第9单元 第6讲 基因工程的原理和技术（Word教参）-【优化指导】2026年高考生物学一轮复习高中总复习·第1轮（浙科版 浙江专版）

第六讲　基因工程的原理和技术 课标要求 1.概述基因工程是在遗传学、微生物学、生物化学和分子生物学等学科基础上发展而来的。 2．阐明DNA重组技术的实现需要利用限制性内切核酸酶、DNA连接酶和载体三种基本工具。 3．阐明基因工程的基本操作程序主要包括获取目的基因、构建重组DNA分子、将目的基因导入受体细胞和检测目的基因及其表达产物等步骤。 4．概述人们根据基因工程原理，进行蛋白质设计和改造，可以获得性状和功能更符合人类需求的蛋白质。 5．举例说明依据人类需要对原有蛋白质结构进行基因改造、生产目标蛋白的过程。 6．活动：DNA的粗提取和鉴定。 7．PCR扩增DNA片段及凝胶电泳鉴定。 考点一　基因工程的工具 [对应学生用书P265] 1．基因工程的建立 2．限制酶、DNA连接酶与载体 3．与DNA有关的四种酶 项目 限制酶 DNA连接酶 DNA聚合酶 解旋酶 作用 底物 切断双链DNA分子 催化2个DNA分子片段连接 催化单个脱氧核糖核苷酸连接 催化DNA分子形成单链 作用 部位 磷酸二酯键 磷酸二酯键 磷酸二酯键 碱基对间的氢键 模板 不需要 不需要 需要 不需要 作用 结果 形成黏性末端或平末端 形成重组DNA分子 形成新的DNA分子 形成单链DNA分子 4.活动：DNA的粗提取和鉴定 (1)实验原理 (2)方法步骤 (3)DNA与蛋白质在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同 项目 溶解规律 2 mol/L NaCl溶液 0.14 mol/L NaCl溶液 DNA 溶解 析出 蛋白质 NaCl溶液物质的量浓度从2 mol/L逐渐降低的过程中，蛋白质溶解度逐渐增大 部分发生盐析沉淀 溶解 1．易错辨析——规避高频误区(正确的画“√”，错误的画“×”) (1)基因工程所需要的工具酶有限制酶、DNA连接酶和载体。(　　×　　) (2)DNA连接酶和DNA聚合酶是一回事。(　　×　　) (3)DNA连接酶可以连接目的基因与载体的氢键，形成重组DNA。(　　×　　) (4)载体质粒通常采用抗生素合成基因作为筛选的标记基因。(　　×　　) 2．深度思考——挖掘新命题点 某同学拟用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA连接酶为工具，将目的基因(两端含相应限制酶的识别序列和切割位点)和质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。思考回答： (1)质粒和目的基因都用酶3切割，用E.coli DNA连接酶连接，能构建重组表达载体吗？为什么？ 不能。酶3切割后得到的是平末端，E.coli_DNA连接酶只能连接黏性末端。 (2)质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4 DNA连接酶连接，能构建重组表达载体吗？为什么？ 不能。质粒用酶3切割后得到平末端，目的基因用酶1切割后得到的是黏性末端，两者应有相同的黏性末端才能连接。 (3)质粒和目的基因分别用哪种酶切割，再用哪种连接酶连接，构建重组表达载体方案合理？ 质粒和目的基因都用酶1和酶2切割后得到黏性末端，用T4_DNA连接酶连接后，还能保证目的基因在质粒上的连接方向，此重组表达载体的构建方案最合理且高效。 [例1] 据图所示，下列有关酶功能的叙述，错误的是(　　　) A．限制性内切核酸酶可以切断a处 B．DNA聚合酶可以连接a处 C．解旋酶可以使b处解开 D．