3.2.1基因工程的基本操作程序课件（第一课时）课件-2024-2025学年高二下学期生物人教版（2019）选择性必修3

3.2.1 基因工程的基本操作程序 核心素养 结合实例，采用文字和图示方式说明基因工程的基本操作程序。 生命观念 01 科学探究 02 社会责任 03 运用结构与功能观等观念理解PCR技术的过程、原理、条件等。 利用基因工程技术和方法获得人类生产或生活所需产品。 课标要求 明确基因工程操作的涉及的技术以及方法。 01 02 03 阐明基因工程的基本操作程序及其主要步骤。 联系基因工程与实际生产生活的关系及应用。 温故知新 限制酶 主要存在于原核生物中 具有专一性(识别序列) 切开DNA分子的磷酸二酯键 DNA连接酶 连接磷酸二酯键 种类 E.coliDNA连接酶 T4 DNA连接酶 载体 具备的 条件 ①具一个至多个限制酶切割位点，供外源DNA片段（基因）插入其中。 ②能够在宿主细胞中自我复制或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制。 ③具有某些标记基因，便于重组DNA分子的筛选。 质粒、噬菌体、动植物病毒 基因工程的工具 1997年，我国政府首次批准商业化种植转基因抗虫棉。到2015年，我国已育成转基因抗虫棉新品种100多个，减少农药用量40万吨，增收节支社会经济效益450亿元。你知道转基因抗虫棉抗虫的机制是什么吗？ 从社会中来 培育转基因抗虫棉一般需要哪些步骤？ 转基因抗虫棉(使棉铃虫死亡，左)与非转基因抗虫棉(右) 培育抗虫棉的简要过程 苏云金芽孢杆菌 提取 普通棉花(不抗虫) 棉花细胞 与载体DNA拼接，导入 棉花植株(抗虫) ( 含抗虫基因 ) 表达抗虫基因 抗虫基因（BT毒蛋白基因） 农杆菌 6 基因工程的基本操作程序 1、目的基因的筛选与获取 2、基因表达载体的构建 3、将目的基因导入受体细胞 4、目的基因的检测与鉴定 前提 核心 关键 保证 有了目的基因，我们才能赋予一种生物以另一种生物的遗传特性。 使目的基因在受体细胞中稳定存在，并可进行遗传、表达和发挥作用。 载体进入受体细胞稳定表达，才能实现一种生物的基因在另一种生物中的转化。 才能确定目的基因是否真正在受体细胞中稳定遗传和正确表达。 目的基因 受体细胞 包括 抗逆性基因 生产药物基因 毒物降解基因 工业用酶基因 1.目的基因 一、目的基因的筛选与获取 在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞 或获得预期 等的基因就是目的基因。 概念 性状 表达产物 它主要是指编码 的基因。 蛋白质 最有效方法之一：从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选 2.目的基因的筛选 ①序列数据库，如美国国家生物信息中心GenBank ②序列对比工具（如BLAST) 一、目的基因的筛选与获取 Bt抗虫蛋白只有在某类昆虫肠道的碱性环境中才能表现出毒性，而人和牲畜的胃液呈酸性，肠道细胞也没有特异性受体。 实例： Bt抗虫蛋白基因（Bt基因）的筛选过程 苏云金杆菌（Bt）制成的生物杀虫剂广泛用于防治棉花虫害 对Bt基因的表达产物-Bt抗虫蛋白有较为深入的了解：苏云金杆菌通过产生苏云金杆菌伴孢晶体蛋白（Bt抗虫蛋白），破坏鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫 苏云金杆菌的杀虫作用与 Bt基因有关 掌握了Bt基因的序列信息 Bt基因是培育转基因抗虫棉较为合适的目的基因 抗虫原理：当Bt抗虫蛋白被分解为多肽后，多肽与害虫肠上皮细胞的特异性受体结合，导致细胞膜穿孔，最后造成害虫死亡。 思考：Bt抗虫蛋白会不会对人畜产生危害？ 一、目的基因的筛选与获取 一、目的基因的筛选与获取 3.目的基因的获取的方法 （1）人工合成 （2）利用PCR获取和扩增目的基因 （3）从基因文库中获取 逆转录法 化学合成法 目的基因的mRNA 双链DNA（目的基因） 逆转录 蛋白质的氨基酸序列 mRNA的核苷酸序列 推测 目的基因的核苷酸序列 推测 目的基因 化学 合成 合作探究：请同学们自主阅读教材P77-79，思考讨论以下问题。 