备课素材：PCR 技术系统 2024—2025学年高二下学期选择性必修3

PCR 技术系统复习 一、PCR技术的实验原理 要掌握PCR技术，就得先理解DNA的半保留复制。细胞内DNA复制时，氢键断裂、双链解旋，以两条单链作为模板，按碱基互补配对原则合成互补新链，经过这一系列的反应，一个DNA分子就变成两个相同的DNA分子，且新的DNA分子各保留了原DNA分子的一条链，即DNA的半保留复制。PCR技术正是巧妙地模拟了这一生物体内的DNA复制过程，只不过它是在试管这个“微型工厂”里进行的。 二、PCR技术的实验步骤 （一）变性（其实质是双链的分离和解旋） PCR反应的第一步是变性，就像是给DNA分子来个 “高温洗礼”。反应体系被加热到90℃至96℃，在如此高温下，DNA双链之间的氢键就像被高温融化的冰一样断裂开来，原本紧密缠绕的双链DNA瞬间变成了两条单链，为后续的复制工作做好了准备。这一步就好比把一本书的书页完全摊开，方便抄写员照着每一页进行抄写。 （二）退火（其实质是引物与模板精准对接） 当温度迅速降低到60℃至65℃时，PCR反应进入了退火阶段。这时候，我们预先设计好的引物就登场了。引物就像是一些精心制作的 “小片段钥匙”，它们能够与单链DNA模板上特定的区域精准匹配并结合。引物与模板结合后，就像在单链 DNA 这张 “图纸” 上标记好了复制的起始点，为下一步的DNA合成指明了方向。 （三）延伸（其实质是DNA的半保留复制） 将温度升至70℃至75℃，这是 Taq 酶的 “最适宜工作温度”。Taq 酶就像是一位不知疲倦的 “工匠”，以 dNTP（四种基本核苷酸）为原料，从引物的 3′端开始，按照5′→3′端的方向，沿着单链DNA模板快速地合成与之互补的 DNA 链。每经过一次变性、退火和延伸的循环，DNA 的含量就会神奇地增加一倍。如果把这个过程想象成生产链条，那么每一轮循环就是在不断地复制产品，数量呈指数级增长。结合上述文字，体悟视频内容。 三、PCR技术的实验条件 根据中心法则，DNA复制需要模板、原料、能量和酶等。而高中阶段的PCR学习中，除了以上相关知识点外，还需知道引物设计与缓冲体系。 （一）模板 PCR的模板可以是DNA，也可以是RNA。模板的来源非常广泛，就像从不同的“生命素材库”中获取。它可以是病原体标本，比如病毒、细菌、真菌等，通过检测这些病原体的DNA或RNA，我们就能知道是否感染了相应的疾病；也可以是病理生理标本，像细胞、血液、羊水细胞等，帮助医生了解人体的生理或病理状态；在法医学领域，血斑、精斑、毛发等标本中的DNA，更是成为了破案的关键线索。不过，这些标本在用于PCR之前，需要进行一些处理，就像对原材料进行初步加工。基本要求是除去杂质，并对标本中的核酸进行部分纯化。多数样品需要用SDS和蛋白酶K处理，比如，从动物组织中提取DNA的实验中，首先将组织样品剪碎，加入含有SDS和蛋白酶K的裂解液。SDS能迅速裂解细胞膜和核膜，使细胞内容物释放出来。蛋白酶K在适宜的温度（通常为50至60℃）下作用一段时间，消化与DNA结合的蛋白质以及核酸酶。经过这样的处理后，DNA从细胞中释放出来，并且处于相对纯净的状态，后续可以通过酚、氯仿抽提纯化，最后用乙醇沉淀，就可以得到纯净的DNA了，至此，纯净的DNA就可以作为PCR反应的优质模板了。 （二）原料和能量 dNTP，中文名为脱氧核糖核苷三磷酸。在 PCR 中作用极为重要，具体为：一是提供原料，为DNA聚合酶提供基本单位，按碱基互补配对原则使新链延伸；二是提供能量，其分子中三磷酸基团形成磷酸二酯键时释放能量，推动PCR反应持续。另外，4 种dNTP 浓度比例和绝对浓度至关重要，浓度不等会致碱基错配、非特异性扩增，适当浓度可保证准确性和特异性。 （三）酶 DNA聚合酶无疑是PCR反应的核心。所有的DNA聚合酶都有一个共同的本领，那就是具有5′→3′聚合酶活性，能够按照5'至3’方向，将一个个核苷酸掺入到引物上，让引物不断延伸，最终合成完整的DNA链。