第14单元 第1课时 基因工程的基本工具和操作程序（课件）-【创新方案】2026年高考生物一轮复习（单选版）

第十四单元 基因工程和生物技术的 安全性与伦理问题 基因工程的基本工具和操作程序 第1课时 5.1.1　概述基因工程是在遗传学、微生物学、生物化学和分子生物学等学科基础上发展而来的 5.1.2　阐明DNA重组技术的实现需要利用限制性内切核酸酶、DNA连接酶和载体三种基本工具 5.1.3　阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的获取、基因表达载体的构建、目的基因导入受体细胞和目的基因及其表达产物的检测鉴定等步骤 5.1.4　举例说明基因工程在农牧、食品及医药等行业的广泛应用改善了人类的生活品质 课标要求 目录 再认再现——教材基础落实 课时跟踪检测 互动课堂——核心深化学习 再认再现——教材基础落实 一、基础知识判断 (1)(2024·贵州卷)使用不同的限制酶也能产生相同的黏性末端。 ( ) (2)DNA连接酶主要有两类：E.coli DNA连接酶和T4 DNA连接酶。 ( ) (3)载体的作用是携带目的基因导入受体细胞中，使之稳定存在并表达。 ( ) (4)切割质粒的限制性内切核酸酶均能特异性地识别6个核苷酸序列。 ( ) √ × √ √ (5)基因工程是人工操作导致的染色体变异，变异是不定向的。 ( ) (6)限制性内切核酸酶、DNA连接酶和质粒是基因工程中常用的三种工具酶。 ( ) (7)外源DNA必须位于重组质粒的启动子和终止子之间才能进行复制。 ( ) (8)(2024·河北卷)配制PCR反应体系时，加入等量的4种核糖核苷酸溶液作为扩增原料。 ( ) (9)用PCR方法扩增目的基因时必须知道基因的全部序列。 ( ) × × × × × 别名 _________技术 操作对象 ______ 操作水平 _________水平 结果 创造出更符合人们需要的新的_________和_________ 二、基本概念梳理 1.基因工程的概念 重组DNA 基因 DNA分子 生物类型 生物产品 2.重组DNA技术的基本工具 (1)限制性内切核酸酶(简称“限制酶”) 原核生物 特定核苷酸序列 磷酸二酯键 黏性末端 (2)DNA连接酶 磷酸二酯键 (3)载体 质粒 噬菌体 有一个至多个 自我复制 受体DNA 标记 3.基因工程的基本操作程序 (1)目的基因的筛选与获取 ①目的基因 在基因工程的设计和操作中，用于改变____________或获得_________ _____等的基因。主要是指___________的基因。 ②筛选合适的目的基因 从相关的已知___________清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。 ③利用PCR获取和扩增目的基因 a.原理：DNA的半保留复制。 b.条件：DNA模板、2种引物、耐高温的DNA聚合酶和4种脱氧核苷酸。 受体细胞性状 预期表达产物 编码蛋白质 结构和功能 过程 说明 图解 变性 当温度超过90 ℃时，双链DNA解聚为单链 复性 当温度下降到50 ℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合 延伸 当温度上升到72 ℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链 c.扩增过程 (2)基因表达载体的构建 ①构建基因表达载体的目的 使目的基因在受体细胞中_________，并且_____给下一代； 使目的基因能够_____和发挥作用。 