2026届高考生物一轮复习讲义第59讲　基因工程的应用

第59讲　基因工程的应用 【课标要求】 1.举例说明基因工程在农牧、食品及医药等行业的广泛应用改善了人类的生活品质； 2.概述人们根据基因工程原理，进行蛋白质设计和改造，可以获得性状和功能更符合人类需求的蛋白质； 3.举例说明依据人类需要对原有蛋白质结构进行基因改造。 考点1　基因工程的应用 考 点 透 析 1. 基因工程在农牧业方面的应用 分类 导入目的基因 转基因生物实例 植物 转基因抗虫植物 外源 基因 抗虫棉花、玉米等 转基因抗病植物 某些病毒、真菌等的 基因 抗病毒甜椒、番木瓜等 转基因抗除草剂植物 降解或抵抗某种 的基因 抗除草剂玉米、大豆等 改良植物的品质 富含 的蛋白质的基因 富含赖氨酸的玉米 与植物 代谢相关的基因 颜色变异的矮牵牛 动物 提高动物的生长速率 外源 的基因 转生长激素基因的鲤鱼 改善畜产品的品质 的基因 转肠乳糖酶基因的奶牛  解 疑 释 惑 (1)转基因作物的优点 ①减少化学杀虫剂的施用量，减少环境污染； ②增加作物产量； ③增加经济效益。 (2)转基因哺乳动物的培育过程 2. 基因工程在医药卫生领域的应用 (1)微生物制药 (2)利用哺乳动物批量生产药物—— 　 (3)建立移植器官的工厂 ①技术方法：利用基因工程技术对猪的器官进行改造，采用的方法是在器官供体的基因组中导入 ，以抑制 的表达，或设法除去 ，然后再结合克隆技术，培育出不会引起 反应的转基因克隆猪器官。 ②对猪进行改造的两点理由：内脏构造、大小、血管分布与人的极为相似；与灵长类动物相比，猪体内隐藏的、可导致人类疾病的病毒少。 3. 基因工程在食品工业方面的应用 (1)技术方法：利用基因工程菌生产食品工业用酶、 和 等。例如将编码牛凝乳酶的基因导入大肠杆菌、黑曲霉或酵母菌的基因组中，再通过 生产凝乳酶。 (2)实例：淀粉酶、脂肪酶、天冬氨酸和苯丙氨酸的大规模生产。  概 念 辨 析 试管动物、克隆动物和转基因动物的比较 比较项目 试管动物 克隆动物 转基因动物 含义 用体外受精的方法获得的动物 用人工方法(核移植或胚胎分割)得到的无性繁殖系 染色体基因组中整合有外源基因并能表达和稳定遗传的一类动物 技术 基础 体外受精、早期胚胎培养、胚胎移植 核移植技术、早期胚胎培养(胚胎分割)、胚胎移植 重组DNA分子技术、早期胚胎培养、胚胎移植 实例 试管牛 “多莉”羊 转基因奶羊 过程 生殖方式 有性生殖 无性生殖 有性生殖或保持原生殖方式 遗传 物质 遗传物质来自两个供体 核基因来自供核个体，质基因来自提供卵母细胞的个体 遗传物质除了来自亲代外，还接受外源基因 意义 充分发挥雌性优良个体的繁殖潜力，缩短供体本身的繁殖周期 加速家畜遗传改良进程、挽救濒危物种等 改良动物品质、制备生物反应器等 相同点 三者均涉及早期胚胎培养、胚胎移植等技术，且移植所选胚胎一般是桑葚胚或囊胚期的胚胎(说明：若是鱼、蛙、鸟等非哺乳类动物则不需胚胎移植技术) 思辨小练 1. 判断下列说法的正误： (1)农业害虫不会对转基因抗虫作物产生抗性。( ) (2)乳腺生物反应器就是把药用蛋白基因导入动物的乳腺细胞中。( ) (3)干扰素是一种具有干扰病毒复制作用的糖蛋白，在临床上被广泛用于治疗病毒感染性疾病。( ) 2. 科学家培育出一种转基因小鼠，其膀胱上皮细胞可以合成人的生长激素并分泌到尿液中。在研制膀胱生物反应器时，应使药用蛋白基因在 细胞中特异性表达。它与乳腺生物反应器一样，具有 ，且有 的优点；且相比之下，还能不受 的限制。 典 题 说 法 考向1　基因工程的应用 例 (2024·江苏卷)为了高效纯化超氧化物歧化酶(SOD)，科研人员将ELP50片段插入pET－SOD构建重组质粒pET－SOD－ELP50，以融合表达SOD－ELP50蛋白，过程如图1。其中，ELP50是由人工合成的DNA片段，序列为：限制酶a识别序列－(GTTCCTGGTGTTGGC)50－限制酶b识别序列，50为重复次数。请回答下列问题： (1)步骤①双酶切时，需使用的限制酶a和限制酶b分别是 。 (2)步骤②转化时，科研人员常用 处理大肠杆菌，使细胞处于感受态；转化后的大肠杆菌采用含有 的培养基进行筛选。用PCR技术筛选成功导入pET－SOD－ELP50的大肠杆菌，应选用的一对引物是 。 (3)步骤③大肠杆菌中RNA聚合酶与 结合，驱动转录，翻译SOD－ELP50蛋白。已知蛋白质中氨基酸残基的平均相对分子质量约为0.11 kDa，将表达的蛋白先进行凝胶电泳，然后用SOD抗体进行杂交，显示的条带应是C(从图2的“A～D”中选填)。 (4)步骤④为探寻高效纯化SOD－ELP50蛋白的方法，科研人员研究了温度、NaCl对SOD－ELP50蛋白纯化效果的影响，部分结果如图3。 (ⅰ)20 ℃时，加入NaCl后实验结果是 。 (ⅱ)100 ℃时，导致各组中所有蛋白都沉淀的原因是 。 (ⅲ)据图分析，融合表达SOD－ELP50蛋白的优点有 。 变式1 (2024·南通二模)磷脂酸(PA)是调节植物生长发育和逆境响应的重要信使物质。为了解植物细胞中PA的动态变化，研究人员用无缝克隆技术将高度专一的PA结合蛋白(PABD)基因与绿色荧光蛋白(GFP)基因融合，构建有效监测细胞PA变化的荧光探针，并测定拟南芥细胞内PA含量。无缝克隆技术连接DNA片段的机理和构建荧光探针表达载体过程如图所示，请回答下列问题： 　(1)无缝克隆时，T5核酸外切酶沿 的方向水解DNA，其目的是形成 。T5核酸外切酶催化的最适温度为37 ℃，而过程①选择的温度为50 ℃，目的是降低酶活性， 。 (2)过程②两个片段退火后存在“缺口”的原因是 ，过程③所需的酶有 。 (3)与传统的酶切再连法相比，无缝克隆技术构建重组质粒的优点有 。 A．不受限制酶切位点的限制 B．不会引入多余碱基 C．操作时间短，成功率高 D．有利于多个小片段(＜50 bp)连接 (4)PCR扩增PABD基因时需依据 设计引物R1。据图分析扩增目的片段的引物F1和R2对应于下表中的 。 1 5′－TCCGGACTCAGATCTCGAGC－3′ 2 5′－AGCTATAGTTCTAGATCTAGATTAACTAGTCTTAGTGGCGTC－3′ 3 5′－TATCGATGGCGCCAGCTGAGGATGGTGAGCAAGGGCGA－3′ 4 5′－GCTCGAGATCTGAGTCCGGACTTGTACAGCTCGTCCA－3′ (5)利用农杆菌花序侵染法转化拟南芥，将获得的种子(T1)进行表面消毒，均匀铺在含有 的MS培养基上进行筛选和鉴定。T1代自交获得的T2代幼苗的抗性表现和比例为 ，说明T1为单位点插入的转基因株系。 (6)通过观测转基因拟南芥根尖细胞中 ，了解PA的动态变化。 变式2 (2025·南通期初)基因L能够通过脱落酸信号途径调控大豆的逆境响应。利用基因工程技术编辑基因L，可培育耐盐碱大豆品系。其基本过程是：在载体上的限制酶BsaⅠ切点处插入大豆基因L的向导DNA序列构建成重组载体，再将重组载体导入大豆细胞，其转录产物可引导编辑酶特异性结合基因L的目标序列进行定点编辑，载体信息如下图1。请回答下列问题： 　(1)基因L的向导DNA序列经 (限制酶)切割后，形成左、右两侧黏性末端序列分别为5′－ －3′、5′－ －3′的片段，与BsaⅠ酶切后的载体混合，经DNA连接酶作用形成重组载体。 (2)将重组载体导入通过 处理的农杆菌，利用农杆菌的侵染性将重组载体导入大豆细胞，培养基中添加 (抗生素)进行筛选。 (3)步骤(2)筛选得到4株植株，为了鉴定基因编辑是否成功，以上述植株的DNA为模板，通过PCR扩增基因L，完全酶切后电泳。