专题17 基因工程 （山东专用）-【好题汇编】5年（2021-2025）高考1年模拟生物真题分类汇编

专题17 基因工程 五年考情 考情分析 基因工程 2025年山东卷第25题 2024年山东卷第13题 2024年山东卷第25题 2023年山东卷第25题 2022年山东卷第13题 2022年山东卷第25题 2021年山东卷第13题 2021年山东卷第25题 近五年山东高考生物试卷，基因工程考点考查频繁。重点考查基因工程的基本工具，如限制酶、DNA连接酶；基本操作程序，像目的基因获取、表达载体构建等，常结合实际案例，考查学生知识运用与分析能力。题目难度系数大；其中启动子的插入位点和插入方向、报告基因的表达等都需要学生有很强的理解信息、获取信息的能力、以及综合运用知识解决问题的科学思维和科学探究能力，通过基因工程考查学生的结构与功能观。 一、单选题 1．（2024·山东·高考真题）关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法正确的是（　　） A．整个提取过程中可以不使用离心机 B．研磨液在4℃冰箱中放置几分钟后，应充分摇匀再倒入烧杯中 C．鉴定过程中DNA双螺旋结构不发生改变 D．仅设置一个对照组不能排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰 【答案】A 【难度】0.65 【知识点】DNA的粗提取及鉴定 【分析】DNA的粗提取与鉴定的实验原理是： ①DNA的溶解性，DNA和蛋白质等其他成分在不同 浓度的氯化钠溶液中的溶解度不同，利用这一特点可 以选择适当浓度的盐溶液可以将DNA溶解或析出， 从而达到分离的目的; ②DNA不溶于酒精溶液，细胞中的某些蛋白质可以溶解于酒精，利用这一原理可以将蛋白质和DNA进一步分离; ③在沸水浴的条件下DNA遇二苯胺会呈现蓝色。 【详解】A、在DNA的粗提取与鉴定实验中，可将获得的研磨液用纱布过滤后，在4℃的冰箱中放置几分钟，再取上清液，也可以直接将研磨液用离心机进行离心后取上清液，A正确； B、研磨液在4℃冰箱中放置几分钟后，DNA在上清液中，应取上清液倒入烧杯中，B错误； C、鉴定过程中用沸水浴加热，DNA双螺旋结构会发生改变，C错误； D、加入二苯胺试剂后沸水浴处理的时间要在5分钟以上，且要等到冷却后再观察结果，这样才可以观察到较为明显的显色反应，仅设置一个对照组可以排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰，D错误。 故选A。 2．（2022·山东·高考真题）关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法错误的是（    ） A．过滤液沉淀过程在4℃冰箱中进行是为了防止DNA降解 B．离心研磨液是为了加速DNA的沉淀 C．在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色 D．粗提取的DNA中可能含有蛋白质 【答案】B 【难度】0.65 【知识点】DNA的粗提取及鉴定 【分析】DNA的粗提取与鉴定的实验原理是：①DNA的溶解性，DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的氯化钠溶液中的溶解度不同，利用这一特点可以选择适当浓度的盐溶液可以将DNA溶解或析出，从而达到分离的目的；②DNA不溶于酒精溶液，细胞中的某些蛋白质可以溶解于酒精，利用这一原理可以将蛋白质和DNA进一步分离；③在沸水浴的条件下DNA遇二苯胺会呈现蓝色。 【详解】A、低温时DNA酶的活性较低，过滤液沉淀过程在4℃冰箱中进行是为了防止DNA降解，A正确； B、离心研磨液是为了使细胞碎片沉淀，B错误； C、在沸水浴条件下，DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色，C正确； D、细胞中的某些蛋白质可以溶解于酒精，可能有蛋白质不溶于酒精，在95%的冷酒精中与DNA一块儿析出，故粗提取的DNA中可能含有蛋白质，D正确。 故选B。 3．（2021·山东·高考真题）粗提取 DNA 时，向鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水并搅拌，过滤后所得滤液进行下列处理后再进行过滤，在得到的滤液中加入特定试剂后容易提取出 DNA相对含量较高的白色丝状物的处理方式是（    ） A．加入适量的木瓜蛋白酶 B．37～40℃的水浴箱中保温 10～15 分钟 C．加入与滤液体积相等的、体积分数为 95%的冷却的酒精 D．加入 NaCl 调节浓度至 2mol/L→过滤→调节滤液中 NaCl 浓度至 0．14mol/L 【答案】A 【难度】0.85 【知识点】DNA的粗提取及鉴定 【分析】DNA粗提取和鉴定的原理：（1）DNA的溶解性：DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同；DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精；DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性。（2）DNA的鉴定：在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色。 【详解】A、木瓜蛋白酶可以水解DNA中的蛋白质类杂质，由于酶具有专一性，不能水解DNA，过滤后在得到的滤液中加入特定试剂后容易提取出 DNA相对含量较高的白色丝状物，A正确； B、37～40℃的水浴箱中保温 10～15 分钟不能去除滤液中的杂质，应该放在60~75℃的水浴箱中保温 10～15 分钟，使蛋白质变性析出，B错误； C、向鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水并搅拌，过滤后在得到的滤液中加入与滤液体积相等的、体积分数为 95%的冷却的酒精，此时DNA析出，不会进入滤液中，C错误； D、加入 NaCl 调节浓度至 2mol/L→过滤→调节滤液中 NaCl 浓度至 0．14mol/L，DNA在0．14mol/L的NaCl溶液中溶解度小，DNA析出，不会进入滤液中，D错误。 故选A。 【点睛】 二、解答题 4．（2025·山东·高考真题）种子休眠是抵御穗发芽的一种机制。通过对Ti质粒的改造，利用农杆菌转化法将Ti质粒上的T-DNA随机整合到小麦基因组中，筛选到2个种子休眠相关基因的插入失活纯合突变体。与野生型相比，突变体种子的萌发率降低。小麦基因组序列信息已知。 (1)Ti质粒上与其在农杆菌中的复制能力相关的结构为 。选用图甲中的SmaI对抗除草剂基因X进行完全酶切，再选择SmaI和 对Ti质粒进行完全酶切，将产生的黏性末端补平，补平时使用的酶是 。利用DNA连接酶将酶切后的包含抗除草剂基因X的片段与酶切并补平的Ti质粒进行连接，构建重组载体，转化大肠杆菌；经卡那霉素筛选并提取质粒后再选用限制酶 进行完全酶切并电泳检测，若电泳结果呈现一长一短2条带，较短的条带长度近似为 bp，则一定为正向重组质粒。 (2)为证明这两个突变体是由于T-DNA插入到小麦基因组中同一基因导致的，提取基因组DNA，经酶切后产生含有T-DNA的基因组片段（图乙）。在此酶切过程中，限于后续PCR难以扩增大片段DNA，最好使用识别序列为 （填“4”“6”或“8”）个碱基对的限制酶，且T-DNA中应不含该酶的酶切位点。需首先将图乙的片段 ，才能利用引物P1和P2成功扩增未知序列。PCR扩增出未知序列后，进行了一系列操作，其中可以判断出2条片段的未知序列是否属于同一个基因的操作为 （填“琼脂糖凝胶电泳”或“测序和序列比对”）。 (3)通过农杆菌转化法将构建的含有野生型基因的表达载体转入突变植株，如果检测到野生型基因， （填“能”或“不能”）确定该植株的表型为野生型。 【答案】(1) 复制原点 XbaI DNA聚合酶 SmaI和SpeI 550bp (2) 4 环化 测序和序列比对 (3)不能 【难度】0.15 【知识点】PCR扩增的原理与过程、DNA重组技术的基本工具、基因表达载体的构建、目的基因的检测与鉴定 【分析】基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成； （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等； （3）将目的基因导入受体细胞； （4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术；个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】（1）DNA复制的起点是复制原点，因此Ti质粒上与其在农杆菌中的复制能力相关的结构为复制原点。根据SmaI限制酶识别序列可知，酶切形成的是平末端，若质粒仅用SmaI酶切，抗除草剂基因和质粒可以正向接入也可以反向接入，且无法区分，为了确定是否是正向重组质粒，因此在构建重组质粒时需要用到另一种限制酶，抗除草剂因需要插入到启动子和终止子之间，因此不能选择BamHI，因为该限制酶会破坏终止子，因此可选择XbaI和SmaI进行酶切，XbaI酶切会形成黏性末端，需要用DNA聚合酶聚合脱氧核糖核苷酸单体将产生的黏性末端补平（可使重组质粒最小，同时PstI酶切后产生的黏性末端无法用DNA聚合酶抹平，因为DNA聚合酶只能从3'延伸子链）。利用DNA连接酶将酶切后的包含抗除草剂基因X的片段与酶切并补平的Ti质粒进行连接，构建重组载体，转化大肠杆菌。重组的T-DNA片段上含有一个SmaI酶切位点和一个SpeI酶切位点，可以选择用SmaI和SpeI进行酶切，转录的方向是从模板的3'→5'，和质粒对应的方向相同，经过两种酶的酶切后并电泳呈现一长一短2条带，较短的条带长度近似为550bp，若反向接，较短的条带长度近似为200bp。 （2）由于后续PCR难以扩增大片段DNA，所以最好选择识别序列为4个碱基的限制酶，原因是识别序列越短，酶切位点越多，切割产生的片段可能越小，更有利于后续的PCR扩增。由于引物是根据已知序列设计的，但此时需要扩增未知序列，因此可以将图乙的片段环化，这样就可以利用现有引物扩增出未知序列。为了确定未知序列是否是同一基因，需要准确比对其上的碱基序列，因此对同一个基因的操作为测序和序列比对。 （3）突变植株成功导入野生型基因，但野生型基因未必可以正常表达，因此不能确定该植株的表型为野生型。 5．（2024·山东·高考真题）研究发现基因L能够通过脱落酸信号途径调控大豆的逆境响应。利用基因工程技术编辑基因L，可培育耐盐碱大豆品系。在载体上的限制酶BsaI切点处插入大豆基因L的向导DNA序列，将载体导入大豆细胞后，其转录产物可引导核酸酶特异性结合基因组上的目标序列并发挥作用。载体信息、目标基因L部分序列及相关结果等如图所示。 (1)用PCR技术从大豆基因组DNA中扩增目标基因L时，所用的引物越短，引物特异性越 （填“高”或“低”）。限制酶在切开DNA双链时，形成的单链突出末端为黏性末端，若用BsaI酶切大豆基因组DNA，理论上可产生的黏性末端最多有 种。载体信息如图甲所示，经BsaI酶切后，载体上保留的黏性末端序列应为5'- -3'和5'- -3'。 (2)重组载体通过农杆菌导入大豆细胞，使用抗生素 筛选到具有该抗生素抗性的植株①～④。为了鉴定基因编辑是否成功，以上述抗性植株的DNA为模板，通过PCR扩增目标基因L，部分序列信息及可选用的酶切位点如图乙所示，PCR产物完全酶切后的电泳结果如图丙所示。据图可判断选用的限制酶是 ，其中纯合的突变植株是 （填序号）。 (3)实验中获得1株基因L成功突变的纯合植株，该植株具有抗生素抗性，检测发现其体细胞中只有1条染色体有T-DNA插入。用抗生素筛选这个植株的自交子代，其中突变位点纯合且对抗生素敏感的植株所占比例为 ，筛选出的敏感植株可用于后续的品种选育。 【答案】(1) 低 256 5'-CAAT-3' 5'-GTTT-3' (2) 卡那霉素 Sac Ⅰ ④ (3)1/4 【难度】0.65 【知识点】基因分离定律的实质和应用、DNA重组技术的基本工具、目的基因的检测与鉴定 【分析】【关键能力】 （1）信息获取与加工 题干关键信息 所学知识 信息加工 黏性末端的种类 基因工程的工具 BsaI切割产生的黏性末端是NNNN，四个碱基最多可能有256种排列顺序 抗生素筛选 目的基因的检测与鉴定 重组载体通过农杆菌导入大豆细胞当中的片段包含了卡那霉素抗性基因，因此可以通过使用卡那霉素筛选到具有该抗生素抗性的植株 （2）逻辑推理与论证 【详解】（1）引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，用于PCR的引物长度通常为20~30个核苷酸。由此可知，在利用PCR技术从大豆基因组DNA中扩增目的基因时，所用的引物越短，则引物的特异性就越低。根据题意可知，限制酶在切开DNA双链时，形成的单链突出末端为黏性末端，若用BsaI酶切大豆基因组DNA，图中给出的只是载体信息，大豆基因组无法从图中看出。只能根据理论来推测，BsaI切割产生的黏性末端是NNNN，四个碱基最多可能有256种排列顺序，故答案应为 256。根据图甲所示的载体信息，经BsaI酶切后，载体上保留的黏性末端序列应为5'-CAAT-3'、5'-GTTT-3'。 （2）根据图示信息可知，重组载体通过农杆菌导入大豆细胞当中的片段包含了卡那霉素抗性基因，因此可以通过使用卡那霉素筛选到具有该抗生素抗性的植株。根据图甲可知，目标基因L的目标序列跟突变序列之间的差异只有在Sac Ⅰ酶切位点上存在差异，BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ这两个酶切位点完全相同，根据图丙及题意可知，所展示的电泳结果可知，要以上述抗性植株的DNA为模板，通过PCR扩增目标基因L，并对PCR产物完全酶切后进行电泳从而判断植株含有的是目标序列还是突变序列，因此只能选用限制酶Sac Ⅰ，限制酶Sac Ⅰ在突变序列存在酶切位点，但是目标序列没有，因此经过该酶酶切后突变序列的电泳条带会出现两条，目标序列是一条带，根据图丙结果可知，只有④为纯和突变的植株。 （3）根据题意可知，在实验当中获得了一株基因l成功突变的纯合之中，已知该植株具有抗生素抗性，经过检测发现其体细胞中只有一条染色体含有T-DNA插入。根据图示可知，抗生素抗性基因在T-DNA片段上，因此如果用抗生素来筛选该植株进行自交，可知其配子中含有抗生素抗性基因的比例为1/2，不含T-DNA（对抗生素敏感）的配子比例为1/2，因此突变位点纯合且对抗生素敏感的植株所占比例应该为1/2×1/2=1/4，纯突变位点纯合且具有抗生素抗性的植株所占比例应该为3/4，可以筛选出的敏感植株可用于后续的品种选育。 6．（2023·山东·高考真题）科研人员构建了可表达J-V5融合蛋白的重组质粒并进行了检测，该质粒的部分结构如图甲所示，其中V5编码序列表达标签短肽V5。    (1)与图甲中启动子结合的酶是 。除图甲中标出的结构外，作为载体，质粒还需具备的结构有 （答出2个结构即可）。 (2)构建重组质粒后，为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，需进行PCR检测，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物 。已知J基因转录的模板链位于b链，由此可知引物F1与图甲中J基因的 （填“a链”或“b链”）相应部分的序列相同。 (3)重组质粒在受体细胞内正确表达后，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表达水平，结果如图乙所示。其中，出现条带1证明细胞内表达了 ，条带2所检出的蛋白 （填“是”或“不是”）由重组质粒上的J基因表达的。 【答案】(1) RNA聚合酶 限制酶切割位点、标记基因、复制原点等 (2) F2和R1或F1与R2 a链 (3) J-V5融合蛋白 不是 【难度】0.65 【知识点】PCR扩增的原理与过程、DNA重组技术的基本工具、基因表达载体的构建、目的基因的检测与鉴定 【分析】基因工程的关键步骤是构建基因表达载体，基因表达载体主要由启动子、目的基因、标记基因和终止子组成，其中标记基因用于筛选重组DNA分子，可以是四环素、氨苄青霉素等抗性基因，也可以是荧光蛋白基因或产物能显色的基因。 【详解】（1）基因表达载体的构建启动子是为了启动下游基因的“表达”，表达首先需要转录，因此RNA聚合酶识别和结合的部位才是转录的起始。作为运载体必须具备的条件：①要具有限制酶的切割位点；②要有标记基因（如抗性基因），以便于重组后重组子的筛选；③能在宿主细胞中稳定存在并复制；④是安全的，对受体细胞无害，而且要易从供体细胞分离出来，图中甲有启动子和终止子等，因此质粒还需具备的结构有限制酶的切割位点、标记基因、复制原点等。 （2）据图甲可知，引物F2与R1或F1与R2结合部位包含J基因的碱基序列，因此推测为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，进行PCR检测时，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物F2和R1或F1与R2。b是模板链，而根据图上启动子和终止子的位置可知转录方向是图上从左向右，对应的模板链方向应该是3’-5'，非模板链（也就是a链）是5'-3'；考虑到DNA复制的方向是子链的5’-3'，引物基础上延伸的方向肯定是5'-3'，所以引物结合的单链其方向是3'-5'；图中F1是前引物，在左侧，所以其配对的单链是3’-5'的b链，故其序列应该与a链相应部分的序列相同。 （3）据图乙可知，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测，均出现条带1，说明条带1是J-V5融合蛋白。抗J蛋白抗体检测出现条带2，抗V5抗体检测不出现条带2，说明条带2所检出的蛋白不是由重组质粒上的融合的J基因表达的。 7．（2022·山东·高考真题）某种类型的白血病由蛋白P引发，蛋白UBC可使P被蛋白酶识别并降解，药物A可通过影响这一过程对该病起到治疗作用。为探索药物A治疗该病的机理，需构建重组载体以获得融合蛋白FLAG-P和FLAG-P△。P△是缺失特定氨基酸序列的P，FLAG是一种短肽，连接在P或P△的氨基端，使融合蛋白能与含有FLAG抗体的介质结合，但不影响P或P△的功能。 (1)为构建重组载体，需先设计引物，通过PCR特异性扩增P基因。用于扩增P基因的引物需满足的条件是 、为使PCR产物能被限制酶切割，需在引物上添加相应的限制酶识别序列，该限制酶识别序列应添加在引物的 （填“3'端”或“5'端”）。 (2)PCR扩增得到的P基因经酶切连接插入载体后，与编码FLAG的序列形成一个融合基因，如图甲所示，其中“ATGTGCA”为P基因编码链起始序列。将该重组载体导入细胞后，融合基因转录出的mRNA序列正确，翻译出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正确，但P基因对应的氨基酸序列与P不同。据图甲分析，出现该问题的原因是 。修改扩增P基因时使用的带有EcoRⅠ识别序列的引物来解决该问题，具体修改方案是 。 (3)融合蛋白表达成功后，将FLAG-P、FLAG-P△、药物A和UBC按照图乙中的组合方式分成5组。各组样品混匀后分别流经含FLAG抗体的介质，分离出与介质结合的物质并用UBC抗体检测，检测结果如图丙所示。已知FLAG-P和FLAG-P△不能降解UBC，由①②③组结果的差异推测，药物A的作用是 ；由②④组或③⑤组的差异推测，P△中缺失的特定序列的作用是 。 (4)根据以上结果推测，药物A治疗该病的机理是 。 【答案】(1) 能与P基因母链的一段碱基序列互补配对、短单链核酸 5'端 (2) P基因编码链的第一个碱基与EcoRⅠ识别序列的最后两个碱基编码一个氨基酸，导致mRNA的密码子被错位读取。 在引物中的EcoRⅠ识别序列3'端添加1个碱基 (3) 增强FLAG-P与UBC的结合 参与P与UBC的结合 (4)药物A通过增强P与UBC结合促进P降解。 【难度】0.15 【知识点】遗传信息的转录、遗传信息的翻译、PCR扩增的原理与过程、目的基因的检测与鉴定 【分析】PCR过程：①变性：当温度上升到90℃以上时，双链DNA解旋为单链；②温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合；③延伸：当温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。 【详解】（1）引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核苷酸，因此设计扩增P基因的引物，需要两种引物分别与两条模板链3'端的碱基序列互补。DNA聚合酶延伸时，是将脱氧核苷酸加到引物的3'端，为了不破坏目的基因，该限制酶识别序列应添加在引物的5'端。 （2）融合基因转录出的mRNA序列正确，翻译出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正确，但P基因对应的氨基酸序列与P不同，说明P基因翻译时出错。