的是(　 ) A．利用核移植技术获得胚胎，分离出ES细胞治疗白血病会产生伦理问题 B．若有国家研制出新型鼠痘病毒，用其制造生物武器会威胁人类安全 2 3 4 1 5 6 7 8 9 10 11 C．干细胞的研究可治疗很多疾病，不会带来伦理问题，不需要监管 D．研究转基因农作物时应采取多种方法防止转基因花粉的传播 2 3 4 √ 1 5 6 7 8 9 10 11 解析：利用核移植技术获得胚胎，分离出ES细胞治疗白血病会产生伦理问题，A正确；新型鼠痘病毒属于生物武器，会威胁人类的安全，B正确；干细胞的研究可治疗很多疾病，但同时会带来伦理问题，需要严格监管，C错误；研究转基因农作物时应采取多种方法防止转基因花粉的传播，避免基因污染，D正确。 2 3 4 1 5 6 7 8 9 10 11 5．(2024·常州中学检测)将从苏云金杆菌中获取的Bt基因转入棉花细胞内培育转基因抗虫棉的过程中，需借助多种分子工具经历多个操作步骤。实验人员使用限制酶EcoRⅠ和NheⅠ切割质粒。如图表示常用的限制酶识别序列和切割位点以及质粒上的限制酶切割位点。下列说法正确的是(　 ) 2 3 4 1 5 6 7 8 9 10 11 A．应选用限制酶MunⅠ和XbaⅠ切割Bt基因才能使之与切割后的质粒相连 B．启动子是转录的起始位点 C．从Bt基因扩增到基因表达载体构建完成共需要6种酶发挥催化作用 D．可通过PCR技术等检测Bt基因是否赋予了棉花抗虫特性以及抗性的程度 2 3 4 √ 1 5 6 7 8 9 10 11 解析：选C　由限制酶识别序列及切割位点可知，限制酶MunⅠ和EcoRⅠ切割后形成的黏性末端相同，限制酶NheⅠ、XbaⅠ和SpeⅠ切割后形成的黏性末端相同，为了避免破坏Bt基因，不能用XbaⅠ切割Bt基因，所以应选择用EcoRⅠ和NheⅠ去切割质粒，用MunⅠ和SpeⅠ切割目的基因，A错误；启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，能启动转录出mRNA，但转录的起始位点是位于启动子后面的序列，B错误； 2 3 4 1 5 6 7 8 9 10 11 切割Bt基因需要的酶是MunⅠ、SpeⅠ，Bt基因扩增需要耐高温的DNA聚合酶，切割质粒需要的酶是EcoRⅠ、NheⅠ，将Bt基因和质粒连接需要DNA连接酶，共需要6种酶，C正确；提取棉花的染色体DNA，用Bt基因的特异性引物进行PCR扩增，如能扩增出Bt基因，说明插入成功，所以可通过PCR技术检测棉花的染色体DNA中是否插入了Bt基因，而检测Bt基因是否赋予了棉花抗虫特性以及抗性的程度需要进行个体生物学鉴定，即用棉铃虫检测抗虫棉的抗性，D错误。 2 3 4 1 5 6 7 8 9 10 11 6．(2024·南京金陵中学一模)基因定点突变的目的是通过定向地改变基因内一个或少数几个碱基来改变多肽链上一个或几个氨基酸。该技术是蛋白质工程中的重要技术。下图为利用PCR技术进行定点突变的流程，相关叙述错误的是(　 ) 2 3 4 1 5 6 7 8 9 10 11 A．由于基因决定蛋白质，因此要对蛋白质的结构进行设计改造，最终还必须通过改造或合成基因来完成 B．酶A应为耐高温的DNA聚合酶，从4种引物中应该选择引物1和4进行PCR C．可以将引物1、引物2、引物3和引物4置于同一个反应系统中同时进行第一个阶段的反应，进而缩短实验时间 D．利用图示流程技术可以将两个不同的基因拼接到一起 2 3 4 √ 1 5 6 7 8 9 10 11 解析：基因控制蛋白质的合成，因此要对蛋白质的结构进行设计改造，最终还必须通过改造或合成基因来完成，A正确；酶A要在高温条件下延伸DNA，所以酶A应为耐高温的DNA聚合酶，由图可知，要得到定点突变的两条链一样长的DNA单链，应选择引物1和引物4，B正确；由图可知，引物2和引物3存在互补配对片段，置于同一个反应系统时它们会发生结合而失去作用，C错误；图示的过程为重叠延伸PCR技术，利用重叠互补引物可将两个不同的基因拼接到一起，D正确。 