基因L部分序列及酶切位点如图2所示，电泳结果如图3所示。 用PCR技术扩增基因L时，所用引物越短，特异性越 (填“高”或“低”)。据图判断选用的限制酶是 ，纯合突变植 (填序号)。除上述分子水平的检测外，可采用 (方案)进行个体生物学水平鉴定。 (4)实验中获得1株基因L成功突变的纯合植株，该植株具有抗生素抗性，检测发现其体细胞中只有1条染色体有T－DNA插入。用抗生素筛选这个植株的自交子代，其中突变位点纯合且对抗生素敏感的植株所占比例为 ，筛选出的敏感植株可用于后续的品种选育。  深 度 指 津 “无缝克隆”的机制复杂多样，不可格式化，要提高具体问题具体分析的能力、识图能力。注意分析不同的“无缝连接”的差异与优劣势。 新视野 1. 融合基因 (1)基因工程中构建融合基因，可以实现两个或更多不同来源的DNA分子组合，置于同一套调控序列控制之下进行表达。表达产物为融合蛋白。 (2)可分为四大类：①由报告基因和功能基因构成的融合基因。常用的报告基因有GFP(绿色荧光蛋白)基因、GUS基因、LacZ基因等，主要目的是对功能基因进行示踪；②由信号肽或单体蛋白的序列与功能基因构成的融合基因，其主要目的是利用信号肽或单体序列携带目的基因高效表达，从而提取纯化目的蛋白；③功能基因与功能基因的融合，包括相同功能基因的融合(目的是增强基因的功能)和不同功能基因的融合；④报告基因与抗药性基因的融合，用于构建融合载体，以利于插入大片段的cDNA或作为双功能标记。 2. 无缝克隆 (1)原理：使载体末端和引物末端具有15～20个同源碱基，由此得到的PCR产物两端便分别带上了15～20个与载体序列同源性的碱基。通过相关酶试剂处理，同时除去载体与目的DNA上同源片段的双链中的一条链，这样载体和目的DNA两端就露出了能够互补配对的序列，依靠同源序列碱基间的配对能使载体和目的DNA较为紧密地连在一起。 (2)优点：无缝克隆不需要任何限制性内切酶和连接酶，突破传统的双酶切后再连接，只需要一步重组法，即可得到高效率克隆的重组载体。 考点2　蛋白质工程的原理和应用 考 点 透 析 知识1　蛋白质工程的原理 1. 对蛋白质工程的理解 基础 蛋白质分子的 及其与 的关系 手段 通过 或 基因，来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质 目的 获得满足人类的生产和生活需求的 2. 蛋白质工程崛起的缘由 (1)基因工程在原则上只能生产 。 (2)天然蛋白质的结构和功能符合特定物种生存的需要，却 。 3. 蛋白质工程的基本思路 A． ，B． ，C． 。 知识2　蛋白质工程的应用 1. 在医药工业方面的应用，如研发速效 ，提高 的保存期，改造抗体等。 2. 在酶方面的应用：改进酶的 或开 ，如提高酶的催化活性、提高酶的稳定性等。 3. 在农业方面：除了改造某些重要的酶，如参与调控光合作用的酶，还用于设计优良微生物农药等。  概 念 辨 析 蛋白质工程和基因工程的比较 项目 蛋白质工程 基因工程 原理 中心法则的逆推 基因重组 过程 预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列(基因) 获取目的基因→构建基因表达载体→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定 实质 定向改造或生产人类所需蛋白质 定向改造生物的遗传特性，以获得人类所需的生物类型或生物产品(基因的异体表达) 结果 生产自然界没有的蛋白质 生产自然界已有的蛋白质 联系 蛋白质工程是在基因工程基础上延伸出的第二代基因工程，因为是对现有蛋白质的改造或制造新的蛋白质，所以必须通过基因修饰或基因合成实现 思辨小练 1. 判断下列说法的正误： (1)蛋白质工程是在分子水平上对蛋白质分子直接进行操作，定向改变分子的结构。( ) (2)蛋白质工程遵循中心法则，而基因工程不遵循。( ) (3)根据某多肽链的一段氨基酸序列，可以很容易地确定控制该肽链合成的基因的脱氧核苷酸序列。( ) (4)蛋白质工程是一项难度很大的工程，主要是因为人们对蛋白质复杂的高级结构没有完全认识。( ) 2. 为什么蛋白质工程不是直接改造蛋白质，而是通过基因改造或基因合成来完成的？ 典 题 说 法 考向　蛋白质工程 例 胰岛素是治疗糖尿病的特效药，但天然胰岛素在人体内的寿命只有几个小时。重症患者每天需要注射多次药物，增加了痛苦。通过蛋白质工程改变蛋白质的空间结构，以延长蛋白质的半衰期，可得到长效胰岛素，还可以增强其稳定性。如图是通过蛋白质工程获得长效胰岛素的过程。请分析回答： 　 　(1)构建新的蛋白质模型是蛋白质工程的关键，图中构建新蛋白质模型的主要依据是 。 (2)通过人工合成DNA形成的新基因应与 结合后，转移到 中，才能准确表达。 (3)若要利用大肠杆菌生产上述长效胰岛素，需要用到的生物工程有 和发酵工程。 (4)图解中从新的胰岛素模型到新的胰岛素基因的基本思路是 。 变式 腈水合酶(N0)广泛应用于环境保护和医药原料生产等领域，但不耐高温。利用蛋白质工程技术在N0的α和β亚基之间加入一段连接肽，可获得热稳定的融合型腈水合酶(N1)。下列有关叙述错误的是( ) A．N1与N0氨基酸序列的差异是影响其热稳定性的原因之一 B．加入连接肽需要通过改造基因实现 C．获得N1的过程需要进行转录和翻译 D．检测N1的活性时先将N1与底物充分混合，再置于高温环境 配套精练 第59讲　基因工程的应用 一、 单项选择题 1. 下列关于基因工程应用的叙述，错误的是( ) A．基因工程育种能够定向改造生物性状 B．可以利用基因工程技术生产细胞因子、抗体、疫苗和激素等药物 C．常将药用蛋白基因和乳腺中特有基因的启动子等重组在一起，组成乳腺生物反应器 D．以大肠杆菌为受体细胞生产的胰岛素，其结构可能与人体自身的胰岛素不完全相同 2. (2024·江苏卷)酵母菌是基因工程中常用的表达系统。下列相关叙述正确的是( ) A. 酵母菌培养液使用前要灭活所有细菌，但不能灭活真菌 B．酵母菌是真核细胞，需放置在CO2培养箱中进行培养 C．可用稀释涂布平板法对酵母菌计数 D．该表达系统不能对合成的蛋白质进行加工和修饰 3. (2024·南京调研)研究人员制备一种膀胱生物反应器，用其制备获得人体特殊功能蛋白A的基本过程如下图所示。下列叙述正确的是( ) A．步骤①和②所代表的操作分别是显微注射、体外受精 B．诱导雌性动物超数排卵所饲喂的激素能作用于特定细胞 C．从卵巢采集的卵子通常需要培养成熟后与获能的精子进行体外受精 D．早期胚胎培养过程中通常在培养液中通入5%的CO2刺激细胞呼吸 4. 下图为蛋白质工程操作的基本思路，下列叙述不正确的是( ) A．代表蛋白质工程操作思路的过程是④⑤ B．代表中心法则内容的是①② C．①代表转录，②代表翻译，④代表分子设计，⑤代表DNA合成 D．蛋白质工程的目的是对基因的结构进行分子设计，通过基因合成或改造实现 5. (2024·江西卷)γ－氨基丁酸在医药等领域有重要的应用价值。利用L － 谷氨酸脱羧酶(GadB)催化L－谷氨酸脱羧是高效生产γ－氨基丁酸的重要途径之一。研究人员采用如图方法将酿酒酵母S的L－谷氨酸脱羧酶基因(gadB)导入生产菌株E.coliA，构建了以L－谷氨酸钠为底物高效生产γ－氨基丁酸的菌株E.coliB。下列叙述正确的是( ) A．上图表明，可以从酿酒酵母S中分离得到目的基因gadB B．E.coli B发酵生产γ－氨基丁酸时，L－谷氨酸钠的作用是供能 C．E.coli A和E.coli B都能高效降解γ－氨基丁酸 D．可以用其他酶替代NcoⅠ和KpnⅠ构建重组质粒 二、 多项选择题 6. 