由图可看出，在转录出的mRNA中，限制酶识别序列对应的最后两个碱基与P基因对应的第一个碱基构成一个密码子，导致读码框改变，翻译出的氨基酸序列改变，可通过在EcoRⅠ识别序列3'端添加1个碱基，使其碱基数目加上FLAG的碱基数目为3的倍数，这样能保证P基因转录出的mRNA上的读码框不改变，能够正常翻译。 （3）①组仅添加UBC，处理后，用UBC抗体检测，不出现杂交带；②组添加UBC和FLAG-P，出现杂交带；③组添加UBC、药物A和FLAG-P，杂交带更加明显，说明药物A的作用是促进UBC与FLAG-P的结合。由②④组或③⑤组的差异在于②③组使用FLAG-P，出现杂交带；④⑤组使用FLAG-P△，不出现杂交带，据此推测P△中缺失的特定序列是与UBC结合的关键序列。 （4）根据（3）的分析推测，药物A促进UBC与FLAG-P的结合，从而促进蛋白P被蛋白酶识别并降解，达到治疗的目的。 【点睛】本题难点在于分析翻译出错的原因，需要结合翻译相关知识对图进行仔细分析方可得出结论。 8．（2021·山东·高考真题）人类γ基因启动子上游的调控序列中含有 BCL11A 蛋白结合位点，该位点结合 BCL11A 蛋白后，γ基因的表达被抑制。通过改变该结合位点的序列，解除对γ基因表达的抑制，可对某种地中海贫血症进行基因治疗。科研人员扩增了γ基因上游不同长度的片段，将这些片段分别插入表达载体中进行转化和荧光检测，以确定 BCL11A 蛋白结合位点的具体位置。相关信息如图所示。 （1）为将扩增后的产物定向插入载体指导荧光蛋白基因表达，需在引物末端添加限制酶识别序列。据图可知，在 F1～F7末端添加的序列所对应的限制酶是 ，在 R 末端添加的序列所对应的限制酶是 。本实验中，从产物扩增到载体构建完成的整个过程共需要 种酶。 （2）将构建的载体导入除去 BCL11A 基因的受体细胞，成功转化后，含 F1～F6与 R 扩增产物的载体表达荧光蛋白，受体细胞有荧光，含 F7与 R 扩增产物的受体细胞无荧光。含 F7 与 R 扩增产物的受体细胞无荧光的原因是 。 （3）向培养液中添加适量的雌激素，含 F1～F4与 R 扩增产物的受体细胞不再有荧光，而含 F5～F6与 R 扩增产物的受体细胞仍有荧光。若γ基因上游调控序列上与引物序列所对应的位置不含有 BCL11A 蛋白的结合位点序列，据此结果可推测，BCL11A 蛋白结合位点位于 ，理由是 。 【答案】 SalI EcoRI 6 F7与R扩增产物不含完整的启动子，荧光蛋白基因不表达 引物 F4 与 F5 在调控序列上所对应序列之间的区段上 根据有无荧光情况判断，F1～F4 与 R 扩增产物上均有结合位点，因此结合位点位于 F4 所对应调控序列的下游（右侧）；F5～F6 与 R 扩增产物上均无结合位点，可知结合位点位于 F5 所对应调控序列的上游（左侧），所以结合位点位于引物 F4 与 F5 在调控序列上所对应序列之间的区段上 【难度】0.4 【知识点】DNA重组技术的基本工具、基因表达载体的构建 【分析】1、据题意可知，科研人员扩增了γ基因上游不同长度的片段，据图中注释可知，F1~F7以及R位置均为引物，故扩增的序列分别是引物F1和引物R之间的序列，引物F2和引物R之间的序列，引物F3和引物R之间的序列，引物F4和引物R之间的序列，引物F5和引物R之间的序列，引物F6和引物R之间的序列，引物F7和引物R之间的序列； 2、据图中对限制酶的注释可知，限制酶Mun Ⅰ 识别并切割后的黏性末端与限制酶EcoR Ⅰ 识别并切割后的黏性末端相同，限制酶Xho Ⅰ 识别并切割后的黏性末端与限制酶Sal Ⅰ 识别并切割后的黏性末端相同。 【详解】（1）据题意可知，需要将扩增后的产物定向插入并指导荧光蛋白基因的表达，则含有启动子的扩增后的产物读取方向与荧光蛋白基因的读取方向一致，故扩增后的产物中的R端与荧光蛋白基因中限制酶Mun Ⅰ 识别序列端结合，才能保证扩增后的产物定向插入并指导荧光蛋白基因的表达。要做到定向插入，需要引物末端两端添加限制酶的识别序列，且被限制酶识别并切割后，两端的黏性末端不能相同。而扩增后的产物中可能含有Mun Ⅰ 和 Xho Ⅰ 的识别位点，故在引物末端添加限制酶的识别序列不能被限制酶Mun Ⅰ 和Xho Ⅰ 所识别，故应该选用添加限制酶EcoR Ⅰ 和限制酶Sal Ⅰ 识别序列，据图中对限制酶的注释可知，限制酶Mun Ⅰ 识别并切割后的黏性末端与限制酶EcoR Ⅰ 识别并切割后的黏性末端相同，故 R 末端添加的序列所对应的限制酶是EcoR Ⅰ ，在 F1～F7 末端添加的序列所对应的限制酶是Sal Ⅰ ；荧光蛋白基因中含有限制酶EcoR Ⅰ 的识别位点，故对载体使用限制酶Mun Ⅰ 和Xho Ⅰ 切割。综上所述，对载体使用限制酶Mun Ⅰ 和Xho Ⅰ 切割，对扩增后的产物用限制酶EcoR Ⅰ 和限制酶Sal Ⅰ 识别序列，然后在DNA连接酶的催化作用下，连接形成重组载体；产物扩增中需要使用Taq酶催化，合成更多的产物，故从产物扩增到载体构建完成的整个过程共需要6种酶，分别是Taq酶、限制酶EcoR Ⅰ 、限制酶Sal Ⅰ、限制酶Mun Ⅰ 、限制酶Xho Ⅰ 、DNA连接酶； （2）受体细胞中已经除去 BCL11A 基因，故扩增产物中的 BCL11A 蛋白结合位点，不会抑制荧光蛋白基因的表达；基因的表达需要RNA聚合酶与启动子结合，才能完成荧光蛋白基因的转录过程；含 F1～F6与 R 扩增产物的载体表达荧光蛋白，受体细胞有荧光，含 F7 与 R 扩增产物的受体细胞无荧光，则可能是F7与R扩增产物不含完整的启动子，荧光蛋白基因不表达； （3）向培养液中添加适量的雌激素，此时重组载体上的BCL11A基因表达，产生 BCL11A 蛋白， BCL11A 蛋白与BCL11A 蛋白结合位点结合后，导致荧光蛋白基因被抑制；含 F1～F4 与 R 扩增产物的受体细胞不再有荧光，则说明BCL11A 蛋白结合位点结合后在引物F4与引物R之间的序列上；含 F5～F6 与 R 扩增产物的受体细胞仍有荧光，则说明BCL11A 蛋白结合位点结合后在引物F5的上游序列，故据此结果可推测，BCL11A 蛋白结合位点位于引物 F4 与 F5 在调控序列上所对应序列之间的区段上。 【点睛】对基因工程中PCR技术的掌握，对基因工程的第二步，基因表达载体的构建的过程的分析，双酶切法的应用，限制酶的作用和切割特点，是解决本题的关键。 一、单选题 1．（2025·山东潍坊·三模）融合PCR技术采用具有互补末端的引物，形成具有重叠链的PCR产物，通过PCR产物重叠链的延伸，从而将不同来源的任意DNA片段连接起来（如图）。下列说法错误的是（    ） A．基因甲至少经3个循环才能获得含引物P2的双链等长DNA B．不能为提高扩增效率把四种引物同时加入一个扩增体系 C．图中融合PCR第一步的两条链重叠部位可互相作为另一条链的引物 D．经融合PCR获得64个融合基因至少消耗63个引物P4 【答案】D 【难度】0.65 【知识点】PCR扩增的原理与过程 【分析】PCR是利用DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链，低温（经常是60°C左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72°C左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。基于聚合酶制造的PCR仪实际就是一个温控设备，能在变性温度，复性温度，延伸温度之间很好地进行控制。 【详解】A、我们根据PCR扩增后的产物类型分类可知，构成DNA的两条链的长度不同，将PCR技术中的DNA分成三种（第一种是：两条链都是最短的（即等长的DNA）；第二种是：最长的+中长的；第三种是：中长的+最短的；那么要求等长的DNA的数量，我们就用n轮后产生的所有DNA的数量减掉第二种和第三种情况的DNA的数量即可，而第二中和第三种都含有中长的链，所有我们只要找到中长链的数量即可。在第一次复制完成后，中长的有2个，在第二次复制完成后，中长的有2+2个，在第三次复制完成后，中长链有2+2+2个，那么，n次复制完成后共有2+2+2+2+2+2+2+2+2............=2n，既为n个2相加，也就是经过n次复制后，不符合要求的（就是两条链不等长的DNA）共有2n个，而总的DNA为2n，所有经过n轮循环后，等长的DNA为2n-2n＞0，即n≥3，所以基因甲至少经3个循环才能获得含引物P2的双链等长DNA，A正确； B、在融合PCR 技术里，甲基因扩增依赖引物 P1、P2，乙基因扩增依赖引物 P3、P4。不同基因扩增所需引物特异性结合各自模板链，且反应条件（如引物与模板的适配性等 ）有差异，若放同一反应体系，引物间易相互干扰（P2和P3存在互补序列），无法精准、高效完成甲、乙基因各自扩增，所以不能为提高扩增效率把四种引物同时加入一个扩增体系，B正确； C、结合图示可知，融合PCR的第一步两条链重叠部位即互补配对，可互为另一条链的引物，C正确； D、若融合PCR获得了64个融合基因，引物数目和新合成的子链数目相同，即该过程消耗了64×2-2=126个引物，该过程消耗了126÷2=63个引物P4，但在融合PCR的第一步前还进行了一次利用引物P4扩增DNA链的过程，所以该过程共消耗了引物63+1=64个，D错误。 故选D。 2．（2025·山东临沂·三模）下列有关“DNA粗提取与鉴定”、“DNA片段的扩增及电泳鉴定”实验的叙述，错误的是（　　） A．设置一组加二苯胺但是不加DNA的对照组用来排除二苯胺受热变蓝的可能 B．提取到的白色丝状物直接与一定浓度的二苯胺溶液混合，沸水浴5min后变蓝 C．电泳实验中待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时停止电泳 D．琼脂糖凝胶中加入核酸染料，便于在300nm的紫外灯下检测扩增产物 【答案】B 【难度】0.65 【知识点】DNA的粗提取及鉴定的方法 【分析】DNA不溶于酒精，而某些蛋白质溶于酒精；鉴定DNA时，需要先将DNA溶解在NaCl溶液中，再与二苯胺溶液混合，并在水浴加热条件下呈现蓝色。 【详解】A、设置对照组的目的是为了排除二苯胺试剂本身或其他实验条件可能产生的颜色变化，从而确保实验结果的特异性，A正确； B、将丝状物溶于2moL的5mL的NaCl溶液中，然后向试管中加入4mL的二苯胺试剂，沸水浴加热5min，试管冷却后溶液呈现 蓝色，B错误； C、电泳缓冲液加入电泳槽，待指示剂前沿迁移至凝胶边缘时停止电泳，C正确； D、在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化，稍冷却后加入适量核酸染料混匀，便于在300nm的紫外灯下检测扩增产物，D正确。 故选B。 3．（2025·山东济南·二模）毕赤酵母是一种能直接利用甲醇的微生物，其含有的醇氧化酶基因(AOX1)强效启动子在甲醇存在时被激活，可以驱动外源基因的高效表达。人体蛋白MT1-MMP定位在细胞膜上，并在多种肿瘤中被高表达出，MT1-MMP能促进肿瘤转移。为进一步研究肿瘤转移机制，科研人员将MT1-MMP基因转化至毕赤酵母，先将转基因个体进行低密度发酵，然后再进行高密度发酵，最终获得目标蛋白。下列相关说法正确的是（    ） A．转基因毕赤酵母和大肠杆菌作为发酵菌种都具有发酵周期短的优点 B．目标蛋白的产量受发酵培养基成分、甲醇、温度、pH的影响 C．可将MT1-MMP基因插入AOX1中以便通过甲醇调控基因表达 D．甲醇的作用是作为碳源和氮源以及诱导目标蛋白的表达 【答案】B 【难度】0.65 【知识点】遗传信息的翻译、基因表达载体的构建、发酵工程的基本环节 【分析】微生物发酵受温度、pH、溶解氧以及发酵培养基的成分等的影响。 【详解】A、大肠杆菌是原核生物，无法对合成的目标蛋白进行加工，不能作为该实验的目标菌种，A错误； B、发酵培养基的成分可以提供微生物生长和代谢所需的营养物质，甲醇可以激活醇氧化酶基因强效启动子从而影响目标蛋白的表达，温度和pH会影响微生物细胞内酶的活性，进而影响微生物的代谢，所以发酵培养基成分、甲醇、温度、pH均会影响目标蛋白的产量，B正确； C、将MT1-MMP基因插入AOX1中会破坏醇氧化酶基因AOX1的结构，应该将MT1-MMP基因插入含有AOX1强效启动子的载体上，这样在甲醇存在时，AOX1启动子被激活，从而驱动MT1-MMP基因高效表达，C错误； D、甲醇含有的是C、H、O元素，不含氮元素，因此甲醇无法作为氮源，D错误。 故选B。 4．（2025·山东青岛·二模）CRISPR/Cas9系统包含向导RNA（gRNA）和核酸酶Cas9，可以对哺乳动物细胞进行基因组编辑。编辑时，Cas9蛋白在gRNA的引导下，结合基因组的特定位点并进行切割。科研人员利用图中gRNA和Cas9共表达质粒，对体外培养的小鼠细胞中A基因的表达进行调控。下列说法错误的是（　　）    A．可以依据A基因的部分序列设计共表达质粒中的编码gRNA序列 B．编码gRNA的序列需要整合到受体细胞基因组DNA上才能发挥作用 C．导入该质粒后使用含潮霉素的液体培养基筛选受体细胞 D．用抗原—抗体杂交技术检测结果为部分细胞A蛋白表达量降低 【答案】B 【难度】0.65 【知识点】基因表达载体的构建、目的基因的检测与鉴定、基因工程的操作程序综合 【分析】1、CRISPR/Cas9系统基因编辑技术是利用该基因表达系统中的引导RNA能识别并结合特定的DNA序列，从而引导Cas9蛋白结合到相应位置并剪切DNA，最终实现对靶基因序列的编辑。由于其他DNA序列也含有与引导RNA互补配对的序列，造成引导RNA错误结合而出现脱靶现象。 2、Ti质粒是农杆菌中的一种质粒，其上有T-DNA，把目的基因插入Ti质粒的T-DNA中是利用了T-DNA可转移至受体细胞并整合到受体细胞染色体DNA分子上。 【详解】A、由图知，gRNA序列中插入了A基因片段，故可以依据A基因的部分序列设计共表达质粒中的编码gRNA序列，A正确； B、编码gRNA的序列不需要整合到受体细胞基因组DNA上就能发挥作用，其作用的对象是受体细胞DNA中的特定基因，B错误； C、重组质粒中标记基因为潮霉素抗性基因，所以导入该质粒后使用含潮霉素的液体培养基筛选受体细胞，能存活的即为导入了质粒的，C正确； D、检测蛋白质的表达用抗原—抗体杂交技术，部分细胞A基因切除后A蛋白表达量降低，D正确。 故选B。 5．（2025·山东济南·二模）单亲二体(UPD)是指体细胞中某对同源染色体来自同一亲本，其它染色体组成正常的个体，其染色体组成是2n。微卫星DNA(STR)的核心序列为2-6个碱基，重复次数和分布个数因染色体而异，可以随染色体稳定地遗传给下一代。可使用STR检测技术对UPD进行诊断：先在各条染色体上找到STR区域，在STR区域的两侧设计PCR引物，每对引物当中有一条是带荧光标记的，在同一体系中进行PCR得到带有不同荧光标记的扩增产物，经电泳后被检测到，然后进行比对、确认。下列说法错误的是（    ） A．同一体系中进行PCR使用的引物的复性温度应大致相同 B．用含有核酸染料的载样缓冲液来鉴定扩增得到的PCR产物 C．UPD现象可能会导致隐性遗传病以显性方式传递 D．检测过程需要分析多个STR位点以确定是否为UPD 【答案】B 【难度】0.65 【知识点】PCR扩增的原理与过程 【分析】PCR技术：（1）概念：PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术。（2）原理：DNA复制。（3）条件：模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA聚合酶(Taq酶)。（4）过程：高温变性、低温复性、中温延伸。 【详解】A、PCR中复性指引物通过碱基互补配对与模板链结合，同一体系中进行PCR使用的引物的复性温度应大致相同，A正确； B、扩增得到的PCR产物通过电泳鉴定，核酸染料加在稍冷却的琼脂糖溶液中，制成琼脂糖凝胶平板，将来对扩增的DNA染色，含有指示剂的凝胶载样缓冲液与扩增得到的PCR产物混合，加到加样孔，电泳时指示剂的移动可以判断DNA分子的移动情况，B错误； C、UPD个体的某对同源染色体来自同一亲本，可能会导致UPD个体的某种隐性致病基因都来自同一个亲本，从而表现出病症，故UPD现象可能会导致隐性遗传病以显性方式传递，C正确； D、微卫星DNA(STR)的核心序列为2-6个碱基，碱基序列短，DNA存在重复，重复次数和分布个数因染色体而异，故检测过程需要分析多个STR位点以确定是否为UPD，D正确。 故选B。 6．（2025·山东青岛·二模）为能快速找到特定抗原的高亲和力抗体，研究者构建抗体文库。从免疫后动物的特定细胞中提取总mRNA，反转录成cDNA，经PCR扩增后，构建重组载体，再把重组载体转化到宿主细胞，形成含不同抗体基因的细胞集合，即抗体文库。下列说法错误的是（　　） A．“特定细胞”是B淋巴细胞 B．反转录出的cDNA全部是抗体基因 C．基因需要定向插入启动子和终止子中间才能表达 D．抗体分布在宿主细胞表面有利于进行抗体筛选 【答案】B 【难度】0.65 【知识点】体液免疫、基因工程在农牧业、制药及环境等方面的应用、基因工程的操作程序综合 【分析】基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成； （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等； （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样； （4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】A、抗体是由浆细胞（效应B细胞）产生的，而浆细胞是由B淋巴细胞分化而来，从免疫后动物中提取能产生抗体相关mRNA的“特定细胞”是B淋巴细胞，A正确； B、从B淋巴细胞中提取的总mRNA包含了该细胞内多种基因转录形成的mRNA，反转录出的cDNA不全部是抗体基因，还有其他基因对应的cDNA，B错误； C、启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录，终止子终止转录，基因需要定向插入启动子和终止子中间才能正常表达，C正确； D、如果抗体分布在宿主细胞表面，就可以利用抗原 - 抗体特异性结合的原理，方便地进行抗体筛选，D正确。 故选B。 7．（2025·山东青岛·二模）DNA因构象不同在电泳时的迁移速率有所差异。超螺旋DNA以超螺旋形式存在，分子体积小；线性DNA分子伸展，在凝胶中移动时受到的摩擦力较大；开环DNA是由环状DNA双链中的一条链发生断裂形成，分子更松散。下列说法正确的是（　　） A．电泳时需要留一个加样孔加入标准参照物 B．电泳时电泳指示剂加在凝胶中，核酸染料与PCR产物混合加入加样孔 C．电泳后的凝胶置于紫外灯下，看到的DNA条带呈蓝色 D．三种构象的DNA在不同浓度的凝胶中迁移速率一定不同 【答案】A 【难度】0.85 【知识点】电泳鉴定 【分析】DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。 【详解】A、电泳时需要留一个加样孔加入标准参照物，A正确； B、配制琼脂糖凝胶时，待凝胶融化稍冷却后，加入适量的核酸染料混合；电泳时，将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内，B错误； C、电泳后的凝胶置于紫外灯下，看到的DNA条带呈桔红色，C错误； D、DNA的迁移速率与凝胶浓度、DNA分子大小和构象有关，三种构象的DNA在不同浓度的凝胶中迁移速率可能相同，D错误。 故选A。 8．（2025·山东青岛·二模）微生物底盘细胞是指经过基因工程改造、用于高效表达目标蛋白的宿主细胞系统。利用合成生物学相关技术对底盘细胞进行遗传及代谢途径改造，可以构建出较为理想的细胞工厂，具体流程见图。研究者已用毕赤酵母作为底盘细胞来生产次生代谢产物萜类物质。下列说法错误的是（　　）      A．毕赤酵母生产的萜类物质是酵母生长所必需的物质 B．某基因失活后菌株无法存活可以确定该基因是必需基因 C．去除野生菌株的非必需基因降低底盘细胞的复杂性，保证目的基因的高效表达 D．选择大肠杆菌做底盘细胞直接合成的胰岛素通常不具备生物活性 【答案】A 【难度】0.65 【知识点】基因工程在农牧业、制药及环境等方面的应用、筛选、获取合适的目的基因 【分析】1.基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。 2.将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。 3.目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】A、毕赤酵母生产的萜类物质是次生代谢物，不是酵母生长所必需的物质，A错误； B、某基因失活后菌株无法存活可以确定该基因是必需基因，B正确； C、去除野生菌株的非必需基因降低底盘细胞的复杂性，保证目的基因的高效表达，避免了非必需基因对目的基因表达的干扰，C正确。 D、大肠杆菌为原核生物，没有内质网和高尔基体等细胞器，不能对胰岛素进行修饰加工，所以以大肠杆菌做底盘细胞直接合成的胰岛素通常不具备生物活性，D正确。 故选A。 9．（2025·山东济南·二模）农杆菌感知到植物分泌的酚类化合物后，会开启其侵染过程，胞内蛋白V2识别并切割T-DNA的边界序列，切割后的T-DNA的一条链与V2形成复合物经通道复合体进入植物细胞。