DNA连接酶可以连接c处 D　解析：限制性内切核酸酶切割DNA片段中两个核苷酸之间的磷酸二酯键，A正确；DNA聚合酶将单个的脱氧核苷酸连接至DNA链片段上，连接的是磷酸二酯键，B正确；解旋酶将DNA双链解开成单链，作用于氢键，C正确；DNA连接酶连接的是a处，不是c处，D错误。 [例2] 图甲、乙中的箭头表示三种限制性内切核酸酶的酶切位点，ampr表示氨苄青霉素抗性基因，neor表示新霉素抗性基因。若想将图乙所示目的基因导入图甲所示质粒中，下列叙述正确的是(　　　) 　 A．图甲中的质粒用BamH Ⅰ 切割后，含有4个游离的磷酸基团 B．在构建重组质粒时，可用Pst Ⅰ 和BamH Ⅰ 切割质粒和外源DNA C．用Pst Ⅰ 和Hind Ⅲ 酶切，加入DNA连接酶后可得到1种符合要求的重组质粒 D．导入目的基因的大肠杆菌可在含氨苄青霉素的培养基中生长 C　解析：环状质粒被限制酶切割后会出现2个游离的磷酸基团，A错误；如果用BamH Ⅰ 切割外源DNA，会破坏目的基因，B错误；用Pst Ⅰ 和Hind Ⅲ 切割外源DNA后，可得到两个能与质粒连接的DNA片段，但只有目的基因未被破坏的片段才符合要求，C正确；导入目的基因的大肠杆菌，其重组质粒中ampr已被破坏，故不可能在含氨苄青霉素的培养基中生长，D错误。 (1)限制酶的选择方法 　　 ①应选择切点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择Pst Ⅰ 。 ②不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择Sma Ⅰ 。 ③为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用Pst Ⅰ 和EcoR Ⅰ 两种限制酶，但要确保质粒(如图乙)上也有这两种酶的切点。 (2)标记基因的筛选原理 载体上的标记基因一般是某种抗生素的抗性基因，而受体细胞没有抵抗该抗生素的能力。将含有某抗生素抗性基因的载体导入受体细胞，抗性基因在受体细胞内表达，受体细胞对该抗生素产生抗性。在含有该抗生素的培养基上，能够生存的是被导入了载体的受体细胞(如下图所示)。 [例3] (2025·浙江嘉兴模拟)下列有关“DNA的粗提取和鉴定”实验的叙述，正确的是(　　　) A．向菜花组织中加入蒸馏水并搅拌可释放核DNA B．鉴定DNA时，可以使用龙胆紫染液对DNA进行染色 C．向DNA滤液中加入冷酒精缓慢搅拌，可见玻璃棒上有白色絮状物 D．实验结束后应保存好剩余的二苯胺试剂，以备下次实验时使用 C　解析：植物细胞具有细胞壁，向菜花组织中加入蒸馏水并不能使细胞吸水涨破，A错误；在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色，B错误；DNA不溶于95%的冷酒精，向DNA滤液中加入冷酒精缓慢搅拌，可见玻璃棒上有白色絮状物析出，C正确；二苯胺试剂需要现配现用，D错误。 考点二　基因工程的基本操作步骤 [对应学生用书P268] 1．基因的结构 2．基因工程的基本操作程序 (1)目的基因：用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因，主要是指编码蛋白质的基因。 (2)获取目的基因的方法 方法 从基因组文库中获取 从部分基因文库，如cDNA文库中获取 化学合成法 通过PCR技术体外扩增 过 程 (3)cDNA文库和基因组文库的主要区别 文库类型 cDNA文库 基因组文库 文库大小 小 大 基因中启动子和终止子 无 有 基因中内含子 无 有 基因多少 某种生物的部分基因 某种生物的全部基因 基因获得过程 mRNAcDNA→与载体组合→导入微生物细胞→克隆 基因组DNA适当大小的DNA片段→与载体组合→导入微生物细胞→克隆 (4)PCR技术 3．