基因工程自20世纪70年代兴起后，在农牧业、医药卫生和食品工业等方面得到了飞速的发展。下列关于基因工程应用的叙述，正确的是( ) A．为增加器官的来源，可对猪的器官进行改造以促进抗原决定基因的表达 B．将肠乳糖酶基因导入奶牛基因组，可降低乳汁中乳糖含量 C．作为乳腺生物反应器的动物体内只有乳腺细胞含目的基因 D．将牛凝乳酶基因导入黑曲霉中，再通过工业发酵可生产凝乳酶 7. (2024·如皋期初)某生物制品公司将人的干扰素基因导入酵母菌生产人的干扰素，过程如下图所示。相关叙述正确的是( ) 　 A．过程①可以提取mRNA通过RT－PCR技术获得，需用到逆转录酶和Taq酶 B．过程②能实现的分子基础是细菌质粒和干扰素基因均为双螺旋结构 C．带干扰素基因的质粒上必须有起始密码子，才能驱动干扰素基因的表达 D．使用酵母菌作为受体细胞与使用大肠杆菌相比，优点是可以对干扰素进行加工 三、 非选择题 8. (2025·海门一诊)血凝素基因(HA)编码的血凝素是构成流感病毒囊膜纤突的主要成分。成熟的血凝素包含HA1和HA2两个亚单位，其中HA1含有病毒与受体相互作用的位点。IgGFc基因片段(长度为717 bp)编码人IgG抗体中的一段小肽，常作为融合蛋白标签。蛋白质分泌依赖于信号肽的引导，本研究中用信号肽IL－2SS代替HA自身信号肽，科研人员尝试构建IL－2SS/HA1/IgGFc融合蛋白表达载体，导入大肠杆菌表达并分泌，请回答下列问题： (1)信号肽编码序列的基本单位是 ，HA信号肽的合成场所是 。 (2)本实验用信号肽IL－2SS代替HA自身信号肽有利于 ，PCR扩增目的基因时应该选择图中引物 。引物不能包含基因HA1的终止密码子的编码序列，原因是 。 (3)应选择限制酶 来切割质粒A，然后直接将PCR产物与质粒A混合，同时最好加入 (填“E.coli DNA连接酶”或“T4 DNA连接酶”)，使得目的基因与质粒A相连。 (4)若目的基因与质粒A正向连接，HA1基因转录时的模板链是图中的引物 在PCR时延伸而成；若目的基因与质粒A反向连接，用BamH Ⅰ和SacⅠ同时切割重组质粒，完全酶切后的产物进行凝胶电泳，其中最靠近加样孔的条带长度约 (2分)bp。 (5)融合蛋白中的标签蛋白有利于目的蛋白的分离和纯化，基因工程生产HA1作为疫苗时，选择人IgGFc作为标签的优点还有 。 9. (2025·南京期初)东方果蝇繁殖力强，雌蝇产卵于果皮下，幼虫孵化后钻入果肉中蛀食，造成水果腐烂，失去商品价值。研究发现，东方果蝇中dsx基因转录出的前体RNA在加工过程中具有独特的性别选择性剪接机制，仅雌果蝇的dsx基因转录出的前体RNA中内含子转录序列会被剪切掉。蓖麻毒素A(RTA)可通过破坏核糖体导致细胞死亡。利用以上信息研发雌性特异性致死基因系统来控制雌蝇的危害，请回答下列问题： ,图1) 图2 图3 (1)研究者获得如图1所示的融合基因1，进而得到转基因果蝇。 ①首先，用PCR技术扩增dsx内含子，应选择图1中的引物是 (填字母)。在PCR反应体系中除了添加模板、引物、耐高温的DNA聚合酶、4种dNTP外，缓冲液中一般需要添加 ，其作用是 。获得PCR产物后需要进行琼脂糖凝胶电泳实验以便进行相关基因测序。制作凝胶时，将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，目的是 。 ②然后将扩增的dsx内含子序列插入RTA基因的内部，再连接 序列，构建含融合基因1的表达载体。 ③最后将含融合基因1的表达载体导入东方果蝇的 (填受体细胞名称)中进一步获得转基因果蝇。判断转基因雌蝇中的成熟mRNA为图2中的C(填字母序号)。 (2)研究发现，RTA蛋白第212位甘氨酸替换为精氨酸会出现冷敏感效应(cs)，即当温度由29 ℃变为18 ℃时，可抑制RTA蛋白对细胞的致死作用。利用此特性培育纯合转基因果蝇。 ①欲得到具有cs效应的RTAcs蛋白，先要推测对应的 ，再经定点突变获得融合基因2(如图3所示)。请在图3方框中画出可继续延伸的复性结果(2分)，要求标明每条链的5′端和3′端。 ②对转入融合基因 2的果蝇进行以下操作： ⅰ：在29 ℃收集雄性果蝇(G0)。 ⅱ：G0与野生型果蝇杂交，筛选出转基因受精卵(G1)。 ⅲ：将每对亲本的受精卵(G1)均分为两组，分别在18 ℃和29 ℃孵化培养，统计两组中雄性个体所占比例，若 ，则说明G1具有cs效应。 ⅳ：在 ℃继续培养具有cs效应的G1果蝇，并使其连续多代相互交配，得到转基因纯合子。 10. (2025·苏州期初)fat1基因和fat2基因控制的酶分别调控两种多不饱和脂肪酸的合成，两种酶的共同表达对于细胞内多不饱和脂肪酸的合成具有协同效应。2A肽是一种来源于病毒的短肽，受2A基因序列控制。2A基因的转录产物可以通过“核糖体跳跃”断开位于2A肽尾端甘氨酸和脯氨酸之间的肽键，将2A基因编码的蛋白分割成2个独立蛋白。图甲表示科研人员利用重叠延伸PCR技术成功构建融合基因fat1－2A－fat2的过程。图乙表示构建成功的包含融合基因的重组质粒的部分片段，F1至F4、R1至R4表示引物。通过基因工程成功实现了fat1基因和fat2基因在大肠杆菌细胞内的共同表达。请回答下列问题： 甲 乙 (1)利用PCR 技术可以实现在体外快速大量进行DNA扩增，其需要的物质条件为：DNA 模板、4种脱氧核苷酸、 和 。 (2)PCR3不需要引物，高温加热后fat1－2A和2A－fat2的双链解开，其中能正常延伸形成融合基因的是 (填序号)形成的杂交链。 (3)图乙所示基因在转录时应以a链为模板，为了确定 fat1基因连接到质粒中且插入2A序列的上游，需进行PCR 检测，若仅用一对引物，应选择图乙中的引物 。 (4)为增加某油料作物种子中多不饱和脂肪酸含量，研究人员将该融合基因(命名为D)转入Ti质粒(图丙)形成基因表达载体，将基因表达载体导入农杆菌，应用农杆菌转化法(图丁)，最终获得多不饱和脂肪酸含量较高的转基因作物品种。 丙 丁 ①Ti质粒部分片段如图丙所示，为使融合基因D成功与Ti 质粒构建表达载体，PCR 时需要在图乙引物 的5′端添加限制酶 的识别位点，并在引物R2的5′端添加限制酶 的识别位点。 ②为了获得含有基因表达载体的农杆菌，从功能角度分类，所用培养基属于 培养基。将筛选出的农杆菌浸泡过的作物愈伤组织进行植物组织培养，从外植体培养成试管苗需要用 种培养基。 ③为研究转化过程中酶D基因插入染色体位点情况，研究者筛选出转基因植株，成熟后自花传粉、单株收种，将其种子播种于含潮霉素的选择培养基中(图丁)，若种子萌发率为15/16，请在下图细胞中画出转基因植株酶D基因(用D表示)在染色体的位置。(2分) 11. (2025·如皋期初)温度是影响微生物生长的重要因素，科研人员应用基因工程以实现通过温度控制工程菌合成所需物质。 (1)为了提高实验成功率，需通过PCR技术扩增相关基因，以获得大量拷贝，PCR反应中的每次循环可分为变性、复性、 三步，利用PCR技术进行体外DNA复制过程中 (填“会”或“不会”)出现冈崎片段，原因是 。 (2)基因工程的核心步骤是 ，该步骤使用的酶通常有 。为实现温度控制蛋白质合成，科研人员设计了如图1所示方案，将构建的载体导入大肠杆菌，获得转基因工程菌。图中不同启动子均是RNA聚合酶的结合位点，其本身 (填“能”或“不能”)被转录。 图1 (3)据图1分析，大肠杆菌在30 ℃和37 ℃均可生长和繁殖，当培养温度为30 ℃时，C基因编码的C蛋白形成二聚体， ，且能减弱红色荧光蛋白的干扰，因而大肠杆菌表达 荧光蛋白。 (4)为检测该方案，科研人员将工程菌稀释涂布在固体培养基上，形成单菌落，培养温度周期控制见图2，依据该方案，每个菌落生长2 d后可出现4个不同的荧光环带，请预测图3所示菌落每个环带的工程菌中荧光蛋白表达情况，在下面表格中按时间顺序，依次写出所表达荧光蛋白的颜色，菌落环带1 ，菌落环带3 。 图2 图3 菌落环带 1 2 3 4 所表达荧光蛋白的颜色 绿、红、绿 绿 学科网（北京）股份有限公司 $$ 第59讲　基因工程的应用 【课标要求】 1.举例说明基因工程在农牧、食品及医药等行业的广泛应用改善了人类的生活品质； 2.概述人们根据基因工程原理，进行蛋白质设计和改造，可以获得性状和功能更符合人类需求的蛋白质； 3.举例说明依据人类需要对原有蛋白质结构进行基因改造。 考点1　基因工程的应用 考 点 透 析 1. 基因工程在农牧业方面的应用 分类 导入目的基因 转基因生物实例 植物 转基因抗虫植物 外源抗虫基因 抗虫棉花、玉米等 转基因抗病植物 某些病毒、真菌等的抗病基因 抗病毒甜椒、番木瓜等 转基因抗除草剂植物 降解或抵抗某种除草剂的基因 抗除草剂玉米、大豆等 改良植物的品质 富含某些必需氨基酸的蛋白质的基因 富含赖氨酸的玉米 与植物花青素代谢相关的基因 颜色变异的矮牵牛 动物 提高动物的生长速率 外源生长激素的基因 转生长激素基因的鲤鱼 改善畜产品的品质 肠乳糖酶的基因 转肠乳糖酶基因的奶牛  解 疑 释 惑 (1)转基因作物的优点 ①减少化学杀虫剂的施用量，减少环境污染； ②增加作物产量； ③增加经济效益。 (2)转基因哺乳动物的培育过程 2. 基因工程在医药卫生领域的应用 (1)微生物制药 (2)利用哺乳动物批量生产药物——乳腺(房)生物反应器 　 (3)建立移植器官的工厂 ①技术方法：利用基因工程技术对猪的器官进行改造，采用的方法是在器官供体的基因组中导入某种调节因子，以抑制抗原决定基因的表达，或设法除去抗原决定基因，然后再结合克隆技术，培育出不会引起免疫排斥反应的转基因克隆猪器官。 ②对猪进行改造的两点理由：内脏构造、大小、血管分布与人的极为相似；与灵长类动物相比，猪体内隐藏的、可导致人类疾病的病毒少。 3. 基因工程在食品工业方面的应用 (1)技术方法：利用基因工程菌生产食品工业用酶、氨基酸和维生素等。例如将编码牛凝乳酶的基因导入大肠杆菌、黑曲霉或酵母菌的基因组中，再通过工业发酵生产凝乳酶。 (2)实例：淀粉酶、脂肪酶、天冬氨酸和苯丙氨酸的大规模生产。  概 念 辨 析 试管动物、克隆动物和转基因动物的比较 比较项目 试管动物 克隆动物 转基因动物 含义 用体外受精的方法获得的动物 用人工方法(核移植或胚胎分割)得到的无性繁殖系 染色体基因组中整合有外源基因并能表达和稳定遗传的一类动物 技术 基础 体外受精、早期胚胎培养、胚胎移植 核移植技术、早期胚胎培养(胚胎分割)、胚胎移植 重组DNA分子技术、早期胚胎培养、胚胎移植 实例 试管牛 “多莉”羊 转基因奶羊 过程 生殖方式 有性生殖 无性生殖 有性生殖或保持原生殖方式 遗传 物质 遗传物质来自两个供体 核基因来自供核个体，质基因来自提供卵母细胞的个体 遗传物质除了来自亲代外，还接受外源基因 意义 充分发挥雌性优良个体的繁殖潜力，缩短供体本身的繁殖周期 加速家畜遗传改良进程、挽救濒危物种等 改良动物品质、制备生物反应器等 相同点 三者均涉及早期胚胎培养、胚胎移植等技术，且移植所选胚胎一般是桑葚胚或囊胚期的胚胎(说明：若是鱼、蛙、鸟等非哺乳类动物则不需胚胎移植技术) 思辨小练 1. 判断下列说法的正误： (1)农业害虫不会对转基因抗虫作物产生抗性。(×) (2)乳腺生物反应器就是把药用蛋白基因导入动物的乳腺细胞中。(×) 提示：乳腺生物反应器是把药用蛋白基因与乳腺中特异表达的基因的启动子等调控元件重组在一起，通过显微注射法导入哺乳动物的受精卵中。 (3)干扰素是一种具有干扰病毒复制作用的糖蛋白，在临床上被广泛用于治疗病毒感染性疾病。(√) 2. 科学家培育出一种转基因小鼠，其膀胱上皮细胞可以合成人的生长激素并分泌到尿液中。在研制膀胱生物反应器时，应使药用蛋白基因在膀胱上皮细胞中特异性表达。它与乳腺生物反应器一样，具有收集药用蛋白较容易，且有不会对动物造成伤害的优点；且相比之下，还能不受性别和年龄的限制。 典 题 说 法 考向1　基因工程的应用 例 (2024·江苏卷)为了高效纯化超氧化物歧化酶(SOD)，科研人员将ELP50片段插入pET－SOD构建重组质粒pET－SOD－ELP50，以融合表达SOD－ELP50蛋白，过程如图1。其中，ELP50是由人工合成的DNA片段，序列为：限制酶a识别序列－(GTTCCTGGTGTTGGC)50－限制酶b识别序列，50为重复次数。请回答下列问题： (1)步骤①双酶切时，需使用的限制酶a和限制酶b分别是EcoR_Ⅰ和Hind_Ⅲ。 (2)步骤②转化时，科研人员常用CaCl2处理大肠杆菌，使细胞处于感受态；转化后的大肠杆菌采用含有卡那霉素的培养基进行筛选。用PCR技术筛选成功导入pET－SOD－ELP50的大肠杆菌，应选用的一对引物是S－F和P－R。 (3)步骤③大肠杆菌中RNA聚合酶与启动子结合，驱动转录，翻译SOD－ELP50蛋白。已知蛋白质中氨基酸残基的平均相对分子质量约为0.11 kDa，将表达的蛋白先进行凝胶电泳，然后用SOD抗体进行杂交，显示的条带应是C(从图2的“A～D”中选填)。 (4)步骤④为探寻高效纯化SOD－ELP50蛋白的方法，科研人员研究了温度、NaCl对SOD－ELP50蛋白纯化效果的影响，部分结果如图3。 (ⅰ)20 ℃时，加入NaCl后实验结果是SOD－ELP50组纯化蛋白数量更多(或SOD－ELP50溶液的蛋白质量比SOD组高)。 (ⅱ)100 ℃时，导致各组中所有蛋白都沉淀的原因是高温使蛋白变性。 (ⅲ)据图分析，融合表达SOD－ELP50蛋白的优点有低温/20_℃下添加NaCl有利于SOD蛋白纯化，(杂蛋白较少，)有利于酶活性的保持。 【解析】(1)目的基因应插入启动子和终止子之间，结合题意可知，ELP50应插入SOD基因之后，由图1可知，限制酶a和限制酶b分别是EcoR Ⅰ、Hind Ⅲ。(2)将目的基因导入细菌时常用CaCl2处理细菌，使其处于感受态。由图可知，重组DNA含有标记基因卡那霉素抗性基因，所以转化后的大肠杆菌采用含有卡那霉素的培养基进行筛选。成功导入pET－SOD－ELP50的大肠杆菌同时含有pET－SOD和ELP50，结合图示可知，选引物S－F和P－R可特异性对pET－SOD－ELP50进行扩增。(3)RNA聚合酶与启动子结合后，启动转录。由图可知，ELP50为750 bp，SOD为462 bp，一共1 212 bp，则对应404个氨基酸，其脱水缩合形成的蛋白质质量为404×0.11 kDa≈44 kDa，电泳后应该为条带C。(4)(ⅰ)由图可知，20 ℃时，较不加NaCl，加入NaCl后纯化蛋白数量更多。(ⅱ)100 ℃时，温度过高，导致蛋白质变性而沉淀。(ⅲ)20 ℃，加入NaCl时，较SOD组，SOD－ELP50组沉淀中蛋白质相对含量较高，说明低温下添加NaCl有利于SOD蛋白纯化，杂蛋白较少，有利于酶活性的保持。 变式1 (2024·南通二模)磷脂酸(PA)是调节植物生长发育和逆境响应的重要信使物质。为了解植物细胞中PA的动态变化，研究人员用无缝克隆技术将高度专一的PA结合蛋白(PABD)基因与绿色荧光蛋白(GFP)基因融合，构建有效监测细胞PA变化的荧光探针，并测定拟南芥细胞内PA含量。无缝克隆技术连接DNA片段的机理和构建荧光探针表达载体过程如图所示，请回答下列问题： 　(1)无缝克隆时，T5核酸外切酶沿5′→3′的方向水解DNA，其目的是形成黏性末端。