植物细胞被农杆菌侵染后会合成磷酸化的蛋白(VIP1-P)激活抗病相关基因的表达。同时，农杆菌的VF蛋白通过通道复合体进入植物细胞使VIP1-P去磷酸化且去除T-DNA上的V2为T-DNA的整合做准备。下列说法正确的是（    ） A．V2识别切割T-DNA并与其形成复合物的过程主要由线粒体供能 B．VF降低了植物的抗菌能力并促进了T-DNA与染色体DNA的整合 C．T-DNA与VF借助细胞膜上的蛋白质通过胞吞进入细胞 D．农杆菌侵染进入植物细胞的过程未涉及氢键、磷酸二酯键的断裂与形成 【答案】B 【难度】0.65 【知识点】胞吞和胞吐、将目的基因导入受体细胞 【分析】农杆菌是一种在土壤中生活的微生物，能在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有侵染能力。农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T-DNA（可转移的DNA）转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。根据农杆菌的这种特点，如果将目的基因插入Ti质粒的T-DNA中，通过农杆菌的转化作用，就可以使目的基因进入植物细胞。 【详解】A、农杆菌是原核生物，无线粒体，V2识别切割T-DNA并与其形成复合物的过程不是由线粒体供能，A错误； B、植物细胞被农杆菌侵染后合成的VIP1 - P能激活抗病相关基因表达，而VF蛋白使VIP1 - P去磷酸化，降低了植物的抗菌能力；同时VF蛋白去除T-DNA上的V2为T-DNA的整合做准备，促进了T-DNA与染色体DNA的整合，B正确； C、由题干可知，T-DNA的一条链与V2形成复合物以及VF蛋白是经通道复合体进入植物细胞，不是通过胞吞，C错误； D、胞内蛋白V2识别并切割T - DNA的边界序列，涉及磷酸二酯键的断裂，D错误。 故选B。 10．（2025·山东泰安·三模）关于“DNA的粗提取与鉴定”、“DNA片段的扩增及电泳鉴定”实验，下列说法正确的是（    ） A．将过滤的洋葱研磨液低温放置几分钟，取沉淀物备用 B．在白色丝状物中加入二苯胺试剂即可出现蓝色 C．根据待分离DNA片段的大小，用扩增缓冲液配制成琼脂糖溶液 D．加样孔要留出一个孔加入指示分子大小的标准参照物 【答案】D 【难度】0.65 【知识点】DNA的粗提取及鉴定的方法、电泳鉴定 【分析】DNA不溶于酒精，而某些蛋白质溶于酒精；鉴定DNA时，需要先将DNA溶解在NaCl溶液中，再与二苯胺溶液混合，并在水浴加热条件下呈现蓝色。 【详解】A、将过滤的洋葱研磨液低温放置几分钟后取上清液备用，A错误； B、将白色丝状物溶于2mol/L的NaCl溶液中再加入二苯胺试剂，需沸水浴加热可出现蓝色，B错误； C、根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制成琼脂糖溶液，C错误； D、DNA相对分子质量标准物（DNAMarker）是一组已知长度和含量的标 准DNA片段混合物，在电泳中能作为参照物；加样孔要留出一个孔加入指示分子大小的标准参照物，D正确。 故选D。 11．（2025·山东菏泽·二模）下列关于“DNA的粗提取与鉴定”和“DNA片段的扩增及电泳鉴定”实验的叙述，错误的是（    ） A．DNA不溶于95%的冷酒精，但可溶于2mol/LNaCl溶液 B．将洋葱切碎、研磨、过滤，滤液放置4℃冰箱中静置几分钟后，DNA存在于上清液中 C．在凝胶电泳中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关 D．凝胶载样缓冲液中加入的核酸染料能与DNA分子的结合，便于在紫外灯下观察 【答案】D 【难度】0.65 【知识点】DNA的粗提取及鉴定的方法 【分析】DNA不溶于酒精溶液，细胞中的某些蛋白质可以溶解于酒精，利用这一原理可以将蛋白质和DNA进一步分离。 【详解】A、DNA 不溶于 95%的冷酒精，这一特性可用于 DNA 的进一步提纯；而 DNA 在 2mol/L NaCl 溶液中的溶解度较高，可溶于该溶液，A正确； B、将洋葱切碎、研磨、过滤后，滤液放置 4°C 冰箱中静置几分钟，此时 DNA 存在于上清液中，因为 DNA 溶解在研磨液经过处理后的上清液体系中，B正确； C、在凝胶电泳中，DNA 分子的迁移速率确实与凝胶的浓度、DNA 分子的大小和构象等有关。凝胶浓度影响 DNA 分子在凝胶中的移动阻力，DNA 分子大小决定其移动的难易程度，构象不同也会导致迁移速率不同，C正确； D、核酸染料是在凝胶制备时加入到凝胶中，而不是在凝胶载样缓冲液中加入，通过核酸染料与 DNA 分子结合，便于在紫外灯下观察，D错误。 故选D。 12．（2025·山东日照·二模）PCR和琼脂糖凝胶电泳是基因工程中常用的两种技术，下列对其中所用试剂和操作的说法正确的是（　　） A．PCR所用微量离心管、微量移液器、枪头都要进行高压蒸汽灭菌 B．PCR扩增前，应根据待扩增DNA片段的长度设置合适的延伸温度 C．需将扩增得到的PCR产物与内含核酸染料的缓冲液混合后进行加样 D．DNA分子较大时，可适当降低凝胶浓度来提高DNA分子的迁移速率 【答案】D 【难度】0.65 【知识点】PCR扩增的原理与过程、电泳鉴定 【分析】PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关，凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来。 【详解】A、微量移液器不需要进行高压蒸汽灭菌，微量离心管、枪头都要进行高压蒸汽灭菌，A错误； B、利用PCR技术进行扩增时，退火温度的设定是成败的关键，退火温度过高会使引物无法与模板的碱基配对，所以退火温度的设定与引物有关；延伸时间的设定与扩增片段的长度有关，B错误； C、将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内，C错误； D、DNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与DNA分子量对数成反比，分子越大则所受阻力越大，也越难于在凝胶孔隙中蠕行，因而迁移得越慢。当DNA分子较大时，可适当降低凝胶浓度来提高DNA分子的迁移速率，D正确。 故选D。 13．（2025·山东泰安·二模）染色体上的端粒DNA由短的串联重复序列组成，同种生物的该序列相同。少数缺乏端粒酶活性的肿瘤细胞可通过端粒延长替代机制（ALT）维持端粒长度。ALT机制如下：第一条染色体端粒的末端①链结合到第二条染色体端粒的末端②链上并延伸；随后①链脱离，在RNA引物和DNA聚合酶的作用下，新延长的①链被转化成双链形式。这个过程可被重复数十次，使得序列信息从一个端粒传递到另一端粒上。下列说法错误的是（    ） A．①链的延伸过程以②链作为模板，该过程不需要合成引物 B．DNA聚合酶只能从核酸片段3′端延伸，这导致端粒DNA5′端比3′端短 C．进行ALT的肿瘤细胞中端粒酶基因甲基化程度可能较高 D．非同源染色体间通过ALT机制实现了基因重组，增加了遗传的多样性 【答案】D 【难度】0.65 【知识点】基因重组、PCR扩增的原理与过程、表观遗传、生物多样性及其价值 【分析】端粒是线状染色体末端的DNA重复序列。 端粒是线状染色体末端的一种特殊结构,在正常人体细胞中，可随着细胞分裂而逐渐缩短。 【详解】A、根据题意，第一条染色体端粒的末端①链结合到第二条染色体端粒的末端②链上并延伸，这个延伸过程以②链为模板，并且文中提到随后在RNA引物和DNA聚合酶的作用下，新延长的①链被转化成双链形式，说明延伸过程不需要引物，A正确； B、DNA聚合酶只能使子链从已有的核酸片段3'端延伸，这会导致端粒DNA在复制过程中5'端比3'端短，B正确； C、端粒酶活性缺乏的肿瘤细胞可通过ALT机制维持端粒长度，端粒酶基因甲基化程度高会抑制端粒酶活性，所以进行ALT的肿瘤细胞中端粒酶基因甲基化程度可能较高，C正确； D、非同源染色体间通过ALT机制能增加遗传的多样性，但并没有实现非同源染色体间基因的重新组合，而是染色体结构变异，D错误。 故选D。 14．（2025·山东泰安·二模）双向启动子可同时结合两个RNA聚合酶来驱动下游基因的表达，研究人员构建了如图所示的表达载体，以检测双向启动子作用效果。下列分析正确的是（    ）    A．表达载体中GUS基因和LUC基因转录时使用同一条DNA单链为模板 B．为连入GUS基因，需用Sal I和Sph I酶切已整合了双向启动子及LUC基因的质粒 C．在培养基中添加壮观霉素可筛选出成功导入表达载体的受体细胞 D．通过观察是否出现荧光和蓝色物质可检测双向启动子的作用效果 【答案】D 【难度】0.65 【知识点】基因表达载体的构建、目的基因的检测与鉴定 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成；（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等；（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法；（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术；个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】A、转录是从子链（mRNA）5'→3'方向进行的，由图可知，双向启动子位于GUS基因和LUC基因之间，所以GUS基因和LUC基因转录时的模板链不是DNA分子的同一条链，A错误； B、如果用SphI 酶切已整合了双向启动子及LUC基因的质粒时就会破坏LUC基因，B错误； C、T-DNA中含有潮霉素抗性基因，而不包含壮观霉素抗性基因，因此可以通过在培养基中添加潮霉素来筛选成功导入表达载体的受体细胞，C错误； D、双向启动子如果正常表达，就会合成荧光素酶和β-葡萄糖苷酶，催化底物分别产生荧光或生成蓝色物质，从而确定双向启动子的作用，D正确。 故选D。 15．（2025·山东潍坊·一模）提取细菌中质粒时常通过调节pH使DNA先变性再复性，拟核DNA分子因为无法复性与其他较大的分子沉淀下来，质粒可以复性与其他小的核酸分子留在上清液中。下列说法错误的是（    ） A．DNA变性过程中会发生氢键的断裂 B．提取液中应加入一定量的核糖核酸水解酶 C．将提取液中的质粒加乙醇析出后，可以再溶于2mol/L的NaCl溶液中 D．通过电泳分离质粒时，待分离的质粒越大，配置的琼脂糖溶液浓度越高 【答案】D 【难度】0.85 【知识点】PCR扩增的原理与过程、DNA的粗提取及鉴定的方法 【分析】DNA的鉴定：在沸水浴条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色，因此二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂。DNA不容易酒精溶液，细胞中的某些蛋白质可以溶解于酒精，利用这一原理可以将蛋白质和DNA进一步分离。 【详解】A、DNA 变性是指 DNA 双链解开成为单链的过程，此过程中氢键会断裂，A正确； B、提取细菌中质粒时，为防止 RNA 对实验的干扰，提取液中应加入一定量的核糖核酸水解酶来水解 RNA，B正确； C、DNA不容易酒精溶液，细胞中的某些蛋白质可以溶解于酒精，将提取液中的质粒加乙醇可溶解一些蛋白质（杂质），DNA在适宜浓度的氯化钠溶液（如2mol/L）中溶解度大，因此将质粒析出后可以再溶于2mol/L的NaCl溶液中，C正确； D、通过电泳分离质粒时，待分离的质粒越大，配置的琼脂糖溶液浓度应较低，这样大质粒才更容易在凝胶中迁移，D错误。 故选D。 16．（2025·山东枣庄·二模）采用焦磷酸光化测序法进行DNA测序的原理是：将待测DNA链固定到一个磁珠上，将磁珠包被在单个油水混合小滴（乳滴）中，在该乳滴里进行独立的DNA复制，四种脱氧核苷三磷酸依照T、A、C、G的顺序一个一个进入该乳滴，如果发生碱基配对，就会释放一个焦磷酸（PPi），PPi经过一系列酶促反应后发出荧光。下列说法错误的是（    ）    A．脱氧核苷三磷酸通过磷酸二酯键把脱氧核苷酸接到多核苷酸链的3'-OH末端 B．PPi经过一系列的酶促反应后，释放出的能量一部分可转化为光能 C．当胞嘧啶脱氧核苷三磷酸进入后能发出荧光，说明此位置模板链上为G D．若将四种脱氧核苷三磷酸同时加入反应体系中，可大大提高DNA测序的效率 【答案】D 【难度】0.65 【知识点】DNA分子的复制过程、特点及意义、PCR扩增的原理与过程 【分析】PCR是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。  PCR反应需要在一定的缓冲溶液中才能进行，需提供DNA模板，分别与两条模板链结合的2种引物，4种脱氧核苷酸和耐高温的DNA聚合酶；同时通过控制温度使DNA复制在体外反复进行。  扩增的过程包括：变性、复性、延伸。 【详解】A、在DNA合成过程中，脱氧核苷三磷酸确实是通过磷酸二酯键把脱氧核苷酸接到多核苷酸链的3'-OH末端，A正确； B、 PPi经过一系列的酶促反应后，释放出的能量一部分可转化为光能，从而发出荧光，B正确； C、根据碱基互补配对原则，胞嘧啶（C）与鸟嘌呤（G）配对，当胞嘧啶脱氧核苷三磷酸进入后能发出荧光，说明此位置模板链上为G，C正确； D、若将四种脱氧核苷三磷酸同时加入反应体系中，就无法根据碱基配对产生荧光的情况来确定模板链上的碱基顺序，不能提高DNA测序的效率，D错误。 故选D。 17．（2025·山东枣庄·二模）下列与DNA有关的实验，说法正确的是（    ） A．DNA粗提取时加入冷酒精出现白色丝状物后不能用离心法收集 B．PCR缓冲液中Mg2+作用是激活DNA聚合酶，浓度越高，酶活性越大 C．DNA电泳指示剂需要加入到熔化之后凝固之前的琼脂糖中 D．DNA电泳指示剂的作用主要用来指示何时停止电泳 【答案】D 【难度】0.85 【知识点】PCR扩增的原理与过程、DNA的粗提取及鉴定的方法 【分析】DNA的粗提取和鉴定的原理：DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精，利用这一原理，可以初步分离DNA和蛋白质。DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，它能溶于2mol/L的NaCl溶液中。在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色。 【详解】A、DNA粗提取时加入冷酒精出现白色丝状物后，可以用离心法收集，这样能使DNA沉淀更集中，A错误； B、PCR缓冲液中Mg2 +作用是激活DNA聚合酶，但并不是浓度越高酶活性越大，浓度过高可能会对酶活性产生抑制作用，B错误； C、核酸染料需要加入到融化之后凝固之前的琼脂糖中，载样缓冲液（内含指示剂）应该在点样的时候（凝胶已经凝固）加入，C错误； D、DNA电泳指示剂的作用主要用来指示何时停止电泳，D正确。 故选D。 18．（2025·山东济南·一模）依赖解旋酶DNA等温（65℃）扩增技术可实现体外扩增DNA分子。利用解旋酶将DNA双链在恒温下解开，在DNA聚合酶的作用下形成子链的过程如图所示。下列说法错误的是（    ）    A．推测图中1为DNA聚合酶，2为解旋酶 B．DNA单链结合蛋白的直接作用是使复制双向进行 C．解旋酶的作用是破坏氢键 D．该技术中每次循环包括解旋、复性、延伸三个过程 【答案】B 【难度】0.65 【知识点】DNA分子的复制过程、特点及意义、PCR扩增的原理与过程 【分析】DNA的复制： 条件：a、模板：亲代DNA的两条母链；b、原料：四种脱氧核苷酸为；c、能量：（ATP）；d、一系列的酶。缺少其中任何一种，DNA复制都无法进行。 过程： a、解旋：首先DNA分子利用细胞提供的能量，在解旋酶的作用下，把两条扭成螺旋的双链解开，这个过程称为解旋；b、合成子链：然后，以解开的每段链（母链）为模板，以周围环境中的脱氧核苷酸为原料，在有关酶的作用下，按照碱基互补配对原则合成与母链互补的子链。 【详解】A、依据图中1、2所处的位置可知，1为DNA聚合酶，作用为聚合脱氧核糖核苷酸单体，2为解旋酶，打开氢键，A正确； B、复制是单向的，只能从子链的5'端向3'端延伸，B错误； C、解旋酶的作用是打开氢键，即破坏氢键，C正确； D、体外扩增DNA分子主要包括解旋（打开氢键）、复性（引物与DNA单链结合）和延伸（聚合脱氧核糖核苷酸单体）三个过程，D正确。 故选B。 19．（2025·山东青岛·一模）野生大豆的SAMS基因具有提高抗逆性的作用。水稻是一种盐敏感型作物，为提高水稻的抗盐碱胁迫能力，研究者将野生大豆的SAMS基因转入水稻细胞内，从而培养出转基因水稻株系，具体过程如图。下列说法错误的是（    ） A．图示过程中发生了两次转化 B．Ⅰ和Ⅲ都需使用固体培养基 C．Ⅰ中的筛选可使用PCR技术 D．获得的转基因水稻苗都具备抗盐碱能力 【答案】D 【难度】0.65 【知识点】植物组织的培养及基本过程、PCR扩增的原理与过程、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定 【分析】将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法。 【详解】A、转化是指目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程，图示过程需要两次转化，分别为，一是将目的基因（SAMS基因）转化质粒的T-DNA分子上，二是指被插入目的基因的T-DNA转化到受体细胞的染色体DNA分子上，A正确； B、Ⅰ筛选含目的基因的农杆菌，需使用固体培养基，Ⅲ为植物组织培养的再分化过程，需要使用固体培养基，B正确； C、PCR技术可用于目的基因和基因表达载体的筛选，C正确； D、SAMS基因具有提高抗逆性的作用，获得的转基因水稻幼苗不一定都具有抗盐碱的能力，所以需要将转基因水稻置于盐碱的环境中，进行筛选与鉴定，D错误。 故选D。 20．（2025·山东青岛·一模）我国科学家敲除猪的糖抗原合成基因（β4GalNT2），转入相应的调节基因后，将基因编辑猪的单个肾移植给猕猴，同时切除猕猴的自体双肾，最终移植肾存活184天。在移植成功5个月内，猕猴的移植肾功能完全正常，之后出现逐渐加重的蛋白尿。下列说法正确的是（    ） A．基因编辑猪的成功体现了动物细胞的全能性 B．出现蛋白尿的原因主要是肾小管细胞凋亡导致 C．猪和猕猴肾脏的差异体现了基因的选择性表达 D．敲除β4GalNT2能改变膜蛋白种类，降低免疫排斥反应 【答案】D 【难度】0.65 【知识点】细胞的分化、细胞的全能性、基因工程在农牧业、制药及环境等方面的应用、器官移植 【分析】器官移植是将一个个体的某一器官整体或部分地转移到另一个体（或本体的另一位置，如自体皮肤移植）的过程。器官移植存在的主要问题：免疫排斥反应和供体器官不足。针对免疫排斥反应，可采用免疫抑制剂来提高移植器官的成活率。 【详解】A、基因编辑猪的成功属于基因工程的应用范畴，其原理不是细胞的全能性，A错误； B、出现蛋白尿的原因主要是肾小球通透性增强导致的，不是肾小管细胞凋亡导致，B错误； C、猪和猕猴肾脏的差异体现了不同遗传物质对性状的决定，不是基因选择性表达的体现，因为猪和猕猴肾脏不是来源于同一物种，更不是同一细胞的后代，C错误； D、β4GalNT2是糖抗原合成基因，因而敲除β4GalNT2能改变膜蛋白种类，进而降低免疫排斥反应，D正确。 故选D。 21．（2025·山东青岛·一模）采用PCR技术可获取并扩增目的基因。下列说法正确的是（    ） A．若PCR的模板是mRNA，完成扩增只需要逆转录酶 B．预变性有利于模板DNA充分解聚为单链 C．复性温度太高会导致引物和模板的非特异性结合增加 D．一个DNA模板完成第20轮循环需要（220-2）个引物 【答案】B 【难度】0.65 【知识点】PCR扩增的原理与过程 【分析】PCR一般要经历三十多次循环，每次循环可分为变性、复性、延伸三步。在循环之前，常需要进行一次预变性，以便增加大分子模板DNA彻底变性的概率。PCR过程为：变性，当温度上升到90 ℃以上时，氢键断裂，双链DNA解旋为单链。复性，当温度降低到50℃左右是，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。延伸，温度上升到72 ℃左右，溶液中的四种脱氧核苷酸，在DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。 【详解】A、若PCR的模板是mRNA，完成扩增需要逆转录酶和耐高温的DNA聚合酶，A错误； B、预变性温度较高，双链DNA在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA，B正确； C、复性温度太低会导致引物和模板的非特异性结合增加，温度太高会使引物与模板结合减少，C错误； D、合成1个DNA分子需要2个引物，一个模板完成第20轮循环会合成220-219个DNA，因此需要的引物为（220-219）×2=220个，D错误。 故选B。 22．