活动：PCR扩增DNA片段及凝胶电泳鉴定 (1)实验原理 ①PCR经过多次循环变性、退火、延伸三个步骤，可获得大量目的基因或DNA片段。 ②PCR技术扩增酵母细胞中编码核糖体RNA的DNA部分片段，长度为841 bp，通过琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。 ③使用亚甲基蓝对凝胶进行染色，再用75%酒精以及蒸馏水脱色，观察并分析琼脂糖凝胶中DNA条带。 (2)方法步骤 ①PCR扩增 ②琼脂糖凝胶电泳 提醒：①1个模板DNA分子经n轮扩增，共产生2n个DNA片段，共需引物2n＋1－2个。 ②经过第3轮扩增后，扩增出的含目的基因的DNA片段才不带黏性末端(占1/4)。 ③经过n轮扩增，扩增出的不带黏性末端的DNA片段所占比例为1－n·21－n。 1．易错辨析——规避高频误区(正确的画“√”，错误的画“×”) (1)用DNA酶分别切割目的基因的DNA和农杆菌的Ti质粒，然后用DNA连接酶连接，形成重组DNA。(　　×　　) (2)使用农杆菌侵染的方法进行植物转基因过程中，使用抗生素的目的：一是抑制农杆菌生长，二是筛选转化细胞。(　　√　　) (3)植物转基因受体全能性表达程度的高低主要与受体的基因型、培养环境、继代次数和培养时间长短等有关。(　　√　　) (4)为获得转基因植株，农杆菌侵染的宿主一般要选用具有优良性状、较高的遗传稳定性、全能性表达充分及易被农杆菌侵染等特点的植物材料。(　　√　　) (5)培育转基因植物时，可利用带有目的基因的农杆菌侵染植株，但不能将目的基因通过显微注射的方法导入植物细胞、组织或器官获得转基因植株。(　　×　　) 2．深度思考——挖掘新命题点 (1)不同组织细胞和同一组织细胞在不同的发育阶段，cDNA文库是会(填“会”或“不会”)有差异的，原因是基因的选择性表达。 (2)目前在PCR反应中使用Taq DNA聚合酶而不使用大肠杆菌DNA聚合酶的主要原因是PCR过程中需要加热至90～95_℃，所用的DNA聚合酶应能耐高温，而Taq_DNA聚合酶的热稳定性比较强，但大肠杆菌DNA聚合酶在高温下会变性失活。 [例1] 科研人员将目的基因J与质粒构建重组表达载体，该质粒的部分结构如图所示，下列叙述错误的是(　　　) A．除图中标出的结构外，质粒还需具备的结构有复制原点、标记基因、限制酶切位点等 B．与图中启动子结合的酶是RNA聚合酶 C．用PCR检测J基因连接到质粒中且方向正确可选用的一对引物是F1和R2 D．若J基因转录的链位于b链，可知引物F1与基因J的b链相应部分序列相同 D　解析：题图中有启动子和终止子等，因此质粒还需具备的结构有限制酶的切割位点、标记基因、复制原点等，A正确；启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA，B正确；引物F2与R1或F1与R2结合部位包含J基因的碱基序列，因此推测为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，进行PCR检测时，若仅用一对引物，应选择题图中的引物F2和R1或F1和R2，C正确；b是模板链，而根据题图上启动子和终止子的位置可知转录方向是题图上从左向右，对应的模板链方向应该是3→5，非模板链(也就是a链)是5→3；考虑到DNA复制的方向是子链的5→3，引物基础上延伸的方向肯定是5→3，所以引物结合的单链其方向是3→5；题图中F1是前引物，在左侧，所以其配对的单链是3→5的b链，故其序列应该与a链相应部分的序列相同，D错误。 [例2] (2024·浙江Z20名校联盟联考)由于某目的基因酶切后的末端为平末端，载体E只有产生黏性末端的酶切位点，需借助中间载体P将目的基因接入载体E。据图分析，下列叙述正确的是(　　　) A．通过PCR扩增获取目的基因是基因工程的核心工作 B．为了便于该目的基因接入载体E，可用限制酶Xho Ⅰ 和Sma Ⅰ 切割载体P C．载体P只能作为中间载体，是因为其没有表达该目的基因的启动子与终止子 D．若受体细胞表现出抗性基因的相应性状，表明重组载体成功导入受体细胞 C　解析：基因工程的核心步骤是构建基因表达载体，不是通过PCR扩增获取目的基因，A错误；由于载体E只有产生黏性末端的酶切位点，要使中间载体P接入载体E，同时防止载体E自身环化，需要用两种限制酶分别切割载体E和中间载体P，据题图可知，中间载体P和载体E均含有Xho Ⅰ 和Pst Ⅰ 酶识别序列，故可选用Xho Ⅰ 和Pst Ⅰ 酶进行酶切，载体P的这两种酶识别序列中含有EcoR Ⅴ 识别位点，并且其切割的为平末端，可以用于连接目的基因，Sma Ⅰ 酶虽然也能切割得到平末端，但是其识别位点没有位于Xho Ⅰ 和Pst Ⅰ 酶识别位点之间，故不能选择其对中间载体P进行切割，B错误；由题图可知，载体P是中间质粒，不含有表达该目的基因的启动子与终止子，C正确；受体细胞表现出抗性基因的相应性状，可能是导入了重组质粒，也可能只导入了空质粒(不含目的基因的质粒)，D错误。 [例3] (2025·浙江诸暨中学模拟)抗原检测阴性但临床仍然高度怀疑甲型流感病毒感染的患者，医生会建议做核酸检测。但等待核酸检测出报告需较长时间，该检测实际采用的技术是逆转录PCR，病毒刺突蛋白编码序列如下图所示，科研人员为该PCR分别设计了引物A(5-CCC…TGTATGGGGTTCTAA-3)和引物B(5-ACG…ACT①TTA②CTGGTGCAG-3)，已知引物A中ATG对应起始密码子，引物B中TTA对应终止密码子，标记基因可以插入刺突蛋白编码序列的首端或末端。DNA编码链为转录时所用模板链的互补链。下列叙述正确的是(　　　) A．获取甲流病毒的遗传物质后直接进行PCR扩增以节省出报告时间 B．扩增后的基因产物中引物A所在的子链是该基因的编码链 C．若标记基因需要插入引物B的①或②位置中则应选择①位置 D．PCR扩增产物经电泳后在琼脂糖凝胶中将出现宽度不同的5个条带 B　解析：获取甲流病毒的遗传物质后先逆转录为DNA后再进行扩增，A错误；已知引物A中ATG对应起始密码子，引物A的序列是5－CCC…TGTATGGGGTTCTAA－3，因此扩增后的基因产物中引物A所在的子链是该基因的编码链，B正确；引物B中TTA对应终止密码子，所以标记基因需要插入引物B的②位置，C错误；PCR扩增产物经电泳后在琼脂糖凝胶中将出现宽度不同的3个条带，D错误。 [对应学生用书P270] (2024·浙江6月卷)阅读下列材料，完成下面1、2小题。 疟疾是一种严重危害人类健康的红细胞寄生虫病，可用氯喹治疗。疟原虫pfcrt基因编码的蛋白，在第76位发生了赖氨酸到苏氨酸的改变，从而获得了对氯喹的抗性。对患者进行抗性筛查，区分氯喹敏感患者和氯喹抗性患者，以利于分类治疗。 研究人员根据pfcrt基因的序列，设计了F1、F2、R1和R2 4种备选引物，用于扩增目的片段，如图甲所示。为选出正确和有效的引物，以疟原虫基因组DNA为模板进行PCR，产物的电泳结果如图乙所示。 1．(2024·浙江6月卷)下列关于引物F1、F2、R1和R2的叙述，错误的是(　　　) A．F1-R1引物可用于特异性地扩增目的片段 B．F1-R2引物不能用于特异性地扩增目的片段 C．F2为无效引物，没有扩增功能，无法使用 D．