在PCR技术中，TaqDNA聚合酶是大家非常熟悉的 “明星酶”，它是从一种嗜热细菌中分离出来的。这种酶拥有极高的热稳定性，能够承受PCR过程中反复的热变性步骤，就像一位耐高温的勇士，在高温环境下依然坚守岗位，保证DNA的合成工作顺利进行。 （四）引物 引物在PCR反应中起着至关重要的作用，就像开启DNA复制大门的钥匙。设计引物时要注意：①从设计引物的长度看：引物不宜过短，否则特异性差，易与非目的片段结合；引物又不宜过长，否则退火时间长，影响反应效率。②从设计引物的结构看：引物内部不能有互补序列，否则会形成发夹结构，阻碍与模板结合及DNA聚合酶的延伸；③从设计引物的关系看：两个引物间不能有互补序列，尤其要避免3′端互补重叠，防止形成引物二聚体，消耗引物，降低扩增效率。④从设计引物的成分比例看，引物中G+C的含量以40至60%为宜。如果G+C太少，扩增效果就不理想，就像钥匙的材质不好，打不开门；但如果G+C过多，又容易出现非特异条带，就像钥匙开错了门，即会影响引物的特异性。 （五）缓冲液 缓冲液pH常为8.0至9.5，以维持 DNA聚合酶的活性。镁离子作为DNA聚合酶活性辅助因子，助dNTP结合到酶活性位点，催化形成磷酸二酯键连接核苷酸成链，还能稳定磷酸盐骨架负电荷，促进引物与模板形成复合物。缓冲液中来自KCl的钾离子可促进引物吸附在模板上。 四、PCR技术在高中阶段的常见应用 （一）重叠延伸PCR 我们知道，基因是由DNA片段组成的，在很多科学研究中，科学家们常常需要把不同的基因片段连接在一起，或者对基因进行一些特定的修改。以前，常用的方法是借助限制酶切和DNA连接酶。这就好比要把两段不同的绳子接在一起，先用剪刀（限制酶）把绳子两端剪出特定的形状，然后再用胶水（DNA 连接酶）把它们粘起来。但这个方法有个大问题，如果找不到合适的 “剪刀口”（酶切位点），或者 “剪刀” 太贵，那这个拼接工作就很难进行下去了。于是，科学家们不断探索，终于发明了重叠延伸 PCR 技术，完美地解决了这些难题。其过程见下图。 过程诠释：引物设计是关键，需设计P1和P2，M1和M2两对引物。并且要保证引物P2与引物M1有部分序列互补。第一轮PCR，分别以含A、B基因的DNA为模板，用对应引物对扩增，得到大量A、B基因片段作为拼接“原材料”。从中筛选出所需要的模板链，进入第二轮PCR。因引物设计使A、B基因片段末端互补，低温时互补末端配对结合，DNA聚合酶延伸连接，就可得到A、B融合基因了。 （二）巢式PCR 巢式 PCR 能有效解决传统 PCR 在目标 DNA 初始量少、样本有杂质干扰时扩增效果不佳以及特异性不足的问题，通过独特的两轮引物设计极大提升扩增特异性与对微量 DNA 的扩增能力 。其过程如下图。 过程诠释：巢式PCR需要设计两轮引物。第一轮引物的作用和传统PCR的引物类似，它们会结合到目标DNA的特定区域，引导DNA聚合酶开始扩增，经过一系列的变性、退火、延伸步骤，得到第一轮扩增产物。这一轮扩增就像是在一片广阔的土地上大致圈定了一个范围。接下来就是巢式PCR的关键——第二轮引物登场。这一轮引物被巧妙地设计在第一轮引物扩增区域的内部，也就是说，它们的结合位点更靠近目标DNA的核心区域，就像是在第一轮圈定的范围内又精准地找到了一个更小的、更关键的区域。然后，以第一轮的扩增产物为模板，用第二轮引物再进行一次PCR扩增。这样做的好处可多了，首先，由于第二轮引物是在第一轮扩增产物的内部进行扩增，所以它能够极大地提高扩增的特异性，减少非目标 DNA 片段的扩增。就好比射箭，第一轮引物射中了一个较大的靶区域，第二轮引物则在这个区域内射中了更精准的靶心，大大提高了命中率。其次，经过两轮扩增，目标 DNA 的量会得到更显著的增加，对于那些初始量极少的目标 DNA，巢式 PCR 也能让它们清晰地呈现在我们面前，就像把微弱的星光聚焦成耀眼的光束。 