（2025·山东青岛·一模）已知紫外线（UV）可诱导DNA单链上相邻的T之间相互结合形成嘧啶二聚体，阻碍碱基正常配对而导致复制错误引起突变，DNA修复机制对维持遗传稳定性至关重要。研究人员发现某细菌中存在两种如图所示修复机制：①光复活修复：光复活酶（PRE）在可见光下直接切割二聚体，恢复原结构；②暗修复：无需光照，通过切除损伤单链并重新合成。下列说法正确的是（    ）    A．PRE可将嘧啶二聚体的磷酸二酯键断开 B．暗修复过程中还需消耗原料、能量和引物 C．PRE基因发生碱基替换后，在光照下PRE的修复功能可能正常 D．UV诱导DNA形成嘧啶二聚体引起的变异不可遗传 【答案】C 【难度】0.65 【知识点】DNA分子的复制过程、特点及意义、基因突变、DNA重组技术的基本工具 【分析】DNA连接酶（将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的磷酸二酯键）： （1）种类： E.coliDNA连接酶和T4DNA连接酶。 （2）作用：E.coli DNA连接酶只能将具有互补黏性末端的DNA片段连接起来，不能连接具有平末端的DNA片段；而T4 DNA连接酶既可以“缝合”双链DNA片段互补的黏性末端，又可以“缝合”双链DNA片段的平末端，但连接平末端的效率相对较低。 【详解】A、由图可知，PRE（光复活酶）切割的是相邻T碱基之间形成的环状共价键，并非磷酸二酯键，A错误； B、无需光照，通过切除损伤单链并重新合成，即暗修复切除损伤片段后，DNA聚合酶可直接利用缺口处原有的3′OH末端延伸合成新链，不需要引物，B错误； C、由于密码子具有简并性，基因的碱基替换未改变氨基酸得排列顺序，酶活性不变，则在光照条件下PRE的修复功能仍可能维持正常，C正确； D、若嘧啶二聚体未被修复而导致DNA碱基序列永久改变，则该突变在细胞分裂过程中是可以遗传的，D错误。 故选C。 二、多选题 23．（2025·山东临沂·三模）某研究小组构建了能表达ACTA1-GFP融合蛋白的重组质粒，该重组质粒的部分结构如下图所示。下列叙述错误的是（    ）    注：F1和F2表示上游引物，R1和R2表示下游引物 A．RNA聚合酶与启动子结合，调控ACTA1基因和GFP基因的表达 B．仅用F2和R1一对引物无法确定ACTA1基因插入方向是否正确 C．ACTA1基因转录的模板链是a链，引物F1与a链的部分序列相同 D．若用引物F2和R2进行PCR，能更好地区分ACTA1-GFP基因纯合子和杂合子 【答案】BC 【难度】0.4 【知识点】遗传信息的转录、PCR扩增的原理与过程 【分析】基因工程的关键步骤是构建基因表达载体，基因表达载体主要由启动子、目的基因、标记基因和终止子组成，其中标记基因用于筛选重组DNA分子，可以是四环素、氨苄青霉素等抗性基因，也可以是荧光蛋白基因或产物能显色的基因。 【详解】A、据图可知，ACTA1基因和GFP基因位于启动子和终止子之间，故RNA聚合酶与启动子结合，调控ACTA1基因和GFP基因的表达，A正确； B、据图可知，引物F2与R1结合部位包含ACTA1基因的碱基序列，因此推测为了确定ACTA1基因连接到质粒中且插入方向正确，进行PCR检测时，若仅用一对引物，应选择图中的引物F2和R1，B错误； C、ACTA1基因转录的模板链是a链，引物F1与b链均可以和a链互补配对，引物F1与a链的部分序列互补，C错误； D、若用引物F2和R2进行PCR，可根据电泳条带数目能更好地区分ACTA1-GFP基因纯合子和杂合子，D正确。 故选BC。 24．（2025·山东济南·二模）进行性脊柱性肌萎缩症(SMA)与假肥大型进行性肌营养不良症(DMD)两种遗传病症状相似，均会导致肌肉力量不足，临床上较难区分。SMA由等位基因A、a控制，DMD由等位基因B、b控制，A、a和B、b不位于Y染色体上。图1为两种遗传病的系谱图，图2为家系中部分个体两种病相关基因PCR扩增后获得的电泳（可分离不同基因，M为标准样品）图，不考虑突变和互换。下列说法错误的是（    ） A．Ⅲ₁的DMD致病基因来自I₂ B．Ⅱ₂和Ⅱ₃再生一个患病男孩的概率为5/16 C．可调查Ⅰ₂父亲是否患病来判断I₂的患病类型 D．a基因可能由A基因发生碱基对的增添突变而来 【答案】CD 【难度】0.65 【知识点】伴性遗传的遗传规律及应用、遗传系谱图中遗传方式的判定及应用、人类遗传病的类型及实例、电泳鉴定 【分析】Ⅱ2号和Ⅱ3号正常，Ⅲ1两病均患，说明两病均为隐性遗传病。又Ⅱ1为患SMA女性，其父正常，说明SMA为常染色体隐性遗传病。结合电泳图，Ⅱ1和Ⅱ3均有3个条带，Ⅲ1两病均患，有两个条带，说明两种病一种为常染色体隐性遗传病，另一种为伴X隐性染色体遗传病，故DMD为伴X染色体隐性遗传，Ⅲ1为aaXbY，Ⅱ1和Ⅱ3分别为aaXBXb、AaXBY。 【详解】A、Ⅱ2号和Ⅱ3号正常，Ⅲ1两病均患，说明两病均为隐性遗传病。又Ⅱ1为患SMA女性，其父正常，说明SMA为常染色体隐性遗传病。结合电泳图，Ⅱ1和Ⅱ3均有3个条带，Ⅲ1两病均患，有两个条带，说明两种病一种为常染色体隐性遗传病，另一种为伴X隐性染色体遗传病，故DMD为伴X染色体隐性遗传，Ⅲ1为aaXbY，Ⅱ1和Ⅱ3分别为aaXBXb、AaXBY。结合各个体基因型，可知Ⅲ1的DMD致病基因来自Ⅱ2，由于I1正常，说明Ⅱ2的致病基因来自I2，A正确； B、由A可知，Ⅱ₂和Ⅱ₃分别为AaXBXb、AaXBY，二者再生一个患病男孩（aaX-Y+A-XbY）的概率为1/4×1/2+3/4×1/4=5/16，B正确； C、Ⅰ₂为女性患者，若其父亲正常，则其患常染色体隐性遗传病，即SMA，若其父亲患病，则不能判断其患病类型，C错误； D、Ⅱ1基因型为aaXBXb、Ⅱ3基因型为AaXBY，Ⅲ1基因型为aaXbY，三个个体都有的基因为a，故电泳图中第四个条带表示a；Ⅱ1与Ⅱ3相同的基因是B，故第三个条带表示B，Ⅲ1中出现的第二个条带表示b，Ⅱ3中出现的第一个条带表示A。电泳时，DNA片段越短，条带离进样口越远，相比A基因，a基因离进样口最远，说明a基因最短。据此可以判断，a基因可能由A基因发生碱基对的缺失突变而来，D错误。 故选CD。 25．（2025·山东泰安·二模）某遗传病家系的系谱图如图甲所示，已知该遗传病由正常基因A突变成A1或A2引起，且A1对A和A2为显性、A对A2为显性。为确定家系中某些个体的基因型，分别根据A1和A2两种基因的序列，设计鉴定该遗传病基因的引物进行PCR扩增，电泳结果如图乙所示。下列说法正确的是（    ） A．表型相同的个体电泳结果不一定相同，电泳结果相同的个体表型一定相同 B．若Ⅱ3的电泳结果有2条条带，则Ⅱ2和Ⅲ3基因型相同的概率为1/3 C．若Ⅲ5的电泳结果仅有1条条带，则Ⅱ6的基因型只有1种可能 D．若Ⅲ1与正常女子结婚，生育后代患病的概率为1/2 【答案】BD 【难度】0.4 【知识点】遗传系谱图中遗传方式的判定及应用、PCR扩增的原理与过程、电泳鉴定 【分析】基因的分离定律的实质是：在杂合子的细胞中，位于一对同源染色体上的等位基因，具有一定的独立性；在减数分裂形成配子的过程中，等位基因会随同源染色体的分开而分离，分别进入两个配子中，独立地随配子遗传给后代。 【详解】A、因为PCR是根据A1和A2设计的引物，如果只有1个较短条带，基因型可能是AA2或A2A2，因此电泳结果相同的个体表型不一定相同，A错误； B、I1和Ⅱ3都是2个条带，基因型均为A1A2，I2和Ⅱ4都是1个条带，且表型正常，因此基因型均为AA2，Ⅱ2的基因型可能为A1A2或A2A2或A1A，Ⅱ1没有条带，表现正常，因此Ⅱ1基因型为AA，而Ⅲ1是患病的，基因型为A1A，因此Ⅱ2的基因型不能为A2A2，可能为A1A2或A1A，且各占1/2，Ⅲ3的基因型可能是A1A2或A2A2或A1A，且各占1/3，因此Ⅱ2和Ⅲ3的基因型相同的概率为1/2×1/3+1/2×1/3=1/3，B正确； C、Ⅱ5基因型为A1A2或A2A2或A1A，Ⅲ5只有1个条带且患病，Ⅲ5基因型为A1A或A1A1或A2A2，而Ⅱ6没患病，Ⅲ5不可能是A1A1，因此Ⅱ6基因型AA2或AA，C错误； D、Ⅱ1无电泳条带且表型正常，Ⅱ1基因型为AA，Ⅱ2基因型为A1A2或A2A2或A1A，但Ⅲ1患病，因此Ⅲ1基因型只能为A1A，因此Ⅲ1与正常女子（A_）结婚，后代为1/2A1_（患病）、1/2A_（正常），因此生育后代患病的概率为1/2，D正确。 故选BD。 26．（2025·山东枣庄·一模）关于“DNA片段的扩增及电泳鉴定”（实验1）和“DNA的粗提取与鉴定”（实验2）的实验操作，下列相关叙述错误的是（　　） A．实验1中，DNA电泳时需要在琼脂糖熔化之后凝固之前加入核酸染料 B．实验1中，将扩增得到的PCR产物进行凝胶电泳，加样前应先接通电源 C．实验2中，取洋葱研磨液的上清液，加入等体积的体积分数为70%的冷酒精后析出DNA D．实验2中，需先将白色丝状物溶于2mol/L的NaCl溶液中，再加二苯胺试剂并进行沸水浴，用于鉴定DNA 【答案】BC 【难度】0.85 【知识点】PCR扩增的原理与过程、DNA的粗提取及鉴定的方法、DNA的粗提取与鉴定的实验设计 【分析】DNA粗提取和鉴定的原理：（1）DNA的溶解性：DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同；DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精。（2）DNA的鉴定：在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色。 【详解】A、DNA电泳鉴定时需要在琼脂糖熔化之后尚未完全凝固之前加入核酸染料，预先将染料加入凝胶中，可使电泳分离后的DNA分子在凝胶中能充分染色，A正确； B、进行PCR扩增产物电泳时，应在加样后再接通电源，B错误； C、实验2中，取洋葱研磨液的上清液，加入等体积的体积分数为95%的冷酒精（或冷的无水乙醇）后析出DNA，C错误； D、在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色，因此实验2中需先将白色丝状物（析出的DNA）溶于2mol/L的NaCl溶液中，再加二苯胺试剂并进行沸水浴，用于鉴定DNA，D正确。 故选BC。 三、解答题 27．（2025·山东临沂·三模）荧光素酶（Luc蛋白）由550个氨基酸组成，分为N端和C端2个功能片段，即NLuc蛋白 （2-416氨基酸） 和CLuc蛋白 （398—550氨基酸），两部分不能自动重组并发挥作用；将目标蛋白OsBIK1蛋白和OsXLG2蛋白分别与NLuc蛋白和CLuc蛋白融合，若2个目标蛋白相互作用，则NLuc蛋白和CLuc蛋白能成功组装为荧光素酶并分解荧光素发出荧光。科研人员构建了可表达OsBIK1-HA-NLuc融合蛋白的表达载体1和可表达CLuc-OsXLG2融合蛋白的表达载体2并进行了检测，如图1所示，图中HA为标签蛋白（用于目的蛋白的检测、示踪等）的编码序列。 (1)构建重组质粒1时，需要把OsBIK1基因的对应终止密码子的3个碱基去除，原因是 ；图中HA编码序列插入OsBIK1基因编码链的 （填“5'端”或“3'端”），编码链为转录时所用模板链的互补链。 (2)如果用抗Luc蛋白抗体分别检测表达载体1和2融合蛋白表达情况，结果如图2，可优先选用抗 蛋白抗体进一步区分条带1为 融合蛋白。 (3)为了满足应用常需要在载体中构建诱导型启动子，当诱导物存在时可以激活或抑制目的基因的表达。双向启动子可同时结合两个RNA聚合酶来驱动下游基因的表达，研究人员已经构建了下图所示的基因表达载体，以检测双向启动子作用效果。试分析：为连入GUS基因，需用 酶切已整合了双向启动子及LUC基因的质粒，若观察到 则可确认双向启动子起作用。 【答案】(1) 保证OsBIK1基因编码的蛋白和NLuc基因片段编码的蛋白形成融合蛋白 3' (2) HA OsBIK1-HA-NLuc (3) AgeⅠ和SalⅠ 蓝色物质且有荧光 【难度】0.4 【知识点】遗传信息的转录、遗传信息的翻译、基因表达载体的构建、目的基因的检测与鉴定 【分析】基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。 （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。 （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。 （4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）终止密码子可控制翻译的结束，如果保留OsBIK1基因的对应终止密码子，则在翻译完OsBIK1基因对应的mRNA序列后就会终止翻译，不能形成OsBIK1基因编码的蛋白和NLuc基因片段编码的蛋白构成的融合蛋白，故保证OsBIK1基因编码的蛋白和NLuc基因片段编码的蛋白形成融合蛋白，需要把OsBIK1基因的对应终止密码子的3个碱基去除；已知编码链为转录时所用模板链的互补链，编码链和模板链反向螺旋在一起，而转录时RNA聚合酶是从DNA模板链的3'端向5'端移动，因此图中HA编码序列插入到OsBIK1基因编码链的3'端，才能使转录时OsBIK1-HA两个基因同时转录。 （2）HA为标签蛋白（用于目的蛋白的检测、示踪等）的编码序列，插入HA序列后会有HA标签蛋白产生，用于目的蛋白的检测、示踪等，故优先选用抗HA蛋白抗体，根据图2可知，用抗Luc蛋白抗体分别检测表达载体1和2融合蛋白表达情况，会出现条带1和条带2，图2中最后一幅图出现的是条带1，且已知图中HA为标签蛋白的编码序列，可用于目的蛋白的检测、示踪等，因此可优先选用抗HA蛋白抗体进一步区分条带1为OsBIK1-HA-NLuc融合蛋白。 （3）观察可知，要连入GUS基因，需要在不破坏其他关键基因（如LUC基因）的前提下进行酶切。分析质粒上的酶切位点，发现GUS基因的两侧含有AgeⅠ、SphⅠ和SalⅠ酶切位点，而如果用SphⅠ酶切已整合了双向启动子及LUC基因的质粒时就会破坏LUC基因，所以应该用AgeⅠ和SalⅠ酶切已整合了双向启动子及LUC基因的质粒，才能在合适的位置连入GUS基因，双向启动子如果正常表达，就会合成荧光素酶和β-葡萄糖苷酶，那么就会既观察到蓝色物质，又观察到荧光，从而确定双向启动子的作用。 28．（2025·山东济南·二模）研究发现水稻MEL2基因等位突变体mel2会导致个体不能产生雌配子，个体的花粉育性保持完全正常，其他农艺性状均不受影响。科研人员将野生型MEL2基因经PCR扩增后接入图甲中含有杀花粉基因ZM-AA1和糊粉层特异性表达的红色荧光基因DsRed2的双T-DNA载体中，以获得新的品系，构建过程如图所示。    (1)通过PCR扩增水稻MEL2基因并正确连入图甲载体中，使用的F引物5'端需要添加的序列为5' CACTGC3'（写出15bp序列）。 (2)使用Bb.Bts1对图甲载体插入位点可得到 个缺口，推测图中94 ℃处理的目的是 ；使用LacZ作为菌落筛选基因时，重组转化后的阳性菌落呈 色（填“蓝”或“白”）。 (3)将重组载体导入mel2纯合突变体，可在阳性转化苗（两T-DNA均可检测到）的后代中挑选出只含第二个T-DNA插入的株系A，原因是 ；假设株系A只有一个T-DNA插入且不影响其他基因功能，该株系自交后产生的种子中红色荧光种子的比例为 。 【答案】(1)CCAGTAGCACTTCGT (2) 6/六 打开氢键，使缺口间的短链解离形成黏性末端 白 (3) 两个T-DNA分别插到不同染色体上，减数分裂后两T-DNA进入不同配子中 1/2/50% 【难度】0.4 【知识点】基因工程的操作程序综合 【分析】由题意可知，LacZ表达后会使菌落呈蓝色，重组质粒中LacZ被破坏，使用LacZ作为菌落筛选基因时，重组转化后的阳性菌落呈白色。 【详解】（1）据图可知，为了保证MEL2基因正确连入图甲载体中，使用F引物5'端需要添加的序列为Bt.Bts1（从而保证用该酶切割目的基因和载体时，产生相同的黏性末端）识别序列附近的序列，即5'CCAGTAGCACTTCGTCACTGC3'。 （2）图中Bb.Bts1识别序列，其中两个在中间，被切割后可产生4个缺口，另外两个在两边，被切割可产生2个缺口，共产生6个缺口。94℃可以是DNA解旋变性，推测图中94 ℃处理的目的是打开氢键，使缺口间的短链解离形成黏性末端。LacZ表达后会使菌落呈蓝色，重组质粒中LacZ被破坏，使用LacZ作为菌落筛选基因时，重组转化后的阳性菌落呈白色。 （3）T-DNA可分别插入不同的染色体上，经减数分裂后两T-DNA进入不同配子中，所以可在阳性转化苗的后代中挑选出只含第二个T-DNA插入的株系A。假设株系A只有一个T-DNA插入且不影响其他基因功能，该株系相当于杂合子，可记作AO，由于其含有杀花粉的基因，所以雄配子只产生O，则自交后产生的种子（AO:OO=1：1）中红色荧光种子的比例为1/2。 29．（2025·山东潍坊·三模）科研人员通过CRISPR/Cas9系统敲除小鼠的PPP2R3A基因，研究该基因对小鼠心脏功能的影响。其过程为：构建含sgRNA基因和Cas9酶基因的表达载体，通过显微注射将该表达载体导入小鼠的卵细胞中，利用CRISPR/Cas9系统敲除PPP2R3A基因构建模型小鼠。图1为Cas9酶基因的DNA片段且转录方向从左到右；图2为所用质粒及质粒上有关限制酶的识别序列和酶切位点示意图，Ampr为氨苄青霉素抗性基因、Tetr为四环素抗性基因。 (1)研究表明，Cas9酶基因两侧没有限制酶切位点，在构建表达载体的过程中，可借助PCR技术在引物的 （填“5′”或“3′”）端添加限制酶切序列；引物1序列区由5′→3′的碱基序列为 ，引物2序列区应含有限制酶 的识别序列。 (2)研究发现，实际操作时，只需敲除PPP2R3A基因的部分碱基序列，即可使其失去功能。科研小组用PPP2R3A基因敲除的模型小鼠（KO组）与未做处理的小鼠（WT组）进行杂交，获得子代小鼠（F1组）。三组小鼠PPP2R3A基因的电泳图谱如下图所示。 据图分析，PPP2R3A基因的长度为 ；敲除掉的碱基序列长度为 ；4、5、6、12、14是 组小鼠的电泳图。 (3)该科研小组检测了小鼠心脏组织中相关基因的表达情况，结果如下表所示（RGS19为参与心脏发育的蛋白信号转导调控因子）。 组别 PPP2R3A mRNA PPP2R3A蛋白 RGS19 WT组 1.31 0.24 0.87 KO组 0.76 0.14 1.21 据表分析可知，与WT组相比，KO组 。由此可以得出结论是 。 【答案】(1) 5′ AGATCTGCATCCTCCAGG BamHⅠ (2) 507bp 113bp F1组 (3) KO组心脏组织中PPP2R3A的mRNA和蛋白表达量明显下降，参与心脏发育的蛋白信号转导调控因子RGS19表达量明显升高 PPP2R3A在体内可能通过抑制RGS19蛋白的合成（与RGS19蛋白互作）来影响心脏的功能 【难度】0.65 【知识点】PCR扩增的原理与过程、基因表达载体的构建、基因工程在农牧业、制药及环境等方面的应用 【分析】基因工程技术的基本步骤包括目的基因的筛选和获取；基因表达载体的构建；将目的基因导入受体细胞；目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）子链延伸的方向是5′→“3′，引物为单个的脱氧核苷酸提供3′端。研究表明，Cas9酶基因两侧没有限制酶切位点，在构建表达载体的过程中，可借助PCR技术在引物的5′端端添加限制酶切序列； 结合图1和图2可知，需要把目的基因插入到启动子和终止子之间，且不能破坏目的基因和复制原点，HindIII、PstI会破坏目的基因，SmaI会破坏复制原点，因此选择限制酶Bgl II和BamHI，引物I的5'端需要添加Bgl II的识别序列，引物结合到模板的3'端，与模板碱基互补配对，因此引物1序列区由5′→3′的碱基序列为AGATCTGCATCCTCCAGG；引物2序列区应含有限制酶BamHⅠ的识别序列，可以保证目的基因插入载体中，且插入到Tetr，保证只有一个标记基因Ampr进行筛选。 （2）图中WT组有一个条带，长度为507bp，据此可知PPP2R3A基因的长度为507bp；研究发现，实际操作时，只需敲除PPP2R3A基因的部分碱基序列，即可使其失去功能，KO组PPP2R3A基因碱基序列长度小于507bp，敲除掉的碱基序列长度为507-394=113bp；4、5、6、12、14基因碱基序列长度是394bp，为F1组小鼠的电泳图。 （3）据表分析可知，与WT组相比，KO组心脏组织中PPP2R3A的mRNA和蛋白表达量明显下降，参与心脏发育的蛋白信号转导调控因子RGS19表达量明显升高；由此可以得出结论是PPP2R3A在体内可能通过抑制RGS19蛋白的合成（与RGS19蛋白互作）来影响心脏的功能。 30．（2025·山东泰安·三模）科研人员尝试利用鸡新城疫病毒（HB1）基因和传染性支气管炎病毒（H120）基因，采用基因工程技术培育转基因工程菌，以制备二联体疫苗，所需要的限制酶的识别序列和切割位点如表所示，培育流程如图所示。 限制酶 BclI PvitⅡ XbaI Sau3AI 识别序列和切割位点（5′-3'） T↓GATCA CAG↓CTG T↓CTAGA ↓GATC (1)根据图示信息，应选用限制酶 切割质粒，不选用其他限制酶的原因是 。 (2)为保证融合基因与质粒的正向连接，在设计PCR引物时，应在b链对应引物的 （填“3'”或“5′”）端添加限制酶 （填种类）的识别序列。