稳定存在 表达 遗传 ②基因表达载体的组成 RNA聚合酶 转录 (3)将目的基因导入受体细胞 生物种类 植物 动物 微生物 常用方法 农杆菌转化法、 _____________ 显微注射法 _____处理法 受体细胞 体细胞或受精卵 ________ 原核细胞 转化过程 将目的基因插入Ti质粒的T⁃DNA中转入农杆菌→侵染植物细胞→整合到受体细胞的染色体DNA上→表达 将含有目的基因的表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→受精卵发育→胚胎移植→获得具有新性状的动物 Ca2+处理细胞→细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态→基因表达载体导入 花粉管通道法 Ca2+ 受精卵 检测水平 检测目的 检测方法 分子 水平 目的基因是否插入受体细胞的染色体DNA上 __________ 目的基因是否转录出了mRNA 目的基因是否翻译出蛋白质 ______________ 个体 水平 转基因生物是否表现出相应的特性 如抗虫、抗病的接种实验 (4)目的基因的检测与鉴定 PCR技术 抗原—抗体杂交 融通大概念——建构知识体系 [盘点总结] (1)DNA连接酶连接的是两个DNA片段，而DNA聚合酶是把单个的脱氧核苷酸连接到已有的DNA片段上。DNA聚合酶起作用时需要以一条DNA链为模板，而DNA连接酶不需要模板。 (2)原核生物中限制酶的作用是切割外源DNA以保证自身安全，防止外来病原物的危害。原核生物中的限制酶不能切割自身DNA是因为原核生物DNA中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。 互动课堂——核心深化学习 [系统知能] 1.归纳比较与DNA有关的五种酶 核心点(一)　基因工程的基本工具 名称 作用部位 作用底物 作用结果 限制酶 磷酸二酯键 DNA 将DNA分子切割开 DNA连接酶 磷酸二酯键 DNA 片段 将两个DNA片段连接为一个DNA分子 DNA聚合酶或耐高温的DNA聚合酶 磷酸二酯键 脱氧 核苷酸 将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端 DNA (水解)酶 磷酸二酯键 DNA 将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸 解旋酶 碱基对之间 的氢键 DNA 将双链DNA分子局部解旋为单链，形成两条长链 续表 2.基因工程中限制酶或质粒的选择方法 (1)根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶种类 ①应选择切点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择PstⅠ。 ②不能选择切点位于目的基因和标记基因内部的限制酶，如图甲、乙不能选择SmaⅠ。 ③为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切点)。 (2)根据质粒的特点确定限制酶的种类 (3)根据限制酶的切割位点选择Ti质粒 图中甲、乙、丁Ti质粒均不宜选取，而丙Ti质粒宜选取(设切割目的基因的限制酶为XbaⅠ和SacⅠ)，分析如下： [题点全练] 题点1　限制酶和DNA连接酶 1.(2024·湖南高考)某同学将质粒DNA进行限制酶酶切时，发现DNA完全没有被酶切，分析可能的原因并提出解决方法。下列叙述错误的是(　 ) A.限制酶失活，更换新的限制酶 B.酶切条件不合适，调整反应条件如温度和酶的用量等 C.质粒DNA突变导致酶识别位点缺失，更换正常质粒DNA D.酶切位点被甲基化修饰，换用对DNA甲基化不敏感的限制酶 √ 解析：限制酶失活会使DNA完全不被酶切，此时应更换新的限制酶，A正确；酶具有微量、高效、作用条件较温和等特性，酶切条件不合适(如高温下酶失活)可导致DNA完全不被酶切，但酶的用量不会，B错误；质粒DNA突变会导致限制酶识别位点缺失，进而造成限制酶无法进行切割，此时应更换正常质粒DNA，C正确；质粒DNA上酶切位点被甲基化修饰，会导致对DNA甲基化敏感的限制酶无法进行酶切，此时应换用对DNA甲基化不敏感的限制酶，D正确。 2.某同学拟用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA连接酶为工具，将目的基因(两端含相应限制酶的识别序列和切割位点)和质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是 (　 ) A.质粒和目的基因都用酶3切割，用E.coli DNA连接酶连接 B.质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4 DNA 连接酶连接 C.质粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4 DNA 连接酶连接 D.质粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E.coli DNA连接酶连接 √ 解析：只用一种限制酶切割质粒和目的基因，会使质粒和目的基因发生自身环化或者使目的基因在质粒中反向连接，且E.coli DNA连接酶连接具有平末端的DNA片段的效率要远远低于T4 DNA 连接酶，A不符合题意；用酶1切割目的基因，产生的是黏性末端，用酶3切割质粒，产生的是平末端，两者切割后无法相互连接，B不符合题意；质粒和目的基因都用酶1和酶2切割后，可使用T4 DNA连接酶连接，使目的基因定向插到质粒中，C符合题意；酶2和酶4切割后产生的黏性末端相同，易导致目的基因和质粒自身环化或者使目的基因在质粒中反向连接，并且用酶4切割会破坏标记基因，D不符合题意。 [微点拨] (1)限制酶的识别序列一般由6个核苷酸组成，少数由4个、8个或其他数量的核苷酸组成。 (2)限制酶作用的化学键只能是磷酸二酯键。 (3)在切割含目的基因的DNA分子时，需用限制酶切割两次此DNA分子，产生4个末端。只有这样才能使目的基因的两端都有可连接的黏性末端或平末端。 题点2　基因工程中质粒的选择方法 3.(2025·张家界二模)质粒是基因工程中常用的载体，质粒有标记基因(如图所示)，通过标记基因可以推知外源基因(目的基因)是否转移成功。质粒上箭头表示三种限制酶的酶切位点。外源基因插入的位置不同，细菌在培养基上的生长情况不同。如表是外源基因插入(插入点有a、b、c)后细菌的生长情况。下列有关叙述正确的是(　 ) 项目 细菌在含氨苄青霉素 的培养基上生长情况 细菌在含四环素的 培养基上生长情况 ① 能生长 不能生长 ② 能生长 能生长 ③ 不能生长 能生长 A.在质粒的复制原点上有RNA聚合酶的结合位点 B.①②③三种重组后细菌的外源基因插入点①是a，②是c，③是b C.质粒被一种限制酶切开时，被水解的磷酸二酯键有2个 D.将外源基因与质粒连接时需用DNA聚合酶 √ 解析：质粒的复制原点上有DNA聚合酶的结合位点，A错误；①②③三种重组后细菌的外源基因插入点①是b，②是c，③是a，B错误；质粒被一种限制酶切开时，被水解的磷酸二酯键有2个，C正确；将外源基因与质粒连接时需用DNA连接酶，D错误。 [微点拨] 限制酶的选择 (1)不破坏目的基因。 (2)保留标记基因、启动子、终止子、复制原点。 (3)善用“双酶切”，注意方向性，其优点和作用是①防止目的基因环化；②避免目的基因与载体反向连接。 (4)巧用“同尾酶”，同尾酶指识别序列不同，但能产生相同黏性末端的限制酶。 4.用DNA重组技术可以赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人类需要的生物产品。在此过程中需要使用多种工具酶，其中4种限制性内切核酸酶的切割位点如图所示。回答下列问题： (1)DNA连接酶催化目的基因片段与质粒载体片段之间形成的化学键是___________。  解析：(1)DNA连接酶可以催化目的基因片段与质粒载体片段之间形成磷酸二酯键。 磷酸二酯键 (2)DNA重组技术中所用的质粒载体具有一些特征，如质粒DNA分子上有复制原点，可以保证质粒在受体细胞中能_________；质粒DNA分子上有_________________________，便于外源DNA插入；质粒DNA分子上有标记基因(如某种抗生素抗性基因)，利用抗生素可筛选出含质粒载体的宿主细胞，方法是 _______________________________________________________ ___________________。  解析：(2)质粒上含有复制原点，能保证质粒在受体细胞中自我复制；质粒DNA分子上有一个至多个限制性内切核酸酶的酶切位点，便于目的基因的插入；利用质粒上的标记基因(如某种抗生素抗性基因)可筛选出含质粒载体的宿主细胞，具体做法是用含有该抗生素的培养基培养宿主细胞，能够存活的即为含有质粒载体的宿主细胞。 