2 3 4 1 5 6 7 8 9 10 11 7．[多选](2024·徐州第一中学检测)原位PCR技术是利用原位PCR仪，在组织或细胞中靶DNA所在的位置上进行的PCR循环扩增，通过掺入标记基团直接显色或结合原位杂交进行检测的方法。进行扩增时，反应体系中的反应成分需渗透到组织或细胞的靶DNA处才能进行扩增。PCR反应体系中需要添加一定浓度的Mg2＋，而组织细胞间的物质会吸附Mg2＋，使进入细胞的Mg2＋减少。下列说法错误的是(　 ) 2 3 4 1 5 6 7 8 9 10 11 A．原位PCR技术需要从患者细胞中选择耐高温的DNA聚合酶 B．原位PCR反应体系中使用的Mg2＋浓度要比常规PCR高 C．反应体系中引物的G、C碱基含量越高，其复性温度越低 D．反应体系中子链的合成需要从模板链的5′端向3′端进行延伸 2 3 4 √ √ √ 1 5 6 7 8 9 10 11 解析：原位PCR技术的反应场所在细胞中，无需使用耐高温的DNA聚合酶，且耐高温的DNA聚合酶是从自然界热泉环境生物中提取的，而非来源于患者细胞，A错误；据题可知，PCR时组织细胞间的物质会吸附Mg2＋，使进入细胞的Mg2＋减少，因此原位PCR反应体系中使用的Mg2＋浓度要比常规PCR高，B正确；G—C之间有3个氢键，反应体系中引物的G、C碱基含量越高，DNA稳定性越强，其复性温度越高，C错误；反应体系中模板与引物结合后，在DNA聚合酶作用下子链从引物的5′端向3′端方向进行延伸反应，D错误。 2 3 4 1 5 6 7 8 9 10 11 8．[多选](2024·扬州检测)双脱氧终止法对DNA进行测序原理如图，在4支试管中分别加入4种脱氧核苷三磷酸(dNTP)和1种双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)；ddNTP可以与dNTP竞争核苷酸链延长位点，并终止DNA片段的延伸。在4支试管中DNA链将会分别在A、C、G及T位置终止，并形成不同长度的DNA片段。这些片段随后可被电泳分开并显示出来。下列说法正确的是(　 ) 2 3 4 1 5 6 7 8 9 10 11 A．这种测序方法需要引物和耐高温的DNA聚合酶 B．电泳图谱中的箭头所指的DNA片段以鸟嘌呤结尾 C．测得未知DNA的序列为5′-­GATTCGAGCTGA­-3′ D．ddNTP与dNTP竞争的延长位点是核苷酸链的5′末端 2 3 4 √ √ 1 5 6 7 8 9 10 11 解析：PCR是一种体外扩增DNA的技术，与细胞内DNA复制相似，需要一定的条件，主要包括耐高温的DNA聚合酶、引物、dNTP、一定的(含Mg2＋)缓冲液和DNA模板，A正确；电泳图谱中的箭头所指的DNA片段以鸟嘌呤(G)结尾，B正确；由图可知，引物扩增出的序列是5′­GATTCGAGCTGA­-3′，所以引物的互补序列是3′-­CTAAGCTCGACT­5′，即测得未知DNA的序列为5′­-TCAGCTCGAATC-­3′，C错误；子链从引物的5′端向3′端延伸，ddNTP与dNTP竞争的延长位点是核苷酸链的3′末端，D错误。 2 3 4 1 5 6 7 8 9 10 11 二、非选择题 9．(2024·南京、盐城一模)人体肝脏细胞中的乙醛脱氢酶2(ALDH2)是人体酒精代谢中的关键酶。研究人员利用定点诱变技术对ALDH2基因进行改造后在大肠杆菌中表达，获得具有较好溶解性的乙醛脱氢酶2。所用质粒和操作过程如图。其中，AmpR为氨苄青霉素抗性基因，TetR为四环素抗性基因。质粒的外侧链为a链，内侧链为b链。基因AmpR转录的模板链属于a链的片段。