选必3 第11单元 第3讲 第二课时 锁定热点题型，强化迁移应用（课件）-【新高考方案】2025版高考生物Ⅰ一轮总复习

锁定热点题型，强化迁移应用 第二课时 限制酶的选取是基因工程操作的重点也是难点，近年来与基因工程相关的较难的高考试题大都围绕限制酶的选取进行考查。PCR技术既可以用于获取目的基因，又可以用于目的基因的检测与鉴定，是基因工程中重要技术之一，在生产、医学领域得到了广泛的应用(如核酸检测)，因此也是近年高考的热点。 目录 题型（一） 题型（二） 基因工程操作中限制酶的选择方法　 PCR技术中引物的相关问题 课时跟踪检测 题型（一）基因工程操作中限制酶的选择方法　 [典例导析] [例1]　(2023·湖北高考)用氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、四环素抗性基因(TetR)作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体(重组质粒)，并转化到受体菌中。下列叙述错误的是(　 ) A．若用Hind Ⅲ酶切，目的基因转录的产物可能不同 B．若用Pvu Ⅰ酶切，在含Tet(四环素)培养基中的菌落，不一定含有目的基因 C．若用Sph Ⅰ酶切，可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否 D．若用Sph Ⅰ酶切，携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)和Tet的培养基中能形成菌落 √ [解析]　若用Hind Ⅲ酶切质粒和含有目的基因的DNA片段，用DNA连接酶将两者连接成重组质粒，目的基因和质粒有正向连接和反向连接两种连接形式，因此，目的基因转录的产物可能不同，A正确； 若用PvuⅠ酶切，会破坏氨苄青霉素抗性基因，四环素抗性基因不受影响，在含Tet培养基中的菌落可能是含有目的基因的重组质粒，也可能是质粒自身连接的普通质粒，因此，在含Tet培养基中的菌落，不一定含有目的基因，B正确； DNA凝胶电泳技术可分离大小不同的DNA分子，若用SphⅠ酶切，由于重组质粒和普通质粒的碱基对数不同，因此可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否，C正确； 若用SphⅠ酶切，会破坏四环素抗性基因，氨苄青霉素抗性基因不受影响，因此携带目的基因的受体菌在含Amp的培养基中能形成菌落，不能在含Tet的培养基中形成菌落，D错误。 [例2]　(2022·福建高考，节选)美西螈具有很强的再生能力。研究表明，美西螈的巨噬细胞在断肢再生的早期起重要作用。为研究巨噬细胞的作用机制，科研人员制备了抗巨噬细胞表面标志蛋白CD14的单克隆抗体，基因工程抗原的制备： (1)根据美西螈CD14基因的核苷酸序列，合成引物，利用PCR扩增CD14片段。已知DNA聚合酶催化引物的3′-OH与加入的脱氧核苷酸的5′-P形成磷酸二酯键，则新合成链的延伸方向是____(填“ 5′→3′”或“ 3′→5′”)。 (2)载体和CD14片段的酶切位点及相应的酶切抗性基因序列如图所示。用XhoⅠ和SalⅠ分别酶切CD14和载体后连接，CD14接入载体时会形成正向连接和反向连接的两种重组DNA。可进一步用这两种限制酶对CD14的连接方向进行鉴定，理由是______________________ ________________________________________________________。 [解析]　(1)PCR扩增时，DNA聚合酶催化引物的3′-OH与加入的脱氧核苷酸的5′-P形成磷酸二酯键，因此新链合成的方向是从5′→3′。 (2)可进一步用限制酶XhoⅠ和SalⅠ对CD14的连接方向进行鉴定，是因为正向连接的重组DNA有这两种酶的酶切位点(限制酶的识别序列)；而反向连接的重组DNA会形成新的序列，没有这两种酶的酶切位点(没有限制酶的识别序列)。 [答案]　(1)5′→3′　(2)正向连接的重组DNA有这两种酶的酶切位点(限制酶的识别序列)；而反向连接的重组DNA会形成新的序列，没有这两种酶的酶切位点(没有限制酶的识别序列) [思维建模] 1．