1.总结出PCR的概念、提出者、原理、目的、优点。 2.结合体内DNA复制过程，思考PCR的进行需要哪些条件？ 所需设备是什么？ 3.构建出PCR的大致过程。 （2）利用PCR获取和扩增目的基因（常用） 12 01 （2）利用PCR获取和扩增目的基因（常用） 一、目的基因的筛选与获取 3.目的基因的获取 PCR是聚合酶链式反应的缩写。它是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。 穆里斯 PCR的概念: 原理 DNA复制的基本条件： 参与的组分 作用 解旋酶 （体外用高温） 打开DNA双链断开氢键 DNA母链 模板 4种游离的 脱氧核苷酸 合成子链的原料 DNA聚合酶 催化合成DNA子链 引物 使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接 脱氧核苷酸 一、目的基因的筛选与获取 DNA复制的过程：半保留复制 解旋酶 DNA聚合酶 母链(模板链) 子链(新合成的链) 四种脱 氧核苷酸 3’ 5’ 3’ 5’ 5’ 体外用高温代替！ 引物 解旋酶和高温都能使DNA的氢键断裂，使DNA的两条链解旋。 15 一、目的基因的筛选与获取 PCR反应体系需要的条件 ①缓冲溶液（一般添加Mg2+） ③四种脱氧核苷酸 真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2+激活。 ②DNA模板（需含有目的基因） ④耐高温的DNA聚合酶(Taq酶） ⑤能严格控制温度的温控设备 PCR扩增仪 ⑥引物 ——合成DNA子链的原料 在DNA复制时，DNA聚合酶不能直接从模板链的一端直接开始合成子链，必须由引物提供3′端之后才能开始连接脱氧核苷酸。 （主要是RNA单链、DNA单链） 由于DNA双链是反相平行的，所以需要两种引物。 引物启动DNA的复制 ⑥引物： 一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。 引物结合在模板链的_________。 3’端 17 ⑥引物 拓展 1、PCR扩增时至少需要______种引物，原因是_________________________________________________________________________________ 2 DNA的两条链是反向平行的，用2种引物才能保证DNA的两条链同时被扩增 2、PCR扩增的前提是： 根据一段已知目的基因的核苷酸序列合成引物 3、设计引物时必须依据： 目的基因的核苷酸序列 4、设计引物的要求： ①同种引物之间不能发生碱基互补配对，原因是：______________________________ ②2种引物之间不能发生碱基互补配对，原因是：______________________________。 防止引物自身折叠 防止引物之间配对，导致引物 不能与模板链结合 当堂检测 Q1 PCR 是一种体外迅速扩增 DNA 片段的技术。 下列有关该技术的叙述，不正确的是（ ） D A. PCR 技术的原理是 DNA 复制 B. 变性过程中利用高温使 DNA 双链解开 C. 复性过程中引物与 DNA 模板链的结合是依靠碱基互补配对原则完成的 D. 延伸过程需要 Taq酶、ATP、四种核糖核苷酸 【拓展延伸】NTP与dNTP 注意：NTP与dNTP 均是高能磷酸化合物，可用作 RNA 或 DNA 的合成原料，合成过程中会脱去两个磷酸基团，并释放出大量的能量。 NTP dNTP 注：PCR技术：dNTP提供原料和能量 90 50 72 ℃ 变性 3` 5` 5` 3` PCR反应的过程 耐高温的DNA聚合酶 引物1 引物2 4种脱氧核苷酸（dNTP) 主要是DNA单链或RNA 90 50 72 ℃ 退火/复性 PCR反应的过程 耐高温的DNA聚合酶 引物1 引物2 4种脱氧核苷酸 90 50 72 ℃ 延伸 PCR反应的过程 耐高温的DNA聚合酶 引物1 引物2 4种脱氧核苷酸 90 50 72 ℃ 变性 PCR反应的过程 耐高温的DNA聚合酶 引物1 引物2 4种脱氧核苷酸 90 50 72 ℃ 退火 PCR反应的过程 90 50 72 ℃ 延伸 PCR反应的过程 耐高温的DNA聚合酶 引物1 引物2 4种脱氧核苷酸 90 50 72 ℃ 变性 PCR反应的过程 90 50 72 ℃ 退火 PCR反应的过程 90 50 72 ℃ 延伸 PCR反应的过程 PCR技术扩增过程 a、变性（超过90℃）：双链DNA模板在热作用下， 断裂，形成 。 