根据图表信息，写出该引物的12个碱基序列5′- -3′。 (3)为筛选出导入了基因表达载体的大肠杆菌，培养基甲中应添加 （填“四环素”或“青霉素”）,培养基乙中应添加 （填“四环素”或“青霉素”）,菌落 （填图中数字）中的大肠杆菌可用来制备疫苗。 【答案】(1) XbaI、PvitⅡ 限制酶BclI的识别和切割位点不在启动子和终止子之间的片段中,限制酶Sau3AI不仅切割自己的识别位点,也会切割BclI的识别位点 (2) 5′ XbaI TCTAGAAGCTCA (3) 四环素 青霉素 3和5 【难度】0.4 【知识点】PCR扩增的原理与过程、DNA重组技术的基本工具、基因表达载体的构建、目的基因的检测与鉴定 【分析】基因工程的基本操作步骤主要包括四步：①目的基因的获取；②基因表达载体的构建；③将目的基因导入受体细胞；④目的基因的检测与表达。其中，基因表达载体的构建是基因工程的核心。 【详解】（1）限制酶BclI的识别和切割位点不在启动子和终止子之间的片段中，限制酶Sau3AI不仅切割自己的识别位点，也会切割BclI的识别位点，因此应选择XbaI、PvitⅡ切割质粒，可避免质粒自连及目的基因反接。 （2）b链为基因的模板链，接入质粒后b链的3，端→5，端为启动子到终止子方向，因此在设计PCR引物时，应在b链对应引物的5，端加上XbaI序列（5，TCTAGA3，），在a链对应引物的5，端加上PvitⅡ序列。b链对应引物的5，端加上XbaI序列，且b链的引物与b链的3端配对，序列为5，AGCTCA3，，故该引物的12个碱基序列5，-TCTAGAAGCTCA-3，。 （3）基因表达载体上含有四环素抗性基因，培养基甲中添加四环素可以筛选出重组质粒；重组质粒中青霉素抗性基因被破坏，因此培养基乙中应添加青霉素，以利用影印接种法来筛选重组菌；在甲中能生长、乙中不能生长的为重组菌落，即3和5中的大肠杆菌可用来制备疫苗。 31．（2025·山东青岛·二模）转录因子是一类在基因表达调控中起关键作用的蛋白质，主要功能是通过结合DNA特定序列，控制基因转录的起始和强度。WRKY基因表达的转录因子在植物的抗逆方面发挥着重要的作用。为提高菠萝的抗干旱能力，研究人员利用Gateway克隆技术构建WRKY基因的过表达载体，培育出抗干旱的转基因菠萝。Gateway克隆技术包含BP反应和LR反应两个阶段。    (1)为得到两端含attB的WRKY基因，可采用 技术，完成该技术需要提供的物质有 。 (2)BP反应中，带有attB序列的WRKY基因与pENTR载体混合，加入BP克隆酶，attB和attP位点之间会发生互换，形成 。这种技术与传统的构建方法相比，区别是 。 (3)LR反应中，pENTR载体上的attL位点和pGWB605载体上的attR位点在LR克隆酶的催化下发生互换，从而将WRKY基因转移到pGWB605载体上。转化大肠杆菌后，在培养基上存活的一定是含WRKY基因的pGWB605载体，而不是pGWB605载体，理由是 。 (4)pGWB605载体含植物强启动子，能 。将重组载体导入菠萝愈伤组织后，通过 技术获得转基因菠萝植株。除了比较转基因菠萝和非转基因菠萝细胞中的WRKY转录因子的含量外，还需要从 水平来检测转基因菠萝是否培育成功。 【答案】(1) PCR 模板、引物、耐高温的DNA聚合酶、原料等 (2) pENTR重组载体 无需限制酶和连接酶 (3)pGWB605载体含ccdB基因，会导致大肠杆菌死亡 (4) 高效驱动WRKY基因的转录 植物组织培养 个体 【难度】0.65 【知识点】影响植物组织培养的因素、PCR扩增的原理与过程、基因表达载体的构建、目的基因的检测与鉴定 【分析】1、基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品；基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，又叫做DNA重组技术。 2、基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成； （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等，标记基因可便于目的基因的鉴定和筛选。 （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法； （4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因；②检测目的基因是否转录出了mRNA；③检测目的基因是否翻译成蛋白质——抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】（1）为得到两端含attB的WRKY基因（目的基因），可采用PCR技术获得，PCR时需要提供的物质有模板、引物、耐高温的DNA聚合酶、原料等。 （2）attB和attP为同源序列，所以BP反应中，带有attB序列的WRKY基因与pENTR载体混合，加入BP克隆酶，attB和attP位点之间会发生互换，使目的基因整合到pENTR载体上，形成pENTR重组载体。这种技术与传统的构建方法相比，区别是无需限制酶和连接酶，利用的是同源重组的原理。 （3）LR反应中，pENTR载体上的attL位点和pGWB605载体上的attR位点在LR克隆酶的催化下发生互换，从而将WRKY基因转移到pGWB605载体上。转化大肠杆菌后，在培养基上存活的一定是含WRKY基因的pGWB605载体，而不是pGWB605载体，理由是pGWB605载体含ccdB基因，ccdB编码毒性蛋白导致细胞死亡。 （4）pGWB605载体含植物强启动子，能高效驱动WRKY基因的转录。将重组载体导入菠萝愈伤组织后，通过植物组织培养技术获得转基因菠萝植株。除了比较转基因菠萝和非转基因菠萝细胞中的WRKY转录因子的含量外，还需要从个体水平来检测转基因菠萝是否培育成功。 32．（2025·山东日照·二模）研究人员利用纤维素生产菌(酪氨酸合成缺陷型)合成了黑色纤维素薄膜。蛋白T7RNAP是一种噬菌体RNA聚合酶(T7RNAP的N端或C端单独存在时不能发挥作用，二者结合可形成完整的T7RNAP)，nMag和pMag是在蓝光环境下能够相互结合的两种光敏蛋白。研究人员通过PCR技术获融合基因，并将不同类型的启动子与相关基因连接，构建成基因表达载体，然后将其导入受体菌，获得了所需的工程菌。 (1)研究人员利用PCR技术实现编码T7RNAPN端的基因下游序列与编码nMag的基因上游序列的无缝连接，获得编码T7RNAPN端-nMag的融合基因，由图1可知，引物2的5＇端9个碱基序列为5＇ 3＇，如此设计引物2的目的是 。用同样的方法获得编码pMag-T7RNAPC端的融合基因。    (2)通用型启动子能够被纤维素生产菌的RNA聚合酶识别，结构完整的T7RNAP对T7启动子表现出高度的特异性。为获得蓝光诱导着色的纤维素生产工程菌，构建了下图所示的基因表达载体，图中3个启动子中，表示通用型启动子的是 (填序号)，表示T7启动子的是 (填序号)。    (3)将构建好的载体导入纤维素生产菌前，通常用 处理受体细胞。为筛选出能够生产黑色纤维素薄膜的工程菌，培养基中应添加 。 【答案】(1) CCTGCACCT 使T7RNAPN端基因的下游添加与nMag基因的上游相同的序列 (2) ②③ ① (3) Ca2+ 氯霉素、酪氨酸 【难度】0.65 【知识点】基因表达载体的构建、目的基因的检测与鉴定 【分析】PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定的DNA片段的核酸合成技术，利用的原理是DNA复制。 【详解】（1）观察图 1，要实现编码 T7RNAP N 端的基因下游序列与编码 nMag 的基因上游序列的无缝连接，引物 2 的5′端 9 个碱基序列应与 nMag 基因的上游序列（从图中可知）相同，所以为5′CCTGCACCT3′。如此设计引物 2 的目的是使T7RNAPN端基因的下游添加与nMag基因的上游相同的序列，从而获得融合基因。 （2）蓝光照射条件下，T7RNAP的N端-nMag与T7RNAP的C端结合，导致无活性的T7RNAP变成有活性的T7RNAP；蓝光处理后，RNA聚合酶（T7RNAP）识别启动子①使基因1转录获得相应的mRNA，再以其为模板通过翻译过程获得酪氨酸酶，可见基因2和3正常表达无活性产物，被蓝光激活后再启动基因1表达，综合上述分析可知，启动子②和启动子③是通用型启动子，启动子①是 T7 启动子。 （3）将构建好的载体导入微生物（纤维素生产菌）前，通常用Ca2+处理受体细胞，使其成为感受态细胞，易于吸收外源 DNA 分子。由于纤维素生产菌是酪氨酸合成缺陷型，所以为筛选出能够生产黑色纤维素薄膜的工程菌，培养基中应添加酪氨酸，同时由于载体中有氯霉素抗性基因，还应添加氯霉素，这样含有重组质粒的工程菌才能在该培养基上生长。 33．（2025·山东青岛·一模）水体中的雌激素能使斑马鱼细胞产生E蛋白，激活卵黄蛋白原（vtg）基因的表达，因此斑马鱼可用于监测环境雌激素污染程度。为了实现可视化监测，科学家将图1中的vtg基因与图2中Luc基因载体连接，形成vtg-Luc基因重组载体，成功培育了转基因斑马鱼，当极微量雌激素污染水体，斑马鱼的肝脏就发出荧光。Luc表示荧光素酶基因（无启动子），Kanr为卡那霉素抗性基因，ori为复制起点，BamHI、BclI、HindIII、BsrGI为限制酶，→表示转录方向。 注：图1DNA片段不含有图2所示限制酶的识别序列 (1)为使vtg基因与Luc基因载体形成重组载体，选用限制酶 切割Luc基因载体可降低“空载”概率。通过PCR技术获取vtg基因时，需设计合适的引物。依据图示信息，推测引物1包含的碱基序列为5′ 3′。（写出已知的所有碱基序列） (2)将“vtg-Luc基因重组载体”导入大肠杆菌中进行扩增，为便于筛选，应将大肠杆菌接种在含 的培养基中，转基因成功的斑马鱼只在肝脏中发出荧光指示污染，其原因是 。 (3)Luc基因载体上有一段P2A序列，其功能如图所示，据此推测P2A的作用 。 (4)进一步研究发现，E蛋白能与vtg基因启动子的特定序列结合，启动该基因的表达。已知vtg基因启动子含区域1和区域2，为研究E蛋白的结合位点，设计如下实验：用限制酶将启动子切割成含区域1和区域2的两个片段，将两个酶切片段分别与Luc基因载体连接，连接位点位于Luc基因的上游，形成两种重组载体。将重组载体分别导入斑马鱼的 ，待发育成熟后，往水体中添加 进行检测。 【答案】(1) Bcl I和Hind Ⅲ 5'-TGATCAAACTAT-3' (2) 卡那霉素 vtg基因在肝脏中特异性表达 (3)有助于序列两侧的基因表达成独立的蛋白质 (4) 受精卵 雌激素和荧光素 【难度】0.65 【知识点】PCR扩增的原理与过程、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定 【分析】基因工程的步骤： （1）提取目的基因：基因组文库中获取、cDNA文库中获取。 （2）目的基因与运载体结合：将目的基因与运载体结合的过程，实际上是不同来源的DNA重新组合的过程。如果以质粒作为运载体，首先要用一定的限制酶切割质粒，使质粒出现一个缺口，露出黏性末端。然后用同一种限制酶切断目的基因，使其产生相同的黏性末端（部分限制性内切酶可切割出平末端，拥有相同效果）。 （3）将目的基因导入受体细胞：将目的基因导入受体细胞是实施基因工程的第三步。目的基因的片段与运载体在生物体外连接形成重组DNA分子后，下一步是将重组DNA分子引入受体细胞中进行扩增。 （4）目的基因的检测和表达。 【详解】（1）由图可知，限制酶BsrGI会破坏Luc，因此不能选择BsrGI，Luc基因载体上存在两个BamHI识别位点，因此不能选择BamHI，为防止目的基因和载体的自身环化和反向连接，因此需选用两种限制酶，即选择BelI、HindIII切割Luc基因载体可降低“空载”概率。根据启动子的位置和基因载体上限制酶的位置，因此需要在引物1上添加限制酶BelI识别序列，因此引物1包含的碱基序列为5′TGATCAAACTAT3′。 （2）Kanr为卡那霉素抗性基因做为标记基因，供重组DNA的鉴定和选择，因此为便于筛选，应将大肠杆菌接种在含卡那霉素的培养基中；转基因成功的斑马鱼只在肝脏中发出荧光指示污染，说明vtg基因只在肝脏中特异性表达。 （3）由图可知2A肽的作用可使两侧基因形成完整蛋白，即P2A有助于序列两侧的基因表达成独立的蛋白质。 （4）可利用显微注射法将目的基因导入动物的受精卵中。由题意可知，在含有雌激素的污水中，转基因斑马鱼可发出荧光，因此可在斑马鱼发育成熟后，往水体中添加雌激素和荧光素检测是否发荧光。 34．（2025·山东潍坊·一模）利用基因编辑技术CRISPR/Cas12a开发出的核酸检测技术，可更加精确快速的进行核酸检测。该系统由crRNA与Cas12a蛋白组成，利用crRNA介导Cas12a蛋白能准确切割靶标DNA，Cas12a蛋白切割靶标DNA的同时切割荧光底物使其发出荧光，通过检测荧光强度确定靶标DNA含量。现利用工程菌制备CRISPR/Cas12a复合体来检测自来水中的大肠杆菌，如图所示。 (1)PCR获取目的基因时，缓冲液中Mg2+的作用是 ，crRNA序列应符合的条件是 。 (2)为实现Cas12a蛋白基因、crRNA编码序列与质粒的准确连接，质粒中两处BsaⅠ酶切后的黏性末端应 （填“相同”或“不同”）。为使重组质粒中不出现BsaⅠ识别序列，需在F和R引物5'端添加的序列是 （填标号）。 ①F5'-NNNNNGAGACC-3'    R5'-NNNNNGAGACC-3' ②F5'-GGTCTCNNNNN-3'    R5'-GGTCTCNNNNN-3' ③F5'-GGTCTCNNNNN-3'    R5'-NNNNNGAGACC-3' ④F5'-NNNNNGAGACC-3'    R5'-GGTCTCNNNNN-3' (3)若要筛选到含有基因表达载体的工程菌，培养基中除细菌生长的必需条件外还应加入 ，从菌落分别挑取少许菌体，接种到含 的平板上，若 ，则对应菌落中细菌含有基因表达载体。 (4)下图为利用CRISPR/Cas12a复合体检测自来水中大肠杆菌DNA含量时绘制的曲线，实验中设置不含大肠杆菌对照组的作用是 。一段时间后，荧光信号强度不再升高，原因是 。 【答案】(1) 激活TaqDNA聚合酶 与大肠杆菌靶标DNA互补配对 (2) 不同 ② (3) 四环素 氨苄青霉素 不能增殖 (4) 排除其他因素对荧光强度的影响 实验组中大肠杆菌的靶标DNA都被切割 【难度】0.65 【知识点】PCR扩增的原理与过程、基因表达载体的构建、目的基因的检测与鉴定 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）PCR获取目的基因时，缓冲液中Mg2+的作用是激活TaqDNA聚合酶，题意显示，利用crRNA介导Cas12a蛋白能准确切割靶标DNA，据此可知，crRNA序列应符合的条件是与大肠杆菌靶标DNA互补配对，进而在该部位实现切割。 （2）为实现Cas12a蛋白基因、crRNA编码序列与质粒的准确连接，质粒中两处BsaⅠ酶切后的黏性末端应“不同”。为使重组质粒中不出现BsaⅠ识别序列，需在F和R引物5'端添加的序列是②，进而构建出不同的BsaⅠ酶切序列。　 （3）若要筛选到含有基因表达载体的工程菌，培养基中除细菌生长的必需条件外还应加入四环素，因为重组质粒和空质粒中均含有四环素抗性基因，而重组质粒中的氨苄青霉素抗性基因被破坏；因此，接下来的操作是从长出的菌落中分别挑取少许菌体，接种到含氨苄青霉素的平板上，若不能增殖，则对应菌落中细菌含有基因表达载体。 （4）下图为利用CRISPR/Cas12a复合体检测自来水中大肠杆菌DNA含量时绘制的曲线，实验中设置不含大肠杆菌对照组的作用是排除其他因素对荧光强度的影响，是实验结果更具说服力。一段时间后，荧光信号强度不再升高，意味着实验组中大肠杆菌的靶标DNA都被切割，据此可检测大肠杆菌的数量。 35．（2025·山东枣庄·二模）无缝克隆技术首先对质粒PCR1获得线性化载体，然后通过PCR2在目的基因片段的两端插入与线性化载体两端相同的碱基序列。再将上述两类PCR产物混合，在In-Fusion酶的作用下，凭借其3′→5′外切核酸酶活性，从线性化DNA的3′端起始切除15个核苷酸，进而暴露出部分单链区域，最终在某些酶的作用下促使插入片段与载体实现连接。Gata基因是哺乳动物体内重要的转录调控因子，与多种疾病的发生发展密切相关，研究者利用无缝克隆技术将Gata基因和绿色荧光蛋白（GFP）基因连接，构建融合蛋白以研究Gata基因的作用机理，相关流程如下图所示。 (1)PCR过程中引物与模板结合发生在 阶段。对质粒进行PCR1扩增时，引物应选 。 A．5'TAGATCTCAGTCGATC3'  B．5'GATCGACTGAGATCTA3' C．5'AGGATCAGTCCGCTA3'   D．5'TAGCGGACTGATCCCT3' (2)进行PCR2过程中，为了在GFP基因两端分别增加Ⅰ、Ⅱ片段，应该从引物①②③④中选择引物 ，并且还要在引物的 （填“5'”或“3'”）端添加Ⅰ、Ⅱ片段对应序列。PCR2进行第四轮扩增结束时，PCR反应体系中含 个需要的双链GFP基因片段。将线性化载体与目的GFP基因相连构建重组质粒阶段除了需要InFusion酶之外，还需要 酶。 (3)将实验得到的常染色体上转入一个Gata-GFP融合基因的1只雄性小鼠，与野生型雌鼠杂交，得到F1小鼠若干，F1雌雄小鼠相互交配得到F2，其中Gata-GFP基因纯合子小鼠的比例为 。 【答案】(1) 复性 A、D (2) ①④ 5' 8 DNA连接酶 (3)1/16 【难度】0.65 【知识点】基因分离定律的实质和应用、DNA重组技术的基本工具、基因工程的操作程序综合 【分析】PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术。其原理为DNA双链复制。PCR的条件为：要有一段已知目的基因的核苷酸序以便合成一对引物、模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA聚合酶(Taq酶)。 【详解】（1）PCR过程中引物与模板结合发生在复性阶段，复性后为脱氧核苷酸依次连接在引物的’端，进而实现延伸。对质粒进行PCR1扩增时，子链延伸的方向为5’→3’，且启动子和终止子应该包含其中，子链的延伸从Ⅰ向左，从Ⅱ向右，因此图中选择的引物应该为A和D。 （2）进行PCR2过程中，为了在GFP基因两端分别增加Ⅰ、Ⅱ片段，根据子链延伸方向可推测，应该从引物①②③④中选择引物①④，并且在引物的5’端添加Ⅰ、Ⅱ片段对应序列，这样获得的DNA片段会加上Ⅰ、Ⅱ片段，并且分别位于GFP基因的两端。PCR2进行第四轮扩增结束时，PCR反应体系中含2n-2n=24-8=8个需要的双链GFP基因片段。将线性化载体与目的GFP基因相连构建重组质粒阶段除了需要InFusion酶（获得相应的黏性末端）之外，还需要DNA连接酶，该酶的作用是构建磷酸二酯键。 （3）将实验得到的常染色体上转入一个Gata-GFP融合基因的1只雄性小鼠（为杂合子，可表示为Aa），与野生型雌鼠（aa）杂交，得到F1小鼠（Aa∶aa=1∶1）若干，F1雌雄小鼠相互交配得到F2，其中Gata-GFP基因纯合子小鼠的比例为1/4×1/4=1/16。 36．（2025·山东枣庄·一模）中国“干扰素之父”侯云德院士于1982年成功研发我国第一个基因工程创新药物——干扰素。干扰素是一种白细胞产生的具有抗病毒能力的分泌蛋白。研究人员从感染病毒的鸡白细胞提取全基因组mRNA，利用PCR技术获取鸡干扰素基因，图1表示鸡干扰素蛋白有关的基因片段，序号①~④表示引物。然后将获取的目的基因连接在大肠杆菌的pET32a质粒（5900bp，注：bp表示碱基对）上，图2表示pET32a质粒及其上部分限制酶切割位点。最后将重组质粒导入大肠杆菌后获得成熟干扰素。 (1)利用鸡白细胞总mRNA获得干扰素蛋白基因，需要在 酶的作用下先合cDNA。图1表示成熟干扰素蛋白序列及其前端的信号肽序列，信号肽是分泌蛋白合成过程中开始合成的一段肽链，其在干扰素合成中的作用是 。 (2)为了获取不含信号肽序列的干扰素基因，在进行PCR扩增时需要用到的一对引物是 ，为了将目的基因准确连接到pET32a质粒上需要在目的基因的两端添加 限制酶的序列。PCR扩增过程除了引物，还需要的条件有 （答出2点）。 (3)为了检测目的基因是否插入pET32a质粒，利用目的基因两端添加的限制酶切割质粒，然后对产物进行电泳，结果如图3，样品 最可能是插入了目的基因的重组质粒，判断的理由是 。 【答案】(1) 逆转录/逆转录酶 引导游离的核糖体转移到内质网上继续肽链的合成 (2) ②④ EcoRI、XhoI 模板；4种游离的脱氧核苷酸（dNTP）；耐高温的DNA聚合酶；含Mg2+缓冲液 (3) 2 EcoRⅠ、XhoⅠ可以把重组质粒切成约500bp和5800bp的两个片段 【难度】0.4 【知识点】PCR扩增的原理与过程、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、基因工程的操作程序综合 【分析】基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成； （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等； （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样； （4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）利用鸡白细胞总mRNA获得干扰素蛋白基因，需要经过RNA变成相应的DNA逆转录过程，需要逆转录酶的作用下先合cDNA。