改造后的ALDH2基因编码区首端到末端(其中一条链)的序列为5′­ATCCATGCGCTC…(中间核苷酸序列)…CAGTGAGTAGCG­-3′。四种限制酶的识别序列及切割位点如下。请回答下列问题： 2 3 4 1 5 6 7 8 9 10 11 BamHⅠ：G↓GATCC，PstⅠ：C↓TGCAG， Xho Ⅰ：C↓TCGAG，Xba Ⅰ：T↓CTAGA 2 3 4 1 5 6 7 8 9 10 11 (1)通过定点突变技术可制备自然界原本________(填“存在”或“不存在”)的蛋白质。 (2)质粒复制的模板链是________(选填“a”“b”“a和b”或“a或b”)链，基因TetR转录的模板链属于________的片段。若用XhoⅠ切割质粒，形成的单链末端碱基序列为________________。 2 3 4 1 5 6 7 8 9 10 11 (3)过程②需要的酶是__________________________________。过程③常采用__________处理以提高操作效果。经过程④，在培养基上能形成菌落的大肠杆菌类型有______________________________________。 (4)为扩增目的基因，某同学设计了如下六种PCR引物，其中可选用的一对引物是________(选填数字序号)。根据选定的引物，至少需经过________次循环，可获得32个符合要求的目的基因。 2 3 4 1 5 6 7 8 9 10 11 ①5′-TCTAGAATCCATGCGCTC-­3′ ②5′-TCTAGACGCTACTCACTG­-3′ ③5′-CTGCAGATCCATGCGCTC­-3′ ④5′-GGATCCCGCTACTCACTG­-3′ ⑤5′-GGATCCATCCATGCGCTC­-3′ ⑥5′-CTCGAGCGCTACTCACTG­-3′ 2 3 4 1 5 6 7 8 9 10 11 解析：(1)需要采用定点突变技术表明自然界不存在相应的基因，因此控制合成的蛋白质在自然界不存在。(2)DNA分子复制时，2条链均可作为复制模板，即质粒的a和b两条链都作为模板进行复制。转录过程从启动子向终止子方向，若同一个DNA分子的不同基因启动子和终止子位置相反，则其各自基因的模板链位于DNA分子的不同链上，TetR的转录方向与AmpR的转录方向相反，说明TetR的转录模板和AmpR的转录模板不在一条链上，AmpR转录的模板链属于a链的片段，则TetR的转录模板链属于b链的片段。XhoⅠ的识别序列为C↓TCGAG，则若用XhoⅠ切割质粒，形成的单链末端碱基序列为TCGA—(或—AGCT)。 2 3 4 1 5 6 7 8 9 10 11 (3)过程②是构建重组质粒，需要用限制酶切割目的基因和质粒，再利用DNA连接酶将目的基因和质粒连接起来。用Ca2＋处理大肠杆菌，使其形成感受态，易于外来DNA进入。重组质粒和空白质粒均含有四环素抗性基因，在培养基上能形成菌落的大肠杆菌类型有导入空白质粒和导入重组质粒的大肠杆菌。 2 3 4 1 5 6 7 8 9 10 11 (4)过程①的PCR过程需要通过在引物中添加限制酶切割位点，以获得改造的目的基因。结合质粒的酶切位点，XhoⅠ会破坏两个标记基因，不能选。为避免反向连接，最好选择BamHⅠ和XbaⅠ两种限制酶，根据ALDH2基因编码区首端到末端的序列为5′-­ATCCATGCGCTC…(中间核苷酸序列)…CAGTGAGTAGCG-­3′，可推测②⑤符合题意。扩增n次，得到符合要求的目的基因数量为2n－2n，当n＝6时，才能获得32个符合要求的目的基因。 2 3 4 1 5 6 7 8 9 10 11 答案：(1)不存在　(2)a和b　b链　TCGA—(或—AGCT)　(3)限制酶(或BamHⅠ、XbaⅠ)和DNA连接酶　Ca2＋　导入空白质粒的和导入重组质粒的大肠杆菌　(4)②⑤　6 2 3 4 1 5 6 7 8 9 10 11 10．