《化学实验技术》液相色谱法（举一反三考点练）- 讲义

举一反三考点练 《化学实验技术》液相色谱法-讲义 1、掌握利用液相色谱法进行定量分析的原理。 知识点一液相色谱的方法原理 1液相色谱法 液相色谱法是以液体作为流动相的柱色谱技术。现代液相色谱由于采用颗粒精细的高效固定相，以高压泵输送流动相，配备高灵敏度检测器，具有高速、高效、高灵敏度等分析特点，因此称为高效液相色谱法。与气相色谱法相比，高效液相色谱法的应用范围更加广泛，不仅适用于一般混合物的分离和分析，还可用于沸点较高、热稳定性差以及相对分子质量较大的物质(如高分子聚合体、生物分子及天然产物等)的分离与分析。 2方法原理 按照试样在两相间的分离机理不同，液相色谱可分为液-固吸附法、液-液分配法、离子交换法以及凝胶渗透法等多种方法。 (1)液-固吸附法 液-固吸附法的固定相为固体吸附剂，是根据其对被测各组分吸附能力的差异进行分离的。当流动相携带被测组分通过色谱柱时，由于吸附剂对被测各组分的吸附能力不同，它们在固定相中的保留时间也不同，吸附能力弱的先流出，吸附能力强的后流出。常用的吸附剂有硅胶、氧化铝、分子筛、聚酰胺等。 (2)液-液分配法 液-液分配法以涂渍在载体上的固定液作固定相，是根据各组分在两相间的溶解度差异进行分离的。当流动相携带被测组分通过色谱柱时，由于被测各组分在两相间的溶解度不同，因此在固定相中的保留时间也不同，溶解度小的组分容易被流动相洗脱，先流出柱，溶解度大的组分不容易被流动相洗脱，后流出柱。 常用的固定液有聚乙二醇、正十八烷、异三十烷以及β,β-氧二丙腈等。载体可用硅藻土、硅胶等。 液-液分配法的流动相应选择与固定液的极性差别较大、互不混溶的液体。当流动相的极性小于固定相时，称为正相分配色谱法；当流动相的极性大于固定相时，称为反相分配色谱法。在正相分配色谱法中，非极性组分先洗脱，极性组分后洗脱。在反相分配色谱法中，洗脱的顺序与之相反。 (3)离子交换法 离子交换法以离子交换树脂作固定相，是根据各组分交换能力不同进行分离的。这一方法要求被测组分在流动相中能够解离成离子，当流动相携带被测组分通过色谱柱时，被测各组分离子与树脂离子亲和力弱的保留时间短，先流出柱，亲和力强的保留时间长，后流出柱。 常用的离子交换树脂有两种，一种是以硅胶为基质，表面涂渍离子交换树脂；另一种是以苯乙烯与二乙烯基苯的共聚物为基质的离子交换剂。 (4) 凝胶渗透法 凝胶渗透法也叫体积排阻法，是以凝胶为固定相，根据被测组分分子体积不同进行分离的。凝胶具有一定大小的孔穴，当流动相携带被测组分通过色谱柱时，比孔穴尺寸大的分子由于不能进入孔穴而被排斥，随流动相流出色谱柱。比孔穴尺寸小的分子则渗人其中而完全不受排斥，所以最后流出。中等大小的分子则渗入较大的孔穴中，但受到较小孔穴的排斥。这样被测组分就按相对分子质量从高到低的顺序依次流出色谱柱。 常用的凝胶有软质(如葡萄糖凝胶、琼脂糖凝胶)、半硬脂(如苯乙烯-二乙烯基苯交联共聚凝胶)和硬脂凝胶(如多孔硅胶、多孔玻珠)等三种。 与气相色谱法相比，高效液相色谱法更适合分离分析（ ） A.沸点低、热稳定性好的小分子​ B.所有气体​ C.沸点较高、热稳定性差的物质​ D.仅适用于简单混合物 【答案】C 【解析】高效液相色谱法应用范围广，可用于沸点较高、热稳定性差以及相对分子质量较大的物质的分离与分析，所以选C。 1.液-固吸附法中，吸附能力弱的组分（ ） A.先流出色谱柱​ B.后流出色谱柱​ C.不流出色谱柱​ D.