自我复制 一个至多个限制酶切割位点 用含有该抗生素的培养基培养宿主细胞，能够存活的即为含有质粒载体的宿主细胞 (3)表达载体含有启动子，启动子是指__________________________ ___________________________________________________ 。  解析：(3)启动子是一段有特殊序列结构的DNA片段，位于基因的上游，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得需要的蛋白质。 位于基因上游的一段特殊DNA序列，是RNA聚合酶识别及结合的部位，能驱动转录过程 [系统知能] 一、基因工程的基本操作程序 1.目的基因的获取 (1)利用PCR获取和扩增目的基因。 (2)人工合成目的基因 ①逆转录法：主要用于相对分子质量较大而又不知其核苷酸序列的基因。以目的基因的mRNA为模板，借助逆转录酶合成双链DNA，其过程如下： 核心点(二)　基因工程的基本操作程序和PCR技术 ②化学合成法：依据某一蛋白质的氨基酸序列，推测出其基因序列，然后直接合成目的基因，其过程如下： (3)从基因文库中获取目的基因 根据目的基因的有关信息，例如，根据基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色体上的位置、基因的转录产物mRNA，以及基因的表达产物蛋白质等特性来获取目的基因。 2.基因表达载体的构建 3.将目的基因导入受体细胞——农杆菌转化法 (1)农杆菌特点 ①能在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有侵染能力。 ②农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T-DNA转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。 (2)基因表达载体导入农杆菌时，对农杆菌的处理 基因表达载体(重组质粒)导入农杆菌细胞时，要用Ca2+处理农杆菌细胞，使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，有利于重组质粒的导入。 (3)农杆菌转化法中的两次拼接和两次导入 拼接 第一次拼接：是将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上；第二次拼接：非人工操作，是指插入目的基因的T-DNA拼接到受体细胞的染色体DNA上 导入 第一次导入：是将含目的基因的Ti质粒导入农杆菌；第二次导入：非人工操作，是指含目的基因的T-DNA导入受体细胞 (4)目的基因的表达离不开植物组织培养技术 将导入目的基因的受体细胞培育成完整的植株要用到植物组织培养技术。 4.目的基因的检测与鉴定 (1)载体上标记基因的标记原理 载体上的标记基因一般是一些抗生素的抗性基因。原理如图所示： (2)目的基因的检测 ①使用PCR等技术，检测目的基因是否插入受体细胞的染色体DNA上及目的基因是否转录出特定mRNA。 ②采用抗原—抗体杂交技术，从转基因生物中提取蛋白质(作抗原)，与相应抗体杂交，依据是否出现杂交带确认目的基因是否“指导”特定蛋白质的合成。 ③采用抗虫、抗病毒等接种实验，进行目的基因是否成功表达的“个体生物学”水平的检测。 5.利用不同方式生产药物的区别 生产方式 乳腺生物反应器 工程菌 含义 指让外源基因在哺乳动物的乳腺中特异性表达，利用动物的乳腺组织生产药物蛋白 指用基因工程的方法，使外源基因得到高效表达的菌类细胞株系 受体与人类基因结构的差异 哺乳动物与人类的基因结构基本相同 细菌和酵母菌与人类的基因结构有较大差异 基因表达 合成的药物蛋白与天然蛋白质相同 细菌合成的药物蛋白可能没有活性 受体细胞 动物受精卵 微生物细胞 目的基因导入方式 显微注射法 Ca2+处理法 生产条件 不需严格灭菌；温度等外界条件对其影响不大 需严格灭菌，严格控制工程菌所需的温度、pH、营养物质浓度等外界条件 药物提取 从动物乳汁中提取 从微生物细胞或其培养液中提取 续表 二、PCR技术的操作原理和过程 1.PCR技术和DNA复制的比较 2.PCR技术中的三个注意点 (1)在PCR过程中实际加入的为dNTP(即dATP、dGTP、dTTP、dCTP)，既可作为合成DNA子链的原料，又可为DNA的合成提供能量。 (2)引物既可以是DNA单链，也可以为RNA单链。细胞内的DNA进行复制时，也需要引物，一般为RNA片段。 (3)真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需Mg2+激活。因此，PCR反应缓冲液中一般要添加Mg2+。 3.PCR扩增过程中的循环图示与规律 循环次数 1 2 3 n DNA数 2 4 8 2n 含引物A(或B) 的DNA数 1 3 7 2n-1 同时含引物A、 B的DNA数 0=21-2 2=22-2 6=23-2 2n-2 共消耗的 引物数量 2=21+1-2 6=22+1-2 14=23+1-2 2n+1-2 [题点全练]　　　　　　　　　 题点1　基因工程的操作程序及应用 1.如图表示培育转基因抗冻番茄的流程图，AmpR表示氨苄青霉素抗性基因，TetR表示四环素抗性基因。图示各种限制酶的识别序列均不相同。下列说法错误的是(　 ) A.①过程中应选择限制酶SmaⅠ和PstⅠ对Ti质粒进行切割 B.②过程需用Ca2+处理农杆菌使其处于能吸收DNA分子的状态 C.③过程中农杆菌侵染根细胞后将Ti质粒整合到染色体上 D.④过程的不同阶段应适当调整培养基中植物激素的比例 √ 解析：目的基因两侧是限制酶PstⅠ和SmaⅠ的识别序列，且质粒上也含有这两种限制酶的切割位点，所以可同时选用限制酶PstⅠ、SmaⅠ对Ti质粒进行切割，A正确；②过程需用Ca2+处理农杆菌使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，B正确；图中过程③侵染植物细胞后，重组Ti质粒上的T-DNA整合到染色体DNA上，而不是重组Ti质粒整合到染色体上，C错误；④过程不同阶段的培养基中细胞分裂素和生长素的比例不同，应在不同阶段适当调整培养基中植物激素的比例，D正确。 [微点拨] (1)基因工程中的基因表达载体≠载体：基因表达载体与载体相比增加了目的基因。 (2)切割目的基因和载体并非只能用同一种限制酶，如果两种不同限制酶切割后形成的黏性末端相同，在DNA连接酶的作用下目的基因与载体也可以连接起来。 2.(2023·湖北高考)用氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、四环素抗性基因(TetR)作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体(重组质粒)，并转化到受体菌中。下列叙述错误的是 (　 ) A.若用Hind Ⅲ酶切，目的基因转录的产物可能不同 B.若用Pvu Ⅰ酶切，在含Tet(四环素)培养基中的菌落，不一定含有目的基因 C.若用Sph Ⅰ酶切，可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否 D.若用Sph Ⅰ酶切，携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)和Tet的培养基中能形成菌落 √ 解析：若用Hind Ⅲ酶切质粒和含有目的基因的DNA片段，用DNA连接酶将两者连接成重组质粒，目的基因和质粒有正向连接和反向连接两种连接形式，因此，目的基因转录的产物可能不同，A正确；若用PvuⅠ酶切，会破坏氨苄青霉素抗性基因，在含Tet(四环素)培养基中的菌落可能是含有目的基因的重组质粒，也可能是质粒自身连接的普通质粒，因此，在含Tet(四环素)培养基中的菌落，不一定含有目的基因，B正确；DNA凝胶电泳技术可分离大小不同的DNA分子，若用SphⅠ酶切，由于重组质粒和普通质粒的碱基对数不同，因此可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否，C正确；若用SphⅠ酶切，会破坏四环素抗性基因，氨苄青霉素抗性基因不受影响，因此携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)的培养基中能形成菌落，不能在含Tet(四环素)的培养基中形成菌落，D错误。 题点2　PCR技术 3.下图表示PCR过程中某个阶段反应体系的情况，①②③④表示相关物质，L、R表示方向。