图1表示成熟干扰素蛋白序列及其前端的信号肽序列，信号肽是分泌蛋白合成过程中开始合成的一段肽链，指导新生的多肽链和核糖体与内质网膜结合，使蛋白质的合成和加工在粗面内质网上进行，所以其在干扰素合成中的作用是引导游离的核糖体转移到内质网上继续肽链的合成。 （2）为了获取不含信号肽序列的干扰素基因，在进行PCR扩增时需要用到的一对引物是②④，其他引物会导致含信号肽序列的干扰素基因的合成，为了将目的基因准确连接到pET32a质粒上，需要在目的基因两端添加可以与质粒酶切位点互补的限制酶识别序列，需要在目的基因的两端添加EcoRI、XhoI限制酶的序列，PCR扩增过程除了引物，还需要的条件有相应的模板；原料是4种游离的脱氧核苷酸（dNTP）；耐高温的DNA聚合酶；含Mg2+缓冲液。 （3）为了检测目的基因是否插入pET32a质粒，利用目的基因两端添加的限制酶切割质粒，然后对产物进行电泳，结果如图3，因为一个切割位点只会将环状的质粒切割成一条线性的DNA，有两个切割位点才能切成2条片段，根据题图分析EcoRⅠ、XhoⅠ可以把重组质粒切成约500bp和5800bp的两个片段，所以样品2最可能是插入了目的基因的重组质粒。 四、实验题 37．（2025·山东泰安·二模）研究人员从麻疯树油中筛选出能产生脂肪酶（LA）的两种菌株。菌株1产生的LA1酶可耐高温，菌株2产生的LA2酶具有高催化效率，且LA1基因和LA2基因具有93%的同源性。研究人员采用交错延伸PCR技术获得了重组LA基因，生产出了更高效的酶。 (1)交错延伸PCR技术具体流程如上图（图中仅显示其中一条链延伸情况）。该技术采用LA1、LA2均做模板，起始所需引物相同，引物作用是 。已知过程①起始引物片段均为25个核苷酸，TaqDNA聚合酶延伸速度为1200个碱基/min，本实验的循环扩增条件为：变性30s，复性15s，延伸15s，经过80轮交错循环后，可获得PCR混合产物。第二轮循环后所得重组型子链长度为 个核苷酸。 (2)获得的重组LA基因中，同时具有LA1和LA2基因序列的原因是 。 (3)过程②用到的PM质粒中A为启动子、B为氯霉素抗性基因cat、C为终止子、D为asd-突变基因、E为复制原点，箭头处指不同限制酶的识别位点。asd基因是编码细菌细胞壁的主要成分DAP合成途径的关键酶，asd基因缺失时，将导致菌株生长对DAP依赖。为使目的基因定向插入PM质粒，交错延伸PCR过程中引物的5′端需引入 酶的识别序列。为便于目的基因的检测和鉴定，过程③中应采用asd基因 的受体菌。从含有PM质粒、重组PM质粒的受体菌中将含有重组PM质粒的受体菌筛选出来的思路为 。 【答案】(1) 使DNA聚合酶从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸 625 (2)第一轮以LA1（LA2）为模板合成子链，该片段在第二轮复制时作为引物，结合到LA2（LA1）的模板上继续合成子链，经多轮交错循环扩增，可以使产物同时含有两种基因的序列 (3) XhoI、BamH I 缺失 将正常培养基上分离出的受体菌单菌落，平移印制到含氯霉素的培养基上，在含氯霉素的培养基上无法生长的菌落对应的原菌落即为含有重组PM质粒的受体菌 【难度】0.4 【知识点】基因工程的操作程序综合 【分析】基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤。基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。 【详解】（1）引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。引物的作用使DNA聚合酶从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸。TaqDNA聚合酶延伸速度为1200个碱基/min，延伸15s，即子链合成了300个碱基，第二轮循环后合成了600个碱基，起始引物片段为25个核苷酸，因此第二轮循环后所得重组型子链长度为300+300+25=625个。 （2）第一轮以LA1（LA2）为模板合成子链，该片段在第二轮复制时作为引物，结合到LA2（LA1）的模板上继续合成子链，经多轮交错循环扩增，可以使产物同时含有两种基因的序列。 （3）由于Sal和Pvit2有两个识别位点，若选用则会破坏标记基因或复制原点，因此要选用Xho Ⅰ和BamH I进行切割，为使目的基因定向插入PM质粒，交错延伸的PCR过程引物的5'端需引入Xho Ⅰ和BamH I的识别序列。PM质粒中带有asd基因为了筛选含有PM质粒或重组PM质粒的受体菌，需要选用asd基因缺失的受体菌，在含DAP的培养基上能生长的应为导入了载体或重组载体的受体菌，即过程③中应采用asd基因缺失的受体菌。PM质粒有完整的氯霉素抗性基因cat，重组PM质粒没有完整的氯霉素抗性基因cat，可以将正常培养基上分离出的受体菌单菌落，平移印制到含氯霉素的培养基上，在含氯霉素的培养基上无法生长的菌落对应的原菌落即为含有重组PM质粒的受体菌。 38．（2025·山东菏泽·二模）抗菌肽以其快速杀菌活性、免疫调节特性和促进伤口愈合的潜力成为最有前景的抗菌药物。研究发现将抗菌肽第52位的脯氨酸（密码子为CCC）替换成苏氨酸（密码子为ACG）可增强抗菌肽的杀菌活性。科研人员利用大引物PCR定点诱变技术对抗菌肽基因进行改造的过程如图所示。请回答下列问题： (1)若将抗菌肽第52位的脯氨酸换成苏氨酸，则基因转录模板链对应碱基的变化是 ，据图分析，写出第51位氨基酸对应的密码子是 。 (2)据图分析，“大引物PCR定点诱变”技术中设计的“诱变引物”应选择________。 A．5'…ATAGCAGGC…3' B．5'…ATAACGGGC…3' C．5'…GCCTGCTAT…3' D．5'GCCCGTTAT3' (3)进行大引物PCR定点诱变获得改良的抗菌肽基因，需要进行两次PCR（PCR1和PCR2），产物1最早出现在PCR1的第 轮循环；PCR2的产物除改良的抗菌肽基因外，还有 ；若考虑1个改良的抗菌肽基因通过PCR3快速扩增，则第n次循环共需引物 个。 (4)PCR过程中温度的控制至关重要，若变性时温度偏低，则会导致反应效率降低，原因是 。在PCR扩增改良的抗菌肽基因时，研究人员尝试利用降落PCR技术提高扩增特异性。降落PCR的原理是：在PCR前几个循环先设置较高的复性温度，随后每个循环均降低一定温度，直至达到适宜复性温度。结合PCR原理分析，降落PCR能提高特异性的原因是 。 【答案】(1) G→T、G→C AUA (2)D (3) 3 诱变前的抗菌肽基因 2n (4) 温度偏低时，DNA双链解旋不充分，延伸时模板减少，产生的产物量偏少 PCR前几个循环复性温度较高，减少非特异性产物的形成；随着温度逐步降低，已积累的特异性产物在竞争中占据优势，进一步抑制非特异性扩增，提高了特异性 【难度】0.4 【知识点】遗传信息的转录、遗传信息的翻译、PCR扩增的原理与过程 【分析】关于PCR技术的相关知识：1、概念：PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术。2、原理：DNA半保留复制。3、前提条件：要有一段已知目的基因的核苷酸序以便合成一对引物。4、条件：模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA聚合酶（Taq酶）。5、过程：①高温变性：DNA解旋过程（PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开）；②低温复性：引物结合到互补链DNA上；③中温延伸：合成子链。 【详解】（1）mRNA上3个相邻的碱基决定一个氨基酸为一个密码子，第51位的氨基酸对应的mRNA上的碱基为51×3=153，脯氨酸密码子为CCC，苏氨酸密码子为ACG，若想将抗菌肽第52位的脯氨酸换成苏氨酸，模板链与mRNA碱基互补配对，则基因模板链对应的碱基改变为G变为T、G→C。转录从模板链的3，端开始，模板链上第52位对应的碱基为GGG，因此第51位对应的位点为TAT，氨基酸对应的密码子是AUA。 （2）第51位氨基酸对应的模板链为TAT，第52位氨基酸对应的模板链上的碱基为GGG，因此模板链的顺序为3'TATGGG5'，现将第52位的脯氨酸换成苏氨酸，模板链上GGG→TGC，新的模板链为3'TATTGC5'，“大引物PCR定点诱变”技术中设计的“诱变引物”应选5'GCCCGTTAT3'。 故选D。 （3） 结合DNA的半保留复制，第1、2轮循环的产物均为不等长的DNA ，产物1最早出现在PCR1的第3轮循环：DNA的复制方式位半保留复制，因此PCR2的产物除改良的抗菌肽基因外，还有诱变前的抗菌肽基因。由图可知，通过PCR3扩增时应选引物是引物1和引物2进行扩增。若考虑1个改良的抗菌肽基因通过PCR3快速扩增，第n-1次共有2n-1个DNA，每扩增一个DNA都需要一对引物，因此第n次循环共需引物2n-1×2=2n。 （4）温度偏低时，DNA双链解旋不充分，延伸时模板减少，产生的产物量偏少；PCR前几个循环复性温度较高，减少非特异性产物的形成；随着温度逐步降低，已积累的特异性产物在竞争中占据优势，进一步抑制非特异性扩增，提高了特异性。 39．（2025·山东济南·一模）突变体是植物功能基因组学研究的基础材料，科研人员利用玉米转座酶基因和D元件的双荧光载体的转座系统（如图甲所示），进行二穗短柄草突变体培育实验。转座酶可识别D元件两端的反向重复序列并将其切离。此外，转座酶能够不断将D元件重新连接到染色体的任意位置，即完成了“转座”过程。相关实验过程、结果如下图所示。 (1)使用引物F1/R1通过PCR技术可特异性扩增转座酶基因，原因是 ；可选用 基因作为筛选基因检测植物是否被农杆菌成功转化。 (2)为了检测图中载体中的D元件是否成功在二穗短柄草基因组中发生切离，分别使用F2/R2引物和F2/R4引物对T0代转基因阳性苗进行PCR检测，已知若D元件未发生切离，使用F2/R4引物进行PCR扩增不出条带。据图丙所示植株1至10的电泳结果，既含有转座的细胞又含有未发生转座的细胞的植株是 ，原因是 。 (3)对T0代阳性植株自交得到的T1代的幼根同时观察绿色荧光（GFP）和红色荧光（RFP），得到4组结果：①GFP（+）、RFP（+）；②GFP（+）、RFP（-）；③GFP（-）、RFP（+）；④GFP（-）、RFP（-）。根据上述实验结果推测含有D元件且D元件遗传稳定性高的是 （填序号）组。 (4)研究发现，D元件随机插入染色体后获得具有突变表型的植物个体的比率较低，可能的原因有 。 【答案】(1) 引物是根据转座酶基因的一段已知序列设计合成的（或：引物能与转座酶基因的cDNA特异性结合，与转座酶基因互补的序列） HPH（潮霉素抗性基因）、GFP（绿色荧光蛋白基因）、RFP（红色荧光蛋白基因）） (2) 2-9组 使用F2/R2引物PCR检测有条带，说明检测的细胞中D元件未切离；使用F2/R4引物进行PCR检测有条带，说明检测的细胞中D元件已切离 (3)③ (4)插入的是非基因序列（或未选择表达的基因或内含子或非编码区等，插入D元件后引发的突变为隐性突变，插入D元件后表达的蛋白质功能未受影响或影响不大） 【难度】0.15 【知识点】PCR扩增的原理与过程、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定 【分析】1‌、PCR技术需要引物的主要原因在于DNA聚合酶只能从3'端延伸DNA链，而不能从头开始合成DNA‌。引物的作用是为DNA聚合酶提供一个起始点，使其能够沿着模板链合成新的DNA链； 2、基因工程共四个步骤：第一步，获取目的基因；第二步，基因表达载体的构建；第三步，将目的基因导入受体细胞；第四步，目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）引物是根据目的基因（转座酶基因）两端的碱基序列设计的，引物F1/R1能与转座酶基因两端的特定序列互补配对，所以使用引物F1/R1通过PCR技术可特异性扩增转座酶基因。由图甲可知，载体上含有HPH（潮霉素抗性基因）、GFP（绿色荧光蛋白基因）、RFP（红色荧光蛋白基因）），当植物被农杆菌成功转化后，这些基因会进入植物细胞，可通过检测来判断植物是否被成功转化，所以可选用HPH（潮霉素抗性基因）、GFP（绿色荧光蛋白基因）、RFP（红色荧光蛋白基因））作为筛选基因检测植物是否被农杆菌成功转化； （2）由题意可知，使用F2/R2引物扩增的是包含D元件的片段，使用F2/R4引物扩增时，若D元件未发生切离则扩增不出条带。观察图丙，植株2-9组用F2/R2引物扩增出条带，说明细胞中D元件未切离；用F2/R4引物也扩增出条带，说明部分细胞中的D元件发生了切离（因为未切离时F2/R4扩增不出条带），所以既含有转座的细胞又含有未发生转座的细胞的植株是2-9组； （3）由图甲可知，D元件插入在绿色荧光蛋白基因（GFP）中，若D元件稳定存在，会破坏GFP基因，导致不产生绿色荧光；红色荧光蛋白基因（RFP）与D元件的转座无关。①组GFP(+)、RFP(+)，说明D元件可能发生了转座，从GFP基因中切离出来，使得GFP基因能正常表达；②组GFP(+)、RFP(-)，不符合载体的基因结构特点（正常载体有RFP基因），可能是异常情况；③组GFP (-)、RFP(+)，说明D元件稳定存在于GFP基因中，破坏了GFP基因，且RFP基因正常表达，所以含有D元件且D元件遗传稳定性高的是③组；④组GFP (-)、RFP(-)，不符合载体的基因结构特点（正常载体有RFP基因），可能是异常情况； （4）D元件随机插入染色体后获得具有突变表型的植物个体的比率较低，可能的原因有插入的是非基因序列（或未选择表达的基因或内含子或非编码区等，插入D元件后引发的突变为隐性突变，插入D元件后表达的蛋白质功能未受影响或影响不大）。 40．（2025·山东潍坊·二模）RACE PCR技术可以在仅知mRNA中部分序列的情况下扩增出对应的DNA，部分过程如图1所示。科研人员在开展植物病害监测工作时，发现一株香石竹呈现出异常症状。经初步检测分析，确定其病因系一种新型病毒——病毒A所致。科研人员欲提取病毒A的mRNA，并通过RACE  PCR技术得到对应的DNA。    (1)为获得较高纯度的病毒A的mRNA，先提取 （填“感染病毒A”或“未感染病毒A”）的香石竹细胞内的mRNA，通过逆转录得到DNA单链。将该DNA单链与从 （填“感染病毒A”或“未感染病毒A”）的香石竹细胞内提取的mRNA混合，未与DNA配对的mRNA即为病毒A的mRNA。 (2)病毒A的mRNA序列未知，但科研人员已经检测出了该病毒蛋白质的部分氨基酸序列。利用已知的氨基酸序列无法准确推知该病毒mRNA中的对应序列，原因是 。此时，若要顺利进行RACEPCR，就需要合成多种引物GSP。若病毒A蛋白中的一段氨基酸序列为“-半胱氨酸-酪氨酸-组氨酸-丝氨酸-组氨酸-酪氨酸-”，结合图2密码子表分析，利用该段序列设计出的含有18个碱基的引物GSP有 种。 第一个 碱基 第二个碱基 第三个碱基 U C A G U 苯丙氨酸 苯丙氨酸 亮氨酸 亮氨酸 丝氨酸 丝氨酸 丝氨酸 丝氨酸 酪氨酸 酪氨酸 终止 终止 半胱氨酸 半胱氨酸 终止 色氨酸 U C A G C 亮氨酸 亮氨酸 亮氨酸 亮氨酸 脯氨酸 脯氨酸 脯氨酸 脯氨酸 组氨酸 组氨酸  谷氨酰胺 谷氨酰胺 精氨酸 精氨酸 精氨酸 精氨酸 U C A G 图2  密码子表（部分） (3)RACE  PCR过程中形成的化学键是 。图1过程完成后，将“3'-RACE”和“5'-RACE”获得的双链DNA置于同一PCR反应体系中，不额外添加引物即可获得完整DNA片段，该过程中充当引物的是 （填图1中序号）。 (4)病毒A的mRNA的3'端为连续多个腺嘌呤核糖核苷酸，故引物1应为 。5'-RACE过程中，需要利用特定的酶为②链的3'添加多个相同的脱氧核苷酸，以便根据这一序列合成引物2。为②链的3'添加的脱氧核苷酸 （填“可以”或“不可以”）是胸腺嘧啶脱氧核苷酸，理由是 。 【答案】(1) 未感染病毒A 感染病毒A (2) 密码子的简并/大多数氨基酸可对应多种密码子 256 (3) 磷酸二酯键 ④和⑥ (4) 多个胸腺嘧啶脱氧核苷酸构成的单链 不可以 如果为②链添加多个连续的胸腺嘧啶脱氧核苷酸单链;⑤链会和③链结合并扩增出错误的DNA 【难度】0.4 【知识点】基因工程的操作程序综合 【分析】合成多肽链所需要的原料是氨基酸，生物体内氨基酸的来源主要是食物中蛋白质的消化吸收，另外还存在自身蛋白分解、通过转氨基作用形成的途径。 【详解】（1）为获得较高纯度的病毒 A 的 mRNA，先提取未感染病毒 A的石竹细胞内的 mRNA，通过逆转录得到 DNA 单链。将该 DNA 单链与感染病毒 A的石竹细胞内提取的 mRNA 混合，未配对的 mRNA 即为病毒 A 的 mRNA（感染细胞的 DNA 单链包含病毒 A 的互补序列，未感染细胞无病毒 A 的 mRNA，未配对部分即为病毒 A 的 mRNA）。 （2）已知氨基酸序列无法准确推知 mRNA 序列，原因是一种氨基酸可能由多种密码子编码（密码子的简并性）。由于密码子的简并性，即大多数氨基酸可对应多种密码子，所以利用已知的氨基酸序列无法准确推知该病毒mRNA中的对应序列。 对于病毒A蛋白中“半胱氨酸 - 酪氨酸 - 组氨酸 - 丝氨酸 - 组氨酸 - 酪氨酸 - 半胱氨酸”这一段氨基酸序列，根据密码子表，每个氨基酸对应的密码子种类数相乘可得引物GSP的种类数。半胱氨酸有2种密码子，酪氨酸有2种密码子，组氨酸有2种密码子，丝氨酸有4种密码子，氨基酸序列可能是正向也可能是反向，所以引物GSP的种类数为2×2×2×4×2×2×2 = 256种。 （3）PCR过程中形成的化学键是磷酸二酯键；图1中过程完成后，将“3'-RACE”和“5'-RACE”获得的双链DNA置于同一PCR反应体系中，不额外添加引物可获得完整病毒DNA片段，这是因为3'-RACE和5'-RACE获得的片段互为引物，即④和⑥作为引物可获得完整片段。 （4）病毒A的mRNA的3'端为连续多个腺嘌呤核糖核苷酸，所以其对应的序列是连续多个胸腺嘧啶脱氧核苷酸。5’-RACE 中，给链②的 3’添加的脱氧核苷酸不可以是胸腺嘧啶脱氧核苷酸，理由是如果为②链添加多个连续的胸腺嘧啶脱氧核苷酸单链；⑤链会和③链结合并扩增出错误的DNA。 试卷第1页，共3页 试卷第1页，共3页 学科网（北京）股份有限公司 $$ 专题17 基因工程 五年考情 考情分析 基因工程 2025年山东卷第25题 2024年山东卷第13题 2024年山东卷第25题 2023年山东卷第25题 2022年山东卷第13题 2022年山东卷第25题 2021年山东卷第13题 2021年山东卷第25题 近五年山东高考生物试卷，基因工程考点考查频繁。重点考查基因工程的基本工具，如限制酶、DNA连接酶；基本操作程序，像目的基因获取、表达载体构建等，常结合实际案例，考查学生知识运用与分析能力。题目难度系数大；其中启动子的插入位点和插入方向、报告基因的表达等都需要学生有很强的理解信息、获取信息的能力、以及综合运用知识解决问题的科学思维和科学探究能力，通过基因工程考查学生的结构与功能观。 一、单选题 1．（2024·山东·高考真题）关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法正确的是（　　） A．整个提取过程中可以不使用离心机 B．研磨液在4℃冰箱中放置几分钟后，应充分摇匀再倒入烧杯中 C．鉴定过程中DNA双螺旋结构不发生改变 D．仅设置一个对照组不能排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰 2．（2022·山东·高考真题）关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法错误的是（    ） A．过滤液沉淀过程在4℃冰箱中进行是为了防止DNA降解 B．离心研磨液是为了加速DNA的沉淀 C．在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色 D．粗提取的DNA中可能含有蛋白质 3．（2021·山东·高考真题）粗提取 DNA 时，向鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水并搅拌，过滤后所得滤液进行下列处理后再进行过滤，在得到的滤液中加入特定试剂后容易提取出 DNA相对含量较高的白色丝状物的处理方式是（    ） A．加入适量的木瓜蛋白酶 B．37～40℃的水浴箱中保温 10～15 分钟 C．加入与滤液体积相等的、体积分数为 95%的冷却的酒精 D．加入 NaCl 调节浓度至 2mol/L→过滤→调节滤液中 NaCl 浓度至 0．14mol/L 二、解答题 4．