与吸附能力强的组分同时流出 【答案】A 【解析】在液-固吸附法中，吸附能力弱的组分在固定相中保留时间短，先流出柱，所以选A。 2.液-液分配法的固定相是（ ） A.固体吸附剂​ B.涂渍在载体上的固定液​ C.离子交换树脂​ D.凝胶 【答案】B 【解析】液-液分配法以涂渍在载体上的固定液作固定相，根据各组分在两相间溶解度差异分离，所以选B。 3.以硅胶为基质，表面涂渍离子交换树脂属于（）常用的固定相​ A.液-固吸附法​ B.液-液分配法​ C.离子交换法​ D.凝胶渗透法 【答案】C 【解析】以硅胶为基质，表面涂渍离子交换树脂是离子交换法常用的固定相类型之一，所以选C。 1.凝胶渗透法中，比孔穴尺寸大的分子（ ） A.渗入孔穴，最后流出​ B.渗入孔穴，先流出​ C.被排斥，随流动相先流出色谱柱​ D.被排斥，不流出柱 【答案】C 【解析】凝胶渗透法中，比孔穴尺寸大的分子由于不能进入孔穴而被排斥，随流动相流出色谱柱，所以选C。 2.某物质在液-固吸附色谱柱中，若要使其更快流出，可采取的措施是（ ） A.更换吸附能力更强的固定相​ B.增加固定相吸附剂用量​ C.降低流动相流速​ D.更换吸附能力更弱的固定相 【答案】D 【解析】在液-固吸附法中，吸附能力弱的组分先流出，更换吸附能力更弱的固定相，该物质受吸附作用减弱，会更快流出，所以选D。 3.离子交换法适用于分离（ ） A.所有物质​ B.在流动相中能解离成离子的物质​ C.非极性物质​ D.大分子物质 【答案】B 【解析】离子交换法要求被测组分在流动相中能够解离成离子，根据各组分离子与树脂离子交换能力不同进行分离，所以选B。 · 液相色谱法定义：以液体为流动相，高效型具高速高效高敏特点，适用高沸点、热稳差及大分子物质。 · 分离机理分类：含液-固吸附、液-液分配（分正/反相）、离子交换、凝胶渗透（按分子体积）法。 · 固定相示例：硅胶、氧化铝、聚乙二醇、离子交换树脂、葡萄糖凝胶等。 知识点二仪器与操作 (1)仪器的组成高效液相色谱仪的结构如图所示。主要由储液器、高压泵、梯度洗脱装置、进样器、色谱柱、检测器和数据处理系统(工作站)等组成。 常用的检测器有紫外-可见光检测器、折光检测器和电导检测器等。现代高效液相色谱仪普遍配有色谱工作站，由微机系统完成数据处理并打印分析结果。 储液器中储存的载液经过滤后，由高压泵输送到色谱柱入口(若采用梯度洗脱时则需用双泵系统来完成输送),样品由进样器注入载液系统，随载液一起进入色谱柱进行分离。分离后的组分经检测器检测，输出信号送至数据处理系统。如果需要，还可在色谱柱一侧出口收集各组分。 (2)仪器的操作高效液相色谱仪的型号繁多，但操作规程大致相同，其基本操作步骤如下： ①接通高压输液泵电源，用所选流动相以1mL/min的流速平衡； ②接通紫外-可见光检测器电源，设定所选用的波长和程序，预热； ③接通智能型接口的电源； ④打开计算机，进入色谱工作站，设定一分析方法； ⑤在泵、检测器和接口都准备好的情况下，按检测器自动调零，进样。仪器自动采集数据，自动计算，并打印结果报告； ⑥清洗色谱柱与进样器后，依次关闭检测器、接口、计算机和泵。 高效液相色谱仪中，用于分离样品组分的核心部件是（ ） A.储液器​ B.高压泵​ C.色谱柱​ D.数据处理系统 【答案】C 【解析】色谱柱是分离样品组分的核心部件，样品在色谱柱中根据不同原理实现分离，所以选C。 1.高效液相色谱仪中，用于储存载液的部件是（ ） A.高压泵​ B.储液器​ C.进样器​ D.色谱柱 【答案】B 【解析】储液器的作用是储存载液，载液经过滤后由高压泵输送，所以选B。 