R2引物可用于特异性地扩增目的片段 D　解析：根据图乙结果显示可知，F1－R1引物只扩增出一条条带，说明能够用于特异性扩增目的片段，A正确；根据图乙信息可知，F1－R2引物扩增条带为三条，说明其不能用于特异性扩增目的片段，B正确；根据图乙信息可知，F1－R1能扩增出一条条带，F2－R1无法扩增出条带，所以F2为无效引物，没有扩增功能，无法使用，C正确；根据图乙显示可知，F1－R1引物只扩增出一条条带，F1－R2引物扩增条带为三条，说明R2引物无法特异性地扩增目的片段，D错误。 2．(2024·浙江6月卷)为了筛查疟原虫感染者，以及区分对氯喹的敏感性。现有6份血样，处理后进行PCR。产物用限制酶Apo Ⅰ 消化，酶解产物的电泳结果如图所示。 1～6号血样中，来自氯喹抗性患者的是(　　　) A．1号和6号 B．2号和4号 C．3号和5号 D．1号、2号、4号和6号 B　解析：根据题干信息可知，疟原虫pfcrt基因编码的蛋白，在第76位发生了赖氨酸到苏氨酸的改变，从而获得了对氯喹的抗性。根据酶切位点可知，具有氯喹抗性的基因组没有Apo Ⅰ 酶切位点，而氯喹敏感型的基因组中具有该酶切位点，因此对6份血样处理后进行PCR，产物用限制酶Apo Ⅰ 消化，酶解产物的电泳出现两条带的为氯喹敏感型，只有一条带的为氯喹抗性，所以1～6号血样中，来自氯喹抗性患者的是2号和4号，B正确。 3．(2023·浙江6月卷)某研究小组利用转基因技术，将绿色荧光蛋白基因(GFP)整合到野生型小鼠Gata3基因一端，如图甲所示。实验得到能正常表达两种蛋白质的杂合子雌雄小鼠各1只，交配以期获得Gata3－GFP基因纯合子小鼠。为了鉴定交配获得的4只新生小鼠的基因型，设计了引物1和引物2用于PCR扩增，PCR产物电泳结果如图乙所示。 下列叙述正确的是(　　　) A.Gata3基因的启动子无法控制GFP基因表达 B．翻译时先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白 C.2号条带的小鼠是野生型，4号条带的小鼠是Gata3－GFP基因纯合子 D．若用引物1和引物3进行PCR，能更好地区分杂合子和纯合子 B　解析：由题图甲可知，Gata3基因与GFP基因共用一个启动子，且由题干可知两基因能正常表达出相关蛋白质，A错误；由于启动子在左侧，基因在右侧，转录基因时，先转录Gata3基因，再转录GFP基因，由于转录和翻译的方向均是沿mRNA的5→3，因此翻译时先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白，B正确；由题图乙可知，大片段包含GFP基因编码区片段，小片段不包含GFP基因编码区片段，则2号小鼠是Gata3－GFP基因纯合子，4号小鼠是野生型，C错误；若用引物1和引物3进行PCR，杂合子和Gata3－GFP基因纯合子均能扩出条带，仅有Gata3基因时无法扩出条带，不利于区分杂合子和纯合子，D错误。 4．(2023·浙江6月卷)赖氨酸是人体不能合成的必需氨基酸，而人类主要食物中的赖氨酸含量很低，利用生物技术可提高食物中赖氨酸含量。回答下列问题： (1)植物细胞合成的赖氨酸达到一定浓度时，能抑制合成过程中两种关键酶的活性，导致赖氨酸含量维持在一定浓度水平，这种调节方式属于____________。根据这种调节方式，在培养基中添加__________________，用于筛选经人工诱变的植物悬浮细胞，可得到抗赖氨酸类似物的细胞突变体，通过培养获得再生植株。 (2)随着转基因技术与动物细胞工程结合和发展，2011年我国首次利用转基因和体细胞核移植技术成功培育了高产赖氨酸转基因克隆奶牛。其基本流程为： ①构建乳腺专一表达载体。