根据限制酶切割位点的位置确定限制酶的种类 (1)应选择切割位点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择PstⅠ。 (2)不能选择切割位点位于目的基因和标记基因内部的限制酶，如图甲、乙不能选择SmaⅠ。 (3)为避免目的基因和质粒的自身环化及随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切割位点)。 2．根据质粒的特点确定限制酶的种类 3．根据Ti质粒的T-DNA片段选择限制酶 图中甲、乙、丁Ti质粒均不宜选取，而丙Ti质粒宜选取(切割目的基因的限制酶为XbaⅠ和SacⅠ)，分析如下： [应用体验] 1．(2024·厦门模拟)下表为四种限制酶所识别的核苷酸序列及相应的切割位置(箭头所指)，下列叙述正确的是(　 ) A.①②③④可催化磷酸二酯键和氢键断裂，形成黏性末端 B．①切出的DNA片段，只有用E.coli DNA连接酶才能连接起来 C．②③切出的末端连接后形成的片段，不能再被②或③识别切割 D．构建基因表达载体时，用②③进行双酶切，可防止目的基因与载体的反向连接 √ 解析：①②③④均为限制酶，可催化磷酸二酯键的断裂，不能催化氢键的断裂，且均形成黏性末端，A错误； ①切出的DNA片段带有黏性末端，用E.coli DNA连接酶和T4 DNA连接酶均能连接起来，B错误； ②③切出的黏性末端相同，用DNA连接酶连接后形成的片段的碱基序列为—GGATCT—，因而不能再被②或③识别切割，C正确； 构建基因表达载体时，用②③进行双酶切，不能防止目的基因与载体的反向连接，因为这两种限制酶切出的黏性末端是相同的，D错误。 2．(2024·东莞模拟)某种病毒(＋RNA)的刺突蛋白S通过与人体黏膜细胞表面的ACE2受体结合而进入细胞，是宿主抗体的重要作用位点。图1是科研人员利用该病毒的＋RNA提取S蛋白基因和S蛋白受体结合域RBD基因作为抗原基因序列，研制该病毒双抗原疫苗的技术路线。已知PCR1与PCR2要分别进行，然后将产物混合，使用引物1和引物4进行PCR3，最终获得大量S-RBD融合基因(1 300 bp)。请分析回答： (1)片段1与片段2连接形成S-RBD融合基因。在PCR3对其进行扩增的过程中，需要使用________酶，该酶的作用是____________。 (2)为初步检测过程B构建是否成功，对重组pX系列质粒及其酶切产物进行凝胶电泳检测，结果如图2。据图可知，酶切时用到的酶是____________________，重组质粒pX2和pX5构建成功的依据是____________________________________________________________。 (3)在筛选工程菌时，可先后用两种抗生素进行培养实验。鉴定pX质粒是否导入工程菌还可以采用的方法是_________________。 解析：(1)由于操作过程具有较高的温度，故PCR过程中，需要的酶是耐高温的DNA聚合酶(Taq DNA聚合酶)；该酶的作用是将单个的脱氧核苷酸连接到引物的3′端。 (2)据图1可知，目的基因应插入到启动子和终止子之间，可选择的酶有HindⅢ、NdeⅠ，此外结合图2电泳图可知，还需将融合基因(1 300 bp)切割，图1中该融合基因中的限制酶是EcoRⅠ；分析图2，图右边M是对照基因，用于标记大小，①②号泳道是两个质粒全长，③④号泳道是酶切后目的基因和质粒的大小，据图可知，重组质粒pX2和pX5构建成功的依据是重组质粒pX2和pX5酶切后形成的750和550片段碱基对总和为S-RBD融合基因的长度1 300。 (3)在筛选工程菌时，由于含目的基因的菌落对第二次培养时使用的抗生素(四环素)无抗性，故在第二次培养时存活的菌落不含目的基因；鉴定pX质粒是否导入工程菌还可以采用的方法是观察菌落是否具有荧光，有荧光的则含有pX质粒。 