b、复性（下降到50℃）：系统温度降低，引物与DNA模板通过碱基互补配对，形成局部 。 c、延伸（上升到72℃）：在TaqDNA聚合酶的作用下，溶液中的的 在 的作用下，根据碱基互补配对原则，合成与模板互补的 的新的DNA链。 氢键 单链DNA 双链 4种脱氧核苷酸 5′端→3′端 耐高温的DNA聚合酶 PCR技术 DNA 复制 项目 条件 原理 解旋 场所 酶 结果 相 同 点 不同 点 比较 PCR 和 DNA 复制 4种脱氧核苷酸、能量、模板、酶、引物 半保留复制；碱基互补配对原则 高温 解旋酶催化，边解旋边复制 体外复制 主要在细胞核内 耐高温的DNA聚合酶 细胞内的DNA聚合酶 大量的DNA片段 形成整个DNA分子 比较PCR反应与体内DNA复制所需的基本条件 在DNA复制中的作用 体内DNA复制条件 PCR反应条件 DNA母链 DNA母链 解旋酶 高温条件（90℃以上） 4种脱氧核苷酸 4种脱氧核苷酸 DNA聚合酶 耐高温的DNA聚合酶 一小段RNA 一小段DNA 提供DNA复制的模板 断裂氢键， 打开DNA双链 合成子链DNA的原料 催化形成磷酸二酯键，进而合成DNA子链 使DNA聚合酶结合在引物的3’端，从而开始连接脱氧核苷酸（引物） 通常是20~30个核苷酸 第二轮循环的产物 第三轮的产物 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 第一轮循环的产物 3’ 5’ 3’ 5’ 【特别提示】PCR扩增过程中引物、原料需要源源不断的加入。 由于一个循环得到的产物又可以作为下一个循环的模板，因而每一次循环后目的基因的量可以增加一倍。 即成指数形式扩增（约为2n，其中n为扩增循环的次数）。 扩增次数 第1次 第2次 第3次 第n次 DNA分子数 含引物A(或B) 的DNA分子数 同时含引物A、B的DNA分子数 共消耗的 引物数量 2 2 0 4 6 8 14 2 6 2n 2n+1-2 2n-2 1 3 7 2n-1 PCR扩增DNA规律 5’ 3’ 5’ 5’ 第一次循环 第二次循环 3’ 5’ 第三次循环 3’ 3’ 思考： PCR技术获取目的基因时至少要经过几次循环才能从DNA分子中分离出目的基因？ 你记住了吗？ 用PCR可以扩增mRNA吗？ mRNA不可以直接扩增，需要将它逆转录成cDNA再进行扩增。 CA …… UCCCUAAGGAUAG CCAUCCCAGAUG --ATGCATGCAT…… CGATCGTAGCCA …… TCCCTAAGGATAG CCATCCCAGATG …… CATGCATCCATGC--- --TACGTACGTA ……GCTAGCATCGGT…… AGGGATTCCTATC GGTAGGGTCTAC …… GTACGTAGGTACG--- 某原核细胞基因 非编码区 非编码区 编码区 不编码mRNA 不编码mRNA (编码mRNA) 启动子 终止子 启动子：启动子是RNA 聚合酶识别、结合和开始转录的一段DNA 序列 终止子：给予RNA聚合酶转录终止信号的DNA序列 RNA聚合酶 --ATGCATGCAT…… CGATCGTAGCCA …… TCCCTAAGGATAG CCATCCCAGATG …… CATGCATCCATGC--- --TACGTACGTA ……GCTAGCATCGGT…… AGGGATTCCTATC GGTAGGGTCTAC …… GTACGTAGGTACG--- 非编码区 非编码区 编码区 (编码mRNA) 启动子 终止子 启动子：启动子是RNA 聚合酶识别、结合和开始转录的一段DNA 序列 终止子：给予RNA聚合酶转录终止信号的DNA序列 CA …… UCCCUAAGGAUAG CCAUCCCAGAUG 转录 mRNA 某原核细胞基因 --ATGCATGCAT…… CGATCGTAGCCA …… TCCCTAAGGATAG CCATCCCAGATG …… CATGCATCCATGC--- --TACGTACGTA ……GCTAGCATCGGT…… AGGGATTCCTATC GGTAGGGTCTAC …… GTACGTAGGTACG--- 非编码区 非编码区 编码区 (编码mRNA) 启动子 终止子 CA …… UCCCUAAGGAUAG CCAUCCCAGAUG 转录 mRNA 翻译 蛋白质 某原核细胞基因 如果该基因为真核细胞基因有什么不同？ CA …… UCCCUAAGGAUAG CCAUCCCAGAUG --ATGCATGCAT…… CGATCGTAGCCA …… TCCCTAAGGATAG CCATCCCAGATG …… CATGCATCCATGC--- --TACGTACGTA ……GCTAGCATCGGT…… AGGGATTCCTATC GGTAGGGTCTAC …… GTACGTAGGTACG--- 某真核细胞基因 非编码区 非编码区 编码区 不编码mRNA 不编码mRNA (编码mRNA) 启动子 终止子 RNA聚合酶 外显子 内含子 外显子 内含子 外显子 外显子：编码蛋白质的序列称为外显子 内含子：外显子之间不能编码蛋白质的序列称为内含子 --ATGCATGCAT…… CGATCGTAGCCA …… TCCCTAAGGATAG CCATCCCAGATG …… CATGCATCCATGC--- --TACGTACGTA ……GCTAGCATCGGT…… AGGGATTCCTATC GGTAGGGTCTAC …… GTACGTAGGTACG--- 非编码区 非编码区 编码区 (编码mRNA) 启动子 终止子 CA …… UCCCUAAGGAUAG CCAUCCCAGAUG 转录 初始mRNA 某真核细胞基因 外显子 内含子 外显子 内含子 外显子 外显子：编码蛋白质的序列称为外显子 内含子：外显子之间不能编码蛋白质的序列称为内含子 外显子和内含子均会被转录成RNA，再经过切去内含子对应部位、连接外显子对应部位等RNA加工过程，形成可以直接用于翻译的mRNA --ATGCATGCAT…… CGATCGTAGCCA …… TCCCTAAGGATAG CCATCCCAGATG …… CATGCATCCATGC--- --TACGTACGTA ……GCTAGCATCGGT…… AGGGATTCCTATC GGTAGGGTCTAC …… GTACGTAGGTACG--- 非编码区 非编码区 编码区 (编码mRNA) 启动子 终止子 CA …… UCCCUAAGGAUAG CCAUCCCAGAUG 转录 某真核细胞基因 外显子 内含子 外显子 内含子 外显子 RNA加工 CA …… UAGGAUCCAGAUG 翻译 蛋白质 外显子和内含子均会被转录成RNA，再经过切去内含子对应部位、连接外显子对应部位等RNA加工过程，形成可以直接用于翻译的mRNA 初始mRNA 成熟mRNA --ATGCATGCAT…… CGATCGTAGCCA …… TCCCTAAGGATAG CCATCCCAGATG …… CATGCATCCATGC--- --TACGTACGTA ……GCTAGCATCGGT…… AGGGATTCCTATC GGTAGGGTCTAC …… GTACGTAGGTACG--- 非编码区 非编码区 编码区 (编码mRNA) 启动子 终止子 CA …… UCCCUAAGGAUAG CCAUCCCAGAUG 转录 mRNA 翻译 蛋白质 某原核细胞基因 --ATGCATGCAT…… CGATCGTAGCCA …… TCCCTAAGGATAG CCATCCCAGATG …… CATGCATCCATGC--- --TACGTACGTA ……GCTAGCATCGGT…… AGGGATTCCTATC GGTAGGGTCTAC …… GTACGTAGGTACG--- 非编码区 非编码区 编码区 (编码mRNA) 启动子 终止子 CA …… UCCCUAAGGAUAG CCAUCCCAGAUG 转录 mRNA 翻译 蛋白质 某原核细胞基因 逆转录 GT…… AGGGATTCCTATC GGTAGGGTCTAC