随着测序技术的发展，为获取富含赖氨酸的酪蛋白基因(目的基因)，可通过检索______________获取其编码序列，用化学合成法制备得到。再将获得的目的基因与含有乳腺特异性启动子的相应载体连接，构建出乳腺专一表达载体。 ②表达载体转入牛胚胎成纤维细胞(BEF)。将表达载体包裹到磷脂等构成的脂质体内，与BEF膜发生________，表达载体最终进入细胞核，发生转化。 ③核移植。将转基因的BEF作为核供体细胞，从牛卵巢获取卵母细胞，经体外培养及去核后作为______________。将两种细胞进行电融合，电融合的作用除了促进细胞融合，同时起到了________重组细胞发育的作用。 ④重组细胞的体外培养及胚胎移植。重组细胞体外培养至______________，植入代孕母牛子宫角，直至小牛出生。 ⑤检测。DNA水平检测：利用PCR技术，以非转基因牛耳组织细胞作为阴性对照，以____________为阳性对照，检测到转基因牛耳组织细胞中存在目的基因。RNA水平检测：从非转基因牛乳汁中的脱落细胞、转基因牛乳汁中的脱落细胞和转基因牛耳组织细胞，提取总RNA，对总RNA进行________处理，以去除DNA污染，再经逆转录形成cDNA，并以此为__________，利用特定引物扩增目的基因片段。结果显示目的基因在转基因牛乳汁中的脱落细胞内表达，而不在牛耳组织细胞内表达，原因是什么？________________________ ________________________________________________________________________________________________________________________________________________。 答案：(1)负反馈调节　过量赖氨酸类似物 (2)①基因数据库　②融合　③核受体细胞　激活　④早期囊胚　⑤含有目的基因的牛耳组织细胞　DNA酶　PCR的模板　构建的表达载体只含有乳腺特异性启动子，只能在乳腺细胞中启动转录，而在牛耳细胞中不能表达 解析：(1)负反馈调节是指在一个系统中，系统工作的效果，反过来又作为信息调节该系统的工作，并且使系统工作的效果减弱或受到限制，有助于系统保持稳定。植物细胞合成的赖氨酸达到一定浓度时，能抑制合成过程中两种关键酶的活性，导致赖氨酸含量维持在一定浓度水平，这种调节方式属于负反馈调节。如果想得到抗赖氨酸类似物的细胞突变体可在培养基中添加过量赖氨酸类似物。(2)①从基因数据库获取目的基因编码序列，用化学合成法制备可得到目的基因。②表达载体包裹到磷脂等构成的脂质体内，根据细胞膜成分，其与BEF膜发生融合。③去核的卵母细胞作为受体细胞，其处于减数第二次分裂中期，因为卵母细胞中含有促使细胞核表达全能性的物质和营养条件。电融合的作用除了促进细胞融合，同时起到了激活重组细胞发育的作用。④胚胎发育到适宜阶段可取出向受体移植。牛、羊一般要培养到桑葚胚或囊胚阶段；植入代孕母牛子宫角，直至小牛出生。⑤阳性对照：按照当前实验方案一定能得到正面预期结果的对照实验。阳性对照是已知的对测量结果有影响的因素，目的是确定实验程序无误。阴性对照和阳性对照相反，按照当前的实验方案一定不能得到正面预期结果的对照实验。排除未知变量对实验产生的不利影响，本实验以非转基因牛耳组织细胞作为阴性对照，为了检测到转基因牛耳组织细胞中存在目的基因，应该以含有目的基因的牛耳组织细胞为阳性对照。为了除去DNA污染，可以使用DNA酶使其水解。经逆转录形成cDNA，并以此为PCR的模板进行扩增。目的基因在转基因牛乳汁中的脱落细胞内表达，而不在牛耳组织细胞内表达，原因是构建的表达载体只含有乳腺特异性启动子，只能在乳腺细胞中启动转录，而在牛耳细胞中不能表达。 学科网（北京）股份有限公司 $$