(2024·徐州考前模拟)纤维二糖酶可以将纤维二糖分解成葡萄糖和其他单糖。将来源于黑曲霉的纤维二糖酶基因(CB)和强启动子Pcbh1、终止子Tcbh1构建成重组质粒，获得了高效表达纤维二糖酶的里氏木霉优势菌株。请回答下列问题： 2 3 4 1 5 6 7 8 9 10 11 (1)科研人员利用PCR扩增黑曲霉的CB，请完成表格。 2 3 4 项目 相关操作 缓冲液 PCR反应缓冲液中一般要添加①________ 模板、引物、原料和酶 提供DNA模板、2种引物、dNTP和Taq DNA聚合酶 1 5 6 7 8 9 10 11 反应过程 每次循环依次分为②______________________三步 循环次数 一次PCR一般要经历30次循环 产物鉴定 常采用③______________________________来鉴定PCR的产物 2 3 4 续表 1 5 6 7 8 9 10 11 (2)为将CB以正确方向插入质粒需要双酶切。已知CB的α链为转录的模板链，应在图1中引物________的________端加入EcoRⅠ的识别序列，理由是________________________________________________________ _________________________________________________________。 2 3 4 1 5 6 7 8 9 10 11 (3)为研究磷脂酶(PLC-­E)与纤维二糖酶基因表达的关系，研究者构建了高效沉默PLC­-E基因的反向双启动子载体，如图3所示，其中TrpC和Rp2为启动子，eGFP为增强绿色荧光蛋白基因。 2 3 4 1 5 6 7 8 9 10 11 实验结果预测和分析： ①转基因里氏木霉菌无绿色荧光，说明PLC­-E基因沉默，其机理是______________________________________________________。 ②与野生型相比，转基因里氏木霉菌的纤维二糖酶含量显著降低，说明_____________________________________________。 2 3 4 1 5 6 7 8 9 10 11 解析：(1)PCR反应为体外DNA复制，反应体系中应加入DNA模板、引物、4种脱氧核苷酸、Taq DNA聚合酶、含Mg2＋的PCR反应缓冲液等。PCR一次循环要经过变性→复性→延伸三步。一次PCR一般要经历30次循环。扩增结束后，常采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物。(2)见答案。 2 3 4 1 5 6 7 8 9 10 11 (3)①在2个方向相反的启动子作用下，转录形成的两种mRNA互补，翻译过程受阻，达到eGFP与PLC-E基因同时沉默的效果，因此转基因里氏木霉菌无绿色荧光，表明PLC-E基因沉默。②转基因里氏木霉菌的磷脂酶基因沉默，与野生型相比，其纤维二糖酶含量显著降低，说明磷脂酶促进纤维二糖酶基因的表达。 2 3 4 1 5 6 7 8 9 10 11 答案：(1)①Mg2＋　②变性、复性和延伸　③琼脂糖凝胶电泳　(2)2　5′　α链为转录的模板链，该链在强启动子Pcbh1后的方向应为3′→5′，因此，引物2应位于CB的上游；子链从引物2的3′端延伸，其5′端应构建EcoRⅠ的酶切位点　(3)①在双启动子作用下，转录形成的两种RNA互补，产生双链RNA，抑制翻译，达到eGFP与PLC-E基因同时沉默的效果　②磷脂酶促进纤维二糖酶基因的表达 2 3 4 1 5 6 7 8 9 10 11 11．(2024·盐城一模)In-Fusion技术是一项新型的无缝克隆技术。