答案：(1)耐高温的DNA聚合(Taq DNA聚合酶)　将单个的脱氧核苷酸连接到引物的3′端　(2)HindⅢ、NdeⅠ、EcoRⅠ　重组质粒pX2和pX5酶切后形成的750和550片段碱基对总和为S-RBD融合基因的长度1 300　(3)观察菌落是否具有荧光，有荧光的则含有pX质粒 题型（二）PCR技术中引物的相关问题 [典例导析] [例1]　(2023·天津高考，节选)基因工程：制备新型酵母菌 (1)已知酵母菌不能吸收淀粉，若想使新型酵母菌可以直接利用淀粉发酵，则应导入多步分解淀粉所需的多种酶，推测这些酶生效的场所应该是________(填“细胞内”和“细胞外”) (2)同源切割是一种代替限制酶、DNA连接酶将目 的基因导入基因表达载体的方法。当目的基因两侧的 小段序列与基因表达载体上某序列相同时，就可以发 生同源切割，将目的基因直接插入。研究人员运用同源切割的方式，在目的基因两端加上一组同源序列A—B，已知酵母菌体内DNA有许多A－B序列位点可以同源切割插入。构建完成的目的基因结构如图，则应选择图中的引物________对目的基因进行PCR。 [解析]　(1)由于酵母菌不能吸收淀粉，所以导入分解淀粉的酶发挥作用的场所在细胞外。 (2)根据题干信息“当目的基因两侧的小段序列与基因表达载体上某序列相同时，就可以发生同源切割，将目的基因直接插入”，要保证目的基因两侧的小段序列与基因表达载体上某序列相同，而酵母菌体内DNA有许多A—B序列位点，因此需要选择P1和P6这对引物进行PCR。 [答案]　(1)细胞外　(2)P1和P6 [例2]　(2023·山东高考)科研人员构建了可表达J-V5融合蛋白的重组质粒并进行了检测，该质粒的部分结构如图甲所示，其中V5编码序列表达标签短肽V5。 (1)与图甲中启动子结合的酶是________________。除图甲中标出的结构外，作为载体，质粒还需具备的结构有____________________ (答出2个结构即可)。 (2)构建重组质粒后，为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，需进行PCR检测，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物________________。已知J基因转录的模板链位于b链，由此可知引物F1与图甲中J基因的________(填“a链”或“b链”)相应部分的序列相同。 (3)重组质粒在受体细胞内正确表达后，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表达水平，结果如图乙所示。其中，出现条带1证明细胞内表达了______________，条带2所检出的蛋白________(填“是”或“不是”)由重组质粒上的J基因表达的。 [解析]　(1)与启动子结合的酶是RNA聚合酶，质粒中除含有启动子和终止子外，还需具备的结构有限制酶切割位点、标记基因、复制原点等。 (2)为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，需进行PCR检测，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物F1和R2或F2和R1。b链是模板链，而根据图甲中启动子和终止子的位置可知转录方向是从左向右，对应的模板链方向应是3′→5′，非模板链(a链)是5′→3′。由于DNA复制的方向是子链的5′→3′，所以引物的延伸方向为5′→3′，引物结合的单链其方向是3′→5′，故与引物F1配对的单链是b链，与引物F1相应的部分序列相同的是a链。 (3)据图乙可知，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测，均出现条带1，说明条带1是J-V5融合蛋白。抗J蛋白抗体检测出现条带2，抗V5抗体检测不出现条带2，说明条带2所检测出的蛋白不是由重组质粒上的J基因表达的。 [答案]　(1)RNA聚合酶　限制酶切割位点、标记基因、复制原点等　(2)F1和R2(或F2和R1)　a链　(3)J-V5融合蛋白　不是 [思维建模] 1．与引物相关的问题归纳概括 (1)PCR技术需要引物的原因 DNA聚合酶不能单独从头开始合成DNA，只能从一段DNA序列的3′端延伸DNA链，因此，DNA的复制需要引物。