（2025·山东·高考真题）种子休眠是抵御穗发芽的一种机制。通过对Ti质粒的改造，利用农杆菌转化法将Ti质粒上的T-DNA随机整合到小麦基因组中，筛选到2个种子休眠相关基因的插入失活纯合突变体。与野生型相比，突变体种子的萌发率降低。小麦基因组序列信息已知。 (1)Ti质粒上与其在农杆菌中的复制能力相关的结构为 。选用图甲中的SmaI对抗除草剂基因X进行完全酶切，再选择SmaI和 对Ti质粒进行完全酶切，将产生的黏性末端补平，补平时使用的酶是 。利用DNA连接酶将酶切后的包含抗除草剂基因X的片段与酶切并补平的Ti质粒进行连接，构建重组载体，转化大肠杆菌；经卡那霉素筛选并提取质粒后再选用限制酶 进行完全酶切并电泳检测，若电泳结果呈现一长一短2条带，较短的条带长度近似为 bp，则一定为正向重组质粒。 (2)为证明这两个突变体是由于T-DNA插入到小麦基因组中同一基因导致的，提取基因组DNA，经酶切后产生含有T-DNA的基因组片段（图乙）。在此酶切过程中，限于后续PCR难以扩增大片段DNA，最好使用识别序列为 （填“4”“6”或“8”）个碱基对的限制酶，且T-DNA中应不含该酶的酶切位点。需首先将图乙的片段 ，才能利用引物P1和P2成功扩增未知序列。PCR扩增出未知序列后，进行了一系列操作，其中可以判断出2条片段的未知序列是否属于同一个基因的操作为 （填“琼脂糖凝胶电泳”或“测序和序列比对”）。 (3)通过农杆菌转化法将构建的含有野生型基因的表达载体转入突变植株，如果检测到野生型基因， （填“能”或“不能”）确定该植株的表型为野生型。 5．（2024·山东·高考真题）研究发现基因L能够通过脱落酸信号途径调控大豆的逆境响应。利用基因工程技术编辑基因L，可培育耐盐碱大豆品系。在载体上的限制酶BsaI切点处插入大豆基因L的向导DNA序列，将载体导入大豆细胞后，其转录产物可引导核酸酶特异性结合基因组上的目标序列并发挥作用。载体信息、目标基因L部分序列及相关结果等如图所示。 (1)用PCR技术从大豆基因组DNA中扩增目标基因L时，所用的引物越短，引物特异性越 （填“高”或“低”）。限制酶在切开DNA双链时，形成的单链突出末端为黏性末端，若用BsaI酶切大豆基因组DNA，理论上可产生的黏性末端最多有 种。载体信息如图甲所示，经BsaI酶切后，载体上保留的黏性末端序列应为5'- -3'和5'- -3'。 (2)重组载体通过农杆菌导入大豆细胞，使用抗生素 筛选到具有该抗生素抗性的植株①～④。为了鉴定基因编辑是否成功，以上述抗性植株的DNA为模板，通过PCR扩增目标基因L，部分序列信息及可选用的酶切位点如图乙所示，PCR产物完全酶切后的电泳结果如图丙所示。据图可判断选用的限制酶是 ，其中纯合的突变植株是 （填序号）。 (3)实验中获得1株基因L成功突变的纯合植株，该植株具有抗生素抗性，检测发现其体细胞中只有1条染色体有T-DNA插入。用抗生素筛选这个植株的自交子代，其中突变位点纯合且对抗生素敏感的植株所占比例为 ，筛选出的敏感植株可用于后续的品种选育。 6．（2023·山东·高考真题）科研人员构建了可表达J-V5融合蛋白的重组质粒并进行了检测，该质粒的部分结构如图甲所示，其中V5编码序列表达标签短肽V5。    (1)与图甲中启动子结合的酶是 。除图甲中标出的结构外，作为载体，质粒还需具备的结构有 （答出2个结构即可）。 (2)构建重组质粒后，为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，需进行PCR检测，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物 。已知J基因转录的模板链位于b链，由此可知引物F1与图甲中J基因的 （填“a链”或“b链”）相应部分的序列相同。 (3)重组质粒在受体细胞内正确表达后，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表达水平，结果如图乙所示。其中，出现条带1证明细胞内表达了 ，条带2所检出的蛋白 （填“是”或“不是”）由重组质粒上的J基因表达的。7．（2022·山东·高考真题）某种类型的白血病由蛋白P引发，蛋白UBC可使P被蛋白酶识别并降解，药物A可通过影响这一过程对该病起到治疗作用。为探索药物A治疗该病的机理，需构建重组载体以获得融合蛋白FLAG-P和FLAG-P△。P△是缺失特定氨基酸序列的P，FLAG是一种短肽，连接在P或P△的氨基端，使融合蛋白能与含有FLAG抗体的介质结合，但不影响P或P△的功能。 (1)为构建重组载体，需先设计引物，通过PCR特异性扩增P基因。用于扩增P基因的引物需满足的条件是 、为使PCR产物能被限制酶切割，需在引物上添加相应的限制酶识别序列，该限制酶识别序列应添加在引物的 （填“3'端”或“5'端”）。 (2)PCR扩增得到的P基因经酶切连接插入载体后，与编码FLAG的序列形成一个融合基因，如图甲所示，其中“ATGTGCA”为P基因编码链起始序列。将该重组载体导入细胞后，融合基因转录出的mRNA序列正确，翻译出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正确，但P基因对应的氨基酸序列与P不同。据图甲分析，出现该问题的原因是 。修改扩增P基因时使用的带有EcoRⅠ识别序列的引物来解决该问题，具体修改方案是 。 (3)融合蛋白表达成功后，将FLAG-P、FLAG-P△、药物A和UBC按照图乙中的组合方式分成5组。各组样品混匀后分别流经含FLAG抗体的介质，分离出与介质结合的物质并用UBC抗体检测，检测结果如图丙所示。已知FLAG-P和FLAG-P△不能降解UBC，由①②③组结果的差异推测，药物A的作用是 ；由②④组或③⑤组的差异推测，P△中缺失的特定序列的作用是 。 (4)根据以上结果推测，药物A治疗该病的机理是 。 8．（2021·山东·高考真题）人类γ基因启动子上游的调控序列中含有 BCL11A 蛋白结合位点，该位点结合 BCL11A 蛋白后，γ基因的表达被抑制。通过改变该结合位点的序列，解除对γ基因表达的抑制，可对某种地中海贫血症进行基因治疗。科研人员扩增了γ基因上游不同长度的片段，将这些片段分别插入表达载体中进行转化和荧光检测，以确定 BCL11A 蛋白结合位点的具体位置。相关信息如图所示。 （1）为将扩增后的产物定向插入载体指导荧光蛋白基因表达，需在引物末端添加限制酶识别序列。据图可知，在 F1～F7末端添加的序列所对应的限制酶是 ，在 R 末端添加的序列所对应的限制酶是 。本实验中，从产物扩增到载体构建完成的整个过程共需要 种酶。 （2）将构建的载体导入除去 BCL11A 基因的受体细胞，成功转化后，含 F1～F6与 R 扩增产物的载体表达荧光蛋白，受体细胞有荧光，含 F7与 R 扩增产物的受体细胞无荧光。含 F7 与 R 扩增产物的受体细胞无荧光的原因是 。 （3）向培养液中添加适量的雌激素，含 F1～F4与 R 扩增产物的受体细胞不再有荧光，而含 F5～F6与 R 扩增产物的受体细胞仍有荧光。若γ基因上游调控序列上与引物序列所对应的位置不含有 BCL11A 蛋白的结合位点序列，据此结果可推测，BCL11A 蛋白结合位点位于 ，理由是 。 一、单选题 1．（2025·山东潍坊·三模）融合PCR技术采用具有互补末端的引物，形成具有重叠链的PCR产物，通过PCR产物重叠链的延伸，从而将不同来源的任意DNA片段连接起来（如图）。下列说法错误的是（    ） A．基因甲至少经3个循环才能获得含引物P2的双链等长DNA B．不能为提高扩增效率把四种引物同时加入一个扩增体系 C．图中融合PCR第一步的两条链重叠部位可互相作为另一条链的引物 D．经融合PCR获得64个融合基因至少消耗63个引物P4 2．（2025·山东临沂·三模）下列有关“DNA粗提取与鉴定”、“DNA片段的扩增及电泳鉴定”实验的叙述，错误的是（　　） A．设置一组加二苯胺但是不加DNA的对照组用来排除二苯胺受热变蓝的可能 B．提取到的白色丝状物直接与一定浓度的二苯胺溶液混合，沸水浴5min后变蓝 C．电泳实验中待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时停止电泳 D．琼脂糖凝胶中加入核酸染料，便于在300nm的紫外灯下检测扩增产物 3．（2025·山东济南·二模）毕赤酵母是一种能直接利用甲醇的微生物，其含有的醇氧化酶基因(AOX1)强效启动子在甲醇存在时被激活，可以驱动外源基因的高效表达。人体蛋白MT1-MMP定位在细胞膜上，并在多种肿瘤中被高表达出，MT1-MMP能促进肿瘤转移。为进一步研究肿瘤转移机制，科研人员将MT1-MMP基因转化至毕赤酵母，先将转基因个体进行低密度发酵，然后再进行高密度发酵，最终获得目标蛋白。下列相关说法正确的是（    ） A．转基因毕赤酵母和大肠杆菌作为发酵菌种都具有发酵周期短的优点 B．目标蛋白的产量受发酵培养基成分、甲醇、温度、pH的影响 C．可将MT1-MMP基因插入AOX1中以便通过甲醇调控基因表达 D．甲醇的作用是作为碳源和氮源以及诱导目标蛋白的表达 4．（2025·山东青岛·二模）CRISPR/Cas9系统包含向导RNA（gRNA）和核酸酶Cas9，可以对哺乳动物细胞进行基因组编辑。编辑时，Cas9蛋白在gRNA的引导下，结合基因组的特定位点并进行切割。科研人员利用图中gRNA和Cas9共表达质粒，对体外培养的小鼠细胞中A基因的表达进行调控。下列说法错误的是（　　）    A．可以依据A基因的部分序列设计共表达质粒中的编码gRNA序列 B．编码gRNA的序列需要整合到受体细胞基因组DNA上才能发挥作用 C．导入该质粒后使用含潮霉素的液体培养基筛选受体细胞 D．用抗原—抗体杂交技术检测结果为部分细胞A蛋白表达量降低 5．（2025·山东济南·二模）单亲二体(UPD)是指体细胞中某对同源染色体来自同一亲本，其它染色体组成正常的个体，其染色体组成是2n。微卫星DNA(STR)的核心序列为2-6个碱基，重复次数和分布个数因染色体而异，可以随染色体稳定地遗传给下一代。可使用STR检测技术对UPD进行诊断：先在各条染色体上找到STR区域，在STR区域的两侧设计PCR引物，每对引物当中有一条是带荧光标记的，在同一体系中进行PCR得到带有不同荧光标记的扩增产物，经电泳后被检测到，然后进行比对、确认。下列说法错误的是（    ） A．同一体系中进行PCR使用的引物的复性温度应大致相同 B．用含有核酸染料的载样缓冲液来鉴定扩增得到的PCR产物 C．UPD现象可能会导致隐性遗传病以显性方式传递 D．检测过程需要分析多个STR位点以确定是否为UPD 6．（2025·山东青岛·二模）为能快速找到特定抗原的高亲和力抗体，研究者构建抗体文库。从免疫后动物的特定细胞中提取总mRNA，反转录成cDNA，经PCR扩增后，构建重组载体，再把重组载体转化到宿主细胞，形成含不同抗体基因的细胞集合，即抗体文库。下列说法错误的是（　　） A．“特定细胞”是B淋巴细胞 B．反转录出的cDNA全部是抗体基因 C．基因需要定向插入启动子和终止子中间才能表达 D．抗体分布在宿主细胞表面有利于进行抗体筛选 7．（2025·山东青岛·二模）DNA因构象不同在电泳时的迁移速率有所差异。超螺旋DNA以超螺旋形式存在，分子体积小；线性DNA分子伸展，在凝胶中移动时受到的摩擦力较大；开环DNA是由环状DNA双链中的一条链发生断裂形成，分子更松散。下列说法正确的是（　　） A．电泳时需要留一个加样孔加入标准参照物 B．电泳时电泳指示剂加在凝胶中，核酸染料与PCR产物混合加入加样孔 C．电泳后的凝胶置于紫外灯下，看到的DNA条带呈蓝色 D．三种构象的DNA在不同浓度的凝胶中迁移速率一定不同 8．（2025·山东青岛·二模）微生物底盘细胞是指经过基因工程改造、用于高效表达目标蛋白的宿主细胞系统。利用合成生物学相关技术对底盘细胞进行遗传及代谢途径改造，可以构建出较为理想的细胞工厂，具体流程见图。研究者已用毕赤酵母作为底盘细胞来生产次生代谢产物萜类物质。下列说法错误的是（　　）      A．毕赤酵母生产的萜类物质是酵母生长所必需的物质 B．某基因失活后菌株无法存活可以确定该基因是必需基因 C．去除野生菌株的非必需基因降低底盘细胞的复杂性，保证目的基因的高效表达 D．选择大肠杆菌做底盘细胞直接合成的胰岛素通常不具备生物活性 9．（2025·山东济南·二模）农杆菌感知到植物分泌的酚类化合物后，会开启其侵染过程，胞内蛋白V2识别并切割T-DNA的边界序列，切割后的T-DNA的一条链与V2形成复合物经通道复合体进入植物细胞。植物细胞被农杆菌侵染后会合成磷酸化的蛋白(VIP1-P)激活抗病相关基因的表达。同时，农杆菌的VF蛋白通过通道复合体进入植物细胞使VIP1-P去磷酸化且去除T-DNA上的V2为T-DNA的整合做准备。下列说法正确的是（    ） A．V2识别切割T-DNA并与其形成复合物的过程主要由线粒体供能 B．VF降低了植物的抗菌能力并促进了T-DNA与染色体DNA的整合 C．T-DNA与VF借助细胞膜上的蛋白质通过胞吞进入细胞 D．农杆菌侵染进入植物细胞的过程未涉及氢键、磷酸二酯键的断裂与形成 10．（2025·山东泰安·三模）关于“DNA的粗提取与鉴定”、“DNA片段的扩增及电泳鉴定”实验，下列说法正确的是（    ） A．将过滤的洋葱研磨液低温放置几分钟，取沉淀物备用 B．在白色丝状物中加入二苯胺试剂即可出现蓝色 C．根据待分离DNA片段的大小，用扩增缓冲液配制成琼脂糖溶液 D．加样孔要留出一个孔加入指示分子大小的标准参照物 11．（2025·山东菏泽·二模）下列关于“DNA的粗提取与鉴定”和“DNA片段的扩增及电泳鉴定”实验的叙述，错误的是（    ） A．DNA不溶于95%的冷酒精，但可溶于2mol/LNaCl溶液 B．将洋葱切碎、研磨、过滤，滤液放置4℃冰箱中静置几分钟后，DNA存在于上清液中 C．在凝胶电泳中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关 D．凝胶载样缓冲液中加入的核酸染料能与DNA分子的结合，便于在紫外灯下观察 12．（2025·山东日照·二模）PCR和琼脂糖凝胶电泳是基因工程中常用的两种技术，下列对其中所用试剂和操作的说法正确的是（　　） A．PCR所用微量离心管、微量移液器、枪头都要进行高压蒸汽灭菌 B．PCR扩增前，应根据待扩增DNA片段的长度设置合适的延伸温度 C．需将扩增得到的PCR产物与内含核酸染料的缓冲液混合后进行加样 D．DNA分子较大时，可适当降低凝胶浓度来提高DNA分子的迁移速率 13．（2025·山东泰安·二模）染色体上的端粒DNA由短的串联重复序列组成，同种生物的该序列相同。少数缺乏端粒酶活性的肿瘤细胞可通过端粒延长替代机制（ALT）维持端粒长度。ALT机制如下：第一条染色体端粒的末端①链结合到第二条染色体端粒的末端②链上并延伸；随后①链脱离，在RNA引物和DNA聚合酶的作用下，新延长的①链被转化成双链形式。这个过程可被重复数十次，使得序列信息从一个端粒传递到另一端粒上。下列说法错误的是（    ） A．①链的延伸过程以②链作为模板，该过程不需要合成引物 B．DNA聚合酶只能从核酸片段3′端延伸，这导致端粒DNA5′端比3′端短 C．进行ALT的肿瘤细胞中端粒酶基因甲基化程度可能较高 D．非同源染色体间通过ALT机制实现了基因重组，增加了遗传的多样性 14．（2025·山东泰安·二模）双向启动子可同时结合两个RNA聚合酶来驱动下游基因的表达，研究人员构建了如图所示的表达载体，以检测双向启动子作用效果。下列分析正确的是（    ）    A．表达载体中GUS基因和LUC基因转录时使用同一条DNA单链为模板 B．为连入GUS基因，需用Sal I和Sph I酶切已整合了双向启动子及LUC基因的质粒 C．在培养基中添加壮观霉素可筛选出成功导入表达载体的受体细胞 D．通过观察是否出现荧光和蓝色物质可检测双向启动子的作用效果 15．（2025·山东潍坊·一模）提取细菌中质粒时常通过调节pH使DNA先变性再复性，拟核DNA分子因为无法复性与其他较大的分子沉淀下来，质粒可以复性与其他小的核酸分子留在上清液中。下列说法错误的是（    ） A．DNA变性过程中会发生氢键的断裂 B．提取液中应加入一定量的核糖核酸水解酶 C．将提取液中的质粒加乙醇析出后，可以再溶于2mol/L的NaCl溶液中 D．通过电泳分离质粒时，待分离的质粒越大，配置的琼脂糖溶液浓度越高 16．（2025·山东枣庄·二模）采用焦磷酸光化测序法进行DNA测序的原理是：将待测DNA链固定到一个磁珠上，将磁珠包被在单个油水混合小滴（乳滴）中，在该乳滴里进行独立的DNA复制，四种脱氧核苷三磷酸依照T、A、C、G的顺序一个一个进入该乳滴，如果发生碱基配对，就会释放一个焦磷酸（PPi），PPi经过一系列酶促反应后发出荧光。下列说法错误的是（    ）    A．脱氧核苷三磷酸通过磷酸二酯键把脱氧核苷酸接到多核苷酸链的3'-OH末端 B．PPi经过一系列的酶促反应后，释放出的能量一部分可转化为光能 C．当胞嘧啶脱氧核苷三磷酸进入后能发出荧光，说明此位置模板链上为G D．若将四种脱氧核苷三磷酸同时加入反应体系中，可大大提高DNA测序的效率 17．（2025·山东枣庄·二模）下列与DNA有关的实验，说法正确的是（    ） A．DNA粗提取时加入冷酒精出现白色丝状物后不能用离心法收集 B．PCR缓冲液中Mg2+作用是激活DNA聚合酶，浓度越高，酶活性越大 C．DNA电泳指示剂需要加入到熔化之后凝固之前的琼脂糖中 D．DNA电泳指示剂的作用主要用来指示何时停止电泳 18．（2025·山东济南·一模）依赖解旋酶DNA等温（65℃）扩增技术可实现体外扩增DNA分子。利用解旋酶将DNA双链在恒温下解开，在DNA聚合酶的作用下形成子链的过程如图所示。下列说法错误的是（    ）    A．推测图中1为DNA聚合酶，2为解旋酶 B．DNA单链结合蛋白的直接作用是使复制双向进行 C．解旋酶的作用是破坏氢键 D．该技术中每次循环包括解旋、复性、延伸三个过程 19．（2025·山东青岛·一模）野生大豆的SAMS基因具有提高抗逆性的作用。水稻是一种盐敏感型作物，为提高水稻的抗盐碱胁迫能力，研究者将野生大豆的SAMS基因转入水稻细胞内，从而培养出转基因水稻株系，具体过程如图。下列说法错误的是（    ） A．图示过程中发生了两次转化 B．Ⅰ和Ⅲ都需使用固体培养基 C．Ⅰ中的筛选可使用PCR技术 D．获得的转基因水稻苗都具备抗盐碱能力 20．（2025·山东青岛·一模）我国科学家敲除猪的糖抗原合成基因（β4GalNT2），转入相应的调节基因后，将基因编辑猪的单个肾移植给猕猴，同时切除猕猴的自体双肾，最终移植肾存活184天。在移植成功5个月内，猕猴的移植肾功能完全正常，之后出现逐渐加重的蛋白尿。下列说法正确的是（    ） A．基因编辑猪的成功体现了动物细胞的全能性 B．出现蛋白尿的原因主要是肾小管细胞凋亡导致 C．猪和猕猴肾脏的差异体现了基因的选择性表达 D．敲除β4GalNT2能改变膜蛋白种类，降低免疫排斥反应 21．（2025·山东青岛·一模）采用PCR技术可获取并扩增目的基因。下列说法正确的是（    ） A．若PCR的模板是mRNA，完成扩增只需要逆转录酶 B．预变性有利于模板DNA充分解聚为单链 C．复性温度太高会导致引物和模板的非特异性结合增加 D．一个DNA模板完成第20轮循环需要（220-2）个引物 22．（2025·山东青岛·一模）已知紫外线（UV）可诱导DNA单链上相邻的T之间相互结合形成嘧啶二聚体，阻碍碱基正常配对而导致复制错误引起突变，DNA修复机制对维持遗传稳定性至关重要。研究人员发现某细菌中存在两种如图所示修复机制：①光复活修复：光复活酶（PRE）在可见光下直接切割二聚体，恢复原结构；②暗修复：无需光照，通过切除损伤单链并重新合成。下列说法正确的是（    ）    A．PRE可将嘧啶二聚体的磷酸二酯键断开 B．暗修复过程中还需消耗原料、能量和引物 C．PRE基因发生碱基替换后，在光照下PRE的修复功能可能正常 D．UV诱导DNA形成嘧啶二聚体引起的变异不可遗传 二、多选题 23．（2025·山东临沂·三模）某研究小组构建了能表达ACTA1-GFP融合蛋白的重组质粒，该重组质粒的部分结构如下图所示。下列叙述错误的是（    ）    注：F1和F2表示上游引物，R1和R2表示下游引物 A．RNA聚合酶与启动子结合，调控ACTA1基因和GFP基因的表达 B．仅用F2和R1一对引物无法确定ACTA1基因插入方向是否正确 C．ACTA1基因转录的模板链是a链，引物F1与a链的部分序列相同 D．若用引物F2和R2进行PCR，能更好地区分ACTA1-GFP基因纯合子和杂合子 24．（2025·山东济南·二模）进行性脊柱性肌萎缩症(SMA)与假肥大型进行性肌营养不良症(DMD)两种遗传病症状相似，均会导致肌肉力量不足，临床上较难区分。SMA由等位基因A、a控制，DMD由等位基因B、b控制，A、a和B、b不位于Y染色体上。图1为两种遗传病的系谱图，图2为家系中部分个体两种病相关基因PCR扩增后获得的电泳（可分离不同基因，M为标准样品）图，不考虑突变和互换。下列说法错误的是（    ） A．Ⅲ₁的DMD致病基因来自I₂ B．Ⅱ₂和Ⅱ₃再生一个患病男孩的概率为5/16 C．可调查Ⅰ₂父亲是否患病来判断I₂的患病类型 D．a基因可能由A基因发生碱基对的增添突变而来 25．（2025·山东泰安·二模）某遗传病家系的系谱图如图甲所示，已知该遗传病由正常基因A突变成A1或A2引起，且A1对A和A2为显性、A对A2为显性。