该技术关键是要在目的基因两端构建与线性化质粒末端相同的DNA序列(即同源序列，通常为15～20 bp)，然后用In-Fusion酶(能识别双链线性化DNA片段5′→3′末端任意16个碱基，使其降解)处理，即可实现无缝连接。其操作步骤如下图。请回答下列问题： 2 3 4 1 5 6 7 8 9 10 11 (1)为获得线性化质粒，除了图示利用PCR方法外，还可利用________________方法实现。 2 3 4 1 5 6 7 8 9 10 11 (2)热启动PCR可提高扩增效率，方法之一是先将除________________以外的各成分混合后，加热到80 ℃以上再混入酶，然后直接从94 ℃开始PCR扩增。与常规PCR相比，这样做的目的是可减少反应起始时________形成的产物。 (3)图中，同源序列1、2中的碱基序列________(填“相同”或“不同”)。这样设计的目的是____________________，还能防止线性化质粒或目的基因自身环化。 2 3 4 1 5 6 7 8 9 10 11 (4)据图分析，引物A或引物B要依据_____________________序列进行设计。 (5)含同源序列的线性化质粒与目的基因混合后，In-Fusion酶的作用可能是处理线性化质粒与目的基因的同源序列，形成________，然后降温使其发生____________，进而在DNA聚合酶及______酶的作用下完成质粒的环化，形成重组质粒。 2 3 4 1 5 6 7 8 9 10 11 (6)与传统构建重组质粒的方法相比，In-Fusion技术的优势之一是____________________________________________________________ _____________________________________________________________。 2 3 4 1 5 6 7 8 9 10 11 解析：(1)环状的质粒变为线性化质粒，需要水解磷酸二酯键，可通过限制酶酶切实现。(2)Taq DNA聚合酶通常在比适宜温度低得多的条件下仍有较强的活性，PCR反应的最初加热过程中，样品温度上升到80 ℃之前，在较低的温度下引物可能与部分单链模板非特异性结合，并在Taq DNA聚合酶的作用下延伸，导致非靶序列的扩增，影响反应的特异性。热启动可减少非靶序列的扩增，提高反应的特异性。 2 3 4 1 5 6 7 8 9 10 11 (3)同源序列应与发生重组的目标序列一致，同源序列1与同源序列2中的碱基序列不能相同。这样设计的目的是防止重组过程中目的基因反向连接，还能防止线性化质粒或目的基因自身环化。(4)图中PCR产物具有线性化质粒的同源序列1和同源序列2，因此在PCR设计引物时需在引物的5′端加上同源序列，设计引物的依据为目的基因及质粒(同源序列1、2)的碱基序列。 2 3 4 1 5 6 7 8 9 10 11 (5)结合题干信息，In-Fusion酶能识别双链线性化DNA片段5′→3′末端任意16个碱基，使其降解，在处理线性化质粒与目的基因的同源序列时，可形成黏性末端，然后降温使其发生碱基互补配对，再在DNA聚合酶和DNA连接酶作用下完成质粒的环化，形成重组质粒。(6)In-Fusion技术的优势有不受限制酶酶切位点的限制；可以把目的基因插入任何位点；避免限制酶切割对质粒功能区的破坏等。 2 3 4 1 5 6 7 8 9 10 11 答案：(1)限制酶处理　(2)Taq DNA聚合酶　引物错配　(3)不同　防止目的基因反向连接　(4)质粒(或同源序列1、2)与目的基因碱基(或脱氧核苷酸)　(5)黏性末端　碱基互补配对　DNA连接　(6)不受限制酶酶切位点的限制；可以把目的基因插入任何位点；避免限制酶切割对质粒功能区的破坏等(合理即可) 2 3 4 $$