CA …… TCCCTAAGGATAG CCATCCCAGATG …… GT…… AGGGATTCCTATC GGTAGGGTCTAC …… cDNA 复制 双链DNA --ATGCATGCAT…… CGATCGTAGCCA …… TCCCTAAGGATAG CCATCCCAGATG …… CATGCATCCATGC--- --TACGTACGTA ……GCTAGCATCGGT…… AGGGATTCCTATC GGTAGGGTCTAC …… GTACGTAGGTACG--- 非编码区 非编码区 编码区 (编码mRNA) 启动子 终止子 CA …… UCCCUAAGGAUAG CCAUCCCAGAUG 转录 某真核细胞基因 外显子 内含子 外显子 内含子 外显子 RNA加工 CA …… UAGGAUCCAGAUG 翻译 蛋白质 初始mRNA 成熟mRNA --ATGCATGCAT…… CGATCGTAGCCA …… TCCCTAAGGATAG CCATCCCAGATG …… CATGCATCCATGC--- --TACGTACGTA ……GCTAGCATCGGT…… AGGGATTCCTATC GGTAGGGTCTAC …… GTACGTAGGTACG--- 非编码区 非编码区 编码区 (编码mRNA) 启动子 终止子 CA …… UCCCUAAGGAUAG CCAUCCCAGAUG 转录 某真核细胞基因 外显子 内含子 外显子 内含子 外显子 RNA加工 CA …… UAGGAUCCAGAUG 翻译 蛋白质 初始mRNA 成熟mRNA 逆转录 GT …… ATCCTAGGTCTAC GT …… ATCCTAGGTCTAC CA …… TAGGATCCAGATG 复制 cDNA：生物的mRNA 逆转录产生的互补DNA。 用PCR可以扩增mRNA吗？ mRNA不可以直接扩增，需要将它逆转录成cDNA再进行扩增。 1.逆转录酶以RNA为模板合成一条与RNA互补的DNA链，形成RNA-DNA杂交分子； 2.核酸酶H降解RNA-DNA杂交分子中的RNA链，使之变成单链DNA； 3.以单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一条互补的DNA链，形成双链DNA分子，即cDNA 1．下列有关PCR的叙述，错误的是（       ） A．PCR扩增过程中双链DNA的解开不需要解旋酶 B．用于PCR扩增的DNA聚合酶是一种耐高温的酶 C．延伸过程中需要DNA聚合酶、ATP和4种核糖核苷酸 D．复性过程中引物与模板链的结合遵循碱基互补配对原则 当堂检测 （2021·全国甲卷·高考真题）PCR技术可用于临床的病原菌检测。为检测病人是否感染了某种病原菌，医生进行了相关操作： ①分析PCR扩增结果；②从病人组织样本中提取DNA； ③利用PCR扩增DNA片段；④采集病人组织样本。回答下列问题： （1）若要得到正确的检测结果，正确的操作顺序应该是_________（用数字序号表示）。（2）操作③中使用的酶是____________________________。PCR 反应中的每次循环可分为变性、复性、_____三步，其中复性的结果是________________________________。（3）PCR（多聚酶链式反应）技术是指___________________________________________________________________________________________________________________。该技术目前被广泛地应用于疾病诊断等方面。 一项根据DNA半保留复制的原理，在体外参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术 ④②③① Taq酶(耐高温的DNA聚合酶） 延伸 引物通过碱基互补配对与单链DNA结合 当堂检测 Lavf58.45.100 Packed by Bilibili XCoder v2.0.2 EVCapture4.2.2软件录制 Lavf57.25.100 本视频由湖南一唯信息科技开发的EV录屏软件录制，www.ieway.cn $$