为确定家系中某些个体的基因型，分别根据A1和A2两种基因的序列，设计鉴定该遗传病基因的引物进行PCR扩增，电泳结果如图乙所示。下列说法正确的是（    ） A．表型相同的个体电泳结果不一定相同，电泳结果相同的个体表型一定相同 B．若Ⅱ3的电泳结果有2条条带，则Ⅱ2和Ⅲ3基因型相同的概率为1/3 C．若Ⅲ5的电泳结果仅有1条条带，则Ⅱ6的基因型只有1种可能 D．若Ⅲ1与正常女子结婚，生育后代患病的概率为1/2 26．（2025·山东枣庄·一模）关于“DNA片段的扩增及电泳鉴定”（实验1）和“DNA的粗提取与鉴定”（实验2）的实验操作，下列相关叙述错误的是（　　） A．实验1中，DNA电泳时需要在琼脂糖熔化之后凝固之前加入核酸染料 B．实验1中，将扩增得到的PCR产物进行凝胶电泳，加样前应先接通电源 C．实验2中，取洋葱研磨液的上清液，加入等体积的体积分数为70%的冷酒精后析出DNA D．实验2中，需先将白色丝状物溶于2mol/L的NaCl溶液中，再加二苯胺试剂并进行沸水浴，用于鉴定DNA 三、解答题 27．（2025·山东临沂·三模）荧光素酶（Luc蛋白）由550个氨基酸组成，分为N端和C端2个功能片段，即NLuc蛋白 （2-416氨基酸） 和CLuc蛋白 （398—550氨基酸），两部分不能自动重组并发挥作用；将目标蛋白OsBIK1蛋白和OsXLG2蛋白分别与NLuc蛋白和CLuc蛋白融合，若2个目标蛋白相互作用，则NLuc蛋白和CLuc蛋白能成功组装为荧光素酶并分解荧光素发出荧光。科研人员构建了可表达OsBIK1-HA-NLuc融合蛋白的表达载体1和可表达CLuc-OsXLG2融合蛋白的表达载体2并进行了检测，如图1所示，图中HA为标签蛋白（用于目的蛋白的检测、示踪等）的编码序列。 (1)构建重组质粒1时，需要把OsBIK1基因的对应终止密码子的3个碱基去除，原因是 ；图中HA编码序列插入OsBIK1基因编码链的 （填“5'端”或“3'端”），编码链为转录时所用模板链的互补链。 (2)如果用抗Luc蛋白抗体分别检测表达载体1和2融合蛋白表达情况，结果如图2，可优先选用抗 蛋白抗体进一步区分条带1为 融合蛋白。 (3)为了满足应用常需要在载体中构建诱导型启动子，当诱导物存在时可以激活或抑制目的基因的表达。双向启动子可同时结合两个RNA聚合酶来驱动下游基因的表达，研究人员已经构建了下图所示的基因表达载体，以检测双向启动子作用效果。试分析：为连入GUS基因，需用 酶切已整合了双向启动子及LUC基因的质粒，若观察到 则可确认双向启动子起作用。 28．（2025·山东济南·二模）研究发现水稻MEL2基因等位突变体mel2会导致个体不能产生雌配子，个体的花粉育性保持完全正常，其他农艺性状均不受影响。科研人员将野生型MEL2基因经PCR扩增后接入图甲中含有杀花粉基因ZM-AA1和糊粉层特异性表达的红色荧光基因DsRed2的双T-DNA载体中，以获得新的品系，构建过程如图所示。    (1)通过PCR扩增水稻MEL2基因并正确连入图甲载体中，使用的F引物5'端需要添加的序列为5' CACTGC3'（写出15bp序列）。 (2)使用Bb.Bts1对图甲载体插入位点可得到 个缺口，推测图中94 ℃处理的目的是 ；使用LacZ作为菌落筛选基因时，重组转化后的阳性菌落呈 色（填“蓝”或“白”）。 (3)将重组载体导入mel2纯合突变体，可在阳性转化苗（两T-DNA均可检测到）的后代中挑选出只含第二个T-DNA插入的株系A，原因是 ；假设株系A只有一个T-DNA插入且不影响其他基因功能，该株系自交后产生的种子中红色荧光种子的比例为 。 29．（2025·山东潍坊·三模）科研人员通过CRISPR/Cas9系统敲除小鼠的PPP2R3A基因，研究该基因对小鼠心脏功能的影响。其过程为：构建含sgRNA基因和Cas9酶基因的表达载体，通过显微注射将该表达载体导入小鼠的卵细胞中，利用CRISPR/Cas9系统敲除PPP2R3A基因构建模型小鼠。图1为Cas9酶基因的DNA片段且转录方向从左到右；图2为所用质粒及质粒上有关限制酶的识别序列和酶切位点示意图，Ampr为氨苄青霉素抗性基因、Tetr为四环素抗性基因。 (1)研究表明，Cas9酶基因两侧没有限制酶切位点，在构建表达载体的过程中，可借助PCR技术在引物的 （填“5′”或“3′”）端添加限制酶切序列；引物1序列区由5′→3′的碱基序列为 ，引物2序列区应含有限制酶 的识别序列。 (2)研究发现，实际操作时，只需敲除PPP2R3A基因的部分碱基序列，即可使其失去功能。科研小组用PPP2R3A基因敲除的模型小鼠（KO组）与未做处理的小鼠（WT组）进行杂交，获得子代小鼠（F1组）。三组小鼠PPP2R3A基因的电泳图谱如下图所示。 据图分析，PPP2R3A基因的长度为 ；敲除掉的碱基序列长度为 ；4、5、6、12、14是 组小鼠的电泳图。 (3)该科研小组检测了小鼠心脏组织中相关基因的表达情况，结果如下表所示（RGS19为参与心脏发育的蛋白信号转导调控因子）。 组别 PPP2R3A mRNA PPP2R3A蛋白 RGS19 WT组 1.31 0.24 0.87 KO组 0.76 0.14 1.21 据表分析可知，与WT组相比，KO组 。由此可以得出结论是 。 30．（2025·山东泰安·三模）科研人员尝试利用鸡新城疫病毒（HB1）基因和传染性支气管炎病毒（H120）基因，采用基因工程技术培育转基因工程菌，以制备二联体疫苗，所需要的限制酶的识别序列和切割位点如表所示，培育流程如图所示。 限制酶 BclI PvitⅡ XbaI Sau3AI 识别序列和切割位点（5′-3'） T↓GATCA CAG↓CTG T↓CTAGA ↓GATC (1)根据图示信息，应选用限制酶 切割质粒，不选用其他限制酶的原因是 。 (2)为保证融合基因与质粒的正向连接，在设计PCR引物时，应在b链对应引物的 （填“3'”或“5′”）端添加限制酶 （填种类）的识别序列。根据图表信息，写出该引物的12个碱基序列5′- -3′。 (3)为筛选出导入了基因表达载体的大肠杆菌，培养基甲中应添加 （填“四环素”或“青霉素”）,培养基乙中应添加 （填“四环素”或“青霉素”）,菌落 （填图中数字）中的大肠杆菌可用来制备疫苗。 31．（2025·山东青岛·二模）转录因子是一类在基因表达调控中起关键作用的蛋白质，主要功能是通过结合DNA特定序列，控制基因转录的起始和强度。WRKY基因表达的转录因子在植物的抗逆方面发挥着重要的作用。为提高菠萝的抗干旱能力，研究人员利用Gateway克隆技术构建WRKY基因的过表达载体，培育出抗干旱的转基因菠萝。Gateway克隆技术包含BP反应和LR反应两个阶段。    (1)为得到两端含attB的WRKY基因，可采用 技术，完成该技术需要提供的物质有 。 (2)BP反应中，带有attB序列的WRKY基因与pENTR载体混合，加入BP克隆酶，attB和attP位点之间会发生互换，形成 。这种技术与传统的构建方法相比，区别是 。 (3)LR反应中，pENTR载体上的attL位点和pGWB605载体上的attR位点在LR克隆酶的催化下发生互换，从而将WRKY基因转移到pGWB605载体上。转化大肠杆菌后，在培养基上存活的一定是含WRKY基因的pGWB605载体，而不是pGWB605载体，理由是 。 (4)pGWB605载体含植物强启动子，能 。将重组载体导入菠萝愈伤组织后，通过 技术获得转基因菠萝植株。除了比较转基因菠萝和非转基因菠萝细胞中的WRKY转录因子的含量外，还需要从 水平来检测转基因菠萝是否培育成功。 32．（2025·山东日照·二模）研究人员利用纤维素生产菌(酪氨酸合成缺陷型)合成了黑色纤维素薄膜。蛋白T7RNAP是一种噬菌体RNA聚合酶(T7RNAP的N端或C端单独存在时不能发挥作用，二者结合可形成完整的T7RNAP)，nMag和pMag是在蓝光环境下能够相互结合的两种光敏蛋白。研究人员通过PCR技术获融合基因，并将不同类型的启动子与相关基因连接，构建成基因表达载体，然后将其导入受体菌，获得了所需的工程菌。 (1)研究人员利用PCR技术实现编码T7RNAPN端的基因下游序列与编码nMag的基因上游序列的无缝连接，获得编码T7RNAPN端-nMag的融合基因，由图1可知，引物2的5＇端9个碱基序列为5＇ 3＇，如此设计引物2的目的是 。用同样的方法获得编码pMag-T7RNAPC端的融合基因。    (2)通用型启动子能够被纤维素生产菌的RNA聚合酶识别，结构完整的T7RNAP对T7启动子表现出高度的特异性。为获得蓝光诱导着色的纤维素生产工程菌，构建了下图所示的基因表达载体，图中3个启动子中，表示通用型启动子的是 (填序号)，表示T7启动子的是 (填序号)。    (3)将构建好的载体导入纤维素生产菌前，通常用 处理受体细胞。为筛选出能够生产黑色纤维素薄膜的工程菌，培养基中应添加 。 33．（2025·山东青岛·一模）水体中的雌激素能使斑马鱼细胞产生E蛋白，激活卵黄蛋白原（vtg）基因的表达，因此斑马鱼可用于监测环境雌激素污染程度。为了实现可视化监测，科学家将图1中的vtg基因与图2中Luc基因载体连接，形成vtg-Luc基因重组载体，成功培育了转基因斑马鱼，当极微量雌激素污染水体，斑马鱼的肝脏就发出荧光。Luc表示荧光素酶基因（无启动子），Kanr为卡那霉素抗性基因，ori为复制起点，BamHI、BclI、HindIII、BsrGI为限制酶，→表示转录方向。 注：图1DNA片段不含有图2所示限制酶的识别序列 (1)为使vtg基因与Luc基因载体形成重组载体，选用限制酶 切割Luc基因载体可降低“空载”概率。通过PCR技术获取vtg基因时，需设计合适的引物。依据图示信息，推测引物1包含的碱基序列为5′ 3′。（写出已知的所有碱基序列） (2)将“vtg-Luc基因重组载体”导入大肠杆菌中进行扩增，为便于筛选，应将大肠杆菌接种在含 的培养基中，转基因成功的斑马鱼只在肝脏中发出荧光指示污染，其原因是 。 (3)Luc基因载体上有一段P2A序列，其功能如图所示，据此推测P2A的作用 。 (4)进一步研究发现，E蛋白能与vtg基因启动子的特定序列结合，启动该基因的表达。已知vtg基因启动子含区域1和区域2，为研究E蛋白的结合位点，设计如下实验：用限制酶将启动子切割成含区域1和区域2的两个片段，将两个酶切片段分别与Luc基因载体连接，连接位点位于Luc基因的上游，形成两种重组载体。将重组载体分别导入斑马鱼的 ，待发育成熟后，往水体中添加 进行检测。 34．（2025·山东潍坊·一模）利用基因编辑技术CRISPR/Cas12a开发出的核酸检测技术，可更加精确快速的进行核酸检测。该系统由crRNA与Cas12a蛋白组成，利用crRNA介导Cas12a蛋白能准确切割靶标DNA，Cas12a蛋白切割靶标DNA的同时切割荧光底物使其发出荧光，通过检测荧光强度确定靶标DNA含量。现利用工程菌制备CRISPR/Cas12a复合体来检测自来水中的大肠杆菌，如图所示。 (1)PCR获取目的基因时，缓冲液中Mg2+的作用是 ，crRNA序列应符合的条件是 。 (2)为实现Cas12a蛋白基因、crRNA编码序列与质粒的准确连接，质粒中两处BsaⅠ酶切后的黏性末端应 （填“相同”或“不同”）。为使重组质粒中不出现BsaⅠ识别序列，需在F和R引物5'端添加的序列是 （填标号）。 ①F5'-NNNNNGAGACC-3'    R5'-NNNNNGAGACC-3' ②F5'-GGTCTCNNNNN-3'    R5'-GGTCTCNNNNN-3' ③F5'-GGTCTCNNNNN-3'    R5'-NNNNNGAGACC-3' ④F5'-NNNNNGAGACC-3'    R5'-GGTCTCNNNNN-3' (3)若要筛选到含有基因表达载体的工程菌，培养基中除细菌生长的必需条件外还应加入 ，从菌落分别挑取少许菌体，接种到含 的平板上，若 ，则对应菌落中细菌含有基因表达载体。 (4)下图为利用CRISPR/Cas12a复合体检测自来水中大肠杆菌DNA含量时绘制的曲线，实验中设置不含大肠杆菌对照组的作用是 。一段时间后，荧光信号强度不再升高，原因是 。 35．（2025·山东枣庄·二模）无缝克隆技术首先对质粒PCR1获得线性化载体，然后通过PCR2在目的基因片段的两端插入与线性化载体两端相同的碱基序列。再将上述两类PCR产物混合，在In-Fusion酶的作用下，凭借其3′→5′外切核酸酶活性，从线性化DNA的3′端起始切除15个核苷酸，进而暴露出部分单链区域，最终在某些酶的作用下促使插入片段与载体实现连接。Gata基因是哺乳动物体内重要的转录调控因子，与多种疾病的发生发展密切相关，研究者利用无缝克隆技术将Gata基因和绿色荧光蛋白（GFP）基因连接，构建融合蛋白以研究Gata基因的作用机理，相关流程如下图所示。 (1)PCR过程中引物与模板结合发生在 阶段。对质粒进行PCR1扩增时，引物应选 。 A．5'TAGATCTCAGTCGATC3'  B．5'GATCGACTGAGATCTA3' C．5'AGGATCAGTCCGCTA3'   D．5'TAGCGGACTGATCCCT3' (2)进行PCR2过程中，为了在GFP基因两端分别增加Ⅰ、Ⅱ片段，应该从引物①②③④中选择引物 ，并且还要在引物的 （填“5'”或“3'”）端添加Ⅰ、Ⅱ片段对应序列。PCR2进行第四轮扩增结束时，PCR反应体系中含 个需要的双链GFP基因片段。将线性化载体与目的GFP基因相连构建重组质粒阶段除了需要InFusion酶之外，还需要 酶。 (3)将实验得到的常染色体上转入一个Gata-GFP融合基因的1只雄性小鼠，与野生型雌鼠杂交，得到F1小鼠若干，F1雌雄小鼠相互交配得到F2，其中Gata-GFP基因纯合子小鼠的比例为 。 36．（2025·山东枣庄·一模）中国“干扰素之父”侯云德院士于1982年成功研发我国第一个基因工程创新药物——干扰素。干扰素是一种白细胞产生的具有抗病毒能力的分泌蛋白。研究人员从感染病毒的鸡白细胞提取全基因组mRNA，利用PCR技术获取鸡干扰素基因，图1表示鸡干扰素蛋白有关的基因片段，序号①~④表示引物。然后将获取的目的基因连接在大肠杆菌的pET32a质粒（5900bp，注：bp表示碱基对）上，图2表示pET32a质粒及其上部分限制酶切割位点。最后将重组质粒导入大肠杆菌后获得成熟干扰素。 (1)利用鸡白细胞总mRNA获得干扰素蛋白基因，需要在 酶的作用下先合cDNA。图1表示成熟干扰素蛋白序列及其前端的信号肽序列，信号肽是分泌蛋白合成过程中开始合成的一段肽链，其在干扰素合成中的作用是 。 (2)为了获取不含信号肽序列的干扰素基因，在进行PCR扩增时需要用到的一对引物是 ，为了将目的基因准确连接到pET32a质粒上需要在目的基因的两端添加 限制酶的序列。PCR扩增过程除了引物，还需要的条件有 （答出2点）。 (3)为了检测目的基因是否插入pET32a质粒，利用目的基因两端添加的限制酶切割质粒，然后对产物进行电泳，结果如图3，样品 最可能是插入了目的基因的重组质粒，判断的理由是 。 四、实验题 37．（2025·山东泰安·二模）研究人员从麻疯树油中筛选出能产生脂肪酶（LA）的两种菌株。菌株1产生的LA1酶可耐高温，菌株2产生的LA2酶具有高催化效率，且LA1基因和LA2基因具有93%的同源性。研究人员采用交错延伸PCR技术获得了重组LA基因，生产出了更高效的酶。 (1)交错延伸PCR技术具体流程如上图（图中仅显示其中一条链延伸情况）。该技术采用LA1、LA2均做模板，起始所需引物相同，引物作用是 。已知过程①起始引物片段均为25个核苷酸，TaqDNA聚合酶延伸速度为1200个碱基/min，本实验的循环扩增条件为：变性30s，复性15s，延伸15s，经过80轮交错循环后，可获得PCR混合产物。第二轮循环后所得重组型子链长度为 个核苷酸。 (2)获得的重组LA基因中，同时具有LA1和LA2基因序列的原因是 。 (3)过程②用到的PM质粒中A为启动子、B为氯霉素抗性基因cat、C为终止子、D为asd-突变基因、E为复制原点，箭头处指不同限制酶的识别位点。asd基因是编码细菌细胞壁的主要成分DAP合成途径的关键酶，asd基因缺失时，将导致菌株生长对DAP依赖。为使目的基因定向插入PM质粒，交错延伸PCR过程中引物的5′端需引入 酶的识别序列。为便于目的基因的检测和鉴定，过程③中应采用asd基因 的受体菌。从含有PM质粒、重组PM质粒的受体菌中将含有重组PM质粒的受体菌筛选出来的思路为 。 38．（2025·山东菏泽·二模）抗菌肽以其快速杀菌活性、免疫调节特性和促进伤口愈合的潜力成为最有前景的抗菌药物。研究发现将抗菌肽第52位的脯氨酸（密码子为CCC）替换成苏氨酸（密码子为ACG）可增强抗菌肽的杀菌活性。科研人员利用大引物PCR定点诱变技术对抗菌肽基因进行改造的过程如图所示。请回答下列问题： (1)若将抗菌肽第52位的脯氨酸换成苏氨酸，则基因转录模板链对应碱基的变化是 ，据图分析，写出第51位氨基酸对应的密码子是 。 (2)据图分析，“大引物PCR定点诱变”技术中设计的“诱变引物”应选择________。 A．5'…ATAGCAGGC…3' B．5'…ATAACGGGC…3' C．5'…GCCTGCTAT…3' D．5'GCCCGTTAT3' (3)进行大引物PCR定点诱变获得改良的抗菌肽基因，需要进行两次PCR（PCR1和PCR2），产物1最早出现在PCR1的第 轮循环；PCR2的产物除改良的抗菌肽基因外，还有 ；若考虑1个改良的抗菌肽基因通过PCR3快速扩增，则第n次循环共需引物 个。 (4)PCR过程中温度的控制至关重要，若变性时温度偏低，则会导致反应效率降低，原因是 。在PCR扩增改良的抗菌肽基因时，研究人员尝试利用降落PCR技术提高扩增特异性。降落PCR的原理是：在PCR前几个循环先设置较高的复性温度，随后每个循环均降低一定温度，直至达到适宜复性温度。结合PCR原理分析，降落PCR能提高特异性的原因是 。 39．（2025·山东济南·一模）突变体是植物功能基因组学研究的基础材料，科研人员利用玉米转座酶基因和D元件的双荧光载体的转座系统（如图甲所示），进行二穗短柄草突变体培育实验。转座酶可识别D元件两端的反向重复序列并将其切离。此外，转座酶能够不断将D元件重新连接到染色体的任意位置，即完成了“转座”过程。相关实验过程、结果如下图所示。 (1)使用引物F1/R1通过PCR技术可特异性扩增转座酶基因，原因是 ；可选用 基因作为筛选基因检测植物是否被农杆菌成功转化。 (2)为了检测图中载体中的D元件是否成功在二穗短柄草基因组中发生切离，分别使用F2/R2引物和F2/R4引物对T0代转基因阳性苗进行PCR检测，已知若D元件未发生切离，使用F2/R4引物进行PCR扩增不出条带。据图丙所示植株1至10的电泳结果，既含有转座的细胞又含有未发生转座的细胞的植株是 ，原因是 。 (3)对T0代阳性植株自交得到的T1代的幼根同时观察绿色荧光（GFP）和红色荧光（RFP），得到4组结果：①GFP（+）、RFP（+）；②GFP（+）、RFP（-）；③GFP（-）、RFP（+）；④GFP（-）、RFP（-）。根据上述实验结果推测含有D元件且D元件遗传稳定性高的是 （填序号）组。 (4)研究发现，D元件随机插入染色体后获得具有突变表型的植物个体的比率较低，可能的原因有 。 40．（2025·山东潍坊·二模）RACE PCR技术可以在仅知mRNA中部分序列的情况下扩增出对应的DNA，部分过程如图1所示。科研人员在开展植物病害监测工作时，发现一株香石竹呈现出异常症状。经初步检测分析，确定其病因系一种新型病毒——病毒A所致。科研人员欲提取病毒A的mRNA，并通过RACE  PCR技术得到对应的DNA。    (1)为获得较高纯度的病毒A的mRNA，先提取 （填“感染病毒A”或“未感染病毒A”）的香石竹细胞内的mRNA，通过逆转录得到DNA单链。将该DNA单链与从 （填“感染病毒A”或“未感染病毒A”）的香石竹细胞内提取的mRNA混合，未与DNA配对的mRNA即为病毒A的mRNA。 (2)病毒A的mRNA序列未知，但科研人员已经检测出了该病毒蛋白质的部分氨基酸序列。利用已知的氨基酸序列无法准确推知该病毒mRNA中的对应序列，原因是 。此时，若要顺利进行RACEPCR，就需要合成多种引物GSP。若病毒A蛋白中的一段氨基酸序列为“-半胱氨酸-酪氨酸-组氨酸-丝氨酸-组氨酸-酪氨酸-”，结合图2密码子表分析，利用该段序列设计出的含有18个碱基的引物GSP有 种。 第一个 碱基 第二个碱基 第三个碱基 U C A G U 苯丙氨酸 苯丙氨酸 亮氨酸 亮氨酸 丝氨酸 丝氨酸 丝氨酸 丝氨酸 酪氨酸 酪氨酸 终止 终止 半胱氨酸 半胱氨酸 终止 色氨酸 U C A G C 亮氨酸 亮氨酸 亮氨酸 亮氨酸 脯氨酸 脯氨酸 脯氨酸 脯氨酸 组氨酸 组氨酸  谷氨酰胺 谷氨酰胺 精氨酸 精氨酸 精氨酸 精氨酸 U C A G 图2  密码子表（部分） (3)RACE  PCR过程中形成的化学键是 。图1过程完成后，将“3'-RACE”和“5'-RACE”获得的双链DNA置于同一PCR反应体系中，不额外添加引物即可获得完整DNA片段，该过程中充当引物的是 （填图1中序号）。 (4)病毒A的mRNA的3'端为连续多个腺嘌呤核糖核苷酸，故引物1应为 。5'-RACE过程中，需要利用特定的酶为②链的3'添加多个相同的脱氧核苷酸，以便根据这一序列合成引物2。为②链的3'添加的脱氧核苷酸 （填“可以”或“不可以”）是胸腺嘧啶脱氧核苷酸，理由是 。 试卷第1页，共3页 试卷第1页，共3页 学科网（北京）股份有限公司 $$