T5核酸外切酶催化的最适温度为37 ℃，而过程①选择的温度为50 ℃，目的是降低酶活性，防止过度水解DNA(或控制水解速度，或控制黏性末端合适长度)。 (2)过程②两个片段退火后存在“缺口”的原因是过程①切割的长度大于同源序列长度(，确保同源序列的高效碱基互补配对)，过程③所需的酶有DNA聚合酶和DNA连接酶。 (3)与传统的酶切再连法相比，无缝克隆技术构建重组质粒的优点有ABC。 A．不受限制酶切位点的限制 B．不会引入多余碱基 C．操作时间短，成功率高 D．有利于多个小片段(＜50 bp)连接 (4)PCR扩增PABD基因时需依据PABD基因一端的核苷酸序列和载体一端的核苷酸序列(或PABD基因一端的核苷酸序列和同源序列)设计引物R1。据图分析扩增目的片段的引物F1和R2对应于下表中的1、4。 1 5′－TCCGGACTCAGATCTCGAGC－3′ 2 5′－AGCTATAGTTCTAGATCTAGATTAACTAGTCTTAGTGGCGTC－3′ 3 5′－TATCGATGGCGCCAGCTGAGGATGGTGAGCAAGGGCGA－3′ 4 5′－GCTCGAGATCTGAGTCCGGACTTGTACAGCTCGTCCA－3′ (5)利用农杆菌花序侵染法转化拟南芥，将获得的种子(T1)进行表面消毒，均匀铺在含有草胺膦的MS培养基上进行筛选和鉴定。T1代自交获得的T2代幼苗的抗性表现和比例为抗草胺膦∶不抗草胺膦＝3∶1，说明T1为单位点插入的转基因株系。 (6)通过观测转基因拟南芥根尖细胞中绿色荧光点的分布(或绿色荧光，或荧光)，了解PA的动态变化。 【解析】本题是利用核酸外切酶的功能，通过控制酶切的时间和温度，获得特定长度的黏性末端。理论上会出现4种情况：①切了部分同源序列，无法黏性末端互补；②正好切除了全部的同源序列，不同DNA片段的黏性末端可以互补；③切除同源序列及其旁边的部分序列，黏性末端部分互补，但是互补后仍留有缺口，需要DNA聚合酶催化延伸；④某一条DNA链全部切除，形成了脱氧核苷酸单链。本题大概率是第③种，所以过程②出现了“缺口”，过程③补齐时需要DNA聚合酶。另外本题中应该通过控制温度避免了第④种，其实也有小概率可能出现第②种。无缝克隆只要有同源臂序列就能连接，不需要考虑限制酶切位点；拼接的同源臂序列是本身的，不额外添加碱基(序列)；且此法可同时拼接多个片段，在一个体系中快速完成，阳性率高。待拼接片段太短会被外切酶水解掉，所以不利于小片段连接。由重组DNA图可知，GFP基因和PABD基因进行连接，PCR扩增GFP基因时需根据GFP基因一端的核苷酸序列和PABD基因一端的核苷酸序列设计引物R2，而设计引物F1仅需根据PABD基因一端的核苷酸序列，因此引物F1的碱基序列比引物R2的碱基序列短，因此扩增目的片段的引物F1对应于表中的1。而引物R2的一部分能与引物F1进行碱基互补配对，对比排查表中2、3、4序列，R2对应于表中的4。假设抗性基因用A表示，则T1代的结果如下图所示，因此T2代幼苗抗草胺膦∶不抗草胺膦＝3∶1。 变式2 (2025·南通期初)基因L能够通过脱落酸信号途径调控大豆的逆境响应。利用基因工程技术编辑基因L，可培育耐盐碱大豆品系。其基本过程是：在载体上的限制酶BsaⅠ切点处插入大豆基因L的向导DNA序列构建成重组载体，再将重组载体导入大豆细胞，其转录产物可引导编辑酶特异性结合基因L的目标序列进行定点编辑，载体信息如下图1。请回答下列问题： 　(1)基因L的向导DNA序列经BsaⅠ(限制酶)切割后，形成左、右两侧黏性末端序列分别为5′－ATTG－3′、5′－AAAC－3′的片段，与BsaⅠ酶切后的载体混合，经DNA连接酶作用形成重组载体。 (2)将重组载体导入通过Ca2＋处理的农杆菌，利用农杆菌的侵染性将重组载体导入大豆细胞，培养基中添加卡那霉素(抗生素)进行筛选。 (3)步骤(2)筛选得到4株植株，为了鉴定基因编辑是否成功，以上述植株的DNA为模板，通过PCR扩增基因L，完全酶切后电泳。基因L部分序列及酶切位点如图2所示，电泳结果如图3所示。 用PCR技术扩增基因L时，所用引物越短，特异性越低(填“高”或“低”)。据图判断选用的限制酶是SacⅠ，纯合突变植株是④(填序号)。除上述分子水平的检测外，可采用将上述大豆与普通大豆种植于盐碱地，观察比较生长情况(方案)进行个体生物学水平鉴定。 (4)实验中获得1株基因L成功突变的纯合植株，该植株具有抗生素抗性，检测发现其体细胞中只有1条染色体有T－DNA插入。用抗生素筛选这个植株的自交子代，其中突变位点纯合且对抗生素敏感的植株所占比例为1/4，筛选出的敏感植株可用于后续的品种选育。 【解析】(1)题中交代载体是限制酶BsaⅠ切割，所以用限制酶BsaⅠ切割大豆基因组DNA，以产生相同的黏性末端。根据图1所示的信息及Bsa Ⅰ酶切位点可知，经BsaⅠ酶切后，形成的左、右两侧黏性末端序列分别为5′－ATTG－3′、5′－AAAC－3′的片段。(2)根据图示信息可知，重组载体通过农杆菌导入大豆细胞当中的片段包含了卡那霉素抗性基因，因此可以用含卡那霉素的培养基筛选到具有该抗生素抗性的植株。(3)植株体内染色体上的L基因有3种情况：都是正常L基因；一个突变L基因，一个正常L基因；两个突变L基因。根据图2可知，突变为位点在Sac Ⅰ的识别序列中，只能选用限制酶SacⅠ。由于目标序列没有SacⅠ切割位点，突变序列有，所以该酶酶切后，突变序列的电泳条带出现两条，目标序列的条带是一条。根据图3结果可知，①③是杂合子，②是纯合正常植株，④是纯合突变植株。(4)由题意可知，该植株产生的配子中，含T－DNA的配子比例为1/2，不含T－DNA的配子比例为1/2。由于T－DNA上含有抗生素抗性基因，所以对抗生素敏感的植株不能含T－DNA，故该植株自交子代中突变位点纯合且对抗生素敏感的植株所占比例为1/4。  深 度 指 津 “无缝克隆”的机制复杂多样，不可格式化，要提高具体问题具体分析的能力、识图能力。注意分析不同的“无缝连接”的差异与优劣势。 新视野 1. 融合基因 (1)基因工程中构建融合基因，可以实现两个或更多不同来源的DNA分子组合，置于同一套调控序列控制之下进行表达。表达产物为融合蛋白。 (2)可分为四大类：①由报告基因和功能基因构成的融合基因。常用的报告基因有GFP(绿色荧光蛋白)基因、GUS基因、LacZ基因等，主要目的是对功能基因进行示踪；②由信号肽或单体蛋白的序列与功能基因构成的融合基因，其主要目的是利用信号肽或单体序列携带目的基因高效表达，从而提取纯化目的蛋白；③功能基因与功能基因的融合，包括相同功能基因的融合(目的是增强基因的功能)和不同功能基因的融合；④报告基因与抗药性基因的融合，用于构建融合载体，以利于插入大片段的cDNA或作为双功能标记。 2. 无缝克隆 (1)原理：使载体末端和引物末端具有15～20个同源碱基，由此得到的PCR产物两端便分别带上了15～20个与载体序列同源性的碱基。通过相关酶试剂处理，同时除去载体与目的DNA上同源片段的双链中的一条链，这样载体和目的DNA两端就露出了能够互补配对的序列，依靠同源序列碱基间的配对能使载体和目的DNA较为紧密地连在一起。 (2)优点：无缝克隆不需要任何限制性内切酶和连接酶，突破传统的双酶切后再连接，只需要一步重组法，即可得到高效率克隆的重组载体。 考点2　蛋白质工程的原理和应用 考 点 透 析 知识1　蛋白质工程的原理 1. 对蛋白质工程的理解 基础 蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系 手段 通过改造或合成基因，来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质 目的 获得满足人类的生产和生活需求的蛋白质 2. 