当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后，DNA聚合酶就能从引物的3′端开始延伸DNA链，因此DNA的合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸。 (2)PCR扩增中需要引物数目的计算规律 若一个DNA分子在PCR中经过n轮循环，理论上需要消耗引物数为2n＋1－2个，第n轮循环需要消耗的引物数为2n个。 2．PCR中使用的引物应具备的特点 (1)引物能与DNA模板的碱基进行互补配对。 (2)2种引物之间不能有互补的碱基序列，避免引物形成双链，导致扩增失败。 (3)某一引物不能存在局部碱基序列互补配对，避免自身出现折叠配对，无法和模板DNA结合。 (4)多数情况需要在2种引物的5′端添加不同限制酶识别的碱基序列，扩增出的DNA片段可以使用相应限制酶切割后与载体正向连接。 (5)引物不能太短，以防扩增出非特异性DNA片段(非目的基因)。 [应用体验] 1．(2023·浙江6月选考)某研究小组利用转基因技术，将绿色荧光蛋白基因(GFP)整合到野生型小鼠Gata3基因一端，如图甲所示。实验得到能正常表达两种蛋白质的杂合子雌雄小鼠各1只，交配以期获得Gata3-GFP基因纯合子小鼠。为了鉴定交配获得的4只新生小鼠的基因型，设计了引物1和引物2用于PCR扩增，PCR产物电泳结果如图乙所示。 下列叙述正确的是(　 ) A．Gata3基因的启动子无法控制GFP基因表达 B．翻译时先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白 C．2号条带的小鼠是野生型，4号条带的小鼠是Gata3-GFP基因纯合子 D．若用引物1和引物3进行PCR，能更好地区分杂合子和纯合子 √ 解析：由图甲可知，Gata3基因与GFP基因共用一个启动子，且由题干可知两基因均能正常表达出相关蛋白质，即Gata3基因的启动子可以控制GFP基因表达，A错误； 由于启动子在左侧，目的基因在右侧，转录基因时，先转录Gata3基因，再转录GFP基因，由于转录和翻译的方向均是沿mRNA的5′→3′，因此翻译时先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白，B正确； 利用引物1和引物2进行PCR扩增，大片段包含GFP基因编码区和非编码区片段，小片段不包含GFP基因编码区片段，只有非编码区片段，则2号小鼠是Gata3-GFP基因纯合子，4号小鼠是野生型，C错误； 若用引物1和引物3进行PCR，杂合子和Gata3-GFP基因纯合子均能扩增出条带，仅有Gata3基因时无法扩增出条带，不利于区分杂合子和纯合子，D错误。 2．(2024·泰安模拟)通过设计引物，运用PCR技术可以实现目的基因的定点诱变。下图为基因工程中获取突变基因的过程，其中引物1序列中含有一个碱基T不能与目的基因片段配对，但不影响引物与模板链的整体配对，反应体系中引物1和引物2的5′端分别设计增加限制酶a和限制酶b的识别位点。下列有关叙述正确的是(　 ) A．在该PCR反应体系中还需要加入4种游离核苷酸、解旋酶、Taq DNA聚合酶等 B．第2轮PCR，引物1能与图中②结合并且形成两条链等长的突变基因 C．引物中设计两种限制酶识别位点有利于目的基因定向插入载体 D．第3轮PCR结束后，含突变碱基对且两条链等长的DNA分子占1/2 √ 解析：在该PCR反应体系中还需要加入4种游离脱氧核苷酸、Taq DNA聚合酶等，但不需要加入解旋酶，A错误； 第2轮PCR，引物1能与图中②结合并且形成两条链不等长的突变基因，其中②较长，B错误； 引物中设计两种限制酶识别位点，可以配合载体的限制酶识别位点，帮助目的基因定向定点插入载体，避免发生自身环化和反向连接，C正确； 在第3轮PCR结束后，含突变碱基对且两条链等长的DNA分子有2个，总DNA分子共8个，所以比例为1/4，D错误。 3．(2024·东莞模拟)幽门螺杆菌(Hp)是慢性胃炎、淋巴增生性胃淋巴瘤的主要致病菌，该菌的Ipp20基因能合成其特有的蛋白质，据此，研究者利用基因工程制备Hp疫苗。