2.以下不属于高效液相色谱仪常用检测器的是（ ） A.紫外-可见光检测器​ B.热导检测器​ C.折光检测器​ D.电导检测器 【答案】B 【解析】高效液相色谱仪常用的检测器有紫外-可见光检测器、折光检测器和电导检测器等，热导检测器常用于气相色谱，所以选B。 3.若采用梯度洗脱，高效液相色谱仪需要的输送系统是（ ） A.单泵系统​ B.双泵系统​ C.无泵系统​ D.磁力泵系统 【答案】B 【解析】采用梯度洗脱时，需要用双泵系统来完成载液的输送，所以选B。 1.完成样品分析后，清洗色谱柱与进样器，应先关闭（ ） A.检测器​ B.接口​ C.计算机​ D.泵 【答案】A 【解析】清洗色谱柱与进样器后，依次关闭检测器、接口、计算机和泵，所以先关闭检测器，选A。 2.梯度洗脱装置的功能是（ ） A.改变载液的组成和比例，实现不同的分离效果​ B.控制进样量​ C.调节检测器灵敏度​ D.打印分析结果 【答案】A 【解析】梯度洗脱装置通过改变载液的组成和比例，改变流动相的极性、离子强度等，实现更好的分离效果，所以选A。 3.电导检测器适用于检测（ ） A.具有紫外吸收的物质​ B.所有有机物​ C.在溶液中能电离成离子的物质​ D.具有折光性质的物质 【答案】C 【解析】电导检测器是基于物质在溶液中电离产生离子，通过检测离子的电导来测定物质含量，适用于在溶液中能电离成离子的物质，所以选C。 · 仪器组成：由储液器、高压泵、梯度洗脱装置、进样器、色谱柱、检测器（紫外-可见光等）和数据处理系统组成，载液经高压泵输送，样品分离后检测。 · 操作步骤：泵用流动相平衡，检测器设波长预热，接口和计算机开机，工作站设方法，调零后进样采集数据。 · 关机要求：清洗色谱柱和进样器后，依次关检测器、接口、计算机和泵。 知识点三定性与定量分析 高效液相色谱（HPLC）作为现代分析化学领域中重要的分离分析技术，在定性与定量分析方面有着系统且科学的方法体系。 （1）定性分析 高效液相色谱常用标准样比较、检测器选择和检测器扫描等方法定性，从不同角度鉴定未知化合物。 标准样比较法：与气相色谱定性原理相同，基于物质在色谱分离中的保留行为。在相同色谱条件下，每种化合物有特征保留值，对比未知样品与标准样品保留值，一致则可初步判定为同种化合物。该方法操作简便，但对性质相似、保留值相近的化合物易误判，需结合其他方法确认。 检测器选择法：依据不同检测器对同一被测物响应特性不同，且灵敏度比值与被测物性质相关。用多种检测器检测样品，分析各检测器响应信号差异和灵敏度比值，推断被测物化学性质和结构，有助于区分相似化合物。 检测器扫描法：利用紫外检测器全波长扫描功能，获取被测物在不同波长下吸光度，绘制紫外光谱图。根据光谱图特征，如最大吸收波长、峰形和强度等，与标准谱图比对或分析特征峰，判断化合物类型，适用于有紫外吸收的化合物定性，在多领域广泛应用。 （2）定量分析 高效液相色谱定量方法主要有归一化法、内标法和外标法，通过建立含量与色谱信号关系测定组分含量。 归一化法：基于样品中所有组分都能出峰，且响应因子相近。各组分峰面积与含量成正比，通过计算峰面积占比得到组分含量。该方法操作简单，对进样量要求不高，但要求样品组分全出峰且响应因子相近，应用有局限。 内标法：在样品和标准溶液中加入内标物，内标物需与被测物性质相似且峰能分离。测定标准溶液和样品中被测物与内标物峰面积，绘制标准曲线，根据样品中二者峰面积比计算被测物含量。内标法可消除实验因素波动影响，定量准确，但操作繁琐，需准确称量内标物和样品。 