蛋白质工程崛起的缘由 (1)基因工程在原则上只能生产自然界中已存在的蛋白质。 (2)天然蛋白质的结构和功能符合特定物种生存的需要，却不一定完全符合人类生产和生活的需要。 3. 蛋白质工程的基本思路 A．预期功能，B．转录，C．翻译。 知识2　蛋白质工程的应用 1. 在医药工业方面的应用，如研发速效胰岛素类似物，提高干扰素的保存期，改造抗体等。 2. 在酶方面的应用：改进酶的性能或开发新的工业用酶，如提高酶的催化活性、提高酶的稳定性等。 3. 在农业方面：除了改造某些重要的酶，如参与调控光合作用的酶，还用于设计优良微生物农药等。  概 念 辨 析 蛋白质工程和基因工程的比较 项目 蛋白质工程 基因工程 原理 中心法则的逆推 基因重组 过程 预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列(基因) 获取目的基因→构建基因表达载体→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定 实质 定向改造或生产人类所需蛋白质 定向改造生物的遗传特性，以获得人类所需的生物类型或生物产品(基因的异体表达) 结果 生产自然界没有的蛋白质 生产自然界已有的蛋白质 联系 蛋白质工程是在基因工程基础上延伸出的第二代基因工程，因为是对现有蛋白质的改造或制造新的蛋白质，所以必须通过基因修饰或基因合成实现 思辨小练 1. 判断下列说法的正误： (1)蛋白质工程是在分子水平上对蛋白质分子直接进行操作，定向改变分子的结构。(×) 提示：蛋白质工程中直接改造的是基因，不是蛋白质。 (2)蛋白质工程遵循中心法则，而基因工程不遵循。(×) (3)根据某多肽链的一段氨基酸序列，可以很容易地确定控制该肽链合成的基因的脱氧核苷酸序列。(×) 提示：由于密码子的简并性等原因，根据某多肽链的一段氨基酸序列，不容易确定基因的脱氧核苷酸序列。 (4)蛋白质工程是一项难度很大的工程，主要是因为人们对蛋白质复杂的高级结构没有完全认识。(√) 2. 为什么蛋白质工程不是直接改造蛋白质，而是通过基因改造或基因合成来完成的？ 提示：①任何一种天然蛋白质都是由基因编码的，改造了基因即对蛋白质进行了改造，而且改造过的蛋白质可以遗传下去。如果对蛋白质直接改造，即使改造成功，被改造的蛋白质也是无法遗传下去的。②对基因进行改造比对蛋白质进行直接改造容易操作，难度小得多。 典 题 说 法 考向　蛋白质工程 例 胰岛素是治疗糖尿病的特效药，但天然胰岛素在人体内的寿命只有几个小时。重症患者每天需要注射多次药物，增加了痛苦。通过蛋白质工程改变蛋白质的空间结构，以延长蛋白质的半衰期，可得到长效胰岛素，还可以增强其稳定性。如图是通过蛋白质工程获得长效胰岛素的过程。请分析回答： 　 　(1)构建新的蛋白质模型是蛋白质工程的关键，图中构建新蛋白质模型的主要依据是蛋白质(胰岛素)的预期功能。 (2)通过人工合成DNA形成的新基因应与载体结合后，转移到大肠杆菌等受体细胞中，才能准确表达。 (3)若要利用大肠杆菌生产上述长效胰岛素，需要用到的生物工程有蛋白质工程和发酵工程。 (4)图解中从新的胰岛素模型到新的胰岛素基因的基本思路是根据新的胰岛素中氨基酸的序列，推测出其基因中的脱氧核苷酸序列，然后利用DNA合成仪来合成新的胰岛素基因。 变式 腈水合酶(N0)广泛应用于环境保护和医药原料生产等领域，但不耐高温。利用蛋白质工程技术在N0的α和β亚基之间加入一段连接肽，可获得热稳定的融合型腈水合酶(N1)。下列有关叙述错误的是(D) A．N1与N0氨基酸序列的差异是影响其热稳定性的原因之一 B．加入连接肽需要通过改造基因实现 C．获得N1的过程需要进行转录和翻译 D．检测N1的活性时先将N1与底物充分混合，再置于高温环境 【解析】在N0的α和β亚基之间加入一段连接肽，可获得热稳定的融合型腈水合酶(N1)，则N1与N0氨基酸序列有所不同，这可能是影响其热稳定性的原因之一，A正确；蛋白质工程的作用对象是基因，故加入连接肽需要通过改造基因实现，B正确；N1的化学本质是蛋白质，获得N1的过程需要进行转录和翻译，C正确；由于酶具有高效性，因此在检测N1的活性时需先将其置于高温环境，再与底物充分混合，D错误。 配套精练 第59讲　基因工程的应用 一、 单项选择题 1. 下列关于基因工程应用的叙述，错误的是(C) A．基因工程育种能够定向改造生物性状 B．可以利用基因工程技术生产细胞因子、抗体、疫苗和激素等药物 C．常将药用蛋白基因和乳腺中特有基因的启动子等重组在一起，组成乳腺生物反应器 D．以大肠杆菌为受体细胞生产的胰岛素，其结构可能与人体自身的胰岛素不完全相同 【解析】基因工程育种能根据人类的生产生活需求，定向改造生物性状，A正确；可利用转基因的工程菌大规模生产药物，如细胞因子、抗体、疫苗、激素等，B正确；制备乳腺生物反应器时，将目的基因(药用蛋白基因)和受精卵中乳腺蛋白基因的启动子重组，转基因动物就能通过分泌乳汁来生产药品，称为乳腺生物反应器，C错误；大肠杆菌是原核生物，无内质网和高尔基体，无法对胰岛素进行加工，以大肠杆菌为受体细胞生产的胰岛素，其结构可能与人体自身的胰岛素不完全相同，D正确。 2. (2024·江苏卷)酵母菌是基因工程中常用的表达系统。下列相关叙述正确的是(C) A. 酵母菌培养液使用前要灭活所有细菌，但不能灭活真菌 B．酵母菌是真核细胞，需放置在CO2培养箱中进行培养 C．可用稀释涂布平板法对酵母菌计数 D．该表达系统不能对合成的蛋白质进行加工和修饰 【解析】培养液中细菌和真菌均需严格灭菌，A错误；酵母菌接种后放入28 ℃左右的恒温培养箱中培养，B错误；酵母菌是真核生物，具有内质网和高尔基体等细胞器，可对蛋白质进行复杂的加工，D错误。 3. (2024·南京调研)研究人员制备一种膀胱生物反应器，用其制备获得人体特殊功能蛋白A的基本过程如下图所示。下列叙述正确的是(C) A．步骤①和②所代表的操作分别是显微注射、体外受精 B．诱导雌性动物超数排卵所饲喂的激素能作用于特定细胞 C．从卵巢采集的卵子通常需要培养成熟后与获能的精子进行体外受精 D．早期胚胎培养过程中通常在培养液中通入5%的CO2刺激细胞呼吸 【解析】图中①表示将目的基因导入受体细胞，该过程是导入动物受精卵，常用显微注射法，而②表示早期胚胎培养，A错误；诱导雌性动物超数排卵的激素是促性腺激素，该激素属于蛋白质类激素，饲喂会被分解而失去作用，B错误；从卵巢采集的卵子通常需要培养成熟后(培养到减数分裂Ⅱ期)才可与获能的精子进行体外受精，C正确；早期胚胎培养过程中通常在培养液中通入5%的CO2，目的是维持培养液的pH，D错误。 4. 下图为蛋白质工程操作的基本思路，下列叙述不正确的是(D) A．代表蛋白质工程操作思路的过程是④⑤ B．代表中心法则内容的是①② C．①代表转录，②代表翻译，④代表分子设计，⑤代表DNA合成 D．蛋白质工程的目的是对基因的结构进行分子设计，通过基因合成或改造实现 【解析】蛋白质工程的目的是对蛋白质的结构进行分子设计，通过基因合成或改造实现，D错误。 5. (2024·江西卷)γ－氨基丁酸在医药等领域有重要的应用价值。利用L － 谷氨酸脱羧酶(GadB)催化L－谷氨酸脱羧是高效生产γ－氨基丁酸的重要途径之一。研究人员采用如图方法将酿酒酵母S的L－谷氨酸脱羧酶基因(gadB)导入生产菌株E.coliA，构建了以L－谷氨酸钠为底物高效生产γ－氨基丁酸的菌株E.coliB。下列叙述正确的是(A) A．上图表明，可以从酿酒酵母S中分离得到目的基因gadB B．