已知Ipp20基因表达时，双链DNA的一条链是编码链，另一条链是模板链，如图1；四种限制酶及其识别序列如图2；三种质粒如图3，箭头表示限制酶的切割位点。回答下列问题： (1)转录产生的mRNA前8个碱基序列为________(方向为5′端→3′端)。若通过PCR技术大量扩增Ipp20基因的编码区段，则需要设计一对引物，其中结合到编码链上的引物序列是________(方向为5′端→3′端，写出5′端8个碱基序列)。 (2)据图1、2、3分析，构建基因表达载体时，应选用的限制酶是_______，最适合用作载体的质粒是_______。 解析：(1)模板链与图1中的编码链为互补链，而转录产生的mRNA又与模板链的碱基互补配对，所以转录产生的mRNA前8个碱基序列为5′CUCGAGAU；若通过PCR技术大量扩增Ipp20基因的编码区段，则需要设计一对引物，其中结合到编码链3′端上的引物序列是5′TCTAGAGG。 (2)据图1、2分析，Ipp20基因编码区内部含BamHⅠ和PstⅠ的识别序列，构建基因表达载体时若选用这两种限制酶会破坏目的基因。虽然目的基因中也有XhoⅠ和XbaⅠ的识别序列，但位于目的基因两端，目的基因被切割后，与质粒上的黏性末端相连，不会对目的基因序列造成影响。为避免目的基因和质粒的自身环化和反向连接，应同时选用XhoⅠ和XbaⅠ。质粒X中，XhoⅠ切割会破坏终止子；质粒Y中，Xho Ⅰ和XbaⅠ同时切割会使标记基因均被破坏；质粒Z中，XhoⅠ和XbaⅠ的切割位点位于启动子与终止子中间，切割后可保留潮霉素抗性基因，且对其他结构无影响。 答案：(1)5′CUCGAGAU　5′TCTAGAGG　 (2)XbaⅠ、XhoⅠ　质粒Z   课时跟踪检测 1 2 3 4 5 6 7 8 一、选择题 1．下列有关限制酶的叙述，正确的是(　 ) A．用限制酶切割一个DNA分子中部，获得一个目的基因时，被水解的磷酸二酯键有2个 B．限制酶识别序列越短，则该序列在DNA中出现的概率就越大 √ 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 8 解析：获得一个目的基因时，需要切割目的基因的两侧，又因DNA为双链结构，因此要断裂4个磷酸二酯键，即被水解的磷酸二酯键有4个，A错误； 限制酶具有专一性，限制酶识别序列越短，则该序列在DNA中出现的概率就越大，B正确； 1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 用不同的限制酶处理含目的基因的DNA片段和质粒，若产生的黏性末端相同，则也能形成重组质粒，D错误。 1 5 6 7 8 2．同尾酶是指切割不同的DNA片段后能产生相同黏性末端的一类限制酶，下列四种限制酶中属于同尾酶的是(　 ) 2 3 4 A．①③ B．②④ C．①③和②④ D．①④ √ 1 5 6 7 8 解析：限制酶切割后，①产生的黏性末端为CATG，③产生的黏性末端为CATG，因此①③产生的黏性末端相同，符合同尾酶的定义，故选A。 2 3 4 1 5 6 7 8 2 3 4 1 5 6 7 8 A．用EcoRⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体 B．用BglⅡ和EcoRⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体 C．用BglⅡ和Sau3AⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体 D．用EcoRⅠ和Sau3AⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体 2 3 4 √ 1 5 6 7 8 解析：用EcoRⅠ切割目的基因和P1质粒载体，产生相同的黏性末端，用DNA连接酶连接时可能会发生反向连接，A错误； 用BglⅡ和EcoRⅠ或用BglⅡ和Sau3AⅠ切割目的基因和P1质粒载体，会导致目的基因的插入方向与图丙中所示的方向相反，B、C错误； 只有用EcoRⅠ和Sau3AⅠ切割目的基因和P1质粒载体，既能产生不同的黏性末端，又能防止发生反向连接，且这样目的基因插入载体后，RNA聚合酶的移动方向与图丙实线方向相同，D正确。 