外标法：配制不同浓度标准溶液，进样分析绘制峰面积-浓度标准曲线，测定未知样品峰面积，从曲线查浓度计算含量。外标法操作简便，适用于大量样品常规分析，但对实验条件稳定性要求高，进样量准确性影响结果，需定期验证校正标准曲线。 高效液相色谱法中，利用保留值进行定性分析的方法是（ ） A.标准样比较法​ B.检测器选择法​ C.检测器扫描法​ D.归一化法 【答案】A 【解析】标准样比较法与气相色谱定性方法原理相同，是基于色谱分离过程中物质的保留行为，通过比较未知物与标准样品的保留值进行定性分析，所以选A。 1.利用紫外检测器全波长扫描功能，根据被测物紫外光谱图特征进行定性分析的方法是（ ） A.标准样比较法​ B.检测器选择法​ C.检测器扫描法​ D.内标法 【答案】C 【解析】检测器扫描法借助紫外检测器全波长扫描，获取被测物在不同波长下吸光度绘制光谱图，依据光谱图特征与标准谱图比对或分析特征峰来判断化合物类型，实现定性，所以选C。 2.高效液相色谱定性分析中，标准样比较法的局限性在于（ ） A.操作复杂​ B.对性质相似、保留值相近的化合物易误判​ C.只能用于气体样品​ D.不能与其他方法结合使用 【答案】B 【解析】标准样比较法操作相对简便，但当样品中存在性质相似、保留值相近的化合物时，可能会出现误判，需要结合其他方法进一步确认，所以选B。 3.在高效液相色谱内标法中，内标物应满足的条件不包括（ ） A.样品中不存在的纯物质​ B.其色谱峰与被测组分的色谱峰能够完全分离​ C.与被测物物理化学性质相似​ D.必须是气体物质 【答案】D 【解析】内标法中内标物应是样品中不存在的纯物质，其色谱峰与被测组分峰能完全分离，且与被测物物理化学性质相似，不要求是气体物质，所以选D。 1.高效液相色谱定量分析中，基于样品中所有组分都能在色谱图上出峰，且各组分响应因子已知或相近的方法是（ ） A.归一化法​ B.内标法​ C.外标法​ D.标准加入法 【答案】A 【解析】归一化法的前提是样品中所有组分都能出峰，且各组分的响应因子已知或相近，通过计算各组分峰面积占比得到含量，所以选A。 2.高效液相色谱外标法的操作步骤是（ ） A.配制标准溶液→进样分析→绘制标准曲线→测定未知样品→计算含量​ B.加入内标物→配制标准溶液→进样分析→绘制标准曲线→计算含量​ C.直接测定未知样品→对比标准谱图→计算含量​ D.测定样品峰面积→直接计算含量 【答案】A 【解析】外标法通过配制一系列不同浓度的标准溶液，进样分析测量峰面积，绘制峰面积-浓度标准曲线，再测定未知样品峰面积，从曲线查浓度计算含量，所以选A. 3.利用高效液相色谱定性分析时，若样品中存在保留值相近的化合物，为准确判断，最好结合（ ） A.只使用标准样比较法多次测量​ B.检测器选择法和检测器扫描法​ C.更换更短的色谱柱​ D.增大进样量 【答案】B 【解析】标准样比较法对保留值相近化合物易误判，结合检测器选择法和检测器扫描法，从不同角度获取化合物性质信息，可更准确判断，所以选B。 · 定性分析：用标准样比较（比保留值）、检测器选择（分析响应差异）、检测器扫描（紫外光谱图）法。 · 定量分析：归一化法（峰面积占比）、内标法（加内标物绘曲线）、外标法（绘峰面积-浓度曲线）。 · 方法特点：定性需结合多法，定量各法操作繁简及适用场景不同。 原创精品资源学科网独家享有版权，侵权必究！2 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 $$