E.coli B发酵生产γ－氨基丁酸时，L－谷氨酸钠的作用是供能 C．E.coli A和E.coli B都能高效降解γ－氨基丁酸 D．可以用其他酶替代NcoⅠ和KpnⅠ构建重组质粒 【解析】题意显示，E.coli B发酵生产γ－氨基丁酸时L－谷氨酸钠的作用是作为底物，B错误；E.coli A中没有L－谷氨酸脱羧酶，因而不能降解L－谷氨酸，而E.coli B中含有该酶的基因，因而能高效降解γ－氨基丁酸，C错误；图中质粒和目的基因上含有NcoⅠ和KpnⅠ的酶切位点，因而不可以用其他酶替代NcoⅠ和KpnⅠ构建重组质粒，D错误。 二、 多项选择题 6. 基因工程自20世纪70年代兴起后，在农牧业、医药卫生和食品工业等方面得到了飞速的发展。下列关于基因工程应用的叙述，正确的是(BD) A．为增加器官的来源，可对猪的器官进行改造以促进抗原决定基因的表达 B．将肠乳糖酶基因导入奶牛基因组，可降低乳汁中乳糖含量 C．作为乳腺生物反应器的动物体内只有乳腺细胞含目的基因 D．将牛凝乳酶基因导入黑曲霉中，再通过工业发酵可生产凝乳酶 【解析】为增加器官的来源，可利用基因工程方法对猪的器官进行改造，将器官供体基因组导入某种调节因子，抑制或除去抗原决定基因，减少免疫排斥反应，A错误；作为乳腺生物反应器的动物体内所有细胞都含有目的基因，但是只有乳腺细胞才能表达目的基因，C错误。 7. (2024·如皋期初)某生物制品公司将人的干扰素基因导入酵母菌生产人的干扰素，过程如下图所示。相关叙述正确的是(ABD) 　 A．过程①可以提取mRNA通过RT－PCR技术获得，需用到逆转录酶和Taq酶 B．过程②能实现的分子基础是细菌质粒和干扰素基因均为双螺旋结构 C．带干扰素基因的质粒上必须有起始密码子，才能驱动干扰素基因的表达 D．使用酵母菌作为受体细胞与使用大肠杆菌相比，优点是可以对干扰素进行加工 【解析】过程①是目的基因的获取，可以提取mRNA通过RT－PCR技术逆转录形成cDNA，需用到逆转录酶和Taq酶，A正确；过程②是基因表达载体的构建，能实现的分子基础是细菌质粒和干扰素基因均为双螺旋结构，这样才能正常连接，B正确；起始密码子位于mRNA上，不在基因上，C错误；大肠杆菌为原核生物，而酵母菌为真核生物，细胞内含有内质网和高尔基体等，与使用大肠杆菌相比，使用酵母菌作为受体细胞的优点是可以对干扰素进行加工，D正确。 三、 非选择题 8. (2025·海门一诊)血凝素基因(HA)编码的血凝素是构成流感病毒囊膜纤突的主要成分。成熟的血凝素包含HA1和HA2两个亚单位，其中HA1含有病毒与受体相互作用的位点。IgGFc基因片段(长度为717 bp)编码人IgG抗体中的一段小肽，常作为融合蛋白标签。蛋白质分泌依赖于信号肽的引导，本研究中用信号肽IL－2SS代替HA自身信号肽，科研人员尝试构建IL－2SS/HA1/IgGFc融合蛋白表达载体，导入大肠杆菌表达并分泌，请回答下列问题： (1)信号肽编码序列的基本单位是脱氧核苷酸，HA信号肽的合成场所是宿主细胞的核糖体。 (2)本实验用信号肽IL－2SS代替HA自身信号肽有利于融合蛋白分泌到大肠杆菌细胞外，PCR扩增目的基因时应该选择图中引物b和c。引物不能包含基因HA1的终止密码子的编码序列，原因是防止产生的HA1上不含IgGFc标签。 (3)应选择限制酶EcoR_Ⅴ来切割质粒A，然后直接将PCR产物与质粒A混合，同时最好加入T4_DNA连接酶(填“E.coli DNA连接酶”或“T4 DNA连接酶”)，使得目的基因与质粒A相连。 (4)若目的基因与质粒A正向连接，HA1基因转录时的模板链是图中的引物c在PCR时延伸而成；若目的基因与质粒A反向连接，用BamH Ⅰ和SacⅠ同时切割重组质粒，完全酶切后的产物进行凝胶电泳，其中最靠近加样孔的条带长度约5_181(2分)bp。 (5)融合蛋白中的标签蛋白有利于目的蛋白的分离和纯化，基因工程生产HA1作为疫苗时，选择人IgGFc作为标签的优点还有降低免疫排斥反应。 【解析】(1)由题图可知，信号肽编码序列是DNA分子片段，因此其基本单位是脱氧核苷酸。信号肽的化学本质是蛋白质，合成场所是宿主细胞的核糖体。(2)IgGFc基因片段(长度为717 bp)编码人IgG抗体中的一段小肽，常作为融合蛋白标签。HA1含有病毒与受体相互作用的位点。科研人员尝试构建IL－2SS/HA1/IgGFc融合蛋白表达载体，并导入大肠杆菌表达和分泌，说明用信号肽IL－2SS代替HA自身信号肽有利于融合蛋白分泌到大肠杆菌细胞外。由图可知，引物b、c可与HA1两端的碱基序列结合，故PCR扩增目的基因应选择图中引物b和引物c。若设计引物含有HA1的终止密码子，则核糖体读到终止密码子时就停止翻译，会导致IgGFc基因不能正常表达，则产生的HA1上不含IgGFc标签。(3)由图可知，限制酶EcoR Ⅴ切割可产生平末端，其识别切割位点恰巧处于IL－2SS和IgGFc中间，可选择该酶对质粒进行切割，然后直接将PCR产物与质粒A混合，同时加入T4 DNA连接酶使得目的基因与质粒A相连。(4)若目的基因与质粒A正向连接，HA1基因转录时的模板链是由图中的引物c在PCR时延伸而成。若目的基因与质粒A反向连接，HA1基因片段长度为1 038－51＝987 bp，重组质粒长度为5 554＋987＝6 541 bp，IgGFc基因片段长度为717 bp，二者反向相连时，BamH Ⅰ作用于HA1中，SacⅠ酶作用于IgGFc末端，完全酶切后的产物的长度约为717＋[987－(1 038－694)]＝1 360，6 541－1 360＝5 181，其中最靠近加样孔的条带长度约为5 181 bp。(5)基因工程生产HA1作为疫苗时，选择人IgGFc的优点在于降低免疫排斥反应。 9. (2025·南京期初)东方果蝇繁殖力强，雌蝇产卵于果皮下，幼虫孵化后钻入果肉中蛀食，造成水果腐烂，失去商品价值。研究发现，东方果蝇中dsx基因转录出的前体RNA在加工过程中具有独特的性别选择性剪接机制，仅雌果蝇的dsx基因转录出的前体RNA中内含子转录序列会被剪切掉。蓖麻毒素A(RTA)可通过破坏核糖体导致细胞死亡。利用以上信息研发雌性特异性致死基因系统来控制雌蝇的危害，请回答下列问题： ,图1) 图2 图3 (1)研究者获得如图1所示的融合基因1，进而得到转基因果蝇。 ①首先，用PCR技术扩增dsx内含子，应选择图1中的引物是a、d(填字母)。在PCR反应体系中除了添加模板、引物、耐高温的DNA聚合酶、4种dNTP外，缓冲液中一般需要添加Mg2＋，其作用是激活DNA聚合酶的活性。获得PCR产物后需要进行琼脂糖凝胶电泳实验以便进行相关基因测序。制作凝胶时，将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，目的是形成加样孔。 ②然后将扩增的dsx内含子序列插入RTA基因的内部，再连接雌性特异性剪切识别序列，构建含融合基因1的表达载体。 ③最后将含融合基因1的表达载体导入东方果蝇的受精卵(填受体细胞名称)中进一步获得转基因果蝇。判断转基因雌蝇中的成熟mRNA为图2中的C(填字母序号)。 (2)研究发现，RTA蛋白第212位甘氨酸替换为精氨酸会出现冷敏感效应(cs)，即当温度由29 ℃变为18 ℃时，可抑制RTA蛋白对细胞的致死作用。利用此特性培育纯合转基因果蝇。 ①欲得到具有cs效应的RTAcs蛋白，先要推测对应的基因碱基序列，再经定点突变获得融合基因2(如图3所示)。请在图3方框中画出可继续延伸的复性结果(2分)，要求标明每条链的5′端和3′端。 如图所示： ②对转入融合基因 2的果蝇进行以下操作： ⅰ：在29 ℃收集雄性果蝇(G0)。 