下列叙述正确的是(　 ) A.②链从L到R的方向为3'→5'，①②链均可作为子链合成的模板 B.PCR过程需要通过解旋酶断开氢键，且为边解旋边复制 C.以1个DNA为模板经3次循环需消耗8个引物③ D.物质③的5'端添加了某序列，至少需经2次循环才可获得该序列的双链产物 √ 解析：根据DNA分子中两条链的反向平行关系可判断，②链从L到R的方向为5'→3'，图中①②链均可作为子链合成的模板，A错误；PCR过程需要通过高温处理使双链中氢键断裂成为单链，而后通过降温使子链和引物之间形成双链结构，而后调节温度使子链沿着引物的3'端延伸，B错误；以1个DNA为模板经3次循环产生的DNA分子数为23=8(个)，则需消耗引物③的数目为(8×2-2)÷2=7(个)，C错误；物质③的5'端添加了某序列，至少需经2次循环才可获得以该序列为模板合成的双链DNA产物，D正确。 [微点拨] PCR过程的两点提醒 (1)复性不一定均为引物与DNA模板结合。复性时，引物与DNA模板的结合是随机的，也存在DNA解开的两条链的结合。 (2)PCR反应的产物并不都是所需的DNA片段。因为第一次循环得到的DNA片段只有一种引物，比所需的DNA片段要长，从第三次循环才出现所需的DNA片段，这样的片段存在两种引物。 4.利用PCR技术扩增目的基因，其原理与细胞内DNA复制类似，过程如图所示。图中引物为单链DNA片段，它是子链合成延伸的基础。下列叙述错误的是 (　 ) A.引物A、B的碱基不能进行互补配对 B.复性的目的是让引物与单链DNA相结合 C.延伸时，DNA聚合酶从引物的3'端连接脱氧核苷酸 D.第二轮循环后，同时含有引物A和引物B的DNA占100% √ 解析：如果引物A和引物B发生碱基互补配对，则其不能与相应模板链结合，无法完成子链的延伸，故引物A、B的碱基不能进行互补配对，A正确；复性的目的是让引物通过碱基互补配对与单链DNA结合，B正确；延伸时，在DNA聚合酶的作用下，将脱氧核苷酸连接到引物的3'端，C正确；DNA复制为半保留复制，第二轮循环(即DNA复制2次)后，共形成22=4(个)DNA分子，其中含有最初模板链的2个DNA分子含有引物A或引物B，其余2个DNA分子同时含有引物A和引物B，所以第二轮循环产物中同时含有引物A和引物B的DNA占50%，D错误。 [微点拨] PCR中设计引物的一般原则 (1)引物长度一般以20~30个核苷酸为宜，过短会降低其特异性，过长会导致复性时结合的模板数减少，降低反应效率。 (2)要避免两个引物间碱基序列互补以及同一引物自身碱基序列互补。 (3)引物5'末端的碱基可添加与模板无关的序列(如限制酶的识别序列、启动子序列等)，便于克隆和表达。 (4)引物的碱基顺序不能与非扩增区有同源性，以免造成不必要的非特异性扩增。 构建基因表达载体时，需要选择合适的限制酶切割含有目的基因的DNA片段和载体。已知限制酶Ⅰ的识别序列和切割位点是 ，限制酶Ⅱ的识别序列和切割位点是 ，根据图示回答下列问题： 主攻学困点——强化规范表达 1.请用图示法写出限制酶Ⅰ和限制酶Ⅱ切割后形成黏性末端的过程。 提示： 酶Ⅰ： 酶Ⅱ： 2.切割图示中的目的基因和质粒应选用哪类限制酶?请说明理由。 提示：用限制酶Ⅱ切割目的基因，用限制酶Ⅰ切割质粒。原因：限制酶Ⅰ的识别序列包含在限制酶Ⅱ的识别序列内，因此限制酶Ⅱ也可切割限制酶Ⅰ的位点，故使用限制酶Ⅱ时，可在目的基因两端同时切割，从而切出“目的基因”，但若使用限制酶Ⅱ切割质粒，会同时破坏质粒中的两个“标记基因”，故只能使用限制酶Ⅰ切割质粒。 3.利用PCR技术扩增目的基因时需要两种引物，原因是什么? 提示：DNA是两条反向平行的双链结构，DNA聚合酶只能从3'端延伸子链，用两种引物才能确保DNA两条链同时被扩增。 4.在PCR扩增目的基因之前，需先设计引物，对设计的两种引物之间的碱基序列的要求是什么? 提示：两种引物之间不能互补配对。 5.为检测胚乳细胞中Wx基因是否表达，科研人员提取胚乳中的总RNA，经逆转录过程获得总cDNA，通过PCR技术可在总cDNA中专一性地扩增出Wx基因的cDNA，原因是什么? 提示：引物是依据Wx基因的一段已知序列设计合成的(或引物能与Wx基因的cDNA特异性结合)。 课时跟踪检测 (单击进入电子文档) $$