2 3 4 1 5 6 7 8 4．利用PCR技术扩增目的基因，其原理与细胞内DNA复制类似，过程如图所示。图中引物为单链DNA片段，它是子链合成延伸的基础。下列叙述错误的是(　 ) 2 3 4 1 5 6 7 8 A．引物A、B的碱基不能进行互补配对 B．复性的目的是让引物与单链DNA相结合 C．延伸时，DNA聚合酶从引物的3′端连接脱氧核苷酸 D．第二轮循环后，同时含有引物A、B的DNA占100% 2 3 4 √ 1 5 6 7 8 解析：如果引物A和引物B发生碱基互补配对，则不能与相应模板链结合，无法完成子链的延伸，故引物A、B的碱基不能进行互补配对，A正确； 复性的目的是让引物通过碱基互补配对与单链DNA结合，B正确； 延伸时，在DNA聚合酶的作用下，将4种脱氧核苷酸加到引物的3′端，C正确； DNA复制为半保留复制，第二轮循环即DNA复制2次，共形成22＝4个DNA分子，其中含有最初模板链的2个DNA分子含有引物A或引物B，其余2个DNA分子均含有引物A和引物B，所以第二轮循环产物中同时含有引物A和引物B的DNA片段所占的比例为50%，D错误。 2 3 4 1 5 6 7 8 2 3 4 1 5 6 7 8 2 3 4 1 5 6 7 8 A．质粒和目的基因都用限制酶Ⅱ切割 B．用限制酶切割获得目的基因时，需要消耗4个水分子 C．限制酶Ⅰ和限制酶Ⅱ切割后获得的黏性末端相同 D．质粒中标记基因便于筛选出含目的基因的细胞 2 3 4 √ 1 5 6 7 8 解析：据题图可知，目的基因的左端是限制酶Ⅰ的识别序列，目的基因右端是限制酶Ⅱ的识别序列，用限制酶Ⅱ切割能将目的基因切割下来；质粒有GeneⅠ和GeneⅡ两种标记基因，分别含有限制酶Ⅰ和限制酶Ⅱ的识别序列，如果用限制酶Ⅱ切割，则GeneⅠ和GeneⅡ都被破坏，造成重组质粒无标记基因，用限制酶Ⅰ切割，则只破坏GeneⅡ，保留GeneⅠ，且其黏性末端和切割目的基因所在DNA的黏性末端相同，可以连接形成重组DNA，故质粒用限制酶Ⅰ切割，目的基因用限制酶Ⅱ切割，A错误。 2 3 4 1 5 6 7 8 用限制酶切割获得目的基因时，会切开两条DNA分子链，断裂四个磷酸二酯键，需要消耗4个水分子，B正确。 限制酶Ⅰ和限制酶Ⅱ切割后获得的黏性末端相同，都是—CTAG，C正确。 质粒中的标记基因的作用是用来筛选含有目的基因的受体细胞，D正确。 2 3 4 1 5 6 7 8 6．研究表明80%的结直肠癌患者的A基因(肿瘤抑制基因)突变产生A－基因，A－表达的错误蛋白不行使正常功能且会干扰正常A蛋白发挥作用。Cre-loxP系统可通过删除DNA特定位点的Stop序列，调控目标基因的表达，原理如图。科研人员利用该系统构建A基因杂合突变的结直肠癌模型鼠，且只允许突变基因A－在该鼠肠上皮细胞表达。具体操作中，研究人员需对两只野生型鼠分别转基因，然后从它们的杂交后代中筛选目标个体。下列相关叙述错误的是(　 ) 2 3 4 1 5 6 7 8 2 3 4 1 5 6 7 8 2 3 4 1 5 6 7 8 2 3 4 √ 1 5 6 7 8 解析：由题图可知，在启动子和目标基因间插入loxP-Stop-loxP序列后，转录终止，目标基因不表达，A正确； 由图可知，Cre酶可通过识别loxP位点敲除Stop序列，实现目标基因的表达，B正确； 2 3 4 1 5 6 7 8 2 3 4 欲从两只鼠杂交后代中选出A基因杂合突变的结直肠癌模型鼠，且只允许突变基因A－在该鼠肠上皮细胞表达，可导入一只野生型鼠的基因及调控序列为A/A－基因的启动子—loxP-Stop-loxP—A－基因，此时A－不能表达， 导入另一只野生型鼠的基因及调控序列为使基因只在肠上皮细胞表达的启动子—Cre酶基因，Cre酶基因可正常表达，杂交后代中，当Cre酶基因表达出Cre酶时，即调控基因表达的序列与Cre酶基因结合，能切除Stop(和一个loxP)序列，这样A－基因转录，符合该条件的小鼠为目标小鼠，C正确，D错误。 1 5 6 7 8 二、非选择题 7．烟草细胞合成的尼古丁是农业生产中比较理想的杀虫剂。