ⅱ：G0与野生型果蝇杂交，筛选出转基因受精卵(G1)。 ⅲ：将每对亲本的受精卵(G1)均分为两组，分别在18 ℃和29 ℃孵化培养，统计两组中雄性个体所占比例，若18_℃组雄性个体所占比例小于29_℃组，则说明G1具有cs效应。 ⅳ：在18℃继续培养具有cs效应的G1果蝇，并使其连续多代相互交配，得到转基因纯合子。 【解析】(1)PCR扩增时一对引物需要与模板的3′端结合，根据图1，扩增dsx内含子应选择的引物是a、d。PCR反应体系中加入的缓冲液一般添加Mg2＋，因为Mg2＋可以激活DNA聚合酶。为了形成加样孔，所以制作凝胶时，将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子。据图可知，融合基因包括RTA基因和dsx内含子序列，故将扩增的dsx内含子序列插入RTA基因的内部，再连接雌性特异性剪切识别序列。将目的基因导入动物细胞通常用受精卵作为对象。RTA基因表达出的蓖麻毒素A(RTA)可通过破坏核糖体导致细胞死亡，由此可知，雌蝇特异性致死的原因是转基因雌蝇个体中含有完整的RTA基因，能成功表达出蓖麻毒素A(RTA)，由此判断转基因雌蝇中的成熟mRNA为C。(2)欲得到具有cs效应的RTAcs蛋白，可通过蛋白质工程实现，该技术中需根据氨基酸的序列推测对应的脱氧核苷酸序列，经定点突变获得融合基因2。图中虚线方框中的两条链在延伸过程中，既可作为模板又可以起到引物的作用，使耐高温的DNA聚合酶能够从两条链的3′端开始连接脱氧核苷酸，继续延伸的复性结果如答案所示。将每对亲本的受精卵(G1)均分为两组，分别在18 ℃和29 ℃孵化培养，统计两组中雄性个体所占比例，若G1具有cs效应，则18 ℃组雌性个体不会致死，雄性个体所占比例小于29 ℃组。在18 ℃时可抑制RTA蛋白对细胞的致死作用，为通过多代自交得到转基因纯合子，应在18 ℃继续培养具有cs效应的G1果蝇。 10. (2025·苏州期初)fat1基因和fat2基因控制的酶分别调控两种多不饱和脂肪酸的合成，两种酶的共同表达对于细胞内多不饱和脂肪酸的合成具有协同效应。2A肽是一种来源于病毒的短肽，受2A基因序列控制。2A基因的转录产物可以通过“核糖体跳跃”断开位于2A肽尾端甘氨酸和脯氨酸之间的肽键，将2A基因编码的蛋白分割成2个独立蛋白。图甲表示科研人员利用重叠延伸PCR技术成功构建融合基因fat1－2A－fat2的过程。图乙表示构建成功的包含融合基因的重组质粒的部分片段，F1至F4、R1至R4表示引物。通过基因工程成功实现了fat1基因和fat2基因在大肠杆菌细胞内的共同表达。请回答下列问题： 甲 乙 (1)利用PCR 技术可以实现在体外快速大量进行DNA扩增，其需要的物质条件为：DNA 模板、4种脱氧核苷酸、引物和耐高温的DNA_聚合酶。 (2)PCR3不需要引物，高温加热后fat1－2A和2A－fat2的双链解开，其中能正常延伸形成融合基因的是①④(填序号)形成的杂交链。 (3)图乙所示基因在转录时应以a链为模板，为了确定 fat1基因连接到质粒中且插入2A序列的上游，需进行PCR 检测，若仅用一对引物，应选择图乙中的引物F1、R3。 (4)为增加某油料作物种子中多不饱和脂肪酸含量，研究人员将该融合基因(命名为D)转入Ti质粒(图丙)形成基因表达载体，将基因表达载体导入农杆菌，应用农杆菌转化法(图丁)，最终获得多不饱和脂肪酸含量较高的转基因作物品种。 丙 丁 ①Ti质粒部分片段如图丙所示，为使融合基因D成功与Ti 质粒构建表达载体，PCR 时需要在图乙引物F1的5′端添加限制酶XbaⅠ的识别位点，并在引物R2的5′端添加限制酶SacⅠ的识别位点。 ②为了获得含有基因表达载体的农杆菌，从功能角度分类，所用培养基属于选择培养基。将筛选出的农杆菌浸泡过的作物愈伤组织进行植物组织培养，从外植体培养成试管苗需要用3/三种培养基。 ③为研究转化过程中酶D基因插入染色体位点情况，研究者筛选出转基因植株，成熟后自花传粉、单株收种，将其种子播种于含潮霉素的选择培养基中(图丁)，若种子萌发率为15/16，请在下图细胞中画出转基因植株酶D基因(用D表示)在染色体的位置。(2分) 如图所示： 【解析】(1)PCR技术的物质条件为DNA模板、4种脱氧核苷酸、引物、耐高温的DNA聚合酶。(2)只有①④结合形成的杂交链能延伸形成融合基因，因为②③结合形成的杂交链的缺口处是5′端，不能自动延伸。(3)因为子链延伸的方向是5′→3′，根据引物的方向可知转录时模板链是a链。为了确定fat1基因连接到质粒中且插入2A序列的上游，需进行PCR检测，若仅用一对引物，应选择图乙中的引物F1、R3。(4)①为使目的基因能够正常表达，目的基因应位于启动子和终止子之间，Ti质粒部分片段如图丙所示，为使融合基因D成功与Ti质粒构建表达载体，PCR时需要在图乙引物F1的5′端添加限制酶XbaⅠ的识别位点，并在引物R2的5′端添加限制酶SacⅠ的识别位点。②为了获得含有基因表达载体的农杆菌，从功能角度来说，需使用含有抗生素的选择培养基进行筛选。从外植体培养成试管苗需要用3种培养基，即诱导愈伤组织的形成、诱导芽的分化、诱导根的分化的培养基。③因为种子萌发率为15/16，所以转基因植株含两个酶D基因，且位于非同源染色体上。 11. (2025·如皋期初)温度是影响微生物生长的重要因素，科研人员应用基因工程以实现通过温度控制工程菌合成所需物质。 (1)为了提高实验成功率，需通过PCR技术扩增相关基因，以获得大量拷贝，PCR反应中的每次循环可分为变性、复性、延伸三步，利用PCR技术进行体外DNA复制过程中不会(填“会”或“不会”)出现冈崎片段，原因是DNA体外复制是先解旋再复制(DNA体外复制不形成复制叉)。 (2)基因工程的核心步骤是基因表达载体的构建，该步骤使用的酶通常有限制酶、DNA连接酶。为实现温度控制蛋白质合成，科研人员设计了如图1所示方案，将构建的载体导入大肠杆菌，获得转基因工程菌。图中不同启动子均是RNA聚合酶的结合位点，其本身不能(填“能”或“不能”)被转录。 图1 (3)据图1分析，大肠杆菌在30 ℃和37 ℃均可生长和繁殖，当培养温度为30 ℃时，C基因编码的C蛋白形成二聚体，抑制启动子R，F蛋白不能表达，解除F蛋白对启动子N的抑制，且能减弱红色荧光蛋白的干扰，因而大肠杆菌表达绿色荧光蛋白。 (4)为检测该方案，科研人员将工程菌稀释涂布在固体培养基上，形成单菌落，培养温度周期控制见图2，依据该方案，每个菌落生长2 d后可出现4个不同的荧光环带，请预测图3所示菌落每个环带的工程菌中荧光蛋白表达情况，在下面表格中按时间顺序，依次写出所表达荧光蛋白的颜色，菌落环带1红、绿、红、绿，菌落环带3红、绿。 图2 图3 菌落环带 1 2 3 4 所表达荧光蛋白的颜色 绿、红、绿 绿 【解析】(1)为了提高实验成功率，需通过PCR技术扩增相关基因，以获得大量拷贝，PCR反应中的每次循环可分为变性、复性、延伸三步。PCR技术是DNA先解旋再复制，所以不会出现冈崎片段。(2)基因工程的核心步骤是基因表达载体的构建，该步骤使用的酶通常有限制酶、DNA连接酶。启动子是RNA聚合酶的结合位点，其本身不能被转录。(3)据图1，当培养温度为30 ℃时，C基因编码的C蛋白形成二聚体，抑制启动子R，F蛋白不能合成，解除对启动子N的抑制，因而大肠杆菌表达绿色荧光蛋白。因为启动子R被抑制，所以RFP基因不能表达，不能编码红色荧光蛋白。(4)根据图2中不同时间的培养温度，确定图3中菌落环带1、2、3、4中所表达的荧光蛋白的颜色依次是红、绿、红、绿；绿、红、绿；红、绿；绿。 学科网（北京）股份有限公司 $$