巢式PCR在高中生物学习题中的情境应用：在医学诊断方面，对于一些难以检测的病原体，像某些病毒、细菌感染，巢式 PCR 能够从患者的血液、组织等样本中，精准地扩增出病原体的特定基因片段，从而帮助医生快速、准确地诊断疾病。哪怕患者体内病原体的含量极低，它也能将其“揪”出来，让疾病无处遁形。例如在艾滋病病毒（HIV）的早期检测中，当患者体内病毒载量还很低时，传统检测方法可能难以发现，但巢式PCR却能敏锐地捕捉到病毒的踪迹，为及时治疗争取宝贵时间。在法医鉴定领域，在犯罪现场，常常只能收集到极其微量的生物样本，如一根头发、一滴血迹。这些样本中的DNA含量少之又少，而且可能还会受到环境因素的污染。巢式 PCR 能够从这些微量且可能受损的DNA中，高效扩增出用于身份识别的关键基因片段，为破案提供重要线索。在遗传学研究中，科学家们利用巢式PCR来研究一些罕见的基因突变。对于那些在基因组中含量极低的突变基因，巢式PCR能够将其放大，便于深入分析这些突变与遗传疾病之间的关系，为攻克遗传性疾病提供有力支持。 （三）大引物PCR 大引物PCR技术克服了传统基因改造手段如化学合成法步骤繁琐、成本高昂，以及限制酶切割连接难寻合适位点、引入多突变位点困难等缺点，为基因改造提供了简便且高效的新途径。比如，我们想把一个己知基因A中的局部序列GGCCAA/CCGGTT，定向改变为GGTTTC/CCAAAG，从而获得想得到的基因A’，其过程如下图。 过程诠释：大引物PCR技术的核心在于巧妙地设计引物。在大引物PCR中，第一轮PCR反应是关键的第一步。我们设计一对引物，其中一个引物（设为引物A）是带有我们期望突变位点的特殊引物，另一个引物（引物B）则是普通引物。以含有目标基因的DNA为模板，经过第二轮PCR反应后，我们会得到一个特殊的PCR产物。这个产物一端含有我们设计的突变位点，它就像是一个特殊的“零件”，由于它相对较大，所以被形象地称为“大引物”。接下来进入第三轮PCR。这时候，我们把第二轮得到的大引物与另一个普通引物（引物C）组合在一起，再次以原始的含有目标基因的DNA为模板进行PCR反应。在这个过程中，大引物凭借其一端的突变位点，与模板DNA的相应区域结合，然后在DNA聚合酶的作用下，延伸出一条完整的、带有突变的新DNA链。经过多轮这样的扩增，我们就能得到大量含有特定突变的目标基因。可以说，大引物PCR技术就像是精心搭建了一座通往基因改造的桥梁，让我们能够轻松地在基因上“书写”我们想要的变化。 （四）荧光定量PCR 我们在高中生物课上学过PCR技术，它能像复印机一样，在体外将极微量的DNA大量扩增，帮助我们研究特定的DNA片段。但传统PCR存在一个明显的短板，它就像一个只知道埋头复制的机器，完成扩增后，我们只能知道有没有扩增出目标DNA，却无法确切地知晓起始模板中目标DNA的含量。这就好比我们烤了一堆面包，却不知道最初用了多少面粉一样。而在许多生物学研究中，比如在某些疾病的研究过程时，研究人员要确晓某些基因表达量的前后变化，或某些病原体初始的量等相关数据，这些数据对问题的解决至关重要。于是，应运而生的荧光定量PCR技术，就能解决传统PCR的这一不足。其过程如下图。 过程诠释：荧光定量 PCR 技术的核心原理融合了PCR的扩增能力与荧光检测技术。荧光探针是一段特殊设计的寡核苷酸序列，其一端连接着荧光基团，另一端连接着淬灭基团。当探针完整时，由于淬灭基团的存在，荧光基团发出的荧光会被淬灭，检测不到荧光信号。而当PCR反应进行时，TaqDNA聚合酶在延伸DNA链的过程中，遇到与模板结合的荧光探针，会发挥其5'→3'外切酶活性，将探针切断。此时，荧光基团与淬灭基团分离，荧光基团便会发出荧光，而且随着PCR反应的进行，扩增出的目标DNA越来越多，被切断的探针也越多，荧光信号就会越来越强。通过实时监测荧光信号的变化，仪器就能根据预先设定的标准曲线，精确计算出起始模板中目标DNA的含量。这就如同通过测量不同重量物品在天平上产生的刻度变化，对照标准重量刻度表，从而准确得出物品的重量。 学科网（北京）股份有限公司 $$