研究人员在烟草细胞中发现PMT基因，欲将外源PMT基因导入烟草细胞，来研究其表达与尼古丁合成量之间的关系。据图请回答下列问题： (1)获取PMT基因的常用方法是提取烟草细胞的总RNA，通过________获得cDNA，一般通过________________来鉴定PCR产物。 2 3 4 1 5 6 7 8 (2)在构建基因表达载体时，应选择______________限制酶，这样选择的理由是____________________________________________________ ___________________________________________________________。 2 3 4 1 5 6 7 8 (3)通过________法转化烟草细胞后，可以使用含____________的选择培养基筛选出含有目的基因T-DNA的烟草细胞。 (4)获得转基因烟草细胞后，通过植物组织培养获得转基因烟草植株，请写出能够证明“PMT基因表达量升高可使得烟草根系细胞中尼古丁合成量提高”的实验结果。_________________________________________ ___________________________________________________________。 2 3 4 1 5 6 7 8 解析：(1)提取烟草细胞的总RNA，通过逆转录的方法获得cDNA；PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。 (2)NcoⅠ在目的基因(PMT)两侧均有切割位点，为避免质粒和目的基因自身环化又可以避免质粒与目的基因反向连接，在构建基因表达载体时，应选择限制酶BamHⅠ和EcoRⅠ。 2 3 4 1 5 6 7 8 (3)通过农杆菌转化法将目的基因转入烟草细胞后，可以使用含潮霉素的选择培养基筛选出含有目的基因T-DNA的烟草细胞。 (4)与普通烟草根系细胞相比，导入了外源PMT基因的烟草根系细胞分泌的尼古丁量增加，可说明PMT基因表达量升高可使得烟草根系细胞中尼古丁合成量提高。 2 3 4 1 5 6 7 8 答案：(1)逆转录　琼脂糖凝胶电泳　(2)BamHⅠ和EcoRⅠ　既可以避免质粒和目的基因自身环化又可以避免质粒与目的基因反向连接　(3)农杆菌转化　潮霉素　(4)与普通烟草根系细胞相比，导入了外源PMT基因的烟草细胞根系分泌的尼古丁量增加 2 3 4 1 5 6 7 8 8．1965年中国科学家人工合成了具有生物活性的结晶牛胰岛素，摘取了人工合成蛋白质的桂冠。此后科学家又提出了利用基因工程改造大肠杆菌生产人胰岛素的两种方法：“AB”法是根据胰岛素A、B两条肽链的氨基酸序列人工合成两种DNA片段，利用工程菌分别合成两条肽链后将其混合自然形成胰岛素；“BCA”法是利用胰岛B细胞中的mRNA得到胰岛素基因，利用工程菌获得胰岛素。这两种方法使用同一种质粒作为载体。请回答下列问题。 2 3 4 1 5 6 7 8 (1)图1是利用基因工程生产人胰岛素过程中使用的质粒及目的基因的部分结构。在设计PCR引物时最好添加限制酶________________的识别序列，选择依据是____________________________________________ ________________________________________________________。 2 3 4 1 5 6 7 8 (2)目前，科学家已通过将肽链中 B链的第28位氨基酸——脯氨酸(密码子 为CCU)替换为天冬氨酸(密码子为GAU)， 有效抑制了胰岛素的聚合，研发出速效 胰岛素类似物产品。在改造用BCA法获得 的胰岛素基因时，可运用大引物PCR进行 定点突变，相关原理如图2所示。 2 3 4 1 5 6 7 8 为保证有效抑制胰岛素的聚合，进行第一次PCR时所用的突变上游引物的合理设计是____________________________。利用所获得的大引物、模板和其他引物等进行第二次PCR，要获得带有突变位点的、适于与上图中质粒构建基因表达载体的改良基因，引物应选用大引物两条链中的______(填“①”或“②”)；至少进行______次循环才能获得双链等长的改良基因。 2 3 4 1 5 6 7 8 (3)β-半乳糖苷酶可以分解无色的X-gal产生蓝色物质使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色。将转化后的大肠杆菌接种到添加了____________________等成分的培养基上，呈现________色的菌落即为含有重组质粒的大肠杆菌菌落。 2 3 4 1 5 6 7 8 解析：(1)根据题图质粒与目的基因上的相关酶切位点分析，SalⅠ和NheⅠ的作用位点在目的基因中，会破坏目的基因，则在引物设计时不能选择添加这两种限制酶的识别位点，只能在XhoⅠ、MunⅠ和EcoRⅠ中选择；由于LacZ基因和AmpR基因中均有MunⅠ的识别序列，若选择MunⅠ，会导致标记基因都被破坏，而无法筛选； 2 3 4 1 5 6 7 8 而质粒上EcoRⅠ和XhoⅠ的作用位点只在一种标记基因(即LacZ基因)上，选择这两种酶只会破坏一种标记基因，仍然保留了另一个标记基因以供筛选，同时可避免目的基因、质粒的自身环化，保证目的基因与质粒不会进行反向连接。若要目的基因两侧带有EcoRⅠ和XhoⅠ这两种限制酶切割的黏性末端，则需要在(扩增目的基因)设计PCR引物时，添加限制酶EcoRⅠ和XhoⅠ的识别序列。 2 3 4 1 5 6 7 8 (2)根据碱基互补配对原则，B链的第28位氨基酸——脯氨酸替换为天冬氨酸，则需要将转录模板链相应位置GGA改为CTA，那么与之结合的相应引物的序列应由CCT改为GAT。从大引物和目的基因的结合位点分析，若选择①链，由于其是与目的基因中间部位结合，导致其延伸的片段并不是完整的目的基因片段，只有选择②链才能与目的基因的3′端结合， 2 3 4 1 5 6 7 8 然后从②链的3′端添加核苷酸才能获得完整的目的基因片段，因此要获得带有诱变点的改良基因，引物应选用大引物两条链中的②链。利用大引物②链作为下游引物和常规上游引物共同进行PCR时，根据PCR过程和DNA 分子半保留复制特点可知，前两轮循环产生的四个DNA 分子的两条链不等长或不含改良基因，第三次循环产生的DNA分子存在等长的含改良基因的序列。   2 3 4 1 5 6 7 8 (3)已知β-半乳糖苷酶可以分解无色的X-gal产生蓝色物质使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色。而结合题图，目的基因的插入破坏了LacZ基因的结构，使其不能正常表达，无法产生β-半乳糖苷酶，底物X-gal不会被分解，则菌落呈现白色。故应将转化后的大肠杆菌接种到添加了氨苄青霉素和X-gal的培养基上，筛选出的白色菌落即为含有重组质粒的大肠杆菌菌落。 2 3 4 1 5 6 7 8 答案：(1)EcoRⅠ和XhoⅠ　胰岛素基因中有SalⅠ和NheⅠ的识别序列，选用这两种限制酶切割会破坏目的基因；LacZ基因和AmpR基因中均有MunⅠ的识别序列，选用该种限制酶切割会破坏标记基因，导致无法筛选；选EcoRⅠ和XhoⅠ能避免目的基因、质粒的自身环化，保证目的基因与质粒不会进行反向连接　(2)将CCT改为GAT　②　3　(3)氨苄青霉素、X-gal　白 2 3 4 C. 和序列被限制酶切出的黏性末端可用DNA连接酶连接 D．只有用相同的限制酶处理含目的基因的片段和质粒，才能形成重组质粒 和序列被限制酶切出的黏性末端不同，分别为—CATG和GATC—，因此不能用DNA连接酶连接，C错误； 3．若要利用某目的基因(见图甲)和P1噬菌体载体(见图乙)构建重组DNA(见图丙)，限制酶的酶切位点分别是Bgl Ⅱ()，EcoR Ⅰ()和Sau3A Ⅰ()。下列分析合理的是(　 ) 5．在基因工程中，已知限制酶Ⅰ的识别序列和切点是，限制酶Ⅱ的识别序列和切点是。根据图示判断，下列操作错误的是(　 ) A．启动子和目标基因间插入loxP-Stop-loxP序列后，目标基因不表达 B．Cre酶可通过识别loxP位点敲除Stop序列，实现目标基因的表达 C．导入一只野生型鼠